痛觉敏感论文-贾磊

导读:本文包含了痛觉敏感论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:慢病毒干扰,DRG原代神经元,钙离子成像,ERK

痛觉敏感论文文献综述

贾磊^[1]（2019）在《ERK-TRPV4通路在大鼠背根神经节持续受压致痛觉敏感中的作用机制研究》一文中研究指出背景早在 1994年,国际疼痛学会(International Association for the Study of Pain,IASP)曾将神经病理性疼痛(Neuropathic Pain,NP)定义为,由神经系统的原发性损伤,或功能障碍所激发货引起的异常疼痛,而其临床疼痛的特征是异常疼痛、痛觉过敏及自发性疼痛等。直到2008年,IASP的神经病理性疼痛相关的特别兴趣小组(NeuPSIG)提出,将其定义重新做出了定义,认为NP是指,由躯体感觉系统的损害、或疾病导致的疼痛,所以在2011年,国际疼痛学会将其定义进行了更新。NeuPSIG经过一系列统计分析,认为神经病理性疼痛的全球患病率,约为3.3%～8.2%。尽管国内还暂时没有针对神经病理性疼痛患者的相关生存质量的系统性研究数据,但神经病理性疼痛对于患者的生活质量的影响是不容忽视且显而易见的。长期的疼痛症状,不但会影响患者的睡眠、工作和生活能力,还会增加其患有抑郁、焦虑等情感障碍的比率。神经病理性疼痛通常上被分为周围性和中枢性两种类型,但是,不同类型的疼痛可能会具有相似或相同的发病机制。由于神经病理性疼痛的发病机制复杂多样,其中可能包括了解剖结构的改变,以及组织功能的受损等不同层面的变化,且经常是由多种机制引起的。可能涉及的机制具有多样化,可能涉及的病理变化亦较。其中值得重视的是,外周敏化和中枢敏化是参与神经病理性疼痛的重要发病机制,其中,中枢敏化是指脊髓及脊髓以上与痛觉相关的神经元的兴奋性异常升高,或者突触传递增强,也包含了多个病理改变。其相应的临床表现有自发性疼痛(spontaneous pain)、痛觉过敏(hyperalgesia)、痛觉敏感或痛觉超敏(allodynia)等。神经病理性疼痛是一个持续的过程,病情可能出现反复,患者需要经过长期治疗。然而,目前的治疗现状却不尽如人意,约一半左右的患有神经病理性疼痛患者,其疼痛症状不能充分得到缓解。目前,对于许多患者来说,神经性疼痛的治疗方法主要是药物治疗,其他治疗方法的应用具有挑战性的,且缺乏有效的。因此,亟需使用一些新的方法,以控制疼痛并改变其在临床治疗中的预后。在临床上,根性神经痛是一种常见的病理性神经痛的类型,而各种腰部疾患引起的相应节段的神经节或神经根压迫后,导致的疼痛是临床上最为常见的根性神经痛的类型。当脊髓背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)受到伤害性因素的刺激时,根性疼痛的症状被诱发产生,常见疾病有腰椎间盘突出、腰椎椎管狭窄、脊髓压迫及周围炎症等。我们课题组多年研究,总结改良了大鼠的背根神经节持续受压(chronic compression of DRG,CCD)模型,而CCD的动物模型作为一种较为成熟且典型的慢性神经痛模型,用于引发大鼠的根性神经痛,有效地模拟了在动物模型中神经病理性疼痛的痛觉改变。在大鼠CCD模型建立后,我们在行为学检测中发现,大鼠出现了机械痛敏、热痛敏和异常疼痛的现象。同时,DRG神经元出现异常兴奋,神经元细胞出现自发性放电增加,同时伴随着动作电位以及电流阈值的降低。这些变化可能是由调节细胞兴奋性、介导突触传递的某些离子通道和某些信号通路共同参与而完成的。因此,当离子通道功能或通路内蛋白激酶的表达受到抑制时,神经元的兴奋性可能会降低,从而缓解疼痛症状和不适。课题组先前的研究(基金号:81071597)发现,CCD后,大鼠的DRG中瞬时感受器-电位离子通道家族中的香草素受体亚家族中TRPV4(transient receptor potential vanilloid receptor 4)被异常激活,TRPV4参与了 CCD导致的DRG的高兴奋性、痛觉敏感和异常疼痛的发生。随后的研究(基金号:81401862),我们又发现,干预TRPV4的表达及功能,可以改变大鼠背根神经节持续受压导致的疼痛症状。然而,在参与痛敏的机制过程中,TRPV4的激活受到何种因素的调节以及干预,都需要进一步研究。DRG神经元是感觉传入的第一级神经元,疼痛的信息传导起始于DRG中的初级感觉神经元,我们也称之为伤害性感受器。DRG神经元在疼痛的信息传导过程中发挥着不可替代的重要作用,DRG神经元纤维的中枢端,将疼痛的伤害性信号传递到了位于脊髓背角神经元(第二级神经元),他们再发出神经纤维,组成脊髓丘脑侧束逐级向上。所以,在探索神经病理性疼痛的发生机制的过程中,不仅要研究外周敏化,中枢敏化参与疼痛的作用更加不能忽略。周围神经损伤可引起神经性疼痛,并使外周丝裂原活化蛋白激酶家族(Mitogen-actived protein kinases,MAPKs)激活,并在DRG和脊髓背角组织中发生相应的磷酸化反应。MAPKs家族包含了叁类主要的成员,即细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)、p38和c-JNK,它们分别代表着叁个独立的信号通路。神经损伤发生后,ERK、p38和JNK都可以在脊髓背角及薄束核的神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞,以及受损的大DRG神经元中均被激活,从而导致促炎或促痛介质的合成,增强和延长疼痛。特别是ERK,通过痛觉活性激活脊髓背角神经元,通过调节谷氨酸受体和钾离子通道的活性,诱导了多种基因的转录。近年来,已有文献报道,在多种神经性疼痛动物模型中,MEK1已被确定为治疗神经性疼痛的新靶点。ERK系与MEK1直接相连的下游分子,MEK1的一些药理学抑制剂,如PD198306、U0126和PD98059,已经被证明可以通过抑制ERK信号的激活来减轻疼痛。因此,靶向抑制ERK亦可以被认为是治疗神经性疼痛的一个较有前景的治疗靶点。基因治疗(gene therapy)具有巨大的治疗潜力,其特点在于作用位点在基因水平,它可以通过替换有缺陷或缺乏的蛋白,也可以通过靶向抑制相关蛋白表达的方法,将以前被归类为不可治疗的疾病或药物治疗疗效欠佳的疾病达到良好预后,甚至完全治愈。慢病毒介导的基因治疗可以提供一种独特的工具来整合小RNA干扰(RNA interference,RNAi)的表达构建,目的是局部抑制特定基因的表达,从而研究该改基因在某些指定信号通路中的功能。慢病毒介导的短探针RNA(shorrt hairpin RNA,shRNA)的载体方式,已被证明是一种长期且以剂量依赖的方式介导稳定的RNAi,因此为整合RNAi表达结构提供了一种方便的方法。例如,通过慢病毒载体转导shRNA可导致大脑中某特定基因表达的持续下调。因此,利用慢病毒稳定表达shRNA,是探索基因在体内功能和神经系统疾病基因治疗的有力手段。ERK与TRPV4共同参了多种病理性疼痛的发生机制,如原发性叁叉神经痛、颞下颂关节功能紊乱引起的咀嚼痛、以及骨关节炎疼痛等,但这些疼痛并非CCD引起的异常疼痛类型。早期的研究已证实,TRPV4的表达量在CCD手术后明显增加,TRPV4通道开放也随之增加,Ca2+的内流增加。研究证实了细胞内的Ca离子浓度的异常升高,促使MAPK家族各成员的活性被激活,MAPK家族的激活又可影响下游分子的生物学效应。随后的研究发现,CCD后P-ERK的表达量较正常组明显增加,ERK被激活后发挥其生物学效应,然而应用MEK1抑制剂U0126后,P-ERK的表达下调明显,改变了 DRG神经元的高兴奋性状态,其动作电位的电流阈值亦随之升高。TRPV4通道的开通引起的DRG神经元兴奋性增高可能也受到ERK表达和生物学功能的影响。本课题组前期研究已证实TRPV4-p38通路参与了CCD后神经病理性疼痛的发生和发展过程,且TRPV4与p38两者之间,亦存在着相互影响的作用关系。因此,我们推出TRPV4与ERK之间亦存在相互联系,继而探索ERK-TRPV4途径在大鼠CCD致痛觉敏感中的作用机制是亟待解决的,这将为靶向抑制ERK用于治疗神经病理性疼痛提供重要依据。第一部分ERK对大鼠背根神经节持续受压后背根神经节原代神经元中TRPV4表达及功能影响的研究目的1.构建慢病毒干扰ERK的shRNA载体并筛选干扰ERK表达的有效病毒片段,研究干扰ERK后是否会影响大鼠CCD后背根神经节原代神经元中TRPV4的表达及功能。2.研究大鼠背根神经节原代神经元中,TRPV4与ERK两者之间的相互联系是否存在。实验方法1.大鼠背根神经节持续受压模型的制作实验用的Wistar大鼠:体重约为150-180g,健康成年,雄性大鼠。以10%水合氯醛(大鼠体重,0.3mL/l00g)腹腔麻醉后,然后在两侧髂棘间切开大鼠背部的皮肤,切口约为2cm,充分暴露深筋膜和肌肉,暴露L4、L5节段的右侧椎间外孔后,选用形状类似“U”形的不锈钢钢棒,将其压迫在L4和L5对应节段的椎间外孔处。术后冲洗切口,逐层缝合。大鼠术后,未出现自残现象、感觉完全缺失及行走不能等现象。2.