导读:本文包含了固定化酶活性论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:固定化酶,酶解动力学,糙米降血糖肽,分子对接
固定化酶活性论文文献综述
张征立[1]（2019）在《固定化酶制备降血糖肽及其生物学活性评价》一文中研究指出随着生活水平提高,糖尿病的发病率也越来越高,严重威胁人类的生命健康。而生物活性肽作为一种新型降血糖药物,副作用较小,在防治糖尿病方面具有较高的应用价值。传统酶解法制备生物活性肽对自由蛋白酶的需求量较大,且酶活不稳定。目前糙米已成为糖尿病患者的最佳食材,其营养成分丰富,有助于胰脏分泌胰岛素,降低血糖。因此本研究以糙米作为原料,使用固定化酶制备降血糖肽,检测其降血糖活性。以聚偏氟乙烯微孔滤膜(F膜)作为载体,采用共价结合法固定胰蛋白酶,通过响应面试验获得固定化工艺参数,采用扫描电镜和红外光谱对固定化酶进行表征。建立固定化酶制备糙米降血糖肽的水解度动力学模型。构建糙米降血糖肽的分离纯化方法,先后使用超滤、离子交换、凝胶过滤层析与反相高效液相方法,再采用液质联用方法分析降血糖肽氨基酸序列,然后进行分子对接,建立抑制动力学模型,从分子层面研究降血糖肽作用机制与类型。通过体内检测降血糖肽对高血糖小鼠的降血糖作用、生长状况以及肠道菌群平衡的影响,研究肠道菌群与糖尿病之间的关系。试验结果如下:胰蛋白酶固定化最优工艺为:戊二醛浓度2.11wt%,酶浓度6.43mg/mL,温度23.57℃。在最优条件下预测酶活回收率达到63.1947%,经过验证酶活回收率为62.25%。固定化胰蛋白酶的最适温度为55℃,最适pH值为8.5,热稳定性、pH值稳定性均高于自由酶;同时固定化酶在重复使用6次以后,仍然保留初始酶活的67.82%;与自由酶相比,固定化胰蛋白酶的储存稳定性提高了18.00%。根据扫描电镜图可以看出固定化酶载体表面出现大量球状突出点,同时在傅里叶红外光谱图上胰蛋白酶内肽键伸缩振动的酰胺带在1100~1000cm~(-1)出现特征峰。以水解度作为评价指标,通过单因素试验分析自由酶与固定化酶水解能力,固定化酶最优水解条件为:加酶量520 cm~2/g,底物浓度6 mg/mL,温度55℃,pH 8.5,反应时间50min,水解度可以达到24.72%,相比自由酶水解度提高了63.38%。在固定化酶酶解体系最优条件下,固定化酶重复使用5次后,水解度保留初始水解度的72.34%。建立固定化酶可控酶解动力学模型为DH=4.5767ln[1+(5.2121 E_0/S_0-0.5032)t]。以α-葡萄糖苷酶抑制率作为评价指标,分别检测不同多肽组分的降血糖活性,其中P-II-B-b-2组分活性最大,IC50为0.097mg/mL。根据二级质谱推断降血糖肽的氨基酸组成序列,分子量为362.99的多肽可能是Gly-Met-Arg,分子量为476.11的多肽包括Asn-Trp-Arg、Gly-Asp-Lys-Arg和Asp-Gly-Lys-Arg,分子量为589.12的多肽包括Lys-Arg-Glu-Arg、Pro-Trp-Met-Arg、Val-Trp-Glu-Arg和Cys-Arg-Gly-Pro-Arg。通过分子对接,多肽可以与α-葡萄糖苷酶中心部位紧密结合,抑制α-葡萄糖苷酶的活性。其中Gly-Asp-Lys-Arg的IC50最小,为0.039mg/mL,抑制效果最好。最后通过研究Gly-Asp-Lys-Arg对α-葡萄糖苷酶抑制动力学发现,K_m值基本保持不变,而V_m逐渐减少,属于非竞争性抑制作用类型,抑制常数K_m=5.405×10~(-3)mol/L。多肽治疗35天后,四氧嘧啶高血糖小鼠的血糖值明显降低,小鼠糖尿病症状,如小鼠毛色、活动能力、反应能力与食欲等各种情况均有明显改善,并提高存活率。通过对小鼠肠道优势菌分离鉴定,肠道菌群包括链球菌、肠杆菌、微球菌、假单胞杆菌与弧菌等。高血糖小鼠肠道内有害菌数量增加,益生菌数量减少。经糙米多肽治疗后,高血糖小鼠血糖降低,肠道微生态平衡得到明显改善恢复。(本文来源于《江苏科技大学》期刊2019-06-10）
