导读:本文包含了微生物谷氨酰胺转氨酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:谷胺酰胺转氨酶,蛋白质,定点修饰,多肽
微生物谷氨酰胺转氨酶论文文献综述
程孝中,赵鑫锐,洪皓飞,杨敏,周志昉[1]（2019）在《微生物谷胺酰胺转氨酶在蛋白质修饰中的应用》一文中研究指出谷胺酰胺转氨酶能催化蛋白质中谷氨酰胺与赖氨酸间的酰基转移反应,广泛应用于食品、纺织等工业。近年来,微生物来源的谷胺酰胺转氨酶,具有易得、反应条件温和、不依赖钙离子调节等优点,被广泛应用于蛋白质的定点修饰。通过基因工程手段,在蛋白质的特定部位引入谷胺酰胺转氨酶特异性识别的Q-Tag和K-Tag,谷胺酰胺转氨酶能催化抗体与小分子之间、蛋白质与蛋白质之间、蛋白质与聚合物之间、蛋白质与糖类物质之间、蛋白质与脂质体之间的定点偶联以及短肽的自身环化。这些蛋白质定点修饰产物在药物化学、化学生物学以及生物材料等领域有着广泛的用途。本文作者综述了近年来微生物谷胺酰胺转氨酶在蛋白质定点修饰中的最新进展。(本文来源于《食品与生物技术学报》期刊2019年06期）
石楠[2]（2019）在《微生物谷氨酰胺转氨酶的发酵与异源表达研究》一文中研究指出微生物源谷氨酰胺转氨酶(Microbial Transglutaminase,MTG)在农产品加工产业中是一种非常重要的酶制剂,广泛应用于乳品、海鲜、肉类、面点、豆制品、可食用膜等多种产品的加工生产中。目前,MTG来源于天然菌种的发酵或MTG基因在细菌、酵母菌中的重组表达。天然菌株发酵可以直接获得有活性的酶,但是发酵周期长且工艺流程复杂;重组菌株发酵周期短、成分简单,但活性表达需要选择适合的表达策略,否则容易形成包涵体或无法获得有活性产物。为了解决以上问题,本研究以实验室前期筛选得到的两株具有MTG活性的放线菌菌株107.3和109.5为研究对象,从菌种选育、下游处理条件摸索、异源表达机制探索、酶分子改造及特性表征等几方面着手,获得主要研究结果如下:MTG产生菌的系统发育研究。经过16S rDNA序列测定和系统发育树的构建以及形态观察,确定菌株107.3为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)近似种,吸水链霉菌是链霉菌属中目前已知的MTG高产菌种之一;菌株109.5为嗜角蛋白拟无枝酸菌(Amycolatopsis keratinophila)的近似种,其MTG活性尚未见报道。菌株109.5的诱变育种以及MTG的浓缩初提。确定了菌株109.5的最适种子培养基为葡萄糖10.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,酵母粉10.0 g/L,MgSO_4·7H_2O 0.5 g/L,K_2HPO_4 0.7 g/L,KH_2PO_4 0.3 g/L,pH7.0;发酵条件为30℃,200 r/min种子培养30h后,以0.5%接种量转接发酵培养基,发酵70 h。先后采用紫外线诱变、羟胺诱变和多功能等离子体诱变系统(MPMS,multifunctional plasma mutagenesis system)对菌株109.5进行了诱变,并通过正交试验优化发酵培养基为葡萄糖25 g/L,蛋白胨35 g/L,酵母粉1 g/L,NaCl 2 g/L,pH 7.2;使突变株PM-66的酶活力达到1.421±0.009 U/mL,比野生型菌株提高了3.55倍。建立了基于Image J图像灰度分析的固体培养基半定量筛选突变株的方法,实现了突变株的高通量筛选,也为其它同样不便于进行液体比色的菌株筛选提供了新思路。采用双水相萃取(ATPE,aqueous two phase extracton)的方法对突变株PM-66发酵液中的MTG进行了浓缩初提,确定了最适双水相系统ATPS(aqueous two phase system)为26%PEG1000-19%(NH_4)_2SO_4-5%NaCl,萃取体系pH值为6.0,萃取的产率为86.51%,比酶活0.83U/mg,萃取后向PEG相中添加9%的(NH_4)_2SO_4可以获得酶的沉淀。