大鼠背根神经节原代神经元的培养应用腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后,减去心脏,酒精消毒后,放入超净台中,剪开椎管暴露椎间孔,迅速摘取DRG,尽量将与之相连的神经根去除干净,取出神经节置于盛有Hanks液的培养皿中且尽量置于冰袋上。取材完毕,吸出培养皿中Hanks液,经过0.25%胰酶在37℃水浴下消化30min并将其离心后,加入完全培养液。用预想处理过尖部吸管重新吹打,吹散后使用细胞筛网(密度为200目)进行细胞滤过,最终得到单细胞悬液。滴加单细胞悬液在已事先经多聚赖氨酸处理的细胞培养皿中,前后左右,呈“8”水平摇晃细胞板,后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育,培养液为含有15%含胎牛血清、100U/mL青链霉素、5umol/L阿糖胞苷等的完全培养基,培养12h至24h后细胞贴壁,备用。3.细胞免疫荧光技术与神经元鉴定大鼠DRG神经元提取并培养72h后,在培养板中将已爬好DRG神经元的玻片,经过4%多聚甲醛固定、0,5%Triton X-100通透、以及小鼠抗大鼠NeuN多克隆抗体(1:500,Abcam,USA)4℃过夜后。再用波长594荧光标记的驴抗小鼠IgG(H+L)-红色荧光二抗(1:450,Thermo Invitrogen,USA)37℃孵育30min,即用型DAPI染核剂染核,防荧光淬灭封片剂封片,观察并采集图像。4.慢病毒干扰ERK shRNA有效病毒片段的筛选及有效片段载体的转染首先,提取正常大鼠原代神经元,培养12-24h后,细胞换液加入含有慢病毒载体的全培养基,即慢病毒阴性对照组和4个不同的慢病毒干扰ERK shRNA片段,感染72小时后,观察细胞GFP(绿色)荧光。慢病毒转染5天后,提取各组细胞总蛋白及总mRNA,检测慢病毒干扰的转染效果。随后提取CCD手术4天后的大鼠DRG原代细胞,培养并给予有效片段载体的转染。5.DRG神经元的细胞活性检测提取原代DRG神经元,以1×104/孔的细胞密度接种于96孔培养板中,37℃、5%CO2的培养箱中培养,过夜后,细胞贴壁生长状态良好。采用MTT法检测慢病毒感染后24h、48h、72h、96h和120h,在波长490nm的吸光光度值(OD值),以正常培养基培养的DRG神经元的OD值作为100%,分别将各组样品的OD值与正常培养基培养的DRG神经元的OD值比较,得出其百分比。6.蛋白印记法测定DRG原代神经元中的蛋白表达情况收集各组细胞并提取总蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳法后,通过电转印的方式将蛋白条带转至PVDF膜。室温封闭后一抗4℃孵育过夜,二抗室温孵育后,化学显影。检测并评价慢病毒干扰ERK的转染效果,观察TRPV4、ERK及P-ERK蛋白表达变化。7.Real-time quantitative PCR法提取各组细胞总mRNA,利用实时荧光定量PCR检测基因水平慢病毒干扰ERK表达的效果,检测慢病毒转染CCD后DRG原代神经元中ERK与TRPV4的总RNA的表达变化。8.钙离子成像技术慢病毒转染5天后,使用激光共聚焦显微镜观察荧光强度。首先将各组培养细胞的培养基吸出,等渗溶液冲洗3次。然后加入Fluo-3/AM,室温下负载45min,负载过程中轻轻摇晃促进染色。等渗液冲洗3次,以去除细胞外多余的Fluo-3/AM。不同刺激细胞内钙离子荧光强度测量,分别记录单个细胞最大荧光强度(Fmax)和最小荧光强度(Fmin),以计算细胞内Ca2+的相对浓度。观察DRG中钙离子浓度的变化。钙浓度变化以AF/F来表示,其公式为:AF/F=(F-Fbase)/(Fbase-B)。9.试剂对实验组给予干扰ERK shRNA序列(中国上海吉玛基因通用制药有限公司)。应用荧光钙指示剂染料氟-3/乙酰氧基甲基酯(Fluo-3/AM,Sigma,美国)进行钙成像。Trpv4抑制剂钌红(RR,Sigma,美国,推荐浓度=1μmol/L)和Trpv4激动剂4α-PDD(CST,美国,推荐浓度=3μmol/L)均溶解于二甲基亚砜(DMSO)。结果1.大鼠背根神经节原代神经元的鉴定原代DRG神经元细胞提取培养72h后,显微镜下观察,原代神经元胞体呈圆形、椭圆形和多角形,大部分细胞呈椭圆形和多角形,且胞体较大,细胞周围光晕明显台盼蓝染色实验显示>90%的细胞有活性。应用神经元标志性(Neuronal Marker)抗体NeuN和DAPI细胞核染色剂进行免疫细胞荧光染色,可以发现细胞中标记为红色荧光的细胞为DRG神经元细胞。2.慢病毒载体对DRG神经元细胞活性的影响根据吉玛慢病毒使用手册推荐的感染复数,选用MOI=5的推荐值,进行慢病毒感染DRG神经元细胞。慢病毒阴性对照感染DRG神经元,24h、48h、72h、96h及120h时,DRG神经元MTT检测发现,神经元的活性均未受影响。3.慢病毒干扰ERK shRNA有效病毒片段的筛选感染慢病毒72小时后观察细胞荧光,标记了 GFP(绿色)荧光的细胞占总细胞的比率>85%。感染慢病毒5天后,提取各组细胞总蛋白及总RNA。与空白对照组相比,慢病毒阴性对照组(Lv-shNC)的ERK的蛋白表达及mRNA无明显变化,即慢病毒载体对大鼠DRG原代神经元的ERK表达无明显影响;慢病毒干扰组Lv-shERK#1、Lv-shERK#3和Lv-shERK#4的ERK蛋白表达均明显下调,而Lv-shERK#2组无明显变化。Lv-shERK#1、Lv-shERK#3和 Lv-shERK#4的ERK1及ERK2的mRNA表达均明显下调(n=6,各组P<0.01),而其中Lv-shERK#1组转染效率最佳,基因及蛋白下调比例最佳;Lv-shERK#2组无明显变化。mRNA表达与蛋白表达的变化趋势相类似,进一步验证慢病毒干扰ERK表达的转染效果。筛选得到感染效率最佳的慢病毒片段为Lv-shERK(550-571,5'-GCTCTTGAAGACACAGCACCT-3')。4.大鼠DRG原代神经元细胞中TRPV4、ERK及P-ERK蛋白表达变化感染慢病毒5天后,提取各组细胞总蛋白。CCD组与CCD+Lv-shNC组无明显差异;与CON组相比,CCD组TRPV4、ERK及P-ERK蛋白表达增加;与Lv-shNC组相比,Lv-shERK组的TRPV4、ERK及P-ERK表达下降(n=6,各组P<0.01),慢病毒干扰ERK后,ERK明显下降的同时,TRPV4的蛋白表达随之亦下降。5.大鼠DRG神经元细胞相关mRNA表达的变化。感染慢病毒5天后,检测细胞的总RNA。与CON组相比,CCD组TRPV4、ERK1及ERK2在mRNA水平的表达增加;给予慢病毒干扰后,ERK1及ERK2表达明显下调,同时,TRPV4的mRNA水平亦下调(n=6,各组P<0.01)。这一变化趋势与相应蛋白表达变化相一致。6.CCD模型后大鼠DRG神经元细胞钙离子浓度的变化各组钙离子浓度变化的统计分析,CCD可引起30%低渗溶液和4α-PDD介导的DRG神经元内Ca离子浓度升高(n=6,各组均重复检测20次,与CON相比较),而正常大鼠DRG神经元去除细胞外液中的钙以及钌红(RR)可以抑制4α-PDD介导的Ca离子浓度升高。CCD手术后,DRG神经元钙离子浓度明显增加,而CCD后给予慢病毒转染干扰ERK,CCD+Lv-shERK组较CCD+Lv-shNC组明显下降,即与CCD+Lv-shNC组相比,慢病毒干扰ERK后明显抑制CCD后大鼠DRG神经元内Ca离子浓度的升高(n=6,各组均重复检测20次,P<0.01)。CCD+Lv-shNC组与CCD组无明显差异。结论1.大鼠DRG神经元的特异性慢病毒干扰ERK的shERK有效片段为ERK-shRNA(550-571,5'-GCTCTTGAAGACACAGCACCT-3')。2.大鼠DRG原代神经元中TRPV4与ERK存在相互影响关系,利用慢病毒干扰靶向抑制ERK,大鼠DRG原代神经元的TRPV4的表达及功能均发生改变。第二部分:ERK-TRPV4通路参与大鼠背根神经节持续受压致痛觉敏感的周围敏化与中枢敏化的研究目的1.研究ERK-TRPV4通路是否参与大鼠背根神经节持续受压后痛觉敏感的发生与发展。2.研究ERK-TRPV4通路是否参与大鼠背根神经节持续受压后痛觉敏感的外周敏化与中枢敏化的机制中。方法1.实验动物及动物模型健康成年雄性Wistar大鼠(山东大学实验动物中心),体重约150-180g,动物实验已经经过山东大学实验动物伦理委员会批准。动物模型制作的方法与第一部分相同。2.鞘内注射慢病毒载体小动物麻醉机吸入性麻醉。大鼠背部剃毛、皮肤消毒后鞘内注射。以双侧髂棘连线的中点处,定位L4与L5间的椎间隙,向下一个椎间隙进针。微量注射器的针头垂直刺入椎间隙,进针时感到有突破感,此时,大鼠出现快速甩尾想想,表明针头已进入蛛网膜下腔。轻轻回抽,如无血液回流,即可缓慢推注,每只大鼠每次注射药物的体积均为10uL,注射的速度应小于2uL/秒。迅速抽出注射器针头抽出,按压注射部位以防脑脊液漏出。停止吸入麻醉后2min至5min,大鼠恢复翻正反射。3.大鼠行为学检测(1)观察大鼠术后自然状态下,随意运动的步态情况,进行评定并评分,只使用步态正常且无足畸形的大鼠,即评分为1分的大鼠用于后续实验。(2)机械刺激缩爪反应阈值的检测:使用BME-404型电子式机械刺激测痛仪进行测试,温度适宜,安静明亮。