杨小翠[2]（2019）在《纳米微球固定化酶制备鱼皮胶原多肽及其抗氧化活性研究》一文中研究指出鱼皮胶原多肽是鱼皮胶原蛋白经过水解工艺制备得到的具有一定生理活性的小分子物质,近年来作为一种新兴的功能性食品原料在国内外开始盛行。蛋白酶水解法是制备鱼皮胶原肽的重要方法,然而在实际应用时,存在酶解条件高、酶回收困难、生产成本高等问题。同时,鱼皮胶原多肽是优质的抗氧化原料,但制备过程复杂繁琐、耗时,这限制了其在食品工业中的应用。本论文通过纳米磺化聚苯乙烯微球(SPSNs)固定化枯草芽孢杆菌蛋白酶(Subtilisin,SU),研究了固定化酶过程的影响因素;利用制备的固定化酶水解罗非鱼鱼皮胶原,获得体外抗氧化性良好的胶原多肽;在解析产物多肽序列的基础上,利用分子对接技术实现了高通量筛选并验证了代表性功能肽的体外抗氧化活性。本论文的主要研究内容和结果如下:(1)枯草杆菌蛋白酶催化活性与分子结构特点的研究。借助于等温量热滴定技术(ITC),可知枯草杆菌蛋白酶对鱼皮胶原蛋白的催化水解活性优于牛血红蛋白和牛血清白蛋白。通过对枯草杆菌蛋白酶生物信息的详细分析,结果表明枯草杆菌蛋白酶为碱性蛋白,等电点为8.66,在pH小于7的溶液中表现为带正电,易于与带有负电的物质发生静电吸附。此外,其活性位点为由天冬氨酸(137)、组氨酸(168)以及丝氨酸(325)组成的催化叁联体,能够催化多肽链中内部ɑ-肽键的水解。(2)纳米磺化聚苯乙烯微球固定化枯草杆菌蛋白酶(SPSNs-Subtilisin,SPSU)的研究。以纳米聚苯乙烯(PSNs)微球为原料,加入浓硫酸进行磺化改性,料液比为1:40(m/v),温度为33℃,反应时间为6 h,得到磺化度为2.625±0.05 mmol/g的SPSNs。采用静电吸附法将枯草杆菌蛋白酶固定化在SPSNs上,最佳固定化条件为:SPSNs浓度1 mg/mL、温度25℃、pH 6.5(磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)、时间60 min。获得的固定化酶负载量为397.15 mg/g,活性回收率为77.3%。在pH 7.0~10.3以及温度25~65℃范围内,固定化酶比游离酶具有较高的相对酶活性,且固定化酶的最适pH从10.3提高为10.6。固定化酶反复使用5次后仍具有68.7%的相对酶活性。(3)鱼皮胶原多肽的制备及其体外抗氧化活性的研究。使用SPSU对罗非鱼鱼皮胶原蛋白进行酶解,多肽转化率为54.9%。体外抗氧化研究结果表明,鱼皮胶原水解液具有较好的抗氧化活性,水解液对羟基自由基(·OH)、2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基以及1,1-二苯基-2-苦基肼基(DPPH)自由基清除能力的IC_(50)值分别为1.29 mg/mL、24.94 mg/mL、12.48 mg/mL。(4)鱼皮胶原多肽序列解析及利用分子对接技术筛选抗氧化活性肽。以液相质谱联用技术解析多肽序列,得到了1500多个多肽序列,分子量分布范围为700~3000 Da,其中I型胶原蛋白肽序列有105个。采用分子对接技术高通量筛选出12个抗氧化活性肽,通过固相肽合成技术合成PFRMY(PY-5),MPVPGPM(MM-7),PGPIGPMGPRG(PG-11)叁个代表性的高抗氧化活性肽,并采用体外抗氧化活性实验验证其活性。结果表明:与鱼皮胶原水解液相比,PY-5、MM-7、PG-11均表现出良好的抗氧化活性,清除·OH的IC_(50)值分别为0.73 mg/mL、0.81 mg/mL、1.42 mg/mL,清除DPPH自由基的IC_(50)值分别为10.17 mg/mL、3.85 mg/mL,4.14 mg/mL;相互作用分析显示,PY-5、MM-7、PG-11主要通过调节SIRT1-7与AMPK通路发挥抗氧化作用,且SIRT1-7通路作用效果比较明显。根据以上研究结果,确定PY-5、MM-7与PG-11是鱼皮胶原蛋白水解液中抗氧化活性成分的重要组成部分。(本文来源于《华南理工大学》期刊2019-04-20）