将双水相萃取法应用于拟无枝酸菌发酵液MTG的初提尚未见报道。菌株107.3的MTG基因克隆表达与分子改造。首先,菌株107.3 MTG基因被克隆并转化到了大肠杆菌(Escherichia coli)中,在IPTG(异丙基硫代半乳糖苷,isopropylβ-D-thiogalactoside)的诱导下,重组大肠杆菌的酶活力为0.372±0.008U/mL;镍离子亲和层析纯化后,重组MTG最适温度35℃,最适pH7;Na~+、K~+对酶活有少许促进作用,Zn~(2+)、Cu~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(2+)、Mn~(2+)则对酶活有不同程度的抑制作用,Ca~(2+)对酶活几乎没有影响。其次,构建并成功表达了14种菌株107.3 MTG的不同形式突变体,多数突变体的的催化活性或稳定性优于未突变酶,Y133F突变体的比活力最高;在Y133位点进一步构建并表达了8种氨基酸替换突变体,其中6种突变体的比活力都高于未突变酶。由此说明酶分子改造的有益突变位点主要集中于分子N端和靠近酶活性裂缝的周围区域;Y133是吸水链霉菌MTG分子中的有益突变位点。最后,为了研究MTG前导片段的功能,吸水链霉菌MTG基因与茂源链霉菌(Streptomyces mobaraense)MTG基因分别被转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株X33中,采用了前导片段与成熟酶分开或融合两种表达形式。表达融合吸水链霉菌MTG前导片段与成熟酶的重组酵母菌株6711在1.5%甲醇诱导下,30℃发酵96 h,酶活力为0.200±0.005 U/mL。单独表达前导片段与成熟酶的重组菌株均未检测到酶活。说明前导片段与成熟酶分别表达不能使成熟酶进行正确的折迭,只有在正确切割的前提下,前导片段才可以帮助成熟酶折迭为正确的空间结构,表现出活性。(本文来源于《河北农业大学》期刊2019-06-04）
张迪,惠希武,曹卫荣,盖文丽,李银贵[3]（2018）在《ELISA法测定微生物谷氨酰胺转氨酶残留量》一文中研究指出目的:建立微生物谷氨酰胺转氨酶(microbial transglutaminase,MTGase)残留量检测的酶联免疫吸附法(ELISA法),并进行方法学验证,用于MTGase催化偶联的生物制品的质量控制。方法:利用MTGase单抗和MTGase兔多抗,建立了MTGase的双抗体夹心ELISA方法,并验证了该方法的定量限、精密度和准确度、稀释可靠性、稳定性和专属性等,对3批PEG-IFNα2a原液进行重复测定。结果:该方法的定量限为0.165~10 ng·mL~(-1),在0.05~40 ng·mL~(-1)范围内拟合度高,R2>0.99,板内和板间精密度和准确度均在(±)15%以内;样品经不同倍数稀释后,回归计算样品的准确度在±15%以内,精密度小于15%;样品室温放置2 h或冻融1次和3次,结果显示质控样品采用该方法检测的精密度均小于15%,回收率为80%~120%;应用该方法在不同稀释倍数的PEG-IFNα2a原液中等量添加5 ng·mL~(-1)质控样品,结果显示加标样品回收率为97.7%~101.1%。3批PEG-IFNα2a原液MTGase残留量重复测定的板内和板间精密度均在15%以内,MTGase的残留量均低于总蛋白含量的0.01%。结论:ELISA法可用于生物制品中MTGase残留量的检定。(本文来源于《药物分析杂志》期刊2018年01期）