将大鼠置于0.5cm×0.5cm的金属网格之上。大鼠适应环境10分钟后,进行测试。垂直向上刺激大鼠后肢足趾间皮肤,大鼠如出现缩爪并记录刺激阈值。每只大鼠需测试5次,每次刺激的间隔时间为5min,最终取其平均值作为统计数据量。(3)热刺激缩爪反应潜伏期的检测:使用BME-410C型热痛刺激仪进行测试。预先将热痛刺激仪至于0.5cm×0.5cm的金属网格下方,将大鼠发在金属网格之上,使得热光源聚焦照射于大鼠后肢足底掌心,电子秒表计时,记录从热辐射照射开始至大鼠后肢回缩的时间,即为热刺激缩爪反应潜伏期。每只大鼠需测试5次,每次刺激的间隔时间为5min,最终取其平均值作为统计数据。4.大鼠慢病毒鞘内注射滴度的确定为了避免慢病毒载体中绿色荧光GFP对后续实验的影响,大鼠鞘内注射采用了无GFP的慢病毒介导的RNAi表达系统。取实验大鼠随机分为5组,分别给予生理盐水、shRNA 10^4 病毒单位(toxic units,TU)、10^5 TU、10^6 TU和10^7 TU,每组各位6只大鼠。各组中,每只大鼠鞘内注射体积均为10uL,连续注射3天。自第1天注射开始计算,第5天时,生理盐水心脏灌注后取材。随后利用Western Blot及RT-qPCR的方法,进行检测并评价慢病毒鞘内注射的效果从而确定慢病毒的注射滴度。5.蛋白印记法测定CCD后DRG及脊髓背角组织中的蛋白表达手术侧L4及L5背根神经节以及相应节段的脊髓背角,提取总蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳法使蛋白分离,转印蛋白至PVDF膜,室温封闭、一抗及二抗孵育后显影。检测鞘内注射慢病毒干扰ERK后,DRG及脊髓背角组织中TRPV4、ERK及P-ERK蛋白表达变化。6.实时定量荧光PCR测定DRG及脊髓背角组织中mRNA的表达变化手术侧L4及L5背根神经节及相应节段的脊髓背角,快速取材,提取总RNA,测定浓度。利用Real-time quantitative PCR检测DRG及脊髓背角组织中TRPV4、ERK1及ERK2的mRNA表达变化。各指标的引物序列同第一部分。7.免疫共沉淀使用IP-WB裂解液,提取DRG和脊髓背角的组织总蛋白后,采用Prorein A-argarose方法,分别用anti-TRPV4抗体和anti-ERK抗体与之反应,进行免疫共沉淀结合。沉淀后的复合物利用蛋白印记法进行分析,分别观察各组中是否存在所需目的蛋白。8.脊髓和DRG的免疫组织化学染色一抗为:anti-NeuN 多克隆抗体(小鼠抗大鼠,1:300,Abcam,USA);anti-ERK多克隆抗体(兔抗大鼠,1:500,CST,USA);anti-P-ERK多克隆抗体(兔抗大鼠,1:200,CST,USA);anti-TRPV4多克隆抗体(兔抗大鼠,1:200,Abcam,USA)。二抗为:辣根过氧化物酶标记-山羊抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶标记-山羊抗兔IgG(北京义翘神州科技有限公司)。经DAB显染色和苏木素染核后,观察目的蛋白的组织定位。9.脊髓和背根神经节ERK-TRPV4免疫荧光双标染色一抗分别为:小鼠抗大鼠ERK多克隆抗体(1:500,CST,USA),采用兔抗大鼠TRPV4多克隆抗体(1:200,Abcam,Cambridge,,UK)。二抗为:488(绿色)荧光标记的驴抗小鼠-IgG(H+L)和594(红色)标记的驴抗兔-IgG(H+L),采用防荧光淬灭封片剂的DAPI染剂封片,观察并采集图片,计数阳性细胞并分析共同表达阳性细胞比率。10.脊髓NeuN-ERK和NeuN-TRPV4免疫组织荧光双标染色采用NeuN神经元标记物标记脊髓背角的神经元细胞,一抗分别为:小鼠抗大鼠NeuN多克隆抗体(1:300,Abcam,USA);兔抗大鼠ERK多克隆抗体(1:500,CST,USA);兔抗大鼠TRPV4多克隆抗体(1:200,Abcam,USA)。二抗为 488(绿色)标记的驴抗小鼠-IgG(H+L)和594(红色)标记的驴抗兔-IgG(H+L),采用防荧光淬灭封片剂的DAPI染剂封片。高倍镜下观察神经元形态,同时统计计算阳性神经元细胞比率。结果1.正常大鼠鞘内注射慢病毒及滴度确定由于10^7 TU组,鞘注后死亡4只,死亡率大于50%,该病毒滴度不利于大鼠的正常生存,取消该分组。其余各组未出现大鼠死亡。鞘内注射慢病毒ERK干扰载体后5天,Western Blot检测发现10^6组ERK表达均明显下调(n=6,P<0.05,与CON组比较),而10^4组和10^5组无明显变化。RT-qPCR检测发现,10^6 TU组的ERK1和ERK2的mRNA表达均明显下调(n=6,P<0.01,与CON组比较)。通过ERK总蛋白及mRNA含量测定以观察ERK干扰效果,10^6 TU即为慢病毒转染载体实验有效滴度。2.机械刺激缩爪反应阈值和热刺激缩爪反应潜伏期的变化连续14天的行为学检测发现,大鼠CCD模型术后,机械刺激缩爪反应阈值自第2天开始,出现下降,与CON组相比较,CCD组第4天到第10天机械刺激缩爪反应阈值的显着降低(n=6,P<0.01)。给予鞘内注射慢病毒ERK shRNA干扰后第2天,机械刺激缩爪反应阈值较慢病毒阴性对照组显着提高(n=6,P<0.01),慢病毒阴性对照组与CCD组不显着差异。CCD术后第2天开始,大鼠热刺激缩爪反应潜伏期开始下降,与CON组相比较,CCD组第4天到第12天机热刺激缩爪反应潜伏期的显着降低(n=6,P<0.01)。给予鞘内注射慢病毒ERK shRNA干扰后第3天,热刺激缩爪反应潜伏期较慢病毒阴性对照组显着提高(n=6,P<0.01),慢病毒阴性对照组与CCD组不显着差异。3.CCD大鼠鞘内注射慢病毒ERK shRNA干扰后蛋白表达的变化大鼠DRG及脊髓背角的CCD组与CCD+Lv-shNC组均无明显差异;分别比较两种组织中蛋白,与CON组相比,CCD组TRPV4、ERK及P-ERK蛋白表达均增加(n=6,P<0.01);与CCD+Lv-shNC组相比,CCD+Lv-shERK组TRPV4、ERK及P-ERK均表达下降(n=6,P<0.01)。4.TRPV4和ERK1/2的mRNA基因检测大鼠DRG及脊髓背角的CCD组与CCD+Lv-shNC组均无明显差异;分别比较两种组织mRNA水平的表达发现,与CON组相比,CCD组TRPV4、ERK1及ERK2在mRNA水平的表达上调(n=6,P<0.01);给予慢病毒干扰后,ERK1和ERK2明显下调,而TRPV4亦伴随ERK的变化而变化,TRPV4的mRNA表达明显下调(n=6,P<0.01,与阴性对照相比较)。5.脊髓背角和DRG组织免疫共沉淀经过anti-TRPV4抗体共沉淀反应后,免疫复合物进行Western Blot检测分析,可检测到TRPV4和ERK蛋白,即表明在脊髓背角和DRG中ERK可被TRPV4抗体沉淀。同时,anti-ERK抗体沉淀的免疫复合物,亦可检测到TRPV4和ERK蛋白,即表明在脊髓背角和DRG中TRPV4可被ERK抗体沉淀,ERK与TRPV4之间存在密切联系。6.免疫组织化学染色法定位DRG组织中NeuN、TRPV4和ERK的分布正常大鼠DRG组织中,NeuN标记的神经元细胞,TRPV4、ERK及P-ERK在DRG中主要分布于大、中型神经元细胞中。7.免疫组织化学染色法定位脊髓背角组织中NeuN、TRPV4和ERK的分布正常大鼠的脊髓背角中,NeuN标记的神经元,TRPV4和ERK、P-ERK标记的细胞均在大鼠脊髓背角的灰质的第I至IV层中均表达及分布。8.CCD后ERK和TRPV4在背根神经节和脊髓背角的阳性细胞数的变化ERK和TRPV4荧光标记的阳性细胞在手术侧和非手术侧均有分布。相较于非手术侧,手术侧的脊髓背角内TRPV4阳性细胞数目和ERK阳性细胞数目,统计技术后均明显较多(n=6,P<0.01)。进而分析ERK和TRPV4共同表达的阳性细胞数,手术侧明显高于对侧(n=6,P<0.01)。9.CCD后TRPV4和ERK在脊髓背角的蛋白表达变化手术侧脊髓背角大鼠背根神经节持续受压后第2至第10天,TRPV4表达升高,同时伴随ERK及P-ERK的表达升高,差异有显着性意义。非手术侧,各组与对照组相比,差异无统计学意义。10.ERK和TRPV4在脊髓背角的阳性神经元比率的变化NeuN神经元标记物标记脊髓背角的神经元细胞,在大鼠脊髓背角的神经元细胞质及细胞核内ERK和TRPV4均有表达,与非手术侧相比,手术侧表达NeuN-ERK和NeuN-TRPV4的阳性神经元百分比同时明显增加(n=6,P<0.01)。结论1.ERK-TRPV4通路参与大鼠背根神经节持续受压致痛觉敏感的发生机制。2.慢病毒干扰ERK后可缓解CCD诱导的痛觉敏感,同时伴随背根神经节和脊髓背角中TRPV4的表达下降。3.大鼠背根神经节持续受压后,手术侧脊髓背角内ERK和TRPV4蛋白表达上调及阳性神经元比率增多,且两者在DRG和脊髓背角共定位的阳性细胞增加,两者之间存在相互联系,ERK-TRPV4通路参与了CCD后痛觉敏感的DRG周围敏化和脊髓中枢敏化的机制。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-20）

