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【摘要】经络实质的研究取得了丰富的成果。以肥大细胞为代表的结缔组织细胞、神经系统、结缔组织间质在经络系统中起到重要的作用。然而循经感传等经络现象只存在于活体动物，受技术手段的局限，无法对其进行实时、原位的观察，所以经络的实质一直缺乏直接证据。活体光学显微成像技术能够对存活组织和动物进行实时原位的观察，已在生物医学领域得到广泛的应用。新型荧光探针的开发和光纤式双光子内窥显微镜技术的发展，有望给经络实质的研究带来突破。
【关键词】双光子荧光显微成像；活体光学成像；经络实质；循经感传；肥大细胞；结缔组织
【中图分类号】R241【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2018）23-0345-02
经络学说是中医学理论基础的重要部分，是针灸疗法的理论基础，起着重要的指导辨证治疗的作用。国内外大量研究，证实了其感传性、声电热等理化特性，论证了其确实存在性。然而经络的实质到底是什么却一直缺乏直接的证据。荧光探针和新型显微镜技术的发实现了生理病理过程中关键生物学过程如活体内细胞、亚细胞结构、分子间互作的实时、可视化观察。本文基于经络实质部分证据，介绍荧光探针结合活体光学显微成像技术，探讨该技术应用于经络实质研究的可行性及发展展望。
1.经络实质的研究
《灵枢·九针十二原》有载：“刺之要，气至而有效，效之信，若风吹云，明乎若见苍天。”，说明“气至”的经络现象作为经络实质研究的切入点有重要价值。对经络实质，许金森[1]认为要抓住经脉的特异性循行路线及其与调控人体机能的关系这一最核心的内容，主要特点就是“循经”。
林继海等[2]通过免疫组化方法观察到人体截肢标本一些主要穴位肥大细胞（MC，MastCell）数量较非穴区多。陈良为等[3]观察到MC与神经末梢间特殊的形态学联系，认为可能是引起循经感传的结构基础。邓云平[4]等观察发现针刺后大鼠足阳明胃经穴区MC数目明显增加，部分MC形态发生变化，可能与MC脱颗粒及趋化游走后形态改变有关。
Langevin等[5]发现，大部分穴位和经脉线与结缔组织有对应关系。郭义等[6]发现针刺家兔经穴后Ca2+浓度明显高于非穴区，且后Ca2+有沿经线重新分布的趋势。丁光宏等[7]的模型得到了组织液定向流动与局部血液流动、胶原纤维多孔率渗透率等变量间的关系，佐证MC在循经感传现象中起重要作用。
缺失肢体的幻肢循经感传现象、胸壁组织离断下循经感传跨越切口传导等[8]，提示经络实质应有中枢神经的参与。郑翠红[9]等发现缝隙连接蛋白Cx43在穴区和经脉沿线的高表达，并且针刺能提高其表达，抑制该蛋白表达能部分抵消针刺的治疗作用，于是提出的猜想：经络系统传输信号由缝隙连接蛋白组成通道，神经递质、钙离子充当信使，同时大脑对信号有整合作用。
2.活体光学显微成像技术简介
活体光学显微成像技术目前已有广泛应用，以观察存活组织或存活动物体内免疫细胞与肿瘤细胞互作、神经元活动等，分子层面用于观察活细胞内分子构象改变、分子互作、分子示踪与定量检测等。2014年诺贝尔化学奖颁给了EricBetzig，StefanW.Hell和WilliamE.Moerner，表彰了其在超高分辨率荧光显微镜领域的贡献，也是对荧光显微成像技术的再次肯定。
2.1荧光探针
根据荧光基团的不同，可分为有机小分子荧光探针、荧光蛋白探针、纳米材料探针等。常用的有通过病毒转染和转基因在神经元内表达以荧光钙调蛋白为代表的基因编码类钙指示剂（GECI，geneticallyencodedcalciumindicator（可以对神经元的活动和结构变化进行观测。荧光探针依据不同的信号转换机理达到不同的检测目的，主要有光致电子转移（PET，photo-inducedelectrontransfer）、分子内电荷转（ICT，intramolecularchargetransfer）、荧光共振能量转移（FRET，fluorescenceresonanceenergytransfer）、跨键能量转移（TBET，through-bondenergytransfer）。基于FRET原理的探针因其工作原理对荧光基团间距离有着严格的要求，常作为蛋白质互作、蛋白动力学研究工具，如利用基于FRET原理的探针，Ma等[10]观察了T细胞受体的蛋白动力学变化。
当满足一定条件下，荧光分子可以同时吸收两个能量较小波长较长的光子，辐射出比激发光光子能量高的光子，称为双光子荧光效应，其发生概率极小，需要极高峰值功率的飞秒激光作为光源。双光子荧光探针采用能量较低的近红外激发、有更深的组织穿透性、对组织的光损伤较小、避免了组织自发荧光的干扰等。
2.2新型显微技术
为了对体层深部的组织进行成像，需要激光共聚焦显微术、双光子显微术、光纤式内窥镜技术等技术的互相结合，其在脑科学研究的运用给经络实质的研究带来启发。
2017年中国科学十大进展报道了北京大学程和平和陈良怡研究组等研制的微型化佩戴式双光子荧光显微镜，其以光纤作为输送激光的点光源，也作为分散杂散光的探测器作用，虽然由于装置重量限制限制未采用共聚焦光路不能对z轴进行变焦，其仅有的2.2克重量，能在小鼠悬尾、跳台、社交等自然行为条件下，记录其大脑神经元和神经突触活动的高速高分辨图像[11]。对于经络实质研究，短期内的需求可能并没有脑科学这么严苛，比如观察部位可以不是颅内，活体观察的组织完整性要求较低，实验动物也不必是自由活动状态，故而光纤内窥镜结合双光子荧光显微技术在经络实质的研究中应用的十分具有可行性及发展前景。
3.结论
寻找经络实质的切入点在于对循经感传现象的研究。循经感传现象的特殊性，需要实时原位的进行活体动物显微成像。其中肥大细胞和神经元间通过神经递质或者及细胞结构联系间的互作可能是十分重要的环节。光纤内窥镜结合双光子荧光显微技术在经络实质的研究中十分有前景。随着针对性荧光探针和高时空分辨率的双光子显微镜性能的不断开发，经络实质的研究将迎来新的机遇。
【参考文献】
[1]许金森.经络研究的现状与展望[J].中华中医药杂志,2016,31(11):4355-4360.
[2]林继海,任知春,阎爱华,吴景兰,黎君若,常庚申.人体皮肤经穴处结组织中肥大细胞的形态学和免疫组化的观察[J].河南中医,1989,9(01):2-6.
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[9]薛崇成.不是否定是肯定[N].中国中医药报,2005/05/12.
[10]郑翠红,张明敏,黄光英.缝隙连接细胞通讯的研究方法及其在经络研究中的可能运用[J].浙江中医杂志,2006(02):69-72.
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[12]Zong,W.,Wu,R.,Li,M.,Hu,Y.,Li,Y.,Li,J.,Cheng,H.(2017).Fasthigh-resolutionminiaturetwo-photonmicroscopyforbrainimaginginfreelybehavingmice.NatMethods,14(7),713-719.doi:10.1038/nmeth.4305.