王文超[4]（2017）在《微生物谷氨酰胺转氨酶作用于酸奶蛋白凝胶特性及抗氧化机理研究》一文中研究指出目前,酸奶产业主要存在乳清析出、保质期短、对食品添加剂使用安全性担忧等问题,相关研究表明添加微生物谷氨酰胺转氨酶(Microbial Transglutaminase,简称mTG)是解决酸奶乳清析出的有效途径。但是关于添加mTG后对酸奶蛋白抗氧化活性的影响以及构效机理研究仍不多见。本论文以乳酸菌和mTG联合发酵生产酸奶,主要研究工作和成果如下:1.通过滴定酸度、乳清析出、粘度、持水力(Water holding capacity,简称WHC)以及微观结构等指标,评价了mTG添加量对酸奶感官品质的影响,得mTG的最适添加量为2U~3U。2.依次采用30kDa、10kDa、3kDa的超滤膜对酸奶乳蛋白离心截留分离得到空白组酸奶蛋白FMPⅠ、FMPⅡ、FMPⅢ和FMPⅣ,以及mTG组酸奶蛋白mFMPⅠ、mFMPⅡ、mFMPⅢ和mFMPⅣ,将FMP/mFMP通过胃肠模拟消化(Gastrointestinal digestion,简称GI)技术得到产物FMP-GI/mFMP-GI;通过体外抗氧化体系评价FMP/mFMP、FMP-GI/mFMP-GI抗氧化活性。结果表明:FMP/mFMP、FMP-GI/mFMP-GI各超滤组分的抗氧化活性均与其分子量呈显着负相关(p<0.05);mFMP/mFMP-GI各超滤组分的抗氧化活性显着高于FMP/FMP-GI。3.采用SDS-PAGE技术对FMP/mFMP各超滤组分的肽组成进行分析,结果表明:在SDS-PAGE图谱中,mFMPⅠ较FMPⅠ出现了乳蛋白新聚合体(分子量约为43.0kDa),mFMPⅡ较FMPⅡ在分子量约为14.0k Da和18.0kDa处条带加深,FMP/mFMPⅢ、FMP/mFMPⅣ条带均不明显。采用氨基酸自动分析技术对FMP/mFMP各超滤组分的游离氨基酸组成进行分析,结果表明:mFMP各超滤组分游离氨基酸总量均显着高于FMP(p<0.05),其中具有较强抗氧化活性的氨基酸(Phe、His、Tyr、Met)以及疏水性氨基酸(Ser、Thr)的含量变化显着(p<0.05)。4.采用Sephadex G-25凝胶色谱技术,对FMP/mFMP各组分进行分离纯化,得产物FMPS/mFMPS-1、FMPS/mFMPS-2;通过不同抗氧化体系评价FMPS/mFMPS-1、FMPS/mFMPS-2抗氧化活性。结果显示:FMPS/mFMPS-2各组分的抗氧化活性显着高于FMPS/mFMPS-1。进一步对FMPS/mFMPS-2氨基酸组成分析发现:mFMPⅢ-2较FMPⅢ-2含有大量抗氧化活性氨基酸Met、Tyr,mFMPSⅣ-2中仅含有Ser、Cys和Tyr叁种氨基酸。采用串联四极杆飞行时间质谱(Hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry,简称Q-TOF)对mFMPⅢ-2、mFMPSⅣ-2中主要抗氧化肽进行结构解析。结果显示:mFMPSⅣ-2中基本没有检测到小肽,从mFMPⅢ-2中筛选出四条抗氧化乳肽IAKYIPIQ、NQFLPYPYYAK、PAAVRSPAQILQWQ、VLPVPQKAVPYPQ。5.通过DPPH·体系,评价IAKYIPIQ、NQFLPYPYYAK、PAAVRSPAQILQWQ、VLPVPQKAVPYPQ的抗氧化活性;采用荧光光谱技术、傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)技术分别对各乳肽二级结构进行结构表征。结果显示:四条乳肽均具有很强的抗氧化活性,其中NQFLPYPYYAK的DPPH·清除率较低可能与其含有无规则卷曲结构有关。(本文来源于《浙江科技学院》期刊2017-06-08）
李轶,范大明,黄建联,张文海,李广[5]（2015）在《微生物谷氨酰胺转氨酶的优势结构及构效特征研究进展》一文中研究指出微生物谷氨酰胺转氨酶可催化蛋白质分子间和分子内发生共价交联反应,由于其具有非Ca2+依赖性,底物特异性低,催化速度快,生产成本低等优势,因此被广泛地应用于食品、医药及纺织等领域。本文介绍了微生物谷氨酰胺转氨酶的理化性质、构象优势,并对微生物谷氨酰胺转氨酶的底物肽序列特征,结构中与催化作用相关的氨基酸残基及其分子改造等前瞻性研究进行综述。(本文来源于《中国食品学报》期刊2015年07期）