马丹^[2]（2019）在《宽筋藤对寒痹、热痹模型大鼠痛觉敏感干预作用的研究》一文中研究指出中医在治疗痹证疼痛方面拥有悠久的历史和丰富的经验,而对不同痹证疼痛的治疗方法也有所区别。本实验采用完全弗氏佐剂所致的大鼠痹证疼痛模型,同时在痹证模型基础上引入寒凉和湿热因素,并结合传统中药宽筋藤干预,分析中医对不同痹证疼痛的治疗效果并对其中枢敏化层面上的镇痛机制评价,体现中医辨证施治的意义。1.宽筋藤抗炎镇疼痛作用的研究目的:探究宽筋藤镇痛抗炎作用的机制,并分析其作用机制。方法:将大鼠按随机数字法分为7组,即正常组、模型组、泼尼松组、宽筋藤水提物1.2g/kg、2.4g/kg组、宽筋藤醇提物1.2g/kg、2.4g/kg组。除对照组外其余各组大鼠足跖部皮内注射完全弗氏佐剂造模,各组于造模后24h开始第一次灌胃给药,1次/天,共灌胃12天。第一次给药2h后进行体重、50%机械缩足痛反应值、热缩足反应时间及患足足跖肿胀率的测定,之后每间隔一天进行测定。给药12天后灌注取材,制作脊髓免疫组化切片,观察NMDA受体的表达情况。并取血清,酶联免疫分析法(ELISA)检测血清IL-1α、IL-6、IL-10、TNF-α的含量。结果:①足肿胀率:造模后模型动物肿胀率显着增加(与对照组相比较P<0.01),且肿胀程度在造模后第3天达到峰值。宽筋藤水提物、醇提物各剂量在造模后第1、3天可明显降低大鼠足跖的肿胀程度(与模型组相比较P<0.01),且宽筋藤水提物1.2g/kg,醇提物2.4g/kg在其余各时间点其大鼠足肿胀率均明显低于模型组大鼠(与模型组相比较P<0.05,P<0.01)。②热缩足反应时间:造模后模型动物患足热缩足反应时间明显缩短(与对照组相比较P<0.01),且在造模后第3天达到最低值。宽筋藤水提物1.2g/kg、2.4g/kg,宽筋藤醇提物1.2g、2.4g/kg在造模后12d内均可显着延长大鼠热缩足痛反应时间(与模型组相比较P<0.01)。③50%机械缩足反应值:造模后模型动物患足50%机械缩足反应值显着降低(与对照组相比较P<0.01),且在造模后第3天达到最低点。宽筋藤水提物、醇提物各剂量在给药1h后即可显着增加动物50%机械缩足反应值(与模型组相比较P<0.01),造模后12d内可显着增加大鼠50%机械缩足反应(与模型组相比较P<0.01)。④炎性细胞因子:模型大鼠血清炎症细胞因子IL-1α、TNF-α、IL-6含量显着增加(与正常组比较P<0.05,P<0.01),IL-10含量显着降低(与正常组比较P<0.05,P<0.01)。给药12d后,宽筋藤水提物1.2g、2.4g/kg,宽筋藤醇提物1.2g、2.4g/kg均可显着降低模型大鼠血清IL-1α、TNF-α、IL-6含量并升高模型大鼠IL-10含量(与模型组比较P<0.05,P<0.01),对炎性疼痛有一定的治疗作用。⑤脊髓中NMDA受体表达量:造模后,炎性疼痛模型大鼠损伤侧的脊髓背角中NMDA受体表达显着增加(与正常组比较P<0.01)。宽筋藤水提物1.2g、2.4g/kg,宽筋藤醇提物1.2g、2.4g/kg均可显着抑制炎性疼痛模型大鼠患侧脊髓中NMDA受体表达量的增加(与模型组比较P<0.01)。结论:宽筋藤水提物、醇提物均可有效抑制炎性疼痛模型大鼠对于温度和机械性刺激敏感性的升高;宽筋藤的镇痛抗炎机制与其降低外周炎症因子和抑制脊髓背角NMDA受体的表达有关;宽筋藤的水提物和醇提物镇痛抗炎效果基本相同,故后续试验采用宽筋藤水提物。2宽筋藤对寒痹、热痹大鼠痛觉敏感干预作用的研究目的:观察宽筋藤对寒痹、热痹模型大鼠痛觉过敏的干预作用及其作用的差异;并从痛觉的中枢敏化角度分析其作用原理。方法:将大鼠按随机数字法分为11组,即正常组、模型组、布洛芬组、热痹模型组、寒痹模型组、宽筋藤热痹模型0.6g/kg、1.2g/kg、2.4g/kg组、宽筋藤寒痹模型0.6g/kg、1.2g/kg、2.4g/kg组。除对照组外,各组大鼠足跖部皮内注射完全弗氏佐剂造模后第二天,将寒热痹症各模型及给药组分别放入恒温气候箱中4h,造模持续14d。各给药组于足底造模后24h开始第一次灌胃给药14d。造模前及造模后3d、7d、10d、14d分别进行50%机械痛反应值、热缩足反应时间指标的测定。在末次给药后一天对每组六只灌注取材,制作脊髓和患侧背根神经节的免疫组化切片,观察CD11b、CX3CL1、CX3CR1、NMDA受体指标的表达情况。末次给药后对大鼠进行取材,每组剩余六只大鼠麻醉后取新鲜的脊髓放入冻存管中迅速冷冻。蛋白质印迹法测定大鼠脊髓中CX3CL1、CX3CR1和NMDAR的表达情况。结果:①热缩足反应时间:模型大鼠热缩足反应时间显着降低(与同组基础值相比较P<0.01),且于造模后第7天达到最低,在造模后第14天未见明显恢复。引入寒凉、湿热因素后,可不同程度的延长大鼠热缩足反应时间,其中寒凉因素的影响效果更明显。宽筋藤各剂量组可不同程度延长热痹模型大鼠患足的热缩足反应时间,其中宽筋藤2.4g/kg在给药后第14天,宽筋藤1.2g/kg在给药后第7、10、14天,宽筋藤0.6g/kg在给药后第7天作用明显(与热痹模型组相比较P<0.05,P<0.01);宽筋藤各剂量组可不同程度降低寒痹模型大鼠对温度刺激的敏感性。②50%机械缩足反应值:模型大鼠50%机械痛反应值显着降低(与同组基础值相比较P<0.01)。模型组大鼠在造模后各时间点患足50%机械痛反应值均明显低于对照组(与对照组相比较P<0.01),且于造模后第7天50%机械痛反应值达到最低,在造模后第14天未见明显恢复。引入寒凉、湿热因素14d后,均可不同程度的升高大鼠患足对机械刺激的敏感性,其中寒凉因素的影响更显着(与模型组相比较P<0.01)。宽筋藤各剂量组可不同程度提高热痹模型大鼠的50%机械痛反应值,其中宽筋藤2.4g/kg在给药14d内可持续抑制热痹模型大鼠50%机械痛反应值的升高(与热痹模型组相比较P<0.05,P<0.01);宽筋藤2.4g/kg在给药14d内可持续促进热痹模型大鼠50%机械痛反应值的升高(与寒痹模型组相比较P<0.05,P<0.01)。③蛋白质印迹法测定脊髓中通路表达量:模型大鼠脊髓中CX3CL1、CX3CR1、NMDA趋化因子及其相关受体蛋白表达显着升高(与对照组相比较P<0.01)。寒凉因素和湿热因素的引入均可显着增加模型大鼠脊髓中CX3CL1、CX3CR1、NMDAR的表达(与模型组相比较P<0.05),其中湿热因素的效果更明显。给予宽筋藤水提物之后,各模型组及热痹模型组大鼠脊髓中CX3CL1、CX3CR1、NMDA趋化因子及其受体蛋白的表达显着减少(与模型组相比较P<0.01)。④免疫组织化学法测定脊髓中通路表达量:模型大鼠脊髓中CD11b、CX3CL1、CX3CR1、NMDA趋化因子及其相关受体表达显着增加(与对照组相比较P<0.01)。寒凉因素和湿热因素的引入均可增加模型大鼠脊髓中CD11b、CX3CL1、CX3CR1、NMDAR表达,其中寒凉因素的效果更明显。灌胃给药宽筋藤水提物各剂量之后,各模型组及热痹模型组大鼠脊髓中CX3CR1、CX3CL1、NMDA趋化因子及其受体蛋白的表达显着减少(与模型组相比较P<0.05,P<0.01)。⑤免疫组织化学法测定患侧背根神经节中通路表达量:模型大鼠患侧背根神经节中CD11b、CX3CL1、CX3CR1、NMDA趋化因子及其相关受体蛋白的表达显着增加(与对照组相比较P<0.01)。寒凉因素和湿热因素的引入均可增加模型大鼠患侧背根神经节中CD11b、CX3CL1、CX3CR1、N]MDAR的表达,其中寒凉因素的效果更明显。灌胃给药宽筋藤水提物各剂量之后,各热痹模型组大鼠患侧背根神经节中CD11b、CX3CL1、CX3CR1、NMDA受体蛋白的表达显着减少(与模型组相比较P<0.05,P<0.01)。结论:寒凉和湿热因素均可不同程度的加强痹症模型大鼠痛觉敏感程度;宽筋藤水提物可有效减轻热痹疼痛模型大鼠痛觉敏感程度,而对寒痹疼痛模型大鼠的痛觉敏感有一定程度的加强作用;宽筋藤在中枢敏化层面上的镇痛机制与其有效的抑制CD11b、CX3CL1、CX3CR1、NMDA几种趋化因子及其受体蛋白的表达有关。(本文来源于《北京中医药大学》期刊2019-05-01）

