导读:本文包含了内质网蛋白论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:肝癌患者,oxLDL,肝癌细胞,内质网蛋白
内质网蛋白论文文献综述
[1]（2019）在《生物物理所杨鹏远课题组揭示内质网蛋白Nogo-B促进肝脏炎-癌转化新机制》一文中研究指出肝癌是第二大癌症,与其他肿瘤相比,肝癌发生的诱因常由于长期的肝脏慢性炎症,如慢性乙型肝炎、非酒精性脂肪肝炎等。在诱导炎症发展成肿瘤的众多因素中,炎性微环境的差异是肝脏炎-癌转化的重要决定性因素。但是,这种炎性微环境如何激活细胞诱导癌变的调控网络和功能机制仍未阐明。(本文来源于《高科技与产业化》期刊2019年08期）
贾梦琪[2]（2019）在《内质网蛋白AGR2介导肿瘤化疗药物与靶向药物耐受的分子机制及应对策略研究》一文中研究指出恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病,其治疗以手术治疗,放射治疗、化学疗法以及近年来的免疫治疗为主。无论是放疗、化疗还是免疫治疗,耐药和精准用药的选择性不高是制约其治疗的难题。虽然免疫治疗的优势显着,但患者的应答率不高,因此化疗虽有诸多不尽人意,但依然侵袭转移性肿瘤的治疗方案。近年来靶向药物的出现,为肿瘤患者带来新的希望。靶向药物靶点明确,但是耐药迅速,并且只有少数靶向药物有耐药标志物。目前临床上缺乏精准有效的指示标志物来预测化疗与靶向治疗效果,因此临床上亟待发现新的指示标志物,用以精准用药,提高患者生存率及生存治疗。AGR2是二硫键异构酶家族成员,虽然是内质网定位蛋白,但AGR2仍可定位于细胞胞质和分泌至细胞外,具有分泌特性。AGR2作为癌基因,在多种肿瘤中高表达:1)可显着促进肿瘤的增殖与侵袭转移;2)其分泌特性,提示可作为肿瘤的诊断标志物;3)可作为药物靶点,已有AGR2抗体药物的研究报道。作为药物靶点,已有研究发现AGR2与耐药有关,对乳腺癌内分泌治疗耐受。目前AGR2与肿瘤耐药的研究较少。因此本论文首先通过药物筛选,确定AGR2表达与肿瘤治疗化疗药物和靶向药物的关联,发现其表达显着影响药物的药效。随后对其耐药机制进行研究,发现细胞内和分泌的AGR2均通过不同的机制参与耐药,最后通过AGR2介导的耐药机制探讨其应对方案,并确定分泌的AGR2可作为化疗以及血管靶向药物的用药指示标志物,并根据AGR2的表达提出序贯用药的策略。第一部分AGR2表达对肿瘤化疗药物和靶向药物敏感性的影响AGR2被认为是一种癌基因,能够显着促进癌细胞增殖与侵袭转移,并且多个报道显示AGR2能够促进癌细胞抵抗细胞死亡。目前发现AGR2在乳腺癌中高表达促进他莫昔芬及多柔比星耐受,但是在我们前期通过组学数据分析在多西紫杉醇耐药的前列腺癌细胞中AGR2表达显着下调。因此我们首先进行了通量的药物筛选以确定AGR2的表达与肿瘤化疗耐受的相关性,为进一步分析AGR2的功能提供基础。一、不同细胞AGR2的基础表达对化疗药物的敏感性对比通过对常见的肿瘤细胞AGR2基础表达进行分析,分别选取AGR2高表达和低表达的细胞进行药物敏感性筛选,发现AGR2的表达水平影响药物的药效:1.低表达AGR2的非小细胞肺癌与结肠癌细胞对化疗药物耐受WB实验结果显示非小细胞肺癌细胞A549中AGR2表达显着低于H460细胞,SW620中AGR2表达显着低于SW480。根据MTT结果分析其IC50值,结果表明低表达AGR2的A549与SW620细胞对多西紫杉醇、阿霉素及顺铂叁种化疗药物较为耐受,而H460与SW480细胞对所选药物较为敏感,。2.高表达AGR2的乳腺癌细胞对细胞毒性化疗药物耐受WB实验显示乳腺癌细胞MDA-MB-453中AGR2表达显着高于MDA-MB-468细胞,MTT结果表明,MDA-MB-453细胞叁种化疗药物较为耐受,而MDA-MB-468细胞对药物较为敏感。二、细胞沉默或过表达AGR2表达对化疗药物及靶向药物的应答分析1.细胞AGR2表达变化对化疗药物敏感性的影响我们在AGR2高表达的PC3,H460,SW480细胞中沉默AGR2表达,在AGR2低表达的DU145,A549,SW620中过表达AGR2后分析其对化疗药物敏感性的影响。MTT检测发现与对照细胞相比,AGR2表达下调后前列腺癌、非小细胞肺癌及结肠腺癌细胞对化疗药物多西紫杉醇、阿霉素及顺铂产生耐受,过表达AGR2后叁种肿瘤细胞对药物敏感性增加,和前期数据一致。2.细胞AGR2表达改变对靶向药物敏感性的影响MTT检测发现与对照细胞相比,AGR2表达下调后前列腺癌、非小细胞肺癌及结肠腺癌细胞对EGFR靶向药物吉非替尼、CDK4/6靶向药物帕布昔利布及血管新生靶向药物卡博替尼耐受,对蛋白酶体靶向药物硼替佐米敏感。过表达AGR2后叁种肿瘤细胞对吉非替尼,帕布昔利布及卡博替尼敏感,对硼替佐米耐受。3.乳腺癌细胞AGR2表达与化疗药物敏感性筛选:MTT检测发现与对照细胞相比,AGR2表达下调后乳腺癌细胞MDA-MB-453细胞毒性化疗药物多西紫杉醇、阿霉素及CDK4/6靶向药物帕布昔利布、血管新生靶向药物卡博替尼以及蛋白酶体靶向药物硼替佐米一致敏感。过表达AGR2的MDA-MB-468细胞对筛选的五种化疗药物一致耐受。第二部分分泌AGR2拮抗抗血管新生靶向药物的分子机制及应对方案在第一部分通量筛选中,我们发现AGR2高表达肿瘤细胞对抗血管新生药物卡博替尼耐受,这引起了我们的兴趣。肿瘤增殖与侵袭转移均需要充足的营养供给,这促使肿瘤组织血管新生以保重营养物质和氧气输送,运出代谢产物并为至肿瘤转移提供重要的门户。虽然AGR2在肿瘤增殖与侵袭中研究较多,但是AGR2对抗血管新生靶向药物的影响是否与促进血管新生有关尚无报道。课题组前期发现AGR2能够显着促进原位前列腺癌的侵袭转移,并且过表达AGR2的原位肿瘤血运尤为丰富,提示AGR2促进肿瘤血管新生以促进前列腺癌侵袭转移。结合第一部分AGR2对抗血管新生药物敏感性的影响,本部分探讨AGR2促血管新生的分子机制及应对策略。一.分泌的AGR2协同VEGFA促进血管新生前期研究已证实,细胞内高表达的AGR2可通过稳定NF-κB介导的EMT机制而发挥促进肿瘤侵袭转移的作用。本论文进一步发现过表达AGR2的细胞上清同样具有显着的促进肿瘤增殖和迁移的作用,提示分泌的AGR2可能发挥促进肿瘤侵袭转移的作用,因此,本部分重点分析分泌的AGR2是否能够促进肿瘤侵袭转移与血管新生:1.重组人AGR2蛋白促进血管新生采用原核表达纯化体系获得了带His标签的重组人AGR2融合蛋白。分子筛结果显示蛋白为二聚体活性形式存在。细胞生长曲线数据表明重组人AGR2蛋白能够促进前列腺癌细胞增殖。小管形成实验表明rhAGR2显着增加内皮细胞HUVECs的小管形成数目。ELISA实验结果显示rhAGR2刺激后,HUVECs培养基中VEGFA含量无明显变化,提示AGR2不促进VEGFA的成熟。