导读:本文包含了双链分子论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:转基因作物,叁螺旋DNA分子信标,苏云金芽孢杆菌,灵敏检测
双链分子论文文献综述
谭效贝[1]（2019）在《荧光修饰双链DNA偶联单链DNA的叁螺旋分子信标检测转Bt基因》一文中研究指出当今世界,科技发展日新月异,科技的进步带动现代生物技术的大发展,其中转基因技术又被称之为人类历史上具有飞跃性进步的第二次“绿色革命”。转基因技术就是在作物原有基因的基础上引入外源基因,改造其遗传物质,使其营养价值、生物性状更好的满足人类的需要。利用转基因技术把苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Bt)转入到小麦体内,目的主要是增加小麦的抗虫性,其中苏云金芽孢杆菌的δ-内毒素基因是小麦获得抗虫性能的最主要原因。但是转基因技术也存在一定的生物安全性问题,所以世界各国不断加强对转基因作物的监管力度与检测手段的研发。本论文应用标记荧光猝灭基团(BHQ-1)的单链DNA(triplex-forming oligonucleotides TFO)和两端同时标记荧光基团(FAM-6)的单链DNA(Single DNA S-DNA)构建叁螺旋DNA分子信标,然后目标DNA单链(Target DNA T-DNA)和叁螺旋DNA分子信标接触,导致叁螺旋结构发生改变,从而引起荧光信号强度的改变,实现对转基因作物的灵敏检测。主要内容如下所示:弱酸性环境下自组装叁螺旋分子信标用于转基因作物中的目标基因苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Bt)灵敏检测;最近几年,叁螺旋分子信标被广泛用于转基因作物的灵敏检测,其中包括T·A?T和C~+·G?C(?是Watson-Crick氢键,·是Hoogsteen氢键)等叁螺旋结构在内的分子信标是最为常用的。当叁螺旋分子信标形成时,含有嘧啶链(胸腺嘧啶T和胞嘧啶C的)的单链DNA(triplex-forming oligonucleotides,TFO)需要在弱酸性环境下首先质子化后才能和双链DNA的嘌呤链(A和G)结合形成稳定的叁螺旋分子信标,其中含有胞嘧啶C的DNA单链(TFO)质子化后,带正电的胞嘧啶C~+与带负电的DNA双链由于静电作用,能够起到稳定叁螺旋分子信标的作用。目标DNA单链加入后可以破坏叁螺旋信标的结构,导致荧光强度的改变,实现对转基因作物的灵敏检测,检测下限达到1 pM。中性环境下自组装叁螺旋分子信标用于转基因作物目标基因苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Bt)灵敏检测;为了扩展叁螺旋分子信标的应用范围,在本论文中人为加入Ag~+用来增加叁螺旋分子信标在中性环境下的稳定性。Ag~+不仅能够特异性识别C·G?C的叁螺旋结构,而且还可以把C~+·G?C中的H~+置换成Ag~+C·G?C新的叁螺旋结构,这样Ag~+的加入就极大的增加叁螺旋分子信标的应用范围。目标DNA单链加入后可以破坏叁螺旋信标的结构,导致荧光强度的改变,实现对转基因作物的灵敏检测,检测下限达到0.1 pM。(本文来源于《山东农业大学》期刊2019-03-27）
刘洋[2]（2018）在《双链DNA荧光探针同时用于细胞表面分子的荧光成像和数目定量》一文中研究指出在生物实验中常常需要对细胞表面或内部的分子进行染色成像以及对分子的含量进行测定。通常这两部分实验需要两套系统分开进行,例如,通过免疫荧光探针和荧光显微镜结合的方法进行细胞分子成像;而分子含量的测定通常要经过目标分子的分离、纯化后再进行BCA、ELISA等测定,不能对分子含量进行原位测量。激光共聚焦显微镜虽然能同时进行成像和荧光强度定量,其荧光强度定量不能精确定量分子的数目。我们实验室前期已成功构建了一种基于双链DNA的荧光探针,用于细胞表面分子的荧光成像,分别是biotin-DNA/SYBR GREEN和Biotin-DNA-ROX。这里存在两大缺陷:(1)由于只偶联了一分子的ROX,Biotin-DNA-ROX探针进行细胞成像时荧光较弱;(2)两类探针都只能通过biotin(生物素)与亲和素特异性识别和结合,要对细胞表面某个蛋白染色的话,需要进行多级偶联(例如,中间还需要针对那个蛋白的抗体),不但会增加多个染色步骤,还无法进行双分子同时成像。