导读:本文包含了体外分子进化技术论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:蛋白质工程,葡萄糖氧化酶,热稳定性,催化效率
体外分子进化技术论文文献综述
涂涛,蒋肖,黄火清,罗会颖,姚斌[1]（2019）在《基于体外分子进化技术提高Aspergillus niger来源葡萄糖氧化酶的热稳定性和催化效率研究》一文中研究指出葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase, Gox, EC 1.1.3.4)是一种黄素蛋白,黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)与酶分子非共价结合。在催化反应过程中,Gox利用FAD作为氧化还原反应的载体,以分子氧为电子受体,将β-D-葡萄糖催化氧化成葡萄糖酸内酯和过氧化氢。基于该催化反应的特点,Gox被广泛应用于化学、食品、临床诊断、生物制药等领域。本研究中,以Aspergillus niger来源的葡萄糖氧化酶GoxA为研究对象,利用根据Gox颜色反应原理建立的毕赤酵母高表达菌株高通量快速筛选方法,采用随机突变和理性设计的策略对其热稳定性和催化效率进行分子进化,获得了一株热稳定性和催化效率均显着提高的突变体M8。突变体M8的最适温度与野生型GoxA保持一致,为40℃;在70℃处理10 min后的剩余酶活由野生型的14%提高到90%;在80℃处理2 min后的剩余酶活由野生型的5%提高到78%;催化效率较野生型提高了1.7倍。改良后的突变体M8其综合性能要明显优越于目前报道的同类酶,完全满足于应用成产的需求。分子动力学模拟(Molecular dynamics simulation)分析结果表明,每个突变位点在热稳定性和催化效率提高上的分子机理各不相同。本研究一方面为Gox结构与功能关系探讨提供了有用信息,更为扩展Gox的实际应用提供了有用素材。(本文来源于《第十二届中国酶工程学术研讨会论文摘要集》期刊2019-08-08）
陈磊,陈晟,吴敬,吴丹[2]（2018）在《基于体外分子进化技术提高弯曲芽孢杆菌CCTCC 2015368 β-淀粉酶的热稳定性》一文中研究指出运用体外分子进化技术易错PCR方法,高通量筛选热稳定性提高的弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus CCTCC2015368β-淀粉酶突变体。利用LB琼脂淀粉板显色、96-孔板DNS法测酶活和酶标仪检测等,最终筛选到了一株热稳定性显着提高的突变体D476N。野生型和突变体D476N分别纯化后,酶学性质测定表明:突变体D476N的最适pH为6.5,与野生型相比降低了0.5。突变体D476N和野生型的最适温度均为55℃,突变体D476N在55℃下的半衰期为35 min,比野生型提高了95%。突变体D476N的T_(50)值比野生型提高4℃。突变体D476N的K_m值为97.98μmol/L,是野生型(85.86μmol/L)1.14倍;突变体稳定性提高的同时,催化活力相对于野生型有略微下降。通过SWISS-MODEL同源模拟野生型和突变体D476N的叁维结构,并通过PyMol软件分析,发现突变后的氨基酸残基Asn476位于蛋白质表面的loop环上,通过MOE软件计算,D476N的分子自由能(ΔG)为106.01kcal/mol,比野生酶降低10.3%,这一结果与蛋白质分子自由能和热稳定性呈负相关的理论相符。(本文来源于《生物工程学报》期刊2018年02期）
乔春霞,罗龙龙,吕明,林周,李新颖[3]（2012）在《利用表位特异性的靶向抗体库技术进行抗体的体外分子进化》一文中研究指出背景:多数情况下,抗体需要进行改造以增强其生物学效应。传统的抗体体外分子进化的方法往往需要构建库容量足够大的抗体库,工作量大,成功率低,容易发生表位漂移从而丧失其生物学功能。目的:本研究基于计算机辅助分析方法,在保证表位不发生漂移的前提下,建立了利用表位特异性的靶向sc Fv抗体库技术平台,用于对已有抗体进行体外分子进化;为了验证这一技术平台的可行性,我们选择抗Her2抗体MIL5进行亲和力成熟改造。