王冠[3]（2018）在《可见光引发可控活性聚合固定化酶与包覆细胞研究》一文中研究指出通过对酶的固定化和细胞的包覆可以显着地增强酶和细胞的稳定性,有效改善其环境耐受性,大幅降低使用成本并拓展其适用范围,因此在工业、能源、医药以及生命科学等方面有广阔的应用前景。目前,基于常规自由基聚合的酶固定化和细胞包覆方法普遍存在高温、紫外辐照、氧化剂等苛刻条件,导致酶和细胞的大量失活,因此亟需开发新型且温和的聚合方法,在保持酶或细胞活性的前提下实现酶固定化或细胞包覆。可见光作为一种温和的自由基聚合引发方式,具有辐照能量低、生物相容性好、对氧气的耐受性好、可低温反应等优点,非常适合于酶和细胞存在下的聚合反应。基于此背景,本论文开展了可见光引发可控/活性自由基聚合用于酶的固定化和细胞包覆的系统研究,主要研究内容和结果如下:1.开发了可见光反相乳液聚合包埋固定化酶的新方法。以异丙基硫杂蒽酮(ITX)和对-二甲基氨基苯甲酸乙酯(EDAB)为可见光引发剂体系,聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)为聚合单体,在LED灯的照射下通过反相乳液聚合实现了木瓜蛋白酶的包埋固定化。首先探究了在LED灯照射下,以液体石蜡为油相,磷酸盐缓冲溶液(PBS)为水相,ITX/EDAB为引发剂,PEGDA为聚合单体的反相乳液聚合规律及聚合动力学特征,证明了 ITX/EDAB引发可见光反相乳液聚合的可行性。随后,将木瓜蛋白酶溶解于PBS溶液中作为水相,并以液体石蜡作为油相,ITX/EDAB作为引发剂,PEGDA作为聚合单体,在LED灯照射下通过反相乳液聚合实现木瓜蛋白酶的原位包埋固定化。通过红外分析(FTIR)和荧光标记法证明了木瓜蛋白酶的成功包埋且包埋率达90%以上。最后,以酪蛋白作为酶催化反应底物表征木瓜蛋白酶的活性,实验结果表明,包埋后的木瓜蛋白酶依然可以有效地催化底物酪蛋白的分解,酶活性回收为67%。包埋木瓜蛋白酶的耐热性得到了显着提升,在70 ℃下放置2 h后依然可以保持54%的初始活性,而游离木瓜蛋白酶仅剩14%左右的初始活性。此外,包埋木瓜蛋白酶表现出良好的操作稳定性,在第10次利用时仍保留了 61%的初始活性。本研究首次实现可见光反相乳液聚合原位固定化酶,相比于紫外光作为聚合引发方式,采用可见光引发聚合包埋固定化酶的活性高出21%,优势明显,为酶和细胞的原位包埋提供了新思路。2.通过可见光活性接枝聚合方法实现β-葡萄糖苷酶和纤维素酶的分隔固定化。首先,将β-葡萄糖苷酶溶解于PBS缓冲溶液中作为水相,并以液体石蜡为油相,ITX/EDAB为引发剂,PEGDA为聚合单体,在LED灯的照射下引发反相乳液聚合实现β-葡萄糖苷酶的包埋固定化。随后,借助于包埋有β-葡萄糖苷酶的交联PEG微球表面的ITX半频哪醇休眠种(ITXSP),在LED灯照射下基于ITXSP的可逆钝化反应引发丙烯酸的接枝聚合,制备出发状(hairy)微球。最后,通过化学结合的方法实现纤维素酶在聚丙烯酸链上的固定化。通过X射线电子衍射能谱(XPS)、紫外光谱分析和FTIR对ITXSP的再引发能力以及丙烯酸的接枝聚合进行表征。实验结果表明,ITXSP可以成功再引发丙烯酸接枝聚合,并且该接枝聚合属于可控/活性接枝聚合。