本课题的目的有两个:(1)改善我们已构建的双链DNA荧光探针,使之在细胞表面分子荧光成像方面更加完美;(2)构建一种细胞表面分子原位定量的全新方法,使我们的双链DNA荧光探针,既能用于细胞表面分子的成像,又能对细胞表面分子进行原位的分子数目定量。本课题包含叁个部分:(1)DNA的制备及鉴定(制备DNA,然后从分子水平和细胞水平上进行鉴定);(2)解决我们已有的双链DNA荧光探针中的两个问题,同时验证该双链DNA荧光探针能够用于对细胞表面的分子进行荧光成像;(3)验证该双链DNA荧光探针能够用于对细胞表面的分子进行原位数量定量。实验结果证明,我们的双链DNA荧光探针,既能用于细胞表面分子的成像,又能对细胞表面分子进行原位的分子数目定量,而且,方法简单、快捷、有效,成本低廉。(本文来源于《南昌大学》期刊2018-06-30）
黄耿,桂定文,姜卫东,叶志华[3]（2018）在《外源性小分子双链RNA激活肾癌细胞野生型P53蛋白表达作用的研究》一文中研究指出目的通过转染外源性低分子双链RNA(dsRNA)ds P53~285至人肾癌细胞系ACHN和786-O,观察其激活肾癌细胞中抑癌蛋白野生型P53的表达作用。方法根据对肾癌细胞的不同处理分为3组,即空白对照(mock)组、阴性对照(转染ds Control)组和实验(ds P53-285)组。荧光实时定量聚合酶链反应(QPCR)和免疫印迹法(Western blot)分别检测P53 mRNA、P21 mRNA和相应蛋白的表达水平。MTT法和集落形成实验检测各组细胞活力及增殖能力。结果 QPCR检测显示ds P53-285能明显促进两种肾癌细胞中P53 mRNA和P21 mRNA水平的升高;与阴性对照组ds Control组相比,ds P53-285分别上调ACHN和786-O细胞中P53 mRNA的表达2.84倍(P<0.01)和3.20倍(P<0.01),ds P53-285分别上调ACHN和786-O细胞中P21mRNA的表达2.33倍(P<0.01)和2.59倍(P<0.01);mock组与ds Control组相比,两种细胞系中P53 mRNA和P21 mRNA的表达差异均没有统计学意义(P>0.05)。Western blot法检测显示在两种细胞系中,P53蛋白、P21蛋白表达水平的上调与相应的P53 mRNA、P21 mRNA水平的上调一致。MTT检测结果显示,与ds Control组相比,转染ds P53-285后,ACHN和786-O细胞活力显着降低(P<0.01),mock组与ds Control组无明显差异(P>0.05)。集落形成实验显示,ds P53-285组的集落数数量显着较少(P<0.05),mock组与ds Control组无明显差异(P>0.05)。结论外源性ds P53-285能显着激活肾癌细胞中P53基因的表达,激活的P53蛋白为野生型而非突变型,并可以显着抑制肾癌细胞的生长。(本文来源于《医学研究杂志》期刊2018年05期）
娄江曼[4]（2018）在《DNA双链断裂修复信号通路选择的分子机制研究》一文中研究指出DNA由于不断遭受来自外界环境和细胞内各种因素的伤害,产生各种不同类型的损伤。其中,DNA双链断裂(Double-strand breaks,DSBs)损伤是最为严重的损伤类型之一,如果不能被正确修复将会导致基因突变,基因组不稳定性以及细胞死亡。根据DSBs末端的性质,DSBs可以被分为两类--双末端DSBs(Two-ended DSBs)和复制相关的单末端 DSBs(Replication-associated one-ended DSBs)。双末端 DSBs一般由外源性因素如X射线和γ射线等造成;而复制相关的单末端DSBs则主要由诱导复制叉停滞或崩解的化学药物造成。DSBs主要由非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)和同源重组(Homologous recombination,HR)两种修复方式进行修复。NHEJ修复是一个相对快速的过程,直接通过DNA连接酶把两个断裂的DSBs末端连接起来。NHEJ修复相比,HR修复是一个多步骤的复杂过程。