2.重组人AGR2蛋白协同VEGFA促进血管新生小管形成实验表明rhAGR2与VEGFA都能够增加HUVECs小管形成数目,二者联合刺激HUVECs小管形成数目显着高于单独刺激。划痕实验表明rhAGR2与VEGFA联合刺激增强HUVECs与前列腺癌细胞PC3的移动能力明显强于单独刺激。Q-PCR结果显示rhAGR2与VEGFA联合刺激增强VEGFR2信号通路。二.分泌的AGR2直接结合VEGFA,激活VEGF/VEGFR信号而促进血管新生1.AGR2与VEGFA直接相互作用采用原核表达纯化体系获得了带His标签的重组人VEGFA融合蛋白与GST标签的AGR2全场及截短体蛋白蛋白,SDS-PAGE表明蛋白正确且纯度较高。His-pulldown实验证实AGR2与VEGFA存在直接相互作用。通过VEGFA与AGR2截短体pulldown实验表明AGR2与VEGFA结合于AGR2的81-101位氨基酸内。2.AGR2与VEGFA形成分子间二硫键His-pulldown实验证实AGR2半胱氨酸突变体不能与VEGFA相互作用,并且还原剂阻断AGR2与VEGFA的相互作用。小管形成实验表明细胞分泌与纯化的AGR2 C81A突变体蛋白都不能促进HUVECs小管形成。因此PDI结构域是AGR2与其他蛋白形成分子间二硫键的关键结构域。3.还原剂谷胱甘肽阻断AGR2促血管新生与促侵袭活性免疫共沉淀实验表明生理性还原剂谷胱甘肽能够破坏细胞外AGR2与VEGFA相互作用。小管形成实验显示谷胱甘肽联合rhAGR2刺激HUVECs小管形成数目显着降低。划痕实验表明谷胱甘肽联合rhAGR2刺激PC3细胞转移能力显着下降。体内肿瘤侵袭转移模型发现谷胱甘肽能够降低注射rhAGR2小鼠肺转移灶数目,但是抗血管新生药物贝伐珠单抗则不能抑制注射rhAGR2小鼠肺转移灶数目。叁、分泌的AGR2拮抗血管新生靶向药物及用药选择研究小管形成实验表明卡博替尼与贝伐珠单抗都可以有效的抑制HUVECs小管形成数目,但是rhAGR2不能逆转卡博替尼而可以逆转贝伐珠单抗抑制HUVECs小管形成数目。裸鼠荷瘤实验表明腹腔注射rhAGR2能够削弱贝伐珠单抗的抗肿瘤活性,而对卡博替尼的抗肿瘤活性没有影响。提示AGR2指示抗血管新生药物用药。第叁部分AGR2低表达介导的肿瘤化疗多药耐药的分子机制在第一部分中,我们发现AGR2低表达介导了激素非依赖的前列腺癌,非小细胞肺癌及结肠腺癌的化疗耐受。而筛选结果表明,下调AGR2介导了癌细胞对多种结构不同靶点各异的化疗药物耐受,提示AGR2介导了肿瘤化疗多药耐药。因此我们探寻AGR2介导肿瘤化疗耐受的分子机制,以及克服耐药的用药策略。一、AGR2负调控MRP2表达介导肿瘤化疗多药耐药由于低水平的AGR2可介导多种不同结构和作用机制的化疗药物耐药,而药泵蛋白是介导多药耐药的重要机制,因此,首先分析药泵蛋白在AGR2低表达介导耐药的作用。流式细胞术结果显示PC3细胞下调AGR2,细胞内阿霉素的蓄积水平显着下降,表明药泵蛋白参与其耐药过程。MTT结果显示,AGR2在前列腺癌、非小细胞肺癌及结肠腺癌细胞中表达与P-gp不亲和的卡巴他赛药物敏感性呈负相关PC3与H460细胞中沉默AGR2表达,免疫印迹结果显示MRP2蛋白水平增加,免疫荧光结果显示过表达AGR2细胞膜上MRP2减少。提示AGR2介导MRP2依赖的多药耐药。二、ARRB1介导MRP2蛋白降解流式细胞术检测沉默ARRB1表达,细胞内阿霉素蓄积明显降低。WB结果显示,沉默ARRB1表达,MRP2蛋白表达升高,而过表达ARRB1,细胞MRP2蛋白表达降低。免疫共沉淀检测MRP2与同家族蛋白MRP1与ARRB1相互作用。蛋白泛素化检测发现过表达ARRB1,MRP2泛素化水平增加,并且ARRB1 S412D失活突变不能增加MRP2泛素化。最后免疫共沉淀结果显示MRP2与E3泛素连接酶MDM2相互作用。叁、AGR2上调ARRB1介导肿瘤化疗多药耐药1.下调ARRB1介导肿瘤化疗多药耐药MTT结果显示PC3细胞与H460细胞沉默ARRB1表达,细胞对多西紫杉醇、阿霉素及顺铂等叁种细胞毒性化疗药物耐受,而在DU145与A459细胞中过表达ARRB1,细胞对叁种化疗药物敏感性增加。动物实验表明,下调ARRB1肿瘤对多西紫杉醇耐受。2.AGR2上调ARRB1蛋白表达介导药物耐受WB结果显示,H460细胞下调AGR2表达,ARRB1蛋白表达下降。免疫共沉淀结果显示,AGR2与ARRB1存在相互作用。MTT结果表明,过表达ARRB1逆转下调AGR2介导的肿瘤化疗耐受,而沉默ARRB1表达则逆转过表达AGR2介导的药物敏感。3.PDI结构域参与AGR2介导的药物耐受WB结果显示,PDI结构域突变的AGR2 C81A突变体不能上调ARRB1表达。MTT结果显示AGR2 C81A突变体不能影响肿瘤细胞对多西紫杉醇和阿霉素的敏感性。4.AGR2上调MRP2蛋白表达介导药物耐受MTT结果表明,在PC3与H460细胞中沉默MRP2表达逆转下调AGR2介导的药物敏感。第四部分蛋白酶体抑制剂克服AGR2低表达介导的肿瘤化疗多药耐药的作用及分子机制研究在前期通量筛选过程中,我们发现蛋白酶体抑制剂硼替佐米的药物敏感性与AGR2表达负相关,这提示我们靶向蛋白酶体有潜力作为AGR2低表达介导的肿瘤化疗多药耐药的应对策略。本部分分析AGR2调控蛋白酶体活性的机制,为肿瘤化疗耐受的逆转策略提供理论支持。一、AGR2负调控肿瘤细胞蛋白酶体活性1.AGR2与细胞泛素-蛋白酶体降解途径相关BioGRID数据库分析AGR2蛋白相互作用网络,聚类结果显示AGR2相互作用蛋白与蛋白质泛素化相关。WB结果显示沉默AGR2表达细胞内总泛素化蛋白减少,而过表达AGR2细胞内泛素化蛋白积累增加2.AGR2负调控蛋白酶体活性蛋白酶体活性分析结果表明,沉默AGR2表达,蛋白酶体中胰蛋白酶样活性、胰凝乳蛋白酶样活性与肽基-谷氨酰基水解酶样活性升高,而过表达AGR2,凝乳蛋白酶样活性与肽基-谷氨酰基水解酶样活性降低,胰蛋白酶样活性基本不变。二、AGR2调控蛋白酶体19s调节亚基与20s核心亚基结合11AGR2通过PDI结构域与19s蛋白酶体调节亚基结合蛋白酶体活性检测结果表明,与对照BSA蛋白相比,纯化的AGR2蛋白并不抑制蛋白酶体活性。免疫共沉淀表明,AGR2与19s调节亚基蛋白PSMD2存在相互作用,并且PDI结构域突变的AGR2 C81A不能与PSMD2相互作用,蛋白酶体活性检测提示AGR2 C81A不能抑制蛋白媒体活性。MTT检测细胞活力表明AGR2 C81A不能降低肿瘤细胞对蛋白酶体抑制剂硼替佐米的敏感性2.AGR2抑制19s调节亚基与20s核心亚基结合免疫共沉淀结果表明过表达AGR2,PSMD2与AGR2结合增多,而与核心亚基蛋白PSMA7结合减少。