苏小玫[6]（2015）在《微生物谷氨酰胺转氨酶生产菌株的筛选和诱变》一文中研究指出转谷氨酰胺酶广泛的运用在工业上、农业上、食品加工业上以及化妆品工业上,能催化蛋白质产生交联作用,转谷氨酰胺酶具有的强大的粘合作用,被誉为“21世纪超级粘合剂”。自然界中很多微生物都能发酵生产转谷氨酰胺酶,但是这些菌株产酶能力低、底物专一性差,这限制了其在工业中的运用。本研究致力于从自然界中筛选出产转谷氨酰酰胺酶的菌株,以此菌株作为原始菌株进行分子生物学改造,以期提高其产转谷氨酰酰胺酶的能力。本研究的主要研究内容如下：(1)从土壤中筛选产转谷氨酰胺酶的菌株,比较其产酶的能力大小,选择一株产酶能力较高的菌株作为原始菌株进行诱变。对原始菌株进行染色,显微镜下观察其形态结构,根据形态特征可初步断定为放线菌。提取原始菌株的基因组,以此基因组为模板进行16SrDNA菌种鉴定,判断原始菌株与茂源链霉菌的亲缘关系最接近。(2)以此菌株的基因组为模板扩增转谷氨酰胺酶编码基因,利用易错PCR技术对转谷氨酰胺酶编码基因进行随机突变。由于野生菌产转谷氨酰胺酶的产量低、酶活小、底物专一性差,希望通过易错PCR对转谷氨酰胺酶的编码基因进行改造,以期达到提高酶活的目的。(3)将易错PCR的获得的片段和未诱变的转谷氨酰胺酶编码基因利用分子生物学手段导入大肠杆菌进行过表达。茂源链霉菌发酵产酶的周期长,培养基复杂,而大肠杆菌具有易培养,生长快,遗传背景清楚等优点,将转谷氨酰胺酶基因导入大肠杆菌中进行过表达,可以达到降低生产成本、缩短发酵周期的目的。(4)将构建好的重组菌株进行发酵生产转谷氨酰胺酶,温度、转速、时间等发酵条件会影响微生物产转谷氨酰胺酶的能力,因此利用单因素法对大肠杆菌产酶的培养条件进行优化,寻找最优的生产条件,为探索大肠杆菌产转谷氨酰胺酶的发酵生产打下基础。(本文来源于《福建师范大学》期刊2015-06-01）
李洪波[7]（2014）在《黏玉米谷氨酰胺转氨酶微生物异源表达及其酶学性质研究》一文中研究指出谷氨酰胺转氨酶（protein-glutamine: amine γ-glutamyltransferase，简称TGase， EC2.3.2.13）是一种催化酰基转移反应的酶，它能催化谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基（氨基受体）和赖氨酸残基的ε-氨基或其它伯胺基（氨基供体）之间的酰基转移反应。TGase的这种催化作用改变了蛋白质的构象，实现了蛋白质分子内、分子间的交联，从而改善了蛋白质的功能性质。TGase广泛分布于自然界，但植物来源TGase的分离纯化困难、得率较低，限制了研究者对植物来源TGase的研究，将其进行异源表达是解决这一问题的有效途径。本论文分别利用大肠杆菌、毕赤酵母表达系统表达黏玉米来源TGase（TGZ），同时利用重迭区扩增基因拼接法对tgz基因进行密码子优化，从而达到TGZ的高效表达，并将纯化后TGZ与微生物来源TGase（MTG）的功能特性进行了比较研究。为了研究tgz基因中叶绿体转移肽对TGZ可溶性表达和产量的影响，分别将tgz和不含叶绿体转移肽的tgz基因转入大肠杆菌感受态细胞，诱导发现两种表达产物均以包涵体的形式存在，且表达量无明显差异，说明叶绿体转移肽对TGZ的可溶性表达和产量无显着影响。对重组TGZ的表达条件进行优化，结果表明：含有tgz基因的重组ArcticExpress E. coli菌株，于37℃在LB培养基中培养至OD600约为0.4时，加入0.2mmol/L IPTG，于16℃诱导16h后获得TGZ的最大表达。诱导表达后，用8mol/L尿素溶解包涵体，复性后用亲和层析法进行分离纯化，纯化后TGZ活性为0.34U/mg，产量达到1.41mg/L。