以对硝基苯酚葡萄糖苷为酶催化分解底物表征固定化β-葡萄糖苷酶活性变化,在接枝聚合完成后固定化β-葡萄糖苷酶仍然保留87%的初始活性。在进一步固定化纤维素酶后,所组成的双酶固定化体系充分发挥了二者的协同作用。在催化滤纸降解过程中,相比于单独固定化纤维素酶,双酶体系在催化滤纸分解48 h时,葡萄糖的产率至少提高了 15%。以催化分解可溶性纤维素(羧甲基纤维素钠,CMC)和不可溶性纤维素(滤纸)表征双酶固定化体系的重复利用性,结果显示在催化CMC水解10批次之后依然可以保留75%的初始活性;在催化纤维素分解5批次以后依然可以达到53%的初始活性。该方法实现了两种酶的分隔固定化,并证明了两种固定化酶的协同作用,展现出该方法在生物医学以及生物传感器等领域的价值。3.利用可见光活性接枝聚合实现细胞表面厚度可控聚合物层的构建。首先,通过静电作用将聚乙烯亚胺(PEI)吸附于酵母细胞表面。随后,利用羧基和氨基作用,将水溶性引发剂硫杂蒽酮儿茶酚-O'O-二乙酸(TX-Ct)偶合在细胞表面,构建TX-Ct/PEI引发体系。最后,在LED灯的照射下,以PEGDA为聚合单体,实现酵母细胞表面引发聚合形成聚合物壳层。以TX-Ct/PEI为引发剂,可见光照射引发PEGDA溶液聚合体系的聚合行为研究表明该聚合属于可控/活性自由基聚合。透射电镜照片显示细胞外接枝层厚度为20-55 nm,并且接枝层厚度可以通过调节接枝时间实现可控。酵母细胞活性测试表明该方法可以有效地保留细胞的活性(>85%)。通过延长接枝聚合时间、增加单体浓度和光照强度可以增强对酵母细胞增殖抑制效果,并提高包覆细胞对溶壁酶的抵抗能力。当使用金黄色葡萄球菌作为细胞模板时,同样实现了单细胞的包覆。该方法实现了单细胞表面的可控/活性接枝交联聚合,成功制备出厚度可控的聚合物壳层,为实现单细胞分析以及细胞传感器等应用提供了基础。(本文来源于《北京化工大学》期刊2018-06-01）
程磊,刘佳炜,郑德娟,丁琳,曹雁平[4]（2018）在《超声强化固定化酶催化活性条件的优化》一文中研究指出本文主要是在海藻酸钠-改性明胶包埋木瓜蛋白酶的基础上,优化超声对固定化木瓜蛋白酶催化活性的条件。采用单因素实验从超声功率、超声频率、超声温度、超声时间四个方面研究超声对固定化酶催化活性的影响,最后利用DPS软件设计均匀实验得到最优超声条件。结果显示最优超声条件:超声功率为0.35 W/cm~2、超声频率40 k Hz、超声温度60℃、超声时间40 min,相对酶活力为273.23%。验证实验测得相对酶活力为260.37%±12.23%,验证值与预测值相对标准偏差为2.41%,可信度高。通过本研究证明适宜的超声处理能提高固定化酶活力。(本文来源于《食品工业科技》期刊2018年13期）
吴晓晨,吕莉莉,韩祥生,李朝旭[5]（2017）在《自支撑蛋白质纳米纤维膜的制备及高活性固定化酶体系的构筑》一文中研究指出由蛋白质分子组装形成的膜材料保留了蛋白质本身优异的生物降解性、生物相容性、反应活性和机械性能,被广泛应用于膜科学、电子学、生物医学、传感等学科及领域。尤其是由各类蛋白质纤维(例如,淀粉样蛋白纤维、蚕丝纤维等)构筑的薄膜,在自然界和人工制造业中广泛存在。但是,由淀粉样蛋白纤维制备出的薄膜通常不具备自支撑性能,无法单独作为膜材料而被应用。对此,本文以牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)为例,通过简单的方法制备出基于淀粉样蛋白纤维的自支撑蛋白质纳米纤维膜,并用做固定化酶基底,构筑高活性固定化酶体系。BSA纳米纤维膜负载的辣根过氧化物酶展现出优于游离酶的稳定性,在高温及酸、碱性条件下的活性保留程度高,并具有更优异的存储稳定性。同时,BSA纳米纤维膜的类水凝胶结构为负载其上的水溶性酶提供了分子水层,可以最大程度地保留水溶性酶的稳定性和催化活性,在多种有机溶剂中展现出优异的活性。(本文来源于《中国化学会2017全国高分子学术论文报告会摘要集——主题B：生物大分子》期刊2017-10-10）