HR修复的发生需要DNA末端切割产生3'单链DNA,这一过程依赖于CtIP-MRN(Mre11-RAD50-NBS1)蛋白复合物。单链DNA 一旦产生会迅速被单链DNA结合蛋白RPA包被。接下来,重组酶RAD51置换RPA形成RAD51-单链DNA核酸蛋白纤维。这种核酸蛋白纤维结构催化同源序列的寻找,3'DNA入侵以及DNA新链合成和连接等多个过程。越来越多的证据表明,双末端DSBs既可以由NHEJ修复也可以由HR修复,其中以NHEJ修复为主。而复制相关的单末端DSBs则只能通过HR完成修复。一旦来自不同染色体上的单末端DSBs通过NHEJ修复则会导致染色体易位和基因组不稳定。然而细胞如何区分双末端DSBs和复制相关的单末端DSBs并选择合适的方式对它们进行修复依然还很不清楚。在我们的研究中,我们用亲和纯化的方法分离CtIP复合物,并通过质谱测序鉴定出一个新的CtIP结合蛋白--AUNIP,并阐明AUNIP在DSBs修复方式选择的过程中的重要功能。一方面,AUNIP可以直接和DNA末端切割过程中的关键蛋白CtIP相互作用。另一方面,AUNIP具有DNA结合能力并且优先结合类似于停滞复制叉结构的DNA底物。它的DNA结合能力对于AUNIP本身的招募和CtIP的招募以及CtIP依赖的DNA末端切割过程都是必需的。相应地,AUNIP的缺失会导致细胞对诱导DSBs产生的药物尤其是诱导复制相关单末端DSBs产生的药物高度敏感。我们的结果表明,AUNIP可以通过促进CtIP在复制相关的单末端DSBs位点的聚集,进而促使复制相关的单末端DSBs通过HR修复途径进行修复,维持基因组的稳定性。(本文来源于《浙江大学》期刊2018-04-01）
张箫浓,张文科[5]（2017）在《双链端粒DNA的制备与单分子力谱研究》一文中研究指出随着生物的进化,高等生物染色体中重复序列含量明显增加,在人体中端粒序列就是一段具有着非常重要生物意义的重复序列。人们研究发现重复序列不是无用的序列,相反它们调控着染色体的功能与结构,若这一调控出现异常,则会引发多种相关疾病。双链重复序列由于存在大量相同的重复结构单元,其退火复性速度比一般片段要快,复性时互补选择性极低,导致重复序列在体外极难合成。目前虽然人们对普通DNA的研究已经非常全面深入,但对重复序列的研究确实十分罕见。所以我们结合前人的方法,以人体端粒序列为例,利用PCR,TA克隆和双酶切等方法,合成一段双端带有修饰,且长度确定的重复序列DNA。通过AFM成像等方法进行表征,并通过单分子操纵技术研究这段DNA的力学性质。通过实验结果我们发现,重复序列的稳定性要比普通DNA低,且含有重复序列的DNA其BS转变平台力值会降低。该研究加深了我们对端粒DNA力学性质的认识。(本文来源于《中国化学会2017全国高分子学术论文报告会摘要集——主题B：生物大分子》期刊2017-10-10）
王晓静,宋廷结,梁好均[6]（2017）在《利用双链的燃料链推动DNA分子机器的运转及其在体内环境下的microRNA的检测》一文中研究指出MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为19-24个核苷酸的非编码单链RNA分子。目前已经有研究表明:miRNA的异常行为会导致疾病的出现,包括心血管疾病,神经发育失常,甚至癌症。因此,肿瘤细胞和肿瘤组织中可视化的miRNA的监测引起了广泛的关注。由于miRNA的长度较短、细胞中含量低这些问题,因此对它的原位监测仍然面临着巨大的挑战。我们发展了一种由双链燃料链(DSF)参与的DNA链替换催化反应体系,它能够有效地(本文来源于《中国化学会2017全国高分子学术论文报告会摘要集——主题B：生物大分子》期刊2017-10-10）
荚恒霞[7]（2017）在《一种线性双链RNA病毒的鉴定及其分子生物学特性研究》一文中研究指出山茶刺盘孢菌(Colletotrichum camelliae Massee)可寄生茶树引起茶云纹叶枯病(Tea Brown Blight)。该病是危害茶树叶的最常见病害,在世界各茶区分布广泛,造成叶枯、芽坏死以及枯萎等症状,从而导致茶叶的产量和质量的严重下降。本研究从茶叶片上分离得到茶云纹叶枯病菌株LT-3-1,相比正常的茶云纹叶枯病菌株DP-3-1,菌株LT-3-1的菌落形态较异常,生长速度较缓慢,致病力也较弱。