提示AGR2高表达抑制了 19s调节亚基与20s核心亚基结合从而蛋白酶体活性降低。叁、多西紫杉醇与硼替佐米序惯性用药克服化疗获得性耐受动物实验数据显示,下调AGR2介导肿瘤细胞对多西紫杉醇耐受,对蛋白酶体抑制剂敏感。多西紫杉醇通过下调AGR2反馈性增加蛋白酶体活性。MTT结果显示,先采用多西紫杉醇处理12h后更换硼替佐米处理12h,肿瘤细胞存活率显着低于单独使用多西紫杉醇与硼替佐米或二者联用。动物实验表明先采用多西紫杉醇治疗后使用硼替佐米治疗的效果优于单独使用多西紫杉醇与硼替佐米或二者联用治疗效果。结论1.低表达AGR2与肿瘤细胞多药耐药相关。2.AGR2协同VEGFA促进肿瘤血管新生及贝伐珠单抗耐受,而谷胱甘肽与卡博替尼可以作为应对策略。3.低表达AGR2通过下调ARRB1的表达介导肿瘤化疗耐受4.AGR2通过抑制蛋白酶体核心亚基与调节亚基的结合负调控蛋白酶体。6.硼替佐米克服低表达AGR2介导的肿瘤多药耐药,并且多西紫杉醇与硼替佐米序惯性用药克服临床化疗获得性耐受创新点1.鉴定VEGFA是分泌AGR2的直接相互作用蛋白2.首次报道ARRB1介导了MRP2的降解起始,并且E3泛素连接酶MDM2介导了MRP2的泛素化。3.首次鉴定PSMD2是AGR2的相互作用蛋白,并且AGR2通过抑制蛋白酶体核心亚基与调节亚基的结合4.首次提出多西紫杉醇与硼替佐米序惯性用药方案,并且提出AGR2作为指示标志物指导临床肿瘤化疗用药。不足之处1.未能分析乳腺癌细胞中AGR2上调介导多药耐药的分子机制2.AGR2促进MRP2降解的机制研究不够完整,应当更进一步分析MRP2降解过程中AGR2所起到的作用。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-17）
朱瑞敏[3]（2019）在《内质网蛋白前向输出异常对胰岛素生物合成的影响》一文中研究指出目的:胰岛素作为体内最主要降低血糖的激素,对机体葡萄糖的代谢至关重要。胰岛素的生物合成过程起始于在粗面内质网的核糖体上翻译为胰岛素的前体-前胰岛素原。前胰岛素原转位进入内质网后,形成胰岛素的另一个前体-胰岛素原。胰岛素原在内质网中正确折迭后,输出内质网进入高尔基体。在高尔基体中被酶解为胰岛素和C肽。成熟的胰岛素和C肽储存在分泌颗粒中,在葡萄糖刺激下,分泌到细胞外发挥生物学作用。胰岛素作为分泌蛋白,其分泌通路的顺畅对形成足够量有活性的胰岛素是基本保证。胰岛素原转运出内质网的前提条件是胰岛素原必须折迭形成其天然结构,然后被COP-Ⅱ囊泡转运到高尔基体中。研究证实,胰岛素基因突变诱导的青少年糖尿病造成血糖升高是由于胰岛素原在折迭过程中叁个二硫键不能正确形成,导致胰岛素原不能形成可以输出内质网的天然状态。有研究报道,野生型胰岛素原在内质网折迭过程中也会形成10%-20%错误折迭的胰岛素原,但当减少野生型胰岛素原输出内质网后,野生型胰岛素原在内质网中的状态变化还不是很清楚,因此本研究拟探讨减少胰岛素原转运出内质网,对胰岛素合成量及胰岛素原状态的影响及对β细胞内质网应激的影响。方法:本研究通过两种不同方式减少野生型胰岛素原转运出内质网。一种是破坏胰岛素原转运出内质网的载体COP-Ⅱ的组装;第二种方法是我们发现氯喹-抗疟疾药物会减少胰岛素原转运出内质网。应用组成COP-Ⅱ囊泡的sar1A蛋白的突变腺病毒sar-1A H79G和sar-1A T39N及对照腺病毒sar-1A WT和GFP感染胰岛β细胞系MIN6细胞或者人胰岛细胞,利用免疫印迹及免疫荧光方法探讨sar-1A突变蛋白对细胞内蛋白产生显性负效应后,造成COP-Ⅱ囊泡不能有效的组装后,胰岛素原的分布,状态,胰岛β细胞的内质网稳态情况;利用免疫共沉淀方法探讨胰岛素原在内质网中折迭需要什么蛋白的协助。除了应用突变蛋白损伤COP-Ⅱ囊泡的组装,本研究中还应用了siRNA敲降sar-1蛋白的表达,检测胰岛素原的分布,在内质网中的状态。应用氯喹处理胰岛β细胞系MIN6细胞或者INS-1832/13细胞后,利用标记追踪技术或者免疫标记技术观察胰岛素的生物合成量;利用还原条件及非还原条件免疫印迹方法检测胰岛素原的状态;利用细胞免疫荧光方法检测胰岛素原的分布;利用免疫印迹及免疫荧光方法检测氯喹对其他蛋白分泌的影响。结果:COP-Ⅱ囊泡组装损伤后,胰岛素原转变为胰岛素的量减少,应用放线酮追踪胰岛素原2小时后,突变组细胞中胰岛素原量明显高于对照组。过表达sar-1A突变蛋白的MIN6细胞或者人胰岛中错误折迭的胰岛素原明显增多,并且内质网应激指标p-e-if-2α和CHOP蛋白的表达量升高。但应用siRNA敲降INS-1/2基因后,细胞中胰岛素的合成量减少,错误折迭的胰岛素原也减少。同时观察到上述两个内质网应激指标下降。在应用siRNA敲降sar-1A/B蛋白组,额观察到了胰岛素原错误折迭。BIP和PDI都会与胰岛素原相互作用,错误折迭胰岛素原增多时,与胰岛素原相互作用的BIP也会相应增加。氯喹会将胰岛素原阻滞在内质网中,减少胰岛素的合成量。氯喹造成胰岛素原错误折迭,但没有损伤胰岛素原出内质网的载体COP-Ⅱ。氯喹不会影响羧基肽酶在细胞内的转运。氯喹会引起胰岛β细胞内质网应激指标p-e-IF-2α和CHOP表达量升高,减少错误折迭的胰岛素原后,升高的内质网应激指标下降。结论:1.该研究提示错误折迭的胰岛素原是内质网前向输出异常造成胰岛β细胞内质网应激的主要诱因。2.该研究揭示了有效内质网(ER)输出在维持ER稳态,胰岛素原的天然折迭及胰岛素生物合成过程中的病理生理学意义。鉴于胰岛素原错误折迭在突变胰岛素基因诱导的青年糖尿病(MIDY)和2型糖尿病中起重要作用,靶向增强胰岛素原ER输出可能是预防或延迟胰岛素原错误折迭和ER应激引起的β细胞衰竭的潜在治疗靶点。(本文来源于《天津医科大学》期刊2019-05-01）
朱广伟,黄金胜,黄永建,郑炜,杨树钢[4]（2019）在《内质网蛋白29过表达慢病毒载体的构建及其对胃癌细胞生物学行为的影响》一文中研究指出目的:构建内质网蛋白29 (ERp29)慢病毒过表达载体,探讨ERp29过表达对胃癌MGC803和SGC7901细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:构建带有红色荧光蛋白标签的ERp29基因表达质粒的慢病毒(pCDH-ERp29)和对照质粒(pCDH-Vector),分别感染MGC803和SGC7901细胞;荧光显微镜观察细胞感染情况;CCK-8和平板克隆实验检测稳定感染ERp29基因的胃癌MGC803和SGC7901细胞的增殖能力;Transwell小室实验分别检测稳定感染ERp29基因的胃癌MGC803和SGC7901细胞的迁移和侵袭能力;应用Real-time PCR和Western blotting技术分别检测稳定感染ERp29基因的胃癌MGC803和SGC7901细胞中ERp29mRNA和蛋白表达水平。结果:酶切鉴定显示成功构建pCDH-ERp29过表达载体,荧光显微镜下观察到成功感染胃癌细胞。CCK-8实验和平板克隆实验检测,与pCDH-Vector组比较,pCDH-ERp29组MGC803和SGC7901细胞增殖能力无明显变化(P>0.05);Transwell小室实验,与pCDH-Vector组比较,pCDH-ERp29组MGC803和SGC7901细胞的迁移和侵袭细胞数明显减少(P<0.05)。pCDH-ERp29组细胞中ERp29mRNA和蛋白表达水平明显高于pCDH-Vector组(P<0.05)。结论:成功构建过表达ERp29基因的慢病毒载体,过表达ERp29基因可明显抑制胃癌MGC803和SGC7901细胞的迁移和侵袭。(本文来源于《吉林大学学报(医学版)》期刊2019年02期）