方法:利用同源模建方法搭建MIL5的叁维结构,利用分子对接、分子动力学模拟以及力学优化等手段,搭建了抗原-抗体的复合物模型,获得了抗体结合Her2的关键氨基酸残基信息;根据抗体关键氨基酸残基的信息,在保证抗原表位不发生漂移的前提下,利用计算机辅助设计平台进行抗体CDR区的虚拟突变和理论评价,获得亲和力提高的突变抗体集合,形成一个理论库容较小且抗原表位恒定的MIL5靶向抗体库;进一步,利用分子生物学手段建立噬菌体抗体库,并最终筛选出一株亲和力提高的新抗体M5sc Fv_ph。结果:体外实验表明新抗体M5sc Fv_ph的亲和力比母本抗体MIL5_sc Fv高,且二者所识别的抗原表位相同;体内试验表明,在卵巢癌细胞系SKOV3的移植瘤小鼠模型中,该抗体保留了母本抗体抑制肿瘤生长的生物学活性。结论:基于计算机辅助分析和虚拟设计方法,我们建立了表位特异性的靶向抗体库技术平台,用于抗体体外分子进化。由于在设计抗体库之初,便保证了库中的抗体集合所识别的抗原表位是恒定的,因此克服了传统方法中抗原表位发生漂移导致生物学活性丧失的缺点。这一技术所需建立的抗体库库容小、功能表位特异、成功率高,能够快速、高效的对已有抗体进行改造,提高抗体效应,具有广阔的应用前景。(本文来源于《第八届全国免疫学学术大会论文集》期刊2012-10-18）
秦久福,高威威,李崎,李永仙,郑飞云[4]（2010）在《通过体外分子进化技术提高淀粉液化芽胞杆菌BS5582 β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性》一文中研究指出应用基于易错PCR随机突变的体外分子进化技术,来提高淀粉液化芽胞杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的热稳定性。利用建立的基于96微孔板高通量筛选模型,经过两轮定向进化与高通量筛选,共筛选得到3株热稳定性明显提高的突变体2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03。将野生型β-葡聚糖酶基因和热稳定性提高的突变基因的高效表达产物经镍亲和层析柱纯化后,酶学性质测定表明突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的T50值分别比野生酶(53℃)提高2.2℃、5.5℃和3.5℃。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03在60℃下的半衰期t1/2,60℃(min)分别比野生酶(18min)提高4min、13min和17min。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Vmax值为286μmol/(mg·min)、304μmol/(mg·min)和279μmol/(mg·min),分别比野生型下降8.3%、2.6%和10.6%。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Km值分别为6.76mg/mL、6.19μmg/mL和6.84mg/mL,与野生型(6.29mg/mL)基本相同。序列分析表明,3个突变体共发生7个氨基酸替代:2-JF-01(N36S,G213R)、2-JF-02(C86R,S115I,N150G)和2-JF-03(E156V,K105R)。同源建模表明,7个氨基酸替代中5个位于蛋白质表面或表面洞穴中,42.8%的替代氨基酸是精氨酸,也表明精氨酸在提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性中起重要的作用。(本文来源于《生物工程学报》期刊2010年09期）
秦久福[5]（2010）在《通过体外分子进化技术提高淀粉液化芽孢杆菌BS5582β-1，3-1，4-葡聚糖酶热稳定性的研究》一文中研究指出β-1,3-1,4-葡聚糖属植物细胞壁的结构性非淀粉多糖,是以混合(1→3)和(1→4)β-糖苷键连接形成的D型葡萄糖聚合物,在大麦整粒和胚乳中含量高达4. 0 %-8. 0 %。β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)能有效水解β-1,3-1,4-葡聚糖,主要产物为叁糖(3-O-β-D-纤维二糖-D-葡萄糖)和四糖(3-O-β-D-纤维叁糖-D-葡萄糖)。在啤酒工业中,β-葡聚糖酶可降低麦汁粘度,提高麦汁滤速及得率,改善啤酒风味,保持成品酒稳定性。目前市售β-葡聚糖酶多为用于饲料加工的粗酶制剂,酶热稳定性较差。