通过提取LT-3-1和DP-3-1菌株菌丝的dsRNA,发现LT-3-1中存在8条dsRNA片段,大小分别为2444、2253、2012、1299、1122、1085、1053和990bp,共编码了10个开放阅读框(Open Reading Frame Finder,ORF)。其中dsRNA1、-2、-3、-4、-6、-7都编码一个独立的开放阅读框,依次命名为ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF7,而dsRNA5和-8分别编码ORF5-1、ORF5-2和ORF8-1、ORF8-2。其中ORF1编码依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp),ORF3编码甲基转移酶,ORF4编码外壳蛋白(Coat protein,CP),其他的开放阅读框所编码的蛋白功能未知。基于该病毒与已知病毒的序列相似性和RdRp进化树分析,显示该dsRNA链为一个新的dsRNA病毒基因组成分。基于该病毒的病毒形态(见下面分析),我们将其命名为刺盘孢线形病毒(Colletotrichum camelliae filamentous virus 1,CcFV1)。采用蔗糖梯度超速离心提纯病毒粒体,从各梯度层提取核酸显示在20%-30%蔗糖层存在8条核酸链,大小与从菌丝中提取的8条dsRNA大小一致;提取蛋白显示在该层存在大小为31kDa的蛋白(命名为P31),经质谱分析表明P31为该病毒的CP蛋白,由dsRNA4编码。将20%-30%蔗糖层纯化的病毒液进行铜网吸附后负染,经透射电镜观察,观察到了长线形的类似病毒的粒子,长为127.1-4661.6nm,宽为11.9-17.7 nm。为了进一步的确定该线形粒子是该病毒的病毒粒体,回收P31蛋白免疫2-3周龄的Balb/C雌鼠,制备CcFV1 CP蛋白的多克隆抗体,间接ELISA测定其效价为1:128000,最适工作浓度为1:2000,且Western-blot分析证明该抗体可与P31蛋白发生特异的免疫反应。将提纯的病毒液和稀释的抗体(1:2000或1:8000)混合,经铜网吸附负染进行透射电镜观察,显示该抗体有效地结合在线形粒子周围,由此确定该线形粒子即为该病毒的病毒粒体。对菌株LT-3-1的分生孢子后代进行单孢培养,挑取47株单孢后代菌株进行dsRNA的提取以及RT-RCR检测,结果显示CcFV1在后代菌株中的脱毒率为100%。采取PEG介导CcFV1 dsRNA1至-8转染无毒菌株DP-3-1和脱毒菌株LT-3-1D2的细胞原生质体,提取dsRNA进行病毒检测,表明在两种菌株中的传毒率分别为10/94和3/129。对脱毒和转染菌株进行病毒提取,从转染菌株中可以提取到CcFV1的核酸、蛋白和长线形病毒粒子,而脱毒菌株中检测不到这些成分。比较脱毒菌株和带毒菌株生物学性状表明,带毒菌株较无毒菌株黑色素增多,菌丝轮纹圈消失,生长速度降低(正常菌株为6.3-6.5 mm/d,带毒菌株为5.4 mm/d),致病力减弱(正常菌株病斑大小为6.1-14.9 mm,带毒菌株为5.4 mm)。将菌株LT-3-1和脱毒菌株LT-3-1D2进行超薄切片观察,相比较于菌株LT-3-1D2来说,菌株LT-3-1细胞中囊泡结构增多,伏鲁宁体和液泡消失。(本文来源于《华中农业大学》期刊2017-06-01）
田磊,苏小运,张臻峰,黄熙泰[8]（2016）在《DNA双链区的切割导致碱变性超螺旋质粒pBR322的分子内结节（英文）》一文中研究指出为进一步研究碱变性超螺旋D NA(Ⅳ型D NA;DNAⅣ)的结构,对碱变性质粒p BR322进行了酶学分析并利用原子力显微镜(AFM)对新形成的D NA结构进行了观察和比较.在所有已检测的限制酶中只有PstⅠ可以切割质粒p BR322的Ⅳ型DNA分子,说明在这种变性的DNA分子中仍存在少数完整的限制酶识别位点.与碱变性DNA分子的闭合环状结构相反,AFM成像的结果显示PstⅠ处理后的DNAⅣ分子均为开放结构,同时这种分子包含明显的DNA结节.与DNAⅣ分子相比,这种D NA分子的表观长度缩短了大约11%.有意思的是,大肠杆菌拓扑异构酶Ⅳ(一种Ⅱ型拓扑异构酶)也可以在p BR322 DNAⅣ分子中引入分子内结节,而这种结节D NA分子仍然保持闭合状态.AFM的结果表明上述两种结节的DNA分子在表观长度及结节结构的尺寸上均比较相似.这些发现证实,在碱变性的超螺旋DNA分子中仍然保留着一些长度较短的、含有特异性碱基配对的D NA双链区,而在这些区域内的D NA双链断裂可以导致D NA结节.(本文来源于《生物化学与生物物理进展》期刊2016年08期）