彭磊,宾捷,欧阳超,卢吉平,肖建林[5]（2018）在《人内质网蛋白29在骨肉瘤患者血清中的表达特点及意义》一文中研究指出目的比较骨肉瘤患者与健康人血清中内质网蛋白29(ERp29)的表达差异,为骨肉瘤的诊断、治疗、预后的判断等提供依据。方法选择来自解放军301医院、中南大学湘雅医院的30例骨肉瘤患者和30例健康体检人员(对照组),抽取静脉血10 ml,应用clean-up试剂盒浓缩,然后去高丰度蛋白质,双向凝胶电泳,Image Master 2DE软件分析差异蛋白的表达,MALDI TOF/TOF(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)质谱鉴定,获取肽指纹图谱,再从Swiss-Prot数据库寻找相关的蛋白质,利用生物信息学蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)和KEGG通路分析寻找有意义的信号传导通路。结果获得重复性较好的双向电泳银染图谱,蛋白质点经质谱分析后证实,骨肉瘤患者血清ERp29明显上调。结论骨肉瘤患者与正常人血清蛋白质组存在明显差异,其中差异表达蛋白质ERp29有望成为诊断治疗骨肉瘤的分子标记物或者治疗靶点,为骨肉瘤的进一步研究提供理论依据。(本文来源于《中国医师杂志》期刊2018年09期）
王向阳,孙慧力,王康,郭宝春,张欣洲[6]（2018）在《内质网蛋白29在维持肾小管上皮细胞极性中作用》一文中研究指出目的观察内质网蛋白(ERP)29在大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型中表达变化及对细胞极性蛋白Par-3表达的影响。方法选取清洁级雄性SD大鼠24只,随机分为假手术组(n=6)与模型组(n=18)。假手术组打开腹腔及分离输尿管,未进行结扎;模型组打开腹腔,双结扎左侧输尿管后缝合切口,造模为UUO模型大鼠。模型组于术后第3、7、14天各处死6只大鼠,假手术组6只大鼠于第14天处死。取两组大鼠肾组织,Western印迹、免疫荧光、免疫组化法进行病理染色及检测E-钙粘素(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Par-3蛋白和ERP29蛋白表达情况。结果 Masson染色显示,模型组大量肾小管萎缩消失,广泛纤维化,且肾间质的纤维化程度逐渐加重。Western印迹及间接免疫荧光/免疫组化结果显示,模型组E-cadherin表达、细胞极性Par-3蛋白、ERP29表达下调;α-SMA表达上调。模型组14 d的E-cadherin蛋白表达与假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.05);模型组各时点α-SMA表达均较假手术组上调,差异有统计学意义(P<0.05);模型组14 d时Par-3蛋白表达下调显着,与假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.05);模型组各时间点ERP29蛋白表达与假手术组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 UUO大鼠模型中发生肾小管上皮细胞转分化过程中,肾小管上皮细胞中ERP29表达下调,可能通过减少细胞极性蛋白的表达而致上皮细胞极性丧失,提示ERP29在维持肾小管上皮细胞极性中发挥重要作用。(本文来源于《临床军医杂志》期刊2018年07期）
宋吉宁,董锦忠,陈文礼[7]（2018）在《芦荟大黄素对胃癌SGC-7901细胞株钙联蛋白/钙网蛋白循环及内质网应激凋亡的影响》一文中研究指出目的探讨芦荟大黄素对胃癌SGC-7901细胞钙联蛋白(Calnexin)/钙网蛋白(Calreticulin)循环及内质网应激(ERS)所致凋亡的影响。方法将胃癌SGC-7901细胞分为对照组(灭活胎牛血清的MEM培养基培养)、低剂量组(SGC-7901细胞+10μmol/L芦荟大黄素培养30 min)、中剂量组(SGC-7901细胞+30μmol/L芦荟大黄素培养30 min)和高剂量组(SGC-7901细胞+50μmol/L芦荟大黄素培养30 min)。细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测各组细胞培养24、48、72 h的细胞增殖率;脱氧核苷酸末端转移酶(Td T)介导的核苷酸(d UTP)缺口末端标记技术(TUNEL)检测各组细胞凋亡情况;实时荧光定量PCR检测各组细胞中Calnexin、Calreticulin及葡萄糖调节蛋白(GRP)78、肌醇需求酶(IRE)1、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)mRNA的变化;蛋白免疫印迹法检测各组细胞Calnexin、Calreticulin、GRP78、IRE1、CHOP的表达。结果 (1)与对照组相比,低剂量组细胞增殖率、凋亡率未见明显变化(P>0.05),中、高剂量组细胞增殖率降低、凋亡指数升高(P<0.05);(2)与对照组相比,低剂量组细胞Calnexin、Calreticulin mRNA和蛋白表达降低,而GRP78、IRE1、CHOP蛋白及mRNA表达无明显变化(P>0.05),中、高剂量组细胞Calnexin、Calreticulin蛋白及mRNA表达水平降低,GRP78、IRE1、CHOP蛋白及mRNA表达增高(P<0.05)。结论芦荟大黄素可能通过影响SGC-7901细胞Calnexin/Calreticulin循环激活GRP78/IRE1/CHOP信号通路,加重胃癌细胞ERS,引发细胞凋亡,降低细胞增殖率。(本文来源于《中国临床研究》期刊2018年06期）