徐欣,王军^[3]（2018）在《针刺腧穴痛觉敏感点治疗偏头痛的临床观察》一文中研究指出目的:观察针刺腧穴痛觉敏感点治疗偏头痛的临床疗效。方法:将60例偏头痛患者随机分为痛敏穴组和非穴组,确定受测者头部、颈部、上肢、下肢相应腧穴,用圆形探棒寻找痛觉敏感点,痛敏穴组在敏感点处行针刺泻法操作,非穴组在敏感点外旁开5mm处浅刺2～3mm,不做补泻手法,均留针20min,每周治疗2次,12次为1个疗程,1个疗程后评价治疗结果。结果:痛敏穴组治疗后VAS评分显着下降(P<0.05),各腧穴敏感点压痛阈值显着增高(P<0.05),其中角孙穴的敏感点治疗后压痛阈值显着增高(P<0.01);非穴组治疗后VAS评分较治疗前无显着性差异,各腧穴敏感点压痛阈值与治疗前相比无显着性差异。结论:针刺腧穴敏感点能明显提高皮肤压痛阈值,从而减轻患者对疼痛的敏感度,达到临床治疗偏头痛的目的。(本文来源于《中华中医药杂志》期刊2018年12期）

张天睿,张硕峰,宋敬怡,马丹,程龙^[4]（2018）在《祖师麻肠溶微丸对结扎坐骨神经所致痛觉敏感大鼠背根神经节P2X4受体及P38MAPK表达的影响》一文中研究指出目的:观察灌胃给予祖师麻肠溶微丸对CCI大鼠的MWT以及背根神经节中P2X4和P38MAPK受体的影响,探究祖师麻肠溶微丸治疗坐骨神经痛的机制。方法:术后第8天按MWT值对位随机分配法分为7组:Control组、Sham组、Model组、Positive Drug组、HEPZ组、MEPZ组和LEPZ组,于术后第8天开始灌胃给药。给药14 d后灌注固定,取背根神经节,免疫组化观察P2X4和P38MAPK的表达情况。结果:Model组在第8、14和20天MWT明显降低(P<0.01)。与Model组相比,其余各组第14天MWT值出现显着差异(P<0.01),20 d以后差异持续存在(P<0.01)。免疫组化P2X4在背根神经节中的表达情况,各组均与Model组有统计学差异(P<0.01),P38MAPK的表达情况除Positive Drug组外,各组与Model组相比,有明显差异(P<0.05)。结论:口服祖师麻肠溶微丸可明显改善CCI模型,提高MWT,且背根神经节中P2X4和P38MAPK受体表达下调,提示祖师麻肠溶微丸有治疗坐骨神经痛的作用,其止痛的效果与P2X4-P38MAPK通路有关。(本文来源于《辽宁中医药大学学报》期刊2018年09期）