朱江[9]（2016）在《TREM-1对大肠杆菌或双链RNA诱导巨噬细胞活化的调控作用及分子机制》一文中研究指出致病原感染机体后,其本身固有的特殊成分——病原体相关分子模式(pathogenassociated molecular patterns,PAMPs)能够被机体先天免疫细胞的模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs)识别,一方面启动病原的吞噬、清除和杀伤,一方面激活机体炎症反应。而由严重感染所致失控性炎症反应是引发感染患者多器官功能损伤、甚至衰竭的重要原因。由于其病死率高,目前还缺乏十分有效的防治手段。新近的研究证实表达于髓样细胞的TREM-1(triggering receptors expressed on myeloid cells-1,TREM-1)在先天免疫系统中具有重要调控作用。该受体活化能够显着上调革兰阴性细菌/LPS作用于多形核白细胞后多种促炎症细胞因子的产生,显着放大感染相关炎症信号,在感染所致脓毒症的发生发展中具有重要的作用,故极有可能是抗脓毒症治疗研究的重要靶分子。而革兰阴性细菌通过其表面的LPS作用于TLR4(Toll-like receptor 4)/MD-2(Myeloid differentiation protein-2)受体复合体触发的炎症信号的过度放大是内毒素血症的发生发展基础,但以此为靶分子抑制LPS触发放大的炎症信号治疗内毒素血症动物模型并不一定能取得良好的疗效。其原因可能是干预TLR4/MD-2受体复合体的功能对先天免疫系统内化、杀伤、清除革兰阴性细菌和LPS影响甚巨,导致严重的副作用。TREM-1受体虽然对炎症信号的级联放大具有重要调控作用,但该受体是否对于先天免疫系统识别、吞噬、杀伤、清除革兰阴性细菌/LPS有作用以及作用的大小尚没有完全认识清楚。鉴于此,本研究通过基因工程方法构建表达EGFP的大肠杆菌,以此为工具研究证实了TREM-1活化对小鼠巨噬细胞内化及细胞内杀伤大肠杆菌具有促进作用。由于TREM-1为髓样细胞表面的一种膜受体,本身缺乏识别LPS/大肠杆菌的分子结构,故直接参与巨噬细胞内化大肠杆菌过程的可能性不大。为深入探讨可能机制,本研究通过构建慢病毒并感染RAW264.7细胞获得差异表达TREM-1的细胞株,并运用基因芯片技术比较了差异表达TREM-1的细胞株之间的全基因组表达谱差异,以期探讨差异表达TREM-1对内化大肠杆菌关键受体或信号分子的影响。在构建差异表达TREM-1细胞株的过程中,我们发现了一个新的现象。即对照慢病毒感染的细胞株,TREM-1表达显着升高。而已知慢病毒的感染过程为所谓的“自杀式感染”,感染后可将靶序列整合到宿主细胞基因组,但并不会复制包装产生新的病毒。而整合到宿主基因组的序列可不断转录产生新的ds RNA。这说明对照慢病毒产生的外源性乱序ds RNA可以诱导TREM-1表达上调。而ds RNA是双链RNA病毒最主要的PAMPs之一,机体的免疫细胞则是通过其PRRs识别胞浆或内体中的ds RNA,进而分泌Ⅰ型干扰素和炎症介质,产生抗病毒免疫,并产生炎症反应。尽管已有多项研究证实TREM-1受体参与调控了机体先天免疫系统对革兰阳性细菌、真菌及病毒产生的多种PAMPs的识别及后续信号过程,但TREM-1受体是否在机体先天免疫系统识别ds RNA后产生的抗病毒免疫中发挥调节作用还缺乏深入的认识。故本研究证实外源性ds RNA能够上调TREM-1的表达,且TREM-1活化可能正向调控ds RNA诱导的抗病毒免疫,而TREM-1的这种调节效应与该受体活化能够上调MAPK信号通路活性及病毒感染相关的PRRs表达有关。主要的实验方法和结果:1.分别用经2%血清调理素化的和未经调理的大肠杆菌BL21(DE3)plys S感染BMDMs,12hrs后收集细胞培养上清,ELISA法检测上清中TNF-α和IL-6的浓度。