高佳[8]（2018）在《里氏木霉内质网蛋白折迭途径改造与异源蛋白BGLA和Lcc1的表达研究》一文中研究指出里氏木霉是纤维素酶生产的主要工业菌株,其胞外蛋白分泌量可达40g/L以上;同时,其也是异源蛋白表达的良好宿主。然而,里氏木霉表达异源蛋白的产量往往低于内源蛋白,该问题的瓶颈可能发生在蛋白翻译后的折迭分泌过程中。内质网是分泌蛋白合成和成熟的重要场所。分泌蛋白进入内质网后,分子伴侣Bip1协助蛋白折迭,二硫键异构酶Pdi1和氧化还原酶Ero1帮助形成二硫键;此外,其糖基化状态也是检测蛋白折迭和分选的重要信号。糖苷酶Gls2切除糖链A分支的葡糖残基,如蛋白正确折迭,则继续分泌;若折迭错误,则甘露糖苷酶Mns1切除B分支最末端的甘露糖残基,激活内质网关联降解途径(ERAD),运出内质网,在细胞质内被降解;或者由UDP-葡糖基转移酶Gpt1在A分支上重新添加葡糖残基,促进蛋白继续循环折迭。对内质网蛋白折迭途径相关基因进行遗传改造,可有助于促进里氏木霉蛋白折迭和分泌,从而构建高效生产纤维素酶菌株。β-葡萄糖苷酶(BGL)能够将纤维二糖水解成两分子葡萄糖,BGL不足是影响纤维素降解酶系高效水解纤维素的一个瓶颈。研究表明,黑曲霉BGLA的底物特异性和比酶活均比里氏木霉Bgl1高,且对木质素的吸附程度较低,从而间接促进纤维素的酶解。漆酶是一种能够氧化酚类和芳香胺类底物的多铜氧化酶。其主要用于木质素降解、污染物脱毒、生物电极等。漆酶主要存在于担子菌中,因宿主菌难培养、需有毒物质诱导、难分离纯化等局限,阻碍其商业化应用。其异源表达是获得大量优质漆酶的重要途径。本论文构建了bip1、pdi1、ero1、gpt1和gls2基因过表达菌株以及mns1基因敲除菌株,对里氏木霉内质网蛋白折迭途径进行初步改造;此外,利用里氏木霉作为宿主对黑曲霉BGLA和毛栓菌漆酶Lcc1进行了表达研究。具体研究内容如下:(一)里氏木霉内质网蛋白折迭途径改造初步完成。构建了内质网蛋白折迭分子伴侣过表达菌株OEbip1、二硫键异构酶过表达菌株OEpdi1、氧化还原酶过表达菌株OEero1以及蛋白折迭循环关键蛋白葡萄糖基转移酶过表达菌株OEgpt1、糖苷酶过表达菌株OEgls2和甘露糖苷酶敲除菌株△mns1。荧光定量PCR表明,过表达bip1、pdi1及ero1 一定程度上引起内质网非折迭蛋白响应(UPR),但没有激活ERAD途径;过表达gpt1和gls2以及敲除mns1一定程度上引起UPR响应,激活ERAD途径。在DTT处理时,突变菌株的BGL活力要明显高于出发菌株。在内质网蛋白折迭压力条件下,突变菌株的胞外BGL分泌能力要强于出发菌株。此外,相较于出发菌株,内质网蛋白折迭途径改造菌株OEgpt1、OEero1、OEbip1及△mns1的滤纸酶活和BGL酶活得到明显提升。发酵培养第7天,过表达pdi1和bip1菌株的滤纸酶活分别提高43.0%和49.6%;BGL酶活分别提高112.3%和41.7%。OEgpt1、OEero1、OEbip1的内切葡聚糖酶酶活略高于出发菌株QP4,△mns1、OEgls2及OEpdi1的内切葡聚糖酶(EG)酶活略低于出发菌株QP4。所有突变菌株的外切葡糖酶(CBH)活力,没有发生较为显着的变化。(二)里氏木霉成功表达黑曲霉BGLA。利用里氏木霉自身诱导型强启动子pcbh1对黑曲霉BGLA进行表达,成功构建工程菌株SCB18。发酵培养第7天,SCB18菌株的BGL酶活为103.9 IU/mL,较对照菌株提高51.3倍;其滤纸酶活为4.6 IU/mL,较对照菌株提升29.8%。黑曲霉BGLA的过表达在一定程度上引起了 UPR响应,但没有明显激活ERAD途径。黑曲霉BGLA在里氏木霉中表达需要更多的分子伴侣Bip1和二硫键异构酶Pdi1协助完成。另外,木糖渣底物糖化结果表明,SCB18菌株所分泌纤维素酶的纤维素转化率明显高于出发菌株SDC11。其中,以脱木素木糖渣为底物,酶解反应96h时SCB18菌株的纤维素转化率为96.6%;以未脱木素木糖渣为底物,酶解反应96h时SCB18菌株的纤维素转化率为53.1%。SCB18菌株所分泌酶液的转糖基能力较强,以60%葡萄糖作为底物,65℃反应2天,葡萄糖转化率实现最大(17.6%);转糖基产物主要为槐糖、龙胆二糖以及纤维二糖。此外,转糖基产物具有较强的诱导生产纤维素酶的能力,其诱导能力强于乳糖但弱于纤维素,转糖基产物是具有较强经济价值的可替代的可溶性诱导型碳源。(叁)里氏木霉表达高氧化还原电势毛栓菌漆酶Lcc1的研究。利用里氏木霉组成型强启动子pcdna1过表达毛栓菌漆酶lcc1基因,共获得7株转化子。毛栓菌漆酶lcc1基因在里氏木霉中成功转录,但发酵培养和ABTS平板显色结果表明过表达菌株漆酶活力均没有被检测到。里氏木霉表达漆酶Lcc1引起了较强的UPR响应,激活了 ERAD途径。漆酶Lcc1可能在里氏木霉中没有完成正确折迭,进而从内质网中运出,在细胞质中被降解。(四)毕赤酵母GS115成功表达毛栓菌漆酶Lcc1及其糖基化突变体蛋白。对漆酶Lcc1的54位和433位两个糖基化位点进行未突变、单突变和双突变,获得未突变Lcc1菌株、单突变N54Q菌株、单突变N433Q菌株以及双突变NDQ菌株。ABTS平板显色结果表明,漆酶活力大小为未突变Lcc1菌株>单突变N54Q菌株>单突变N433Q菌株>双突变NDQ菌株。漆酶纯化和活性检测表明433位天冬酰胺糖基化对漆酶Lcc1保持活性至关重要。未突变Lcc1利用ABTS和2,6-DMP的最适pH均为5.0;且利用ABTS和2,6-DMP最适温度分别为60℃和55℃。(本文来源于《山东大学》期刊2018-05-28）
隋委伽[9]（2018）在《伯式疟原虫内质网蛋白YOP1在蛋白质分泌中的作用研究》一文中研究指出研究目的:疟疾是由疟原虫引起的一种严重危害生命健康的全球性传染疾病,其临床症状主要是由疟原虫在宿主红细胞内的无性生长增殖所引起的。疟原虫有多种种属,本文我们重点研究的是鼠源的伯氏疟原虫(Plasmodium berghei ANKA),其可侵染鼠的正常红细胞。成熟红细胞无细胞器与细胞核,疟原虫侵入后可利用自身的内质网合成并分泌大量不同功能的蛋白质至红细胞胞浆或胞膜,从而完成对红细胞结构的重塑,以利于疟原虫摄取营养物质、进行细胞粘附、或逃逸免疫清除等。前期研究表明,伯式疟原虫表达真核细胞保守的内质网蛋白YOP1。YOP1通过诱导膜曲度来稳定管状内质网结构,缺失YOP1会影响内质网管状网络,而管状网络又与蛋白质分泌相关联。本文旨在研究伯式疟原虫YOP1(PbYOP1)的缺失对其蛋白分泌及致病能力的影响,以便寻找干扰疟原虫蛋白质合成与分泌的新方法,为疟疾疫苗的研制提供可靠的理论依据。研究内容:第一部分:利用野生型(wt)和YOP1缺失(△yop1)的伯式疟原虫分别感染Wistar大鼠,通过伯式疟原体外同步化培养技术得到大量发育至裂殖体时期的疟原虫化的红细胞并同时富集未感染疟原虫的红细胞。