张家君,岳伟,张灿文,胡冬梅,袁慧^[5]（2018）在《JNK抑制剂对福尔马林内脏炎症痛大鼠痛觉敏感化的影响》一文中研究指出目的:考察JNK抑制剂SP600125对大鼠内脏炎症痛疼痛评分和脊髓背角神经元电活动的影响,探索JNK抑制剂对内脏炎症痛痛觉敏感化的作用。方法:清洁级雄性SD大鼠,重200~250 g,随机分为4组:福尔马林直肠致炎组(F组);福尔马林直肠致炎和脊髓蛛网膜下腔内插管组(IT组);福尔马林直肠致炎、脊髓蛛网膜下腔内插管并注射生理盐水组(Na Cl组);福尔马林直肠致炎、脊髓蛛网膜下腔内插管并注射SP600125组(SP600125组);每组大鼠12只,共48只。4组大鼠,每组8只,每15 min作为一个时间段,共8个时间段,分别记录内脏炎症痛疼痛评分和脊髓背角神经元放电。结果:四组大鼠都在注射福尔马林后30 min均达到疼痛评分的最大值,并且在福尔马林注射后45 min至120 min之间,其疼痛评分逐渐降低至正常。SP600125组在前90 min内疼痛分数显着低于F组(P<0.05或P<0.01),而IT组和Na Cl组与F组相比未见显着性差异。注射福尔马林后,F组神经元放电频率均立即明显增加,致炎后0~15 min、15~30 min和30~45 min内的放电频率分别为致炎前基线水平的252.36±28.76%、288.74±40.64%和186.47±32.16%,与致炎前相比均有显着性增加(P<0.05或P<0.01)。SP600125组在致炎后0~15 min、15~30 min和30~45 min两时间段的脊髓背角神经元放电频率分别为基线水平的146.86%±25.79%、175.49%±28.74%和126.48%±21.68%,分别与F组致炎后0~15 min、15~30 min和30~45 min内的放电频率(252.36±28.76%、288.74±40.64%和186.47±32.16%)相比均有显着性的降低(P<0.05或P<0.01);F和IT、Na Cl组相比没有显着性差异。结论:JNK抑制剂SP600125通过降低内脏炎症痛疼痛评分和抑制脊髓背角神经元放电,起到抑制内脏炎症痛痛觉敏感化作用,JNK可能为内脏炎症痛镇痛靶点之一。(本文来源于《中国疼痛医学杂志》期刊2018年06期）

李秀娟,李黛,陈辉,熊源长^[6]（2018）在《脊髓背角基质细胞衍生因子1对皮肤肌肉切口牵拉术致持续性疼痛大鼠中枢敏感化及痛觉过敏的影响》一文中研究指出目的观察脊髓背角基质细胞衍生因子1(SDF-1)对皮肤肌肉切口牵拉术(SMIR)致持续性疼痛大鼠中枢敏感化及痛觉过敏的影响,为探讨术后慢性疼痛的发生机制和治疗靶点提供依据。方法采用SMIR后持续性疼痛大鼠模型。将36只雄性SD大鼠随机分为假手术组(仅切开皮肤)和SMIR后1、5、10、20 d组以及SMIR+鞘内注射SDF-1中和性抗体组,每组6只大鼠。用up-down法测定术后大鼠痛行为学,用蛋白质印迹法检测各组大鼠脊髓组织中SDF-1的表达。再取18只雄性SD大鼠随机分为假手术组、SMIR组和SMIR+脊髓表面给予SDF-1中和性抗体组(每组6只大鼠),检测3组大鼠脊髓背角C纤维诱发场电位长时程增强(LTP)的变化。结果与假手术组大鼠相比,SMIR后第5、10、20天大鼠脊髓组织SDF-1表达均增加(P均<0.05),且SMIR后大鼠痛阈降低(P<0.01),鞘内注射SDF-1中和性抗体可部分逆转SMIR引起的痛阈下降(P<0.05)。SMIR后1 h脊髓背角LTP升高(P<0.01),脊髓表面给予SDF-1中和性抗体可抑制SMIR导致的LTP升高(P<0.01)。结论脊髓背角SDF-1参与了SMIR致持续性疼痛大鼠中枢敏感化及痛觉过敏,但具体机制有待进一步研究。(本文来源于《第二军医大学学报》期刊2018年05期）

莫思怡,徐啸翔,曹烨,颉慧菲,谢秋菲^[7]（2018）在《重复咬合干扰对大鼠咬肌痛觉敏感的易化作用》一文中研究指出目的:分析初次咬合干扰对再次咬合干扰致大鼠咀嚼肌痛觉敏感的影响。方法:于大鼠右上第一磨牙粘固0.4mm厚金属冠,建立咬合干扰;初次干扰2d后去除,再次干扰2d或4d后去除,测试2次干扰前后多个时间点双侧咬肌机械摆头阈值。结果:初次干扰2d去除后阈值需8d恢复至基线;初次干扰2d后再次干扰2d去除,阈值需10d恢复至基线;初次干扰2d后再次干扰4d去除,阈值需19d恢复至基线;初次假手术后再次干扰4d去除,阈值仅需12d恢复至基线。结论:初次咬合干扰2d对再次咬合干扰2d、4d致咬肌痛敏有易化作用,表现在延长了再次咬合干扰致咬肌痛敏的恢复时间。本研究成功建立了重复咬合干扰易化咀嚼肌痛敏的动物模型。(本文来源于《口腔医学研究》期刊2018年03期）