啤酒工业使用复合酶中的β-葡聚糖酶温度稳定性范围也较窄,从而限制了啤酒糖化工艺和啤酒工业的发展。因此,为适应行业发展需要,迫切需要开发耐高温的β-葡聚糖酶,提高我国啤酒产业的国际竞争力。本研究首先应用基于易错PCR随机突变的体外定向进化技术,来提高淀粉液化芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的热稳定性。利用建立的基于96微孔板高通量筛选模型,经过两轮定向进化与高通量筛选,共筛选得到叁株热稳定性明显提高突变体2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03。将野生型β-葡聚糖酶基因和热稳定性提高的突变基因的高效表达产物经镍亲和层析柱纯化后,酶学性质测定表明突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的T50值分别比野生酶(53℃)提高2.2℃、5.5℃和3.5℃。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03在60℃下的半衰期t1/2,60℃(min)分别比野生酶(18 min)提高4 min,13 min和17 min。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Vmax值为286μmol/(mg·min),304μmol/(mg·min)和279μmol/(mg·min),分别比野生型下降8.3%,2.6%和10.6%。突变酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Km值分别为6.76 mg/mL、6.19μmg/mL和6.84 mg/mL,与野生型(6.29 mg/mL)基本相同。序列分析表明,叁个突变体共发生7个氨基酸替代:2-JF-01(N36S,G213R),2-JF-02(C86R,S115I,N150G)和2-JF-03(E156V,K105R)。同源建模表明,7个氨基酸替代中5个位于蛋白质表面或表面洞穴中,42.8%的替代氨基酸是精氨酸,表明精氨酸在提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性中起重要的作用。本研究基于PyMOL软件,将定向进化得到的多株突变体所包含的氨基酸突变,逐一进行单点突变,并借助foldX软件对各个含有单一突变位点的酶蛋白变种逐一进行分子修复和分子自由能(△G)计算,根据分子自由能与热稳定性负相关的关系,七个氨基酸突变中,野生型β-葡聚糖酶第156位由谷氨酸突变为缬氨酸后,酶蛋白分子的自由能由野生型的15.80 kcal/moL下降至14.28 kcal/moL,下降9.6%,在所有突变中下降幅度最大。本研究基于四引物PCR介导的定点突变技术,将野生型β-葡聚糖酶156位的谷氨酸突变为缬氨酸。热稳定性实验结果显示,定点突变体较野生型β-葡聚糖酶分子的半失活温度由52.5℃提高至56.4℃,提高了7.4%。基于SWISS-MODEL数据,对野生型及定点突变体进行蛋白叁维结构同源模拟,结果由PROCHECK验证。酶蛋白分子中156位谷氨酸突变为缬氨酸后,由于谷氨酸是亲水性残基,缬氨酸疏水性较强,可能是造成酶蛋白热稳定性提高的主要原因。(本文来源于《江南大学》期刊2010-06-01）
熊爱生,姚泉洪,章镇,彭日荷,庄静[6]（2005）在《基因体外定向分子进化技术在农业中应用的研究进展》一文中研究指出农业生物工程在农业生产中发挥着重要的作用,已经在除草剂抗性,抗虫,抗病和饲料添加剂 等方面取得了良好的成绩。体外定向分子进化技术是改造基因的有效手段,通常可以用来提高酶的比 活,改变酶动力学特征,产生新的底物特异性,产生新的产物和改变酶的最适条件。该技术已经成功的 应用在农业的各个领域。主要从除草剂抗性,抗虫,抗病和饲料添加剂4个方面对基因体外定向分子 进化技术在农业中的应用作一综述。(本文来源于《中国农学通报》期刊2005年12期）