选用两种不同的红细胞及疟原虫蛋白提取方法进行研究:其一是胰蛋白酶膜表面处理法,即在富集的感染与未感染红细胞沉淀中加入胰酶溶液,处理一段时间后取其上清,用BCA法测上清中的蛋白浓度,同时将上清做定性与定量质谱并统计对比,此方法主要研究的是暴露于红细胞膜表面的蛋白质种类与含量;其二是低渗破膜法,将相同数量未感染与感染的红细胞用低渗破膜液处理后,分别取所有的疟原虫与红细胞膜沉淀,用蛋白质电泳的方法检测不同组所有蛋白质的表达量差异,并将蛋白质胶条做定性质谱,统计不同组红细胞膜与疟原虫相关蛋白质种类与含量的差异。第二部分:利用wt和△yop1的伯式疟原虫分别感染BALB/C小鼠,在感染的不同时期分别取两组鼠的脾脏与肝脏,以未感染疟原虫的鼠肝脾为对照组,利用实时荧光定量技术检测不同脏器的炎症因子及其内质网应激分子的相对表达量,进一步探究伯式疟原虫YOP1的缺失对不同组织脏器致病能力的影响。研究结果:第一部分结果显示:用胰酶膜表面处理组中,wt疟原虫感染的红细胞表面蛋白浓度高于△yop1,并且二者均高于未感染红细胞组;质谱结果表明感染疟原虫后红细胞膜表面或胞浆中整合了大量疟原虫相关蛋白质,并且红细胞自身蛋白质的种类与含量出现了不同程度的上调与下调;PbYOP1基因缺失影响了疟原虫蛋白质的分泌,使得红细胞中疟原虫相关蛋白质的种类相比较wt组有所下降,其蛋白含量主要以下调为主,部分种类的疟原虫分泌蛋白在△yop1组并未检测到。低渗处理法组中wt和△yop1组全部的红细胞膜与疟原虫沉淀跑胶的胶条结果用ImageJ软件统计分析,结果显示wt组与△yop1组总蛋白含量无统计学差异;质谱结果显示PbYOP1缺失组疟原虫分泌蛋白质的种类出现下降。第二部分结果显示:感染疟原虫后,随着感染天数的延长,鼠肝脾内质网应激分子和炎症相关因子的表达量逐渐升高,其中在感染中晚期,△yop1组其因子表达量相比较wt组出现显着下降,在感染的早期两组无显着差异。研究结论:伯式疟原虫YOP1的缺失会降低其分泌蛋白的种类,蛋白含量以下调为主,并且PbYOP1的缺失会显着降低伯式疟原虫对鼠肝脾脏器的致病力。这些结果为深入研究伯氏疟原虫YOP1的生理功能奠定了重要基础。(本文来源于《天津医科大学》期刊2018-05-01）
管培燕[10]（2018）在《拟南芥内质网蛋白SES1调控盐胁迫抗性的分子机理研究》一文中研究指出土壤盐渍化严重影响植物的生长及发育,成为限制当今作物产量的主要环境因素之一。土壤中的高盐能打破植物体内的离子平衡,对植物造成渗透胁迫、离子毒害及氧化损伤。全球大约20%的耕地及将近一半的灌溉土地受到盐胁迫的危害。因此,如何高效的利用盐渍化土壤、培育耐盐新作物,成为全球广泛关注的问题。为了在盐渍化土壤中生存,植物进化出多种生理生化机制保护自身,减轻盐胁迫对其造成的伤害。例如:重建体内离子平衡、合成渗透保护物质、激活抗氧化酶活性及调控盐胁迫下基因的表达等。同时,近几年研究表明,内质网在应对盐胁迫信号转导及整合方面也发挥重要作用。盐胁迫严重影响内质网中蛋白质的加工折迭过程,导致内质网中未折迭蛋白积累,引发植物内质网胁迫。然而,盐胁迫与内质网胁迫之间的调控关系仍然不清楚。通过正向遗传学,我们分离鉴定了拟南芥中调控盐胁迫抗性的重要功能基因SES1(SENSITIVE to SALT 1),并阐明了其通过缓解盐害造成的内质网胁迫,从而增强植物的盐胁迫抗性。主要实验结果如下:(1)从EMS诱变的拟南芥突变体库中筛选并鉴定了一株盐敏感突变体ses1-1。通过图位克隆确定突变基因为SES1。SES1能完全互补ses1-1及T-DNA插入突变体ses1-2的盐敏感表型。(2)SES1是植物特有的一类含有Saposin B结构域的蛋白质。ses1-1突变的谷氨酸位于该保守结构域内,且该氨基酸在植物界高度保守。拟南芥中共有6个蛋白含有该结构域。进化关系显示其余5个蛋白与SES1亲缘关系较远。在其它植物中,SES1同源蛋白的功能未知。(3)过量表达SES1并没有增强转基因拟南芥的盐胁迫抗性。(4)ses1-1和ses1-2不仅对NaCl超敏感,而且对NaNO_3、KCl、KNO_3、LiCl及甘露醇的抗性均明显下降,表明SES1不仅调控盐胁迫抗性,也是渗透胁迫抗性所必需的功能基因。(5)SES1在拟南芥根、茎、叶、花、果荚、种子均有表达,且受盐胁迫诱导上调。SES1定位于内质网中,且其亚细胞分布不受盐胁迫影响。(6)对照及盐处理条件下ses1体内Na~+含量及盐胁迫响应基因的表达水平与野生型相比无明显差异。RNA-seq结果显示盐胁迫处理后ses1体内参与内质网胁迫相关基因的表达量发生明显改变,表明盐胁迫处理后ses1受到更严重的内质网胁迫。蛋白质组分析检测到14种参与内质网中蛋白折迭加工的组分在NaCl处理后的ses1-2中明显增多,表明盐胁迫条件下,更多未正确加工折迭的蛋白在ses1-2体内积累。透射电子显微镜观察发现盐处理后ses1内质网明显肿胀,形成许多内质网池并出现撕裂现象。(7)SES1具有分子伴侣的活性,能参与蛋白质的折迭过程,且分泌路径Marker蛋白secGFP在ses1体内的荧光信号明显强于WT,且荧光信号主要产生于内质网,表明SES1缺失影响蛋白折迭加工,导致分泌蛋白滞留在内质网内,造成内质网胁迫。(8)SES1受内质网胁迫试剂衣霉素诱导表达,且ses1对衣霉素敏感。SES1启动子中含有内质网胁迫响应元件ERSEL,EMSA、ChIP等实验均证明内质网胁迫感知因子bZIP17能通过靶向ERSEL元件激活SES1表达。在bzip17体内过量表达SES1能恢复bzip17的盐敏感表型。(本文来源于《山东农业大学》期刊2018-04-10）
内质网蛋白论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病,其治疗以手术治疗,放射治疗、化学疗法以及近年来的免疫治疗为主。无论是放疗、化疗还是免疫治疗,耐药和精准用药的选择性不高是制约其治疗的难题。虽然免疫治疗的优势显着,但患者的应答率不高,因此化疗虽有诸多不尽人意,但依然侵袭转移性肿瘤的治疗方案。近年来靶向药物的出现,为肿瘤患者带来新的希望。靶向药物靶点明确,但是耐药迅速,并且只有少数靶向药物有耐药标志物。目前临床上缺乏精准有效的指示标志物来预测化疗与靶向治疗效果,因此临床上亟待发现新的指示标志物,用以精准用药,提高患者生存率及生存治疗。AGR2是二硫键异构酶家族成员,虽然是内质网定位蛋白,但AGR2仍可定位于细胞胞质和分泌至细胞外,具有分泌特性。AGR2作为癌基因,在多种肿瘤中高表达:1)可显着促进肿瘤的增殖与侵袭转移;2)其分泌特性,提示可作为肿瘤的诊断标志物;3)可作为药物靶点,已有AGR2抗体药物的研究报道。