李云泽^[8]（2017）在《脊髓内NF-kappa B p65信号通路在膝关节骨性关节炎所致痛觉敏感中的作用》一文中研究指出研究背景膝关节骨性关节炎(Knee Osteoarthritis,KOA)是老年人中的常见病和多发病,严重损害患者身心伤害,同时给社会带来了巨大的经济负担。KOA主要表现为膝关节慢性疼痛、活动障碍甚至残疾,而难以忍受的慢性疼痛往往是患者就医的主要原因。目前,KOA慢性疼痛的药物治疗效果不佳,且患者长期用药易产生耐药及严重的副作用。KOA后期,患者不得不选择进行膝关节置换术来改善关节的功能、缓解疼痛。然而,全膝关节置换术(total knee replacement,TKR)后6个月内,仍有16%-39%的患者存在膝关节疼痛。因此,目前针对KOA后期慢性、难治性疼痛缺乏行之有效的治疗方法,患者只能长期忍受慢性疼痛带来的身体上和精神上的折磨。除此之外,相关的研究还表明膝关节痛还会使得患者的死亡率增高。基于患者对KOA慢性疼痛有效治疗方案的迫切需求,临床研究人员也渐渐开始关注KOA慢性疼痛,KOA慢性疼痛的发病机制及治疗方案的研究也渐渐成为研究的热点。临床研究发现,患者疼痛的严重程度及持续时间与关节内部的病理改变不成正比。进一步的研究证实,疼痛相关中枢神经系统的改变相比于外周因素在KOA慢性疼痛发生和发展过程中发挥着更为重要的作用。目前,临床上已经尝试通过对神经系统的干预来治疗KOA患者后期产生的慢性难治性疼痛。因此,探索KOA导致的慢性疼痛的中枢发病机制也许能够为我们找到KOA慢性疼痛治疗的理想靶点。核因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)是一种重要的核转录因子,在免疫和炎症反应、细胞的分裂和凋亡过程中发挥着必不可少的作用。除了发挥上述重要作用外,在神经系统中NF-κB还能够参与到学习、记忆和疼痛的形成过程中。多项研究发现,在脊髓甚至是更高级别的中枢神经系统内炎症、创伤等刺激因素本身及随之产生炎症因子、神经递质和神经营养因子均可导致NF-κB信号通路的激活。NF-κB信号通路的激活又可以使进一步的导致脊髓内炎症反应加重、神经递质释放量增加以及离子通道功能改变,进而导致疼痛程度加剧。当刺激因素持续存在,NF-κB信号通路处于长期激活状态,脊髓背角内炎症慢性化、神经递质受体大幅度增加,甚至导致神经元及神经胶质细胞产结构性的改变,产生慢性、难治性及神经病理性疼痛。NF-κB二聚体是其最常见的活性状态,p50/p65是最常见的二聚体形式,其中主要由p65与目的基因结合因此我们选择NF-κB/p65作为我们的研究对象。前期研究已证实,干扰脊髓内NF-κB/p65的表达能够减轻风湿性膝关节炎的疼痛程度,同时还能够改善外周炎症反应。然而,在主要表现为慢性退行性病变而非炎症反应的骨性关节炎中NF-κB/p65是否能够发挥同样的作用却未见报道。本研究将在以碘乙酸钠(monosodium iodoacetate,MIA)建立的KOA大鼠模型上,对NF-κB/p65在KOA导致的慢性疼痛及关节破坏的进展速度上所发挥的作用进行研究。研究目的本研究目的是通过关节内注射MIA建立的KOA大鼠模型,探索脊髓内NF-κB/p65信号通路在KOA导致的疼痛敏感的形成过程中的作用及其机制。研究方法1、采用随机数字法将健康的雌性SD大鼠为叁组:对照组、KOA模型组和NF-κ B抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)鞘内给药的KOA模型组,每组50只。自大鼠关节腔内注射MIA完成当天起,每天鞘内给予大鼠PDTC 12μl(0.2mg/ml)直至相应时间点。2、MIA注射前1d和注射后7d、14d、21d和28d通过检测50%缩足阈值(paw withdrawal threshold,PWT)对大鼠的机械痛域进行检测。于相同时间点,通过直接拍照和制作病理切片的方法对大鼠关节面肉眼及显微镜下的病理学改变进行观察和评估;采用Western blot技术、免疫荧光技术和RT-PCR(real-time polymerase chain reaction)技术检测大鼠脊髓内NF-κ B/p65的蛋白量和转录水平的变化;采用 RT-PCR检测 IL-1β(interleukin-1β)、IL-33 和 TNF-α(tumor necrosis factor-α)的转录水平的变化趋势。结果MIA注射后,KOA模型组大鼠膝关节的痛觉敏感程度逐渐增加,并于14d到达高峰后维持在较高水平;关节面破坏程度不断加重、关节间隙逐渐变窄,符合临床上KOA的变化特点。脊髓内NF-κB/β65的蛋白水平和mRNA水平与大鼠痛觉敏感程度的变化趋势一致,脊髓内IL-1β、IL-33和TNF-α的转录水平逐渐增加,峰值与NF-κB/p65一致。鞘内注射PDTC模型组MIA注射后21d起痛觉敏感程度较模型组明显降低,向KOA模型大鼠鞘内注射PDTC后大鼠脊髓内NF-κB/p65的蛋白水平和mRNA水平较模型组明显降低。鞘内注射PDTC模型组大鼠MIA注射后28d时脊髓内的IL-1 β、IL-33和TNF-α转录水平较模型组也明显降低。结论骨性关节炎导致脊髓背角内NF-κB/p65蛋白和mRNA的表达量的上调;鞘内注射阻滞剂PDTC能够下调脊髓内NF-κB/p65蛋白和mRNA的表达量,并且在KOA中后期能够降低大鼠的痛觉敏感程度。结果表明,脊髓内NF-κB/p65在KOA中后期产生的痛觉过敏中发挥着重要的作用。此外,下调脊髓内NF-κB/p65还能抑制IL-1β、IL-33和TNF-α在KOA中后期的过表达。在骨性关节炎的进展的后期,脊髓内NF-κB/p65增加了大鼠的痛觉敏感程度有可能是通过上调IL-1β、IL-33和TNF-α的表达量而导致的。(本文来源于《山东大学》期刊2017-05-04）

王军,徐欣,陈叁叁,刘然^[9]（2016）在《针刺腧穴痛觉敏感点治疗偏头痛的临床观察》一文中研究指出目的:观察针刺腧穴痛觉敏感点治疗偏头痛的临床疗效。方法:将60例偏头痛患者随机分配到针刺组和假针刺组,确定受测者头部、颈部、上肢、下肢相应的腧穴,用圆形探棒寻找痛觉敏感点,用标记笔在标出,以数字测力计检测相关穴位的疼痛阈值,针刺组在敏感点处行针刺补泻操作,假针刺组在敏感点外旁开3mm处浅刺2-3mm,不做补泻手法,均留针20min,每周治疗2次,共12次为一疗程。结果:针刺组治疗后VAS评分较治疗前明显下降(P<0.05),各腧穴压痛阈值显着增高(P<0.05),其中角孙穴治疗后压痛阈值非常明显增高(P<0.01);假针刺组治疗后VAS评分较治疗前没有下降没有显着性差异(P>0.05),各腧穴处压痛阈值与治疗前相比没有显着性差异(P>0.05)。结论:针刺腧穴敏感点能明显提高皮肤压痛阈值,从而减轻患者对疼痛的敏感度,达到治疗偏头痛的目的;针刺腧穴非敏感点不能明显提高皮肤压痛阈值,不能减轻患者对疼痛的敏感度,对治疗偏头痛效果不明显。(本文来源于《第二十二届全国针灸临床学术研讨会暨第二届全国针灸学术流派交流研讨会暨河南省针灸学会针灸临床分会2016年年会暨河南省针灸临床应用及特色技术学术交流会会议学习资料参会代表论文集》期刊2016-08-05）

李帆,毕生龙,陈艾琼,宋俪^[10]（2016）在《不同剂量右美托咪啶用于妇科腹腔镜对瑞芬太尼术后痛觉敏感的临床观察》一文中研究指出目的:观察不同剂量的右美托嘧啶在妇科腹腔镜中处理瑞芬太尼导致的术后痛觉敏感的影响。方法:选ASAⅠ或Ⅱ级行妇科腹腔镜全麻患者90例,随机分为3组:对照组(D组)、实验组(S1组)和(S2组),每组30例。麻醉诱导前15 min,分别静脉给D组生理盐水,S1组右美托嘧啶0.5μg·kg-1,S2组右美托嘧啶1μg·kg-1,分别记录VAS评分、RAMSAY评分、患者的苏醒时间、术后呕吐和寒颤率。结果:S1组和S2组VAS评分明显小于D组(P<0.05);术后呕吐和寒颤发生率S1和S2组也低于D组(P<0.05)。结论:静脉给予右美托嘧啶0.5μg·kg-1或者1μg·kg-1能有效的缓解瑞芬太尼引起的术后痛觉敏感,右美托嘧啶0.5μg·kg-1对术后防呕吐和寒颤效果确切、安全,呈剂量依赖性,但剂量越大,出现血压下降,心率下降患者增多。右美托嘧啶0.5μg·kg-1对于控制常规的妇科腹腔镜手术后的呕吐和寒战最确切,最安全。(本文来源于《赣南医学院学报》期刊2016年01期）