郎伟超,张丽[6]（2013）在《共价结合法固定化酶活性载体的研究进展》一文中研究指出共价结合法已经成为酶固定化的最主要的方法之一,载体在酶固定化技术中发挥着关键作用。论文对近年来国内外共价结合法固定化酶活性载体的研究发展状况进行了综述,包括含有酰基迭氮、酸酐、卤素、乙酰基、聚碳酸酯、苯酚的聚合物的研究与应用。认为开发新型改性复合载体将成为今后研究的重点。(本文来源于《生物技术世界》期刊2013年10期）
梁彦鹏[7]（2012）在《功能化TiO_2微球表面共价固定化酶及催化活性和稳定性研究》一文中研究指出二氧化钛（TiO_2）具有无毒、制备成本低、机械强度高、抗微生物降解、热稳定性和化学稳定性高等优点。此外，TiO_2可与儿茶酚及其衍生物发生螯合作用而牢固相连。研究表明，利用螯合作用可以有效地对金属氧化物进行表面修饰。该方法具有反应迅速、完全、便捷等优点。受此启发，本研究利用TiO_2与儿茶酚基团之间的螯合作用对TiO_2微球进行表面修饰，并利用共价法在修饰的TiO_2微球上固定化酶。本论文的研究内容主要包括以下几个方面：（1）首先采用溶胶-凝胶法制备出粒径在500-600nm的TiO_2微球，然后利用TiO_2与3,4-二羟基苯基丙酸（儿茶酚衍生物）之间的螯合作用对TiO_2微球进行表面修饰，制得羧基化的TiO_2微球（TiO_2-COOH）。最后采用EDC/NHS化学方法在TiO_2-COOH微球表面分别固定过氧化氢酶和脂肪酶。红外光谱图证明TiO_2微球表面成功地修饰上了3,4-二羟基苯基丙酸，同时其表面成功地共价固定上了过氧化氢酶和脂肪酶。本论文还对两种固定化酶的催化活性和稳定性进行系统的研究。研究结果表明，两种固定化酶的稳定性得到了显着提高。固定化过氧化氢酶和脂肪酶分别保持了65%和60%的相对酶活力，其负载率分别为150mg/gsupport和200mg/g support。两种酶的米氏常数在固定后没有明显变化。（2）首先利用TiO_2与多巴胺（儿茶酚衍生物）之间的螯合作用对TiO_2微球进行表面修饰，制得氨基化的TiO_2微球（TiO_2-NH2）。然后利用戊二醛将TiO_2-NH2微球活化并在其表面分别固定过氧化氢酶和脂肪酶。红外光谱图证明了载体与酶分子间共价键的形成。固定化酶表现出了较高的活力和稳定性，固定化过氧化氢酶和脂肪酶分别保持了66.7%和65%的相对酶活力，其负载率分别为150mg/g support和230mg/g support。两种酶米氏常数在固定后也没有明显变化。（3）首先采用EDC/NHS化学方法在过氧化氢酶分子上接枝3,4-二羟基苯基丙酸，然后利用儿茶酚基团与TiO_2微球的螯合作用将改性后的过氧化氢酶固定于TiO_2微球上。研究发现，利用该方法制备的固定化酶的负载率高达500mg/gsupport，相对酶活力为60%。为了验证该方法的普适性，利用该法在TiO_2微球上固定化醇脱氢酶，并对其催化活性和稳定性进行系统研究。研究结果显示，固定化醇脱氢酶的相对酶活力高达90%。红外光谱图证明两种酶均成功地共价固定在TiO_2微球表面。（4）对以上不同方法制备的固定化酶的负载率、相对酶活力、动力学常数、热稳定性、循环稳定性和储存稳定性进行比较。通过比较总结出以上不同方法固定化酶的优点和不足。(本文来源于《天津大学》期刊2012-06-01）
M.Sallat,A.Berthel,U.Bhmer,T.Bley,董晓雯[8]（2011）在《固定化酶在活性染料染色织物后整理中的应用》一文中研究指出若能将酶再利用,则可极大地提升酶的使用效率。研发项目的结果表明,就纺织品色牢度而言,无论是在优化还是在满足要求方面,都不再受缚于酶的一次性使用。(本文来源于《国际纺织导报》期刊2011年01期）