熊爱生,姚泉洪,彭日荷,陈建民,李贤[7]（2002）在《通过体外分子进化技术获得耐高温β-葡萄糖苷酸酶的研究》一文中研究指出采用高保真聚合酶从质粒pBI12 1中扩增出 1.8kb的专一条带 ,克隆入pBluescriptSK载体 ,测序结果显示与报道一致。该克隆GUS基因被用作对照 ,再以此为模板 ,通过DNA重排技术 ,经DNaseⅠ降解 ,PrimerlessPCR ,PrimerPCR重新得到大量的突变GUS基因。这些突变的GUS基因构建入原核表达载体pG2 5 1中 ,电击转化大肠杆菌菌株DH5α ,构建GUS基因突变体库 ,经过 3轮的重排、筛选得到 80℃处理 30分钟仍显示较高活性的耐高温GUS基因GUS3 3,基因测序显示 ,GUS3 3与GUS基因之间的同源性为 99.2 % ,核苷酸序列推导的氨基酸序列显示 ,11个氨基酸发生了突变 ,80 %的突变集中在蛋白的C端。Tm值GUS3 3为 80℃ ,GUS ck为 5 5℃ ,提高了 2 5℃ ,GUS3 3β -葡萄糖苷酸酶热稳定性有了很大的提高 ,GUS3 3酶的最适温度明显提高。(本文来源于《遗传学报》期刊2002年11期）
张用书,赵志虎,马清钧[8]（1999）在《用于蛋白质体外分子进化研究的DNA随机突变技术》一文中研究指出蛋白质体外分子进化是模拟自然的进化过程，利用基因随机突变和定向筛选（选择）技术，以获得具有预期新功能的突变体分子。虽然体外进化近几年才产生，但已成为医药和工业领域中筛选具有特殊催化性质的酶的最重要的方法之一。ＤＮＡ随机突变技术是蛋白质体外分子进化研究的基础，本文将对几种最重要的突变方法：倾向错误的ＰＣＲ、ＤＮＡ重排、模板交错延伸反应和随机延伸突变的原理和应用等加以介绍。(本文来源于《生物技术通讯》期刊1999年04期）
体外分子进化技术论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
运用体外分子进化技术易错PCR方法,高通量筛选热稳定性提高的弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus CCTCC2015368β-淀粉酶突变体。利用LB琼脂淀粉板显色、96-孔板DNS法测酶活和酶标仪检测等,最终筛选到了一株热稳定性显着提高的突变体D476N。野生型和突变体D476N分别纯化后,酶学性质测定表明:突变体D476N的最适pH为6.5,与野生型相比降低了0.5。突变体D476N和野生型的最适温度均为55℃,突变体D476N在55℃下的半衰期为35 min,比野生型提高了95%。突变体D476N的T_(50)值比野生型提高4℃。突变体D476N的K_m值为97.98μmol/L,是野生型(85.86μmol/L)1.14倍;突变体稳定性提高的同时,催化活力相对于野生型有略微下降。通过SWISS-MODEL同源模拟野生型和突变体D476N的叁维结构,并通过PyMol软件分析,发现突变后的氨基酸残基Asn476位于蛋白质表面的loop环上,通过MOE软件计算,D476N的分子自由能(ΔG)为106.01kcal/mol,比野生酶降低10.3%,这一结果与蛋白质分子自由能和热稳定性呈负相关的理论相符。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
体外分子进化技术论文参考文献
[1].涂涛,蒋肖,黄火清,罗会颖,姚斌.基于体外分子进化技术提高Aspergillusniger来源葡萄糖氧化酶的热稳定性和催化效率研究[C].第十二届中国酶工程学术研讨会论文摘要集.2019
[2].陈磊,陈晟,吴敬,吴丹.基于体外分子进化技术提高弯曲芽孢杆菌CCTCC2015368β-淀粉酶的热稳定性[J].生物工程学报.2018
[3].乔春霞,罗龙龙,吕明,林周,李新颖.利用表位特异性的靶向抗体库技术进行抗体的体外分子进化[C].第八届全国免疫学学术大会论文集.2012
[4].秦久福,高威威,李崎,李永仙,郑飞云.通过体外分子进化技术提高淀粉液化芽胞杆菌BS5582β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性[J].生物工程学报.2010
[5].秦久福.通过体外分子进化技术提高淀粉液化芽孢杆菌BS5582β-1，3-1，4-葡聚糖酶热稳定性的研究[D].江南大学.2010
[6].熊爱生,姚泉洪,章镇,彭日荷,庄静.基因体外定向分子进化技术在农业中应用的研究进展[J].中国农学通报.2005
[7].熊爱生,姚泉洪,彭日荷,陈建民,李贤.通过体外分子进化技术获得耐高温β-葡萄糖苷酸酶的研究[J].遗传学报.2002
[8].张用书,赵志虎,马清钧.用于蛋白质体外分子进化研究的DNA随机突变技术[J].生物技术通讯.1999