为了获得TGZ的可溶性表达，将tgz基因在真核表达宿主毕赤酵母中进行诱导表达。首先在不改变TGZ氨基酸序列的基础上，根据毕赤酵母密码子的偏好性，对tgz基因进行密码子优化。由于tgz基因含有15个重复序列，且重复序列个数对TGZ活性无影响，为了正确合成tgz基因，我们只保留一个重复序列，并把tgz分为A、B和C叁个亚片段，利用重迭区扩增基因拼接法对优化后tgz基因（tgzo）进行合成。与tgz基因相比，tgzo基因共改变了289个核苷酸，涉及239个氨基酸，G+C含量从53.1%下降至40.3%，与毕赤酵母的G+C含量相符。同时为了便于后续的分离纯化，设计的tgzo基因带有组氨酸标签。将tgz和tgzo基因分别与载体pPIC9K连接，构建重组表达载体pPIC9K-tgz和pPIC9K-tgzo。将两种重组载体单酶切后通过电击转化入毕赤酵母GS115感受态细胞，经表型、G418抗性及菌落PCR法筛选出His+Mut+表型的高拷贝重组菌株G-tgz和G-tgzo。将两种重组菌株分别进行甲醇诱导表达，其中G-tgz通过凝胶过滤层析和离子交换树脂进行分离纯化，纯化后TGZ的比活达到0.32U/mg，产量达到1.44mg/L。G-tgzo则通过亲和层析法进行分离纯化，纯化后TGZo的比活达到0.89U/mg，产量达到4.4mg/L。密码子优化后，TGZo的酶活分别是大肠杆菌表达TGZ的2.6倍，毕赤酵母表达TGZ的2.8倍，产量分别是大肠杆菌和毕赤酵母表达TGZ的3.1倍，所以通过密码子优化设计，成功的提高了TGZ的活性和产量。为了提高重组子G-tgzo的表达量，本实验对诱导培养基、甲醇浓度、诱导时间、装液量、诱导阶段pH、诱导前菌体生物量、油酸及PMT1进行了单因素优化，确定了各因素的最佳值。采用Plackett-Burman设计及响应面分析法确定了最佳的表达条件：重组子G-tgzo用37mL pH6.5的改良BMMY培养基（含有0.006%PMT1和0.07%油酸）重悬至OD600为2时，于28℃诱导96h，每24h时补加100%甲醇，使其终浓度为1.31%，同时补加0.006%PMT1和0.07%油酸。在该条件下TGZo的活性达到1078mU/mL，比优化前提高了1.8倍。利用亲和层析法分离纯化TGZo，产量达到7.6mg/L，是优化前的1.73倍。采用荧光测定法对不同来源TGase的酶学性质进行研究。结果表明，重组酶对酪蛋白的亲和力低于MTG，TGZo的最适反应温度为37℃，低于TGZe和MTG的45℃，但是重组酶的温度稳定范围高于MTG，为4~60℃。重组酶的最适反应pH为8.0，高于MTG的7.0，且在偏碱性条件下重组酶的稳定性更好。不同金属离子对酶活性有一定的影响，其中低浓度的Ca2+对重组酶的促进作用最强。两种酶对不同底物蛋白的交联作用研究表明，TGZo和MTG对酪蛋白和大豆分离蛋白有显着的交联作用，其中TGZo对大豆分离蛋白的交联作用高于MTG，但是TGZo对乳清蛋白无交联作用。将重组TGZo用于酸奶发酵，发现它能提高酸奶的质构参数、表观黏度，降低酸奶的乳清析出量，但是TGZo的酶学性质导致了其对酸奶品质的改善作用低于MTG。同时研究了TGZo对不同脂肪含量酸奶样品的改善作用，发现脂肪对酶的催化作用影响不大。这些结果为植物来源TGase在食品工业中的应用奠定了基础。(本文来源于《哈尔滨工业大学》期刊2014-07-01）