吴晖,李丽丽,李晓凤,余以刚[9]（2010）在《非水相中固定化酶水解制备玉米肽的体外醒酒活性研究》一文中研究指出对在非水相中经固定化碱性蛋白酶Alcalase 2.4L水解的玉米蛋白肽的体外醒酒活性进行了研究。考察了在体外试验中,玉米肽对乙醇脱氢酶(ADH)及对乙醛脱氢酶(ALDH)活力的影响,分析了活性最高的酶解物的氨基酸组成和相对分子量分布及其与醒酒活性之间的关系。结果表明:当控制水解度最高为22.7%时,非水相中制备的玉米肽在体外试验中对乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)的激活作用最高,ADH激活率可达27.1%,ALDH激活率可达50.0%,此高醒酒活性肽中含有较高比例的Ala、Leu及Pro,尤其是Leu,3种氨基酸含量均高于相同水解度下水相中制备的玉米肽的氨基酸含量。在酶解产物分子量<3 548 u,其中分子量<1 295 u的肽含量最多,约占80%,以2～10肽为主。(本文来源于《食品与发酵工业》期刊2010年12期）
何平,黄家乐,史清翠,巫光宏,初志战[10]（2009）在《不同疏水参数有机溶剂中木瓜蛋白酶及其固定化酶活性的变化》一文中研究指出【目的】探寻疏水参数(logP)不同的有机溶剂对木瓜蛋白酶及其固定化酶活性的影响。【方法】制备固定化木瓜蛋白酶,在疏水参数不同(logP=-1.30,-1.10,-0.76,-0.33,-0.24,0.28,0.49,0.68,0.80,1.31,1.80,2.0,2.5,3.5和5.0)的15种有机溶剂及其不同体积分数(φ=5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,50%,60%和70%)的溶液中,测定木瓜蛋白酶及其固定化酶的活性,以不含相应有机溶剂的0.1 mol/L pH 7.2磷酸缓冲液或Tris-盐酸缓冲液为对照,分析不同有机溶剂及其体积分数对酶活性的影响。【结果】在低疏水参数(logP≤-0.24)的有机溶剂中,有机溶剂二甲基亚砜、1,4-二氧六环和乙腈具有在低体积分数(φ≤10%)下,激活木瓜蛋白酶及其固定化酶活性的特性,有机溶剂甲醇、乙醇虽然在低体积分数(φ≤10%)下不能激活木瓜蛋白酶及其固定化酶活性,但其活性与对照(φ=0)相当;低疏水参数有机溶剂在高体积分数(φ≥30%)下抑制酶活。当有机溶剂的疏水参数为0.28~1.31时,其对木瓜蛋白酶及其固定化酶活性有显着抑制作用。在有机溶剂疏水参数较高(logP≥1.80)条件下,低体积分数(φ≤10%)时酶活性下降较慢,超过一定体积分数(φ≥30%)后,酶活性开始升高。【结论】低logP(logP≤-0.24)有机溶剂在低体积分数(φ≤10%)时可激活或稳定木瓜蛋白酶及其固定化酶活性,而在高体积分数(φ≥30%)时对酶活有抑制作用;中logP(0.28≤logP≤1.31)有机溶剂对木瓜蛋白酶及其固定化酶活性具有显着抑制作用;高logP(logP≥1.80)有机溶剂在低体积分数(φ≤10%)时抑制木瓜蛋白酶及其固定化酶活性,但在高体积分数(φ≥30%)时酶活性升高。(本文来源于《西北农林科技大学学报(自然科学版)》期刊2009年03期）
固定化酶活性论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