结果发现感染经血清调理或未调理的大肠杆菌的细胞培养上清中,TNF-α和IL-6的分泌均明显上调(P<0.01);而用TREM-1激动型抗体活化该受体后再感染细菌,则TNF-α和IL-6的分泌效应被显着放大(P<0.05);而单独比较调理素化和未调理细菌对巨噬细胞的刺激作用,则发现调理素化细菌对TNF-α和IL-6的分泌具有更强的诱导作用(P<0.05)。2.通过基因工程方法构建EGFP原核表达载体,转化入表达大肠杆菌后,通过诱导EGFP表达使细菌携带稳定绿色荧光,从而获得能够可视化研究吞噬细胞内化细菌过程及通过流式细胞术定量、高通量测定吞噬细胞内化能力的有力工具。3.使用TREM-1受体激动型抗体与BMDMs孵育半小时活化该受体,加入细菌感染细胞半小时,可检测到TREM-1受体活化的细胞内化有细菌的比例显着增加,细胞平均荧光强度显着增加,吞噬系数增高(P<0.01)。在不同时像点收集保本检测结果也证实TREM-1活化促进BMDMs对大肠杆菌的吞噬。同时,也采用同样方法检测RAW264.7细胞内化大肠杆菌的能力,结果发现RAW264.7细胞内化大肠杆菌的能力弱于BMDMs,且TREM-1受体活化不能显着上调RAW264.7细胞内化大肠杆菌能力。4.用TREM-1受体激动型抗体与巨噬细胞孵育半小时后,向细胞培养上清中加入荧光标记乳胶微球和中性红颗粒,结果发现细胞非特异胞饮能力并未增强,而作为实验对照的经LPS刺激半小时的BMDMs的胞饮能力显着增强(P<0.01)。5.同样激活BMDMs的TREM-1受体,并使其内化大肠杆菌。然后用抗生素杀灭胞外菌后,再继续培养细胞5hrs进行细胞内杀伤大肠杆菌,通过裂解细胞进行菌落计数发现TREM-1受体活化的BMDMs的细胞内杀伤大肠杆菌的能力显着增强(P<0.05)。6.慢病毒感染RAW264.7细胞,对照慢病毒感染组细胞的TREM-1表达上调,而敲减TREM-1表达并不影响TLR4、MD-2表达。TREM-1受体活化增强巨噬细胞内化革兰阴性细菌,可能与该受体活化调节TLR4受体功能及MAPK等信号通路有关。7.Poly IC刺激RAW264.7细胞,可剂量依赖地上调TREM-1的表达(P<0.001),这一效应可被PI3K、MAPK信号通路抑制剂阻断(P<0.01)。Poly IC刺激BMDMs可持续上调TREM-1表达,在刺激后36hrs达到高峰,而LPS诱导的TREM-1表达上调在24hrs即达到高峰,随后下跌。短片段ds RNA对TREM-1表达同样具有诱导作用。8.细胞与激动型anti-TREM-1抗体孵育活化TREM-1,再经Poly IC刺激后,其MAPK信号通路的JNK、ERK1/2和P38的磷酸化发生更早,磷酸化水平更高,而且持续时间更长,MAPK信号通路活化程度增强。9.经TREM-1激动型抗体处理的BMDMs细胞受到Poly IC刺激活化后,IFN-β、TNF-α、IL-6的分泌水平显着上调(P<0.01),IL-1β、IL-10、MCP-1的m RNA转录显着增强。且RAW264.7细胞与BMDMs细胞的TREM-1受体功能存在差异。10.TREM-1受体活化的BMDMs细胞受Poly IC刺激后,MDA5、TLR3和TLR7受体表达上调;而受到短片段ds RNA刺激后表现为RIG-I表达上调。RAW264.7细胞的上述受体表达存在异常。结论:1.TREM-1受体活化选择性促进巨噬细胞内化和细胞内杀伤大肠杆菌,从而上调促炎症介质分泌,但并不增强细胞非特异的胞饮能力。2.敲减TREM-1表达并不能改变TLR4、MD-2等内化革兰阴性细菌相关基因的表达。TREM-1促进巨噬细胞内化革兰阴性细菌能力的机制可能与该受体活化能调节TLR4/MD-2受体复合体功能及细胞MAPK等信号通路活化状态有关。3.基因组表达谱芯片及体外实验结果证实ds RNA刺激巨噬细胞能上调TREM-1的表达,存在剂量和时间依赖性。4.TREM-1活化状态对ds RNA诱导的抗病毒免疫反应具有重要的调节作用,参与病毒感染过程的发生、发展;而这种调节作用与其能协同增强MAPK信号通路活化及病毒相关PRR表达有关。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2016-05-01）