叶程,邵坤彦,王亚南,覃桂,代风娇[8]（2013）在《重迭延伸PCR法定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶基因》一文中研究指出目的通过重迭延伸PCR法,定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶(Microbial transglutaminase,MTG)基因。方法根据GenBank中登录的Streptomyces sp.H197基因中MTG序列及重迭延伸PCR定点突变技术的原理,利用DNA-MAN5.0软件设计引物,以提取的Streptomyces sp.H197基因组DNA为模板,PCR扩增MTG基因,以扩增的MTG基因片段为模板,采用重迭延伸PCR技术对一个位点进行定点突变,胶回收PCR产物,与克隆载体pMD19-T连接后,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒,经PCR及单、双酶切鉴定,并测序。结果重迭延伸PCR产物可见含有酶切位点和突变位点的特异性片段;重组质粒pMD19-T-MTG经PCR及单、双酶切鉴定,证明构建正确;测序结果表明,与野生型序列比对,仅有一个碱基发生改变,即第773位腺嘌呤突变为胞嘧啶,突变位点与预期一致,实现了目标位点的定点突变。结论重迭延伸PCR法对MTG基因序列预定位点突变成功,证明阳性克隆子含突变位点,为下阶段突变型功能表达奠定基础。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2013年05期）
李洪波,张兰威,崔艳华,张莉丽[9]（2013）在《微生物源谷氨酰胺转氨酶基因工程菌株的研究进展》一文中研究指出微生物源谷氨酰胺转氨酶(mTCase)是一种催化酰基转移反应的酶,它可以催化蛋白质分子内、分子间的交联,进行蛋白质翻译后修饰,从而改变蛋白质的功能特性,在食品、生物医学、纺织等领域有着广泛的应用前景.本文综述了构建产微生物源谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌株的相关技术、研究进展,并对未来研究方向提出建议。(本文来源于《食品工业科技》期刊2013年17期）
王齐,宋小平,王雅洁,蔡晶晶,李光伟[10]（2013）在《微生物发酵生产谷氨酰胺转氨酶的研究进展》一文中研究指出谷氨酰胺转氨酶(TG)是一种催化酰基转移反应的转移酶,它可使蛋白分子间和分子内产生共价交联,从而改变蛋白的功能特性,在食品工业具有重要的潜在应用价值。为了实现工业化生产TG目的,文中综述了近年来国内外在谷氨酰胺转氨酶菌株的选育、发酵条件的优化和分离提纯等方面的进展情况。(本文来源于《齐齐哈尔医学院学报》期刊2013年05期）
微生物谷氨酰胺转氨酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
微生物源谷氨酰胺转氨酶(Microbial Transglutaminase,MTG)在农产品加工产业中是一种非常重要的酶制剂,广泛应用于乳品、海鲜、肉类、面点、豆制品、可食用膜等多种产品的加工生产中。目前,MTG来源于天然菌种的发酵或MTG基因在细菌、酵母菌中的重组表达。天然菌株发酵可以直接获得有活性的酶,但是发酵周期长且工艺流程复杂;重组菌株发酵周期短、成分简单,但活性表达需要选择适合的表达策略,否则容易形成包涵体或无法获得有活性产物。为了解决以上问题,本研究以实验室前期筛选得到的两株具有MTG活性的放线菌菌株107.3和109.5为研究对象,从菌种选育、下游处理条件摸索、异源表达机制探索、酶分子改造及特性表征等几方面着手,获得主要研究结果如下:MTG产生菌的系统发育研究。经过16S rDNA序列测定和系统发育树的构建以及形态观察,确定菌株107.3为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)近似种,吸水链霉菌是链霉菌属中目前已知的MTG高产菌种之一;菌株109.5为嗜角蛋白拟无枝酸菌(Amycolatopsis keratinophila)的近似种,其MTG活性尚未见报道。菌株109.5的诱变育种以及MTG的浓缩初提。确定了菌株109.5的最适种子培养基为葡萄糖10.