作为药物靶点,已有研究发现AGR2与耐药有关,对乳腺癌内分泌治疗耐受。目前AGR2与肿瘤耐药的研究较少。因此本论文首先通过药物筛选,确定AGR2表达与肿瘤治疗化疗药物和靶向药物的关联,发现其表达显着影响药物的药效。随后对其耐药机制进行研究,发现细胞内和分泌的AGR2均通过不同的机制参与耐药,最后通过AGR2介导的耐药机制探讨其应对方案,并确定分泌的AGR2可作为化疗以及血管靶向药物的用药指示标志物,并根据AGR2的表达提出序贯用药的策略。第一部分AGR2表达对肿瘤化疗药物和靶向药物敏感性的影响AGR2被认为是一种癌基因,能够显着促进癌细胞增殖与侵袭转移,并且多个报道显示AGR2能够促进癌细胞抵抗细胞死亡。目前发现AGR2在乳腺癌中高表达促进他莫昔芬及多柔比星耐受,但是在我们前期通过组学数据分析在多西紫杉醇耐药的前列腺癌细胞中AGR2表达显着下调。因此我们首先进行了通量的药物筛选以确定AGR2的表达与肿瘤化疗耐受的相关性,为进一步分析AGR2的功能提供基础。一、不同细胞AGR2的基础表达对化疗药物的敏感性对比通过对常见的肿瘤细胞AGR2基础表达进行分析,分别选取AGR2高表达和低表达的细胞进行药物敏感性筛选,发现AGR2的表达水平影响药物的药效:1.低表达AGR2的非小细胞肺癌与结肠癌细胞对化疗药物耐受WB实验结果显示非小细胞肺癌细胞A549中AGR2表达显着低于H460细胞,SW620中AGR2表达显着低于SW480。根据MTT结果分析其IC50值,结果表明低表达AGR2的A549与SW620细胞对多西紫杉醇、阿霉素及顺铂叁种化疗药物较为耐受,而H460与SW480细胞对所选药物较为敏感,。2.高表达AGR2的乳腺癌细胞对细胞毒性化疗药物耐受WB实验显示乳腺癌细胞MDA-MB-453中AGR2表达显着高于MDA-MB-468细胞,MTT结果表明,MDA-MB-453细胞叁种化疗药物较为耐受,而MDA-MB-468细胞对药物较为敏感。二、细胞沉默或过表达AGR2表达对化疗药物及靶向药物的应答分析1.细胞AGR2表达变化对化疗药物敏感性的影响我们在AGR2高表达的PC3,H460,SW480细胞中沉默AGR2表达,在AGR2低表达的DU145,A549,SW620中过表达AGR2后分析其对化疗药物敏感性的影响。MTT检测发现与对照细胞相比,AGR2表达下调后前列腺癌、非小细胞肺癌及结肠腺癌细胞对化疗药物多西紫杉醇、阿霉素及顺铂产生耐受,过表达AGR2后叁种肿瘤细胞对药物敏感性增加,和前期数据一致。2.细胞AGR2表达改变对靶向药物敏感性的影响MTT检测发现与对照细胞相比,AGR2表达下调后前列腺癌、非小细胞肺癌及结肠腺癌细胞对EGFR靶向药物吉非替尼、CDK4/6靶向药物帕布昔利布及血管新生靶向药物卡博替尼耐受,对蛋白酶体靶向药物硼替佐米敏感。过表达AGR2后叁种肿瘤细胞对吉非替尼,帕布昔利布及卡博替尼敏感,对硼替佐米耐受。3.乳腺癌细胞AGR2表达与化疗药物敏感性筛选:MTT检测发现与对照细胞相比,AGR2表达下调后乳腺癌细胞MDA-MB-453细胞毒性化疗药物多西紫杉醇、阿霉素及CDK4/6靶向药物帕布昔利布、血管新生靶向药物卡博替尼以及蛋白酶体靶向药物硼替佐米一致敏感。过表达AGR2的MDA-MB-468细胞对筛选的五种化疗药物一致耐受。第二部分分泌AGR2拮抗抗血管新生靶向药物的分子机制及应对方案在第一部分通量筛选中,我们发现AGR2高表达肿瘤细胞对抗血管新生药物卡博替尼耐受,这引起了我们的兴趣。肿瘤增殖与侵袭转移均需要充足的营养供给,这促使肿瘤组织血管新生以保重营养物质和氧气输送,运出代谢产物并为至肿瘤转移提供重要的门户。虽然AGR2在肿瘤增殖与侵袭中研究较多,但是AGR2对抗血管新生靶向药物的影响是否与促进血管新生有关尚无报道。课题组前期发现AGR2能够显着促进原位前列腺癌的侵袭转移,并且过表达AGR2的原位肿瘤血运尤为丰富,提示AGR2促进肿瘤血管新生以促进前列腺癌侵袭转移。结合第一部分AGR2对抗血管新生药物敏感性的影响,本部分探讨AGR2促血管新生的分子机制及应对策略。一.分泌的AGR2协同VEGFA促进血管新生前期研究已证实,细胞内高表达的AGR2可通过稳定NF-κB介导的EMT机制而发挥促进肿瘤侵袭转移的作用。本论文进一步发现过表达AGR2的细胞上清同样具有显着的促进肿瘤增殖和迁移的作用,提示分泌的AGR2可能发挥促进肿瘤侵袭转移的作用,因此,本部分重点分析分泌的AGR2是否能够促进肿瘤侵袭转移与血管新生:1.重组人AGR2蛋白促进血管新生采用原核表达纯化体系获得了带His标签的重组人AGR2融合蛋白。分子筛结果显示蛋白为二聚体活性形式存在。细胞生长曲线数据表明重组人AGR2蛋白能够促进前列腺癌细胞增殖。小管形成实验表明rhAGR2显着增加内皮细胞HUVECs的小管形成数目。ELISA实验结果显示rhAGR2刺激后,HUVECs培养基中VEGFA含量无明显变化,提示AGR2不促进VEGFA的成熟。2.重组人AGR2蛋白协同VEGFA促进血管新生小管形成实验表明rhAGR2与VEGFA都能够增加HUVECs小管形成数目,二者联合刺激HUVECs小管形成数目显着高于单独刺激。划痕实验表明rhAGR2与VEGFA联合刺激增强HUVECs与前列腺癌细胞PC3的移动能力明显强于单独刺激。Q-PCR结果显示rhAGR2与VEGFA联合刺激增强VEGFR2信号通路。二.分泌的AGR2直接结合VEGFA,激活VEGF/VEGFR信号而促进血管新生1.AGR2与VEGFA直接相互作用采用原核表达纯化体系获得了带His标签的重组人VEGFA融合蛋白与GST标签的AGR2全场及截短体蛋白蛋白,SDS-PAGE表明蛋白正确且纯度较高。His-pulldown实验证实AGR2与VEGFA存在直接相互作用。通过VEGFA与AGR2截短体pulldown实验表明AGR2与VEGFA结合于AGR2的81-101位氨基酸内。2.AGR2与VEGFA形成分子间二硫键His-pulldown实验证实AGR2半胱氨酸突变体不能与VEGFA相互作用,并且还原剂阻断AGR2与VEGFA的相互作用。小管形成实验表明细胞分泌与纯化的AGR2 C81A突变体蛋白都不能促进HUVECs小管形成。因此PDI结构域是AGR2与其他蛋白形成分子间二硫键的关键结构域。3.还原剂谷胱甘肽阻断AGR2促血管新生与促侵袭活性免疫共沉淀实验表明生理性还原剂谷胱甘肽能够破坏细胞外AGR2与VEGFA相互作用。小管形成实验显示谷胱甘肽联合rhAGR2刺激HUVECs小管形成数目显着降低。划痕实验表明谷胱甘肽联合rhAGR2刺激PC3细胞转移能力显着下降。体内肿瘤侵袭转移模型发现谷胱甘肽能够降低注射rhAGR2小鼠肺转移灶数目,但是抗血管新生药物贝伐珠单抗则不能抑制注射rhAGR2小鼠肺转移灶数目。