鱼皮胶原多肽是鱼皮胶原蛋白经过水解工艺制备得到的具有一定生理活性的小分子物质,近年来作为一种新兴的功能性食品原料在国内外开始盛行。蛋白酶水解法是制备鱼皮胶原肽的重要方法,然而在实际应用时,存在酶解条件高、酶回收困难、生产成本高等问题。同时,鱼皮胶原多肽是优质的抗氧化原料,但制备过程复杂繁琐、耗时,这限制了其在食品工业中的应用。本论文通过纳米磺化聚苯乙烯微球(SPSNs)固定化枯草芽孢杆菌蛋白酶(Subtilisin,SU),研究了固定化酶过程的影响因素;利用制备的固定化酶水解罗非鱼鱼皮胶原,获得体外抗氧化性良好的胶原多肽;在解析产物多肽序列的基础上,利用分子对接技术实现了高通量筛选并验证了代表性功能肽的体外抗氧化活性。本论文的主要研究内容和结果如下:(1)枯草杆菌蛋白酶催化活性与分子结构特点的研究。借助于等温量热滴定技术(ITC),可知枯草杆菌蛋白酶对鱼皮胶原蛋白的催化水解活性优于牛血红蛋白和牛血清白蛋白。通过对枯草杆菌蛋白酶生物信息的详细分析,结果表明枯草杆菌蛋白酶为碱性蛋白,等电点为8.66,在pH小于7的溶液中表现为带正电,易于与带有负电的物质发生静电吸附。此外,其活性位点为由天冬氨酸(137)、组氨酸(168)以及丝氨酸(325)组成的催化叁联体,能够催化多肽链中内部ɑ-肽键的水解。(2)纳米磺化聚苯乙烯微球固定化枯草杆菌蛋白酶(SPSNs-Subtilisin,SPSU)的研究。以纳米聚苯乙烯(PSNs)微球为原料,加入浓硫酸进行磺化改性,料液比为1:40(m/v),温度为33℃,反应时间为6 h,得到磺化度为2.625±0.05 mmol/g的SPSNs。采用静电吸附法将枯草杆菌蛋白酶固定化在SPSNs上,最佳固定化条件为:SPSNs浓度1 mg/mL、温度25℃、pH 6.5(磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)、时间60 min。获得的固定化酶负载量为397.15 mg/g,活性回收率为77.3%。在pH 7.0~10.3以及温度25~65℃范围内,固定化酶比游离酶具有较高的相对酶活性,且固定化酶的最适pH从10.3提高为10.6。固定化酶反复使用5次后仍具有68.7%的相对酶活性。(3)鱼皮胶原多肽的制备及其体外抗氧化活性的研究。使用SPSU对罗非鱼鱼皮胶原蛋白进行酶解,多肽转化率为54.9%。体外抗氧化研究结果表明,鱼皮胶原水解液具有较好的抗氧化活性,水解液对羟基自由基(·OH)、2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基以及1,1-二苯基-2-苦基肼基(DPPH)自由基清除能力的IC_(50)值分别为1.29 mg/mL、24.94 mg/mL、12.48 mg/mL。(4)鱼皮胶原多肽序列解析及利用分子对接技术筛选抗氧化活性肽。以液相质谱联用技术解析多肽序列,得到了1500多个多肽序列,分子量分布范围为700~3000 Da,其中I型胶原蛋白肽序列有105个。采用分子对接技术高通量筛选出12个抗氧化活性肽,通过固相肽合成技术合成PFRMY(PY-5),MPVPGPM(MM-7),PGPIGPMGPRG(PG-11)叁个代表性的高抗氧化活性肽,并采用体外抗氧化活性实验验证其活性。结果表明:与鱼皮胶原水解液相比,PY-5、MM-7、PG-11均表现出良好的抗氧化活性,清除·OH的IC_(50)值分别为0.73 mg/mL、0.81 mg/mL、1.42 mg/mL,清除DPPH自由基的IC_(50)值分别为10.17 mg/mL、3.85 mg/mL,4.14 mg/mL;相互作用分析显示,PY-5、MM-7、PG-11主要通过调节SIRT1-7与AMPK通路发挥抗氧化作用,且SIRT1-7通路作用效果比较明显。根据以上研究结果,确定PY-5、MM-7与PG-11是鱼皮胶原蛋白水解液中抗氧化活性成分的重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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