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,酵母粉10.0 g/L,MgSO_4·7H_2O 0.5 g/L,K_2HPO_4 0.7 g/L,KH_2PO_4 0.3 g/L,pH7.0;发酵条件为30℃,200 r/min种子培养30h后,以0.5%接种量转接发酵培养基,发酵70 h。先后采用紫外线诱变、羟胺诱变和多功能等离子体诱变系统(MPMS,multifunctional plasma mutagenesis system)对菌株109.5进行了诱变,并通过正交试验优化发酵培养基为葡萄糖25 g/L,蛋白胨35 g/L,酵母粉1 g/L,NaCl 2 g/L,pH 7.2;使突变株PM-66的酶活力达到1.421±0.009 U/mL,比野生型菌株提高了3.55倍。建立了基于Image J图像灰度分析的固体培养基半定量筛选突变株的方法,实现了突变株的高通量筛选,也为其它同样不便于进行液体比色的菌株筛选提供了新思路。采用双水相萃取(ATPE,aqueous two phase extracton)的方法对突变株PM-66发酵液中的MTG进行了浓缩初提,确定了最适双水相系统ATPS(aqueous two phase system)为26%PEG1000-19%(NH_4)_2SO_4-5%NaCl,萃取体系pH值为6.0,萃取的产率为86.51%,比酶活0.83U/mg,萃取后向PEG相中添加9%的(NH_4)_2SO_4可以获得酶的沉淀。将双水相萃取法应用于拟无枝酸菌发酵液MTG的初提尚未见报道。菌株107.3的MTG基因克隆表达与分子改造。首先,菌株107.3 MTG基因被克隆并转化到了大肠杆菌(Escherichia coli)中,在IPTG(异丙基硫代半乳糖苷,isopropylβ-D-thiogalactoside)的诱导下,重组大肠杆菌的酶活力为0.372±0.008U/mL;镍离子亲和层析纯化后,重组MTG最适温度35℃,最适pH7;Na~+、K~+对酶活有少许促进作用,Zn~(2+)、Cu~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(2+)、Mn~(2+)则对酶活有不同程度的抑制作用,Ca~(2+)对酶活几乎没有影响。其次,构建并成功表达了14种菌株107.3 MTG的不同形式突变体,多数突变体的的催化活性或稳定性优于未突变酶,Y133F突变体的比活力最高;在Y133位点进一步构建并表达了8种氨基酸替换突变体,其中6种突变体的比活力都高于未突变酶。由此说明酶分子改造的有益突变位点主要集中于分子N端和靠近酶活性裂缝的周围区域;Y133是吸水链霉菌MTG分子中的有益突变位点。最后,为了研究MTG前导片段的功能,吸水链霉菌MTG基因与茂源链霉菌(Streptomyces mobaraense)MTG基因分别被转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株X33中,采用了前导片段与成熟酶分开或融合两种表达形式。表达融合吸水链霉菌MTG前导片段与成熟酶的重组酵母菌株6711在1.5%甲醇诱导下,30℃发酵96 h,酶活力为0.200±0.005 U/mL。单独表达前导片段与成熟酶的重组菌株均未检测到酶活。说明前导片段与成熟酶分别表达不能使成熟酶进行正确的折迭,只有在正确切割的前提下,前导片段才可以帮助成熟酶折迭为正确的空间结构,表现出活性。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
微生物谷氨酰胺转氨酶论文参考文献
[1].程孝中,赵鑫锐,洪皓飞,杨敏,周志昉.微生物谷胺酰胺转氨酶在蛋白质修饰中的应用[J].食品与生物技术学报.2019
[2].石楠.微生物谷氨酰胺转氨酶的发酵与异源表达研究[D].河北农业大学.2019
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