叁、分泌的AGR2拮抗血管新生靶向药物及用药选择研究小管形成实验表明卡博替尼与贝伐珠单抗都可以有效的抑制HUVECs小管形成数目,但是rhAGR2不能逆转卡博替尼而可以逆转贝伐珠单抗抑制HUVECs小管形成数目。裸鼠荷瘤实验表明腹腔注射rhAGR2能够削弱贝伐珠单抗的抗肿瘤活性,而对卡博替尼的抗肿瘤活性没有影响。提示AGR2指示抗血管新生药物用药。第叁部分AGR2低表达介导的肿瘤化疗多药耐药的分子机制在第一部分中,我们发现AGR2低表达介导了激素非依赖的前列腺癌,非小细胞肺癌及结肠腺癌的化疗耐受。而筛选结果表明,下调AGR2介导了癌细胞对多种结构不同靶点各异的化疗药物耐受,提示AGR2介导了肿瘤化疗多药耐药。因此我们探寻AGR2介导肿瘤化疗耐受的分子机制,以及克服耐药的用药策略。一、AGR2负调控MRP2表达介导肿瘤化疗多药耐药由于低水平的AGR2可介导多种不同结构和作用机制的化疗药物耐药,而药泵蛋白是介导多药耐药的重要机制,因此,首先分析药泵蛋白在AGR2低表达介导耐药的作用。流式细胞术结果显示PC3细胞下调AGR2,细胞内阿霉素的蓄积水平显着下降,表明药泵蛋白参与其耐药过程。MTT结果显示,AGR2在前列腺癌、非小细胞肺癌及结肠腺癌细胞中表达与P-gp不亲和的卡巴他赛药物敏感性呈负相关PC3与H460细胞中沉默AGR2表达,免疫印迹结果显示MRP2蛋白水平增加,免疫荧光结果显示过表达AGR2细胞膜上MRP2减少。提示AGR2介导MRP2依赖的多药耐药。二、ARRB1介导MRP2蛋白降解流式细胞术检测沉默ARRB1表达,细胞内阿霉素蓄积明显降低。WB结果显示,沉默ARRB1表达,MRP2蛋白表达升高,而过表达ARRB1,细胞MRP2蛋白表达降低。免疫共沉淀检测MRP2与同家族蛋白MRP1与ARRB1相互作用。蛋白泛素化检测发现过表达ARRB1,MRP2泛素化水平增加,并且ARRB1 S412D失活突变不能增加MRP2泛素化。最后免疫共沉淀结果显示MRP2与E3泛素连接酶MDM2相互作用。叁、AGR2上调ARRB1介导肿瘤化疗多药耐药1.下调ARRB1介导肿瘤化疗多药耐药MTT结果显示PC3细胞与H460细胞沉默ARRB1表达,细胞对多西紫杉醇、阿霉素及顺铂等叁种细胞毒性化疗药物耐受,而在DU145与A459细胞中过表达ARRB1,细胞对叁种化疗药物敏感性增加。动物实验表明,下调ARRB1肿瘤对多西紫杉醇耐受。2.AGR2上调ARRB1蛋白表达介导药物耐受WB结果显示,H460细胞下调AGR2表达,ARRB1蛋白表达下降。免疫共沉淀结果显示,AGR2与ARRB1存在相互作用。MTT结果表明,过表达ARRB1逆转下调AGR2介导的肿瘤化疗耐受,而沉默ARRB1表达则逆转过表达AGR2介导的药物敏感。3.PDI结构域参与AGR2介导的药物耐受WB结果显示,PDI结构域突变的AGR2 C81A突变体不能上调ARRB1表达。MTT结果显示AGR2 C81A突变体不能影响肿瘤细胞对多西紫杉醇和阿霉素的敏感性。4.AGR2上调MRP2蛋白表达介导药物耐受MTT结果表明,在PC3与H460细胞中沉默MRP2表达逆转下调AGR2介导的药物敏感。第四部分蛋白酶体抑制剂克服AGR2低表达介导的肿瘤化疗多药耐药的作用及分子机制研究在前期通量筛选过程中,我们发现蛋白酶体抑制剂硼替佐米的药物敏感性与AGR2表达负相关,这提示我们靶向蛋白酶体有潜力作为AGR2低表达介导的肿瘤化疗多药耐药的应对策略。本部分分析AGR2调控蛋白酶体活性的机制,为肿瘤化疗耐受的逆转策略提供理论支持。一、AGR2负调控肿瘤细胞蛋白酶体活性1.AGR2与细胞泛素-蛋白酶体降解途径相关BioGRID数据库分析AGR2蛋白相互作用网络,聚类结果显示AGR2相互作用蛋白与蛋白质泛素化相关。WB结果显示沉默AGR2表达细胞内总泛素化蛋白减少,而过表达AGR2细胞内泛素化蛋白积累增加2.AGR2负调控蛋白酶体活性蛋白酶体活性分析结果表明,沉默AGR2表达,蛋白酶体中胰蛋白酶样活性、胰凝乳蛋白酶样活性与肽基-谷氨酰基水解酶样活性升高,而过表达AGR2,凝乳蛋白酶样活性与肽基-谷氨酰基水解酶样活性降低,胰蛋白酶样活性基本不变。二、AGR2调控蛋白酶体19s调节亚基与20s核心亚基结合11AGR2通过PDI结构域与19s蛋白酶体调节亚基结合蛋白酶体活性检测结果表明,与对照BSA蛋白相比,纯化的AGR2蛋白并不抑制蛋白酶体活性。免疫共沉淀表明,AGR2与19s调节亚基蛋白PSMD2存在相互作用,并且PDI结构域突变的AGR2 C81A不能与PSMD2相互作用,蛋白酶体活性检测提示AGR2 C81A不能抑制蛋白媒体活性。MTT检测细胞活力表明AGR2 C81A不能降低肿瘤细胞对蛋白酶体抑制剂硼替佐米的敏感性2.AGR2抑制19s调节亚基与20s核心亚基结合免疫共沉淀结果表明过表达AGR2,PSMD2与AGR2结合增多,而与核心亚基蛋白PSMA7结合减少。提示AGR2高表达抑制了 19s调节亚基与20s核心亚基结合从而蛋白酶体活性降低。叁、多西紫杉醇与硼替佐米序惯性用药克服化疗获得性耐受动物实验数据显示,下调AGR2介导肿瘤细胞对多西紫杉醇耐受,对蛋白酶体抑制剂敏感。多西紫杉醇通过下调AGR2反馈性增加蛋白酶体活性。MTT结果显示,先采用多西紫杉醇处理12h后更换硼替佐米处理12h,肿瘤细胞存活率显着低于单独使用多西紫杉醇与硼替佐米或二者联用。动物实验表明先采用多西紫杉醇治疗后使用硼替佐米治疗的效果优于单独使用多西紫杉醇与硼替佐米或二者联用治疗效果。结论1.低表达AGR2与肿瘤细胞多药耐药相关。2.AGR2协同VEGFA促进肿瘤血管新生及贝伐珠单抗耐受,而谷胱甘肽与卡博替尼可以作为应对策略。3.低表达AGR2通过下调ARRB1的表达介导肿瘤化疗耐受4.AGR2通过抑制蛋白酶体核心亚基与调节亚基的结合负调控蛋白酶体。6.硼替佐米克服低表达AGR2介导的肿瘤多药耐药,并且多西紫杉醇与硼替佐米序惯性用药克服临床化疗获得性耐受创新点1.鉴定VEGFA是分泌AGR2的直接相互作用蛋白2.首次报道ARRB1介导了MRP2的降解起始,并且E3泛素连接酶MDM2介导了MRP2的泛素化。3.首次鉴定PSMD2是AGR2的相互作用蛋白,并且AGR2通过抑制蛋白酶体核心亚基与调节亚基的结合4.首次提出多西紫杉醇与硼替佐米序惯性用药方案,并且提出AGR2作为指示标志物指导临床肿瘤化疗用药。不足之处1.未能分析乳腺癌细胞中AGR2上调介导多药耐药的分子机制2.AGR2促进MRP2降解的机制研究不够完整,应当更进一步分析MRP2降解过程中AGR2所起到的作用。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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