王伟[10]（2016）在《长链双链RNA调控内源性免疫和慢性炎症的分子机制研究》一文中研究指出双链RNA(dsRNA)是具有两条互补链的RNA,依据其碱基对长度,将长于30bp的dsRNA称为长链dsRNA。近二十年来研究发现短链dsRNA(<30bp)在生命活动中起着重要作用,在真核细胞中主要以microRNA的形式调控基因的表达,对其调控机制的研究已经较为完整。microRNA的前体pre-microRNA是真核细胞中目前发现的一类长链dsRNA,而在病理过程中,细胞中也会出现大量长链dsRNA,目前对于这些长链dsRNA的作用机制尚不清楚。本课题分别针对外源性和内源性dsRNA及其生物学功能,通过建立相关的疾病模型,探讨了dsRNA是否以及如何参与疾病的病理过程,揭示了外源性和内源性dsRNA分别在抗病毒免疫应答和氧化应激引起的代谢紊乱中的调控机制。第一部分:靶向外源性dsRNA激活抗病毒固有免疫的分子机制研究病毒感染会导致宿主细胞内dsRNA大量产生。在哺乳动物细胞中,这些dsRNA会被一套特异的dsRNA受体识别成危险信号,其中主要的胞内受体是RLR家族受体。rlr受体可以识别并结合外源性的长链dsrna,并将其作为病原信号(pamps)通过死亡结构域传递给下游,激活干扰素介导的抗病毒信号通路,在严重感染时甚至激活细胞凋亡。本部分研究中,我们提出了一种新的抗病毒策略,即通过识别dsrna、并以类似于rlr受体的方式激活下游信号,诱导程序性坏死以快速清除被感染的细胞,从而达到广谱高效抗病毒的目的。我们首先运用分子生物学方法改构了rlr受体并将其命名为dscare,证明了被腺病毒(adv)和呼吸道合胞病毒(rsv)感染的a549细胞能被dscare快速杀伤。运用实时定量pcr、elisa和westernblotting等方法,我们发现虽然dscare没有激活细胞内ifn-β通路,但是促进了炎性因子il-1β的表达和分泌。通过经典的细胞死亡标志的分析,如细胞形态学检测、磷脂酰丝氨酸外翻、caspase活化、化学抑制剂阻断特定通路等,我们发现dscare主要通过激活细胞程序性坏死来杀死被感染的细胞而没有激活细胞凋亡。通过基因沉默和化学阻断的方式,发现dscare通过溶酶体蛋白组织蛋白酶d介导了necrosome复合物形成,继而激活程序性坏死通路,而通过rna干涉的方法证明了在这个通路中rip1和rip3都是dscare发挥抗病毒活性的重要分子。化学阻断细胞凋亡和程序性坏死的对照实验进一步表明,抑制剂nec-1通过抑制程序性坏死而阻断了dscare的抗病毒活性,抑制剂zvad阻断细胞凋亡则对dscare的抗病毒活性没有影响。研究结果表明,重组rlr受体dscare绕过了通常被激活的干扰素抗病毒途径,直接激活了程序性坏死通路,从而达到了快速杀伤被感染细胞的目的。这个机制的发现和提出为发展新的高效抗病毒药物提供了理论依据。第二部分:内源性dsrna调控血管内皮功能紊乱的分子机制研究在高血糖引起的血管病变过程中,氧化应激和炎症导致的血管内皮功能紊乱是主要发病诱因。虽然ambati等报道了在氧化应激和炎性状态下内源性dsrna会大量累积并对细胞产生毒性,但是dsrna在高血糖诱导的血管内皮病变过程中是否参与以及其生物学功能尚不清楚。本部分研究旨在探索内源性dsrna是否参与血管内皮细胞的氧化应激及功能紊乱,揭示内源性dsrna参与调控的信号通路。我们运用dsrna特异性抗体j2通过免疫组织化学的方法来检测可能在高血糖小鼠和高糖刺激的人脐静脉内皮细胞(huvec)细胞中产生的dsrna,结果显示在高血糖小鼠的胸主动脉血管内皮中和高糖刺激的HUVEC细胞中均有大量的dsRNA产生。通过免疫沉淀的方法,我们捕获了在高糖刺激的HUVEC细胞中产生的dsRNA,并通过构建文库和DNA测序的方法鉴定捕获到的dsRNA,发现这些dsRNA与Alu RNA Sc亚家族高度同源。我们通过基因克隆的方法构建了真核表达Alu RNA的重组质粒。运用实时定量PCR、ELISA、Western Blotting等方法,通过比较高糖刺激的HUVEC细胞与Alu RNA转染的HUVEC细胞的抗氧化酶系统和氧化应激标志物,我们在HUVEC细胞中检查了捕获到的dsRNA对内皮细胞功能的影响。结果显示,与高糖刺激的促氧化应激和促炎作用类似,Alu RNA过表达促进了活性氧簇(ROS)的产生,并且上调了IL-1β的表达和分泌,而且Alu RNA抑制了内皮细胞一氧化氮合酶eNOS和超氧化物歧化酶SOD2的表达。