痛觉敏感论文开题报告

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

中医在治疗痹证疼痛方面拥有悠久的历史和丰富的经验,而对不同痹证疼痛的治疗方法也有所区别。本实验采用完全弗氏佐剂所致的大鼠痹证疼痛模型,同时在痹证模型基础上引入寒凉和湿热因素,并结合传统中药宽筋藤干预,分析中医对不同痹证疼痛的治疗效果并对其中枢敏化层面上的镇痛机制评价,体现中医辨证施治的意义。1.宽筋藤抗炎镇疼痛作用的研究目的:探究宽筋藤镇痛抗炎作用的机制,并分析其作用机制。方法:将大鼠按随机数字法分为7组,即正常组、模型组、泼尼松组、宽筋藤水提物1.2g/kg、2.4g/kg组、宽筋藤醇提物1.2g/kg、2.4g/kg组。除对照组外其余各组大鼠足跖部皮内注射完全弗氏佐剂造模,各组于造模后24h开始第一次灌胃给药,1次/天,共灌胃12天。第一次给药2h后进行体重、50%机械缩足痛反应值、热缩足反应时间及患足足跖肿胀率的测定,之后每间隔一天进行测定。给药12天后灌注取材,制作脊髓免疫组化切片,观察NMDA受体的表达情况。并取血清,酶联免疫分析法(ELISA)检测血清IL-1α、IL-6、IL-10、TNF-α的含量。结果:①足肿胀率:造模后模型动物肿胀率显着增加(与对照组相比较P<0.01),且肿胀程度在造模后第3天达到峰值。宽筋藤水提物、醇提物各剂量在造模后第1、3天可明显降低大鼠足跖的肿胀程度(与模型组相比较P<0.01),且宽筋藤水提物1.2g/kg,醇提物2.4g/kg在其余各时间点其大鼠足肿胀率均明显低于模型组大鼠(与模型组相比较P<0.05,P<0.01)。②热缩足反应时间:造模后模型动物患足热缩足反应时间明显缩短(与对照组相比较P<0.01),且在造模后第3天达到最低值。宽筋藤水提物1.2g/kg、2.4g/kg,宽筋藤醇提物1.2g、2.4g/kg在造模后12d内均可显着延长大鼠热缩足痛反应时间(与模型组相比较P<0.01)。③50%机械缩足反应值:造模后模型动物患足50%机械缩足反应值显着降低(与对照组相比较P<0.01),且在造模后第3天达到最低点。宽筋藤水提物、醇提物各剂量在给药1h后即可显着增加动物50%机械缩足反应值(与模型组相比较P<0.01),造模后12d内可显着增加大鼠50%机械缩足反应(与模型组相比较P<0.01)。④炎性细胞因子:模型大鼠血清炎症细胞因子IL-1α、TNF-α、IL-6含量显着增加(与正常组比较P<0.05,P<0.01),IL-10含量显着降低(与正常组比较P<0.05,P<0.01)。给药12d后,宽筋藤水提物1.2g、2.4g/kg,宽筋藤醇提物1.2g、2.4g/kg均可显着降低模型大鼠血清IL-1α、TNF-α、IL-6含量并升高模型大鼠IL-10含量(与模型组比较P<0.05,P<0.01),对炎性疼痛有一定的治疗作用。⑤脊髓中NMDA受体表达量:造模后,炎性疼痛模型大鼠损伤侧的脊髓背角中NMDA受体表达显着增加(与正常组比较P<0.01)。宽筋藤水提物1.2g、2.4g/kg,宽筋藤醇提物1.2g、2.4g/kg均可显着抑制炎性疼痛模型大鼠患侧脊髓中NMDA受体表达量的增加(与模型组比较P<0.01)。结论:宽筋藤水提物、醇提物均可有效抑制炎性疼痛模型大鼠对于温度和机械性刺激敏感性的升高;宽筋藤的镇痛抗炎机制与其降低外周炎症因子和抑制脊髓背角NMDA受体的表达有关;宽筋藤的水提物和醇提物镇痛抗炎效果基本相同,故后续试验采用宽筋藤水提物。2宽筋藤对寒痹、热痹大鼠痛觉敏感干预作用的研究目的:观察宽筋藤对寒痹、热痹模型大鼠痛觉过敏的干预作用及其作用的差异;并从痛觉的中枢敏化角度分析其作用原理。方法:将大鼠按随机数字法分为11组,即正常组、模型组、布洛芬组、热痹模型组、寒痹模型组、宽筋藤热痹模型0.6g/kg、1.2g/kg、2.4g/kg组、宽筋藤寒痹模型0.6g/kg、1.2g/kg、2.4g/kg组。除对照组外,各组大鼠足跖部皮内注射完全弗氏佐剂造模后第二天,将寒热痹症各模型及给药组分别放入恒温气候箱中4h,造模持续14d。各给药组于足底造模后24h开始第一次灌胃给药14d。造模前及造模后3d、7d、10d、14d分别进行50%机械痛反应值、热缩足反应时间指标的测定。在末次给药后一天对每组六只灌注取材,制作脊髓和患侧背根神经节的免疫组化切片,观察CD11b、CX3CL1、CX3CR1、NMDA受体指标的表达情况。末次给药后对大鼠进行取材,每组剩余六只大鼠麻醉后取新鲜的脊髓放入冻存管中迅速冷冻。蛋白质印迹法测定大鼠脊髓中CX3CL1、CX3CR1和NMDAR的表达情况。结果:①热缩足反应时间:模型大鼠热缩足反应时间显着降低(与同组基础值相比较P<0.01),且于造模后第7天达到最低,在造模后第14天未见明显恢复。引入寒凉、湿热因素后,可不同程度的延长大鼠热缩足反应时间,其中寒凉因素的影响效果更明显。宽筋藤各剂量组可不同程度延长热痹模型大鼠患足的热缩足反应时间,其中宽筋藤2.4g/kg在给药后第14天,宽筋藤1.2g/kg在给药后第7、10、14天,宽筋藤0.6g/kg在给药后第7天作用明显(与热痹模型组相比较P<0.05,P<0.01);宽筋藤各剂量组可不同程度降低寒痹模型大鼠对温度刺激的敏感性。②50%机械缩足反应值:模型大鼠50%机械痛反应值显着降低(与同组基础值相比较P<0.01)。模型组大鼠在造模后各时间点患足50%机械痛反应值均明显低于对照组(与对照组相比较P<0.01),且于造模后第7天50%机械痛反应值达到最低,在造模后第14天未见明显恢复。引入寒凉、湿热因素14d后,均可不同程度的升高大鼠患足对机械刺激的敏感性,其中寒凉因素的影响更显着(与模型组相比较P<0.01)。宽筋藤各剂量组可不同程度提高热痹模型大鼠的50%机械痛反应值,其中宽筋藤2.4g/kg在给药14d内可持续抑制热痹模型大鼠50%机械痛反应值的升高(与热痹模型组相比较P<0.05,P<0.01);宽筋藤2.4g/kg在给药14d内可持续促进热痹模型大鼠50%机械痛反应值的升高(与寒痹模型组相比较P<0.05,P<0.01)。③蛋白质印迹法测定脊髓中通路表达量:模型大鼠脊髓中CX3CL1、CX3CR1、NMDA趋化因子及其相关受体蛋白表达显着升高(与对照组相比较P<0.01)。寒凉因素和湿热因素的引入均可显着增加模型大鼠脊髓中CX3CL1、CX3CR1、NMDAR的表达(与模型组相比较P<0.05),其中湿热因素的效果更明显。给予宽筋藤水提物之后,各模型组及热痹模型组大鼠脊髓中CX3CL1、CX3CR1、NMDA趋化因子及其受体蛋白的表达显着减少(与模型组相比较P<0.01)。④免疫组织化学法测定脊髓中通路表达量:模型大鼠脊髓中CD11b、CX3CL1、CX3CR1、NMDA趋化因子及其相关受体表达显着增加(与对照组相比较P<0.01)。寒凉因素和湿热因素的引入均可增加模型大鼠脊髓中CD11b、CX3CL1、CX3CR1、NMDAR表达,其中寒凉因素的效果更明显。灌胃给药宽筋藤水提物各剂量之后,各模型组及热痹模型组大鼠脊髓中CX3CR1、CX3CL1、NMDA趋化因子及其受体蛋白的表达显着减少(与模型组相比较P<0.05,P<0.01)。⑤免疫组织化学法测定患侧背根神经节中通路表达量:模型大鼠患侧背根神经节中CD11b、CX3CL1、CX3CR1、NMDA趋化因子及其相关受体蛋白的表达显着增加(与对照组相比较P<0.01)。寒凉因素和湿热因素的引入均可增加模型大鼠患侧背根神经节中CD11b、CX3CL1、CX3CR1、N]MDAR的表达,其中寒凉因素的效果更明显。灌胃给药宽筋藤水提物各剂量之后,各热痹模型组大鼠患侧背根神经节中CD11b、CX3CL1、CX3CR1、NMDA受体蛋白的表达显着减少(与模型组相比较P<0.05,P<0.01)。结论:寒凉和湿热因素均可不同程度的加强痹症模型大鼠痛觉敏感程度;宽筋藤水提物可有效减轻热痹疼痛模型大鼠痛觉敏感程度,而对寒痹疼痛模型大鼠的痛觉敏感有一定程度的加强作用;宽筋藤在中枢敏化层面上的镇痛机制与其有效的抑制CD11b、CX3CL1、CX3CR1、NMDA几种趋化因子及其受体蛋白的表达有关。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

痛觉敏感论文参考文献

[1].贾磊.ERK-TRPV4通路在大鼠背根神经节持续受压致痛觉敏感中的作用机制研究[D].山东大学.2019

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[4].张天睿,张硕峰,宋敬怡,马丹,程龙.祖师麻肠溶微丸对结扎坐骨神经所致痛觉敏感大鼠背根神经节P2X4受体及P38MAPK表达的影响[J].辽宁中医药大学学报.2018

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[6].李秀娟,李黛,陈辉,熊源长.脊髓背角基质细胞衍生因子1对皮肤肌肉切口牵拉术致持续性疼痛大鼠中枢敏感化及痛觉过敏的影响[J].第二军医大学学报.2018

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标签：慢病毒干扰;  DRG原代神经元;  钙离子成像;  ERK;