通过化学清除ROS和化学抑制NFκB的活化,我们发现Alu RNA通过促进ROS产生和激活NFκB来抑制抗氧化酶的表达;而通过构建Alu RNA的功能缺失突变体,我们发现Alu RNA对多种酶的表达抑制是依赖于Alu RNA在转录和翻译水平的负调控机制。我们的研究揭示了内源性dsRNA——Alu RNA在高糖刺激下在血管内皮细胞中大量积累的现象,阐述了内源性Alu RNA激活NFκB通路促进氧化应激和炎症,并通过NFκB通路、转录和(或)翻译水平两种方式负调控抗氧化酶eNOS和SOD2表达,从而进一步加重细胞内氧化应激这一分子机制。这些发现更新了对内皮细胞功能紊乱的调控机制的理解,提出了内源性dsRNA调控代谢紊乱类疾病的发生发展的新理论。(本文来源于《第四军医大学》期刊2016-05-01）
双链分子论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
在生物实验中常常需要对细胞表面或内部的分子进行染色成像以及对分子的含量进行测定。通常这两部分实验需要两套系统分开进行,例如,通过免疫荧光探针和荧光显微镜结合的方法进行细胞分子成像;而分子含量的测定通常要经过目标分子的分离、纯化后再进行BCA、ELISA等测定,不能对分子含量进行原位测量。激光共聚焦显微镜虽然能同时进行成像和荧光强度定量,其荧光强度定量不能精确定量分子的数目。我们实验室前期已成功构建了一种基于双链DNA的荧光探针,用于细胞表面分子的荧光成像,分别是biotin-DNA/SYBR GREEN和Biotin-DNA-ROX。这里存在两大缺陷:(1)由于只偶联了一分子的ROX,Biotin-DNA-ROX探针进行细胞成像时荧光较弱;(2)两类探针都只能通过biotin(生物素)与亲和素特异性识别和结合,要对细胞表面某个蛋白染色的话,需要进行多级偶联(例如,中间还需要针对那个蛋白的抗体),不但会增加多个染色步骤,还无法进行双分子同时成像。本课题的目的有两个:(1)改善我们已构建的双链DNA荧光探针,使之在细胞表面分子荧光成像方面更加完美;(2)构建一种细胞表面分子原位定量的全新方法,使我们的双链DNA荧光探针,既能用于细胞表面分子的成像,又能对细胞表面分子进行原位的分子数目定量。本课题包含叁个部分:(1)DNA的制备及鉴定(制备DNA,然后从分子水平和细胞水平上进行鉴定);(2)解决我们已有的双链DNA荧光探针中的两个问题,同时验证该双链DNA荧光探针能够用于对细胞表面的分子进行荧光成像;(3)验证该双链DNA荧光探针能够用于对细胞表面的分子进行原位数量定量。实验结果证明,我们的双链DNA荧光探针,既能用于细胞表面分子的成像,又能对细胞表面分子进行原位的分子数目定量,而且,方法简单、快捷、有效,成本低廉。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
双链分子论文参考文献
[1].谭效贝.荧光修饰双链DNA偶联单链DNA的叁螺旋分子信标检测转Bt基因[D].山东农业大学.2019
[2].刘洋.双链DNA荧光探针同时用于细胞表面分子的荧光成像和数目定量[D].南昌大学.2018
[3].黄耿,桂定文,姜卫东,叶志华.外源性小分子双链RNA激活肾癌细胞野生型P53蛋白表达作用的研究[J].医学研究杂志.2018
[4].娄江曼.DNA双链断裂修复信号通路选择的分子机制研究[D].浙江大学.2018
[5].张箫浓,张文科.双链端粒DNA的制备与单分子力谱研究[C].中国化学会2017全国高分子学术论文报告会摘要集——主题B：生物大分子.2017
[6].王晓静,宋廷结,梁好均.利用双链的燃料链推动DNA分子机器的运转及其在体内环境下的microRNA的检测[C].中国化学会2017全国高分子学术论文报告会摘要集——主题B：生物大分子.2017
[7].荚恒霞.一种线性双链RNA病毒的鉴定及其分子生物学特性研究[D].华中农业大学.2017
[8].田磊,苏小运,张臻峰,黄熙泰.DNA双链区的切割导致碱变性超螺旋质粒pBR322的分子内结节（英文）[J].生物化学与生物物理进展.2016
[9].朱江.TREM-1对大肠杆菌或双链RNA诱导巨噬细胞活化的调控作用及分子机制[D].第叁军医大学.2016
[10].王伟.长链双链RNA调控内源性免疫和慢性炎症的分子机制研究[D].第四军医大学.2016
标签：转基因作物; 叁螺旋DNA分子信标; 苏云金芽孢杆菌; 灵敏检测;