导读:本文包含了裂解复制论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:I型人类免疫缺陷病毒,Tat蛋白,慢病毒表达载体,卡波济肉瘤相关疱疹病毒
裂解复制论文文献综述
陈玉礼[1]（2018）在《参与HIV-1 Tat激活KSHV裂解复制周期的宿主细胞甲基化基因筛选》一文中研究指出目的:明确宿主细胞基因组甲基化在HIV-1 Tat蛋白激活KSHV裂解周期中的作用,筛选参与HIV-1 Tat蛋白激活KSHV裂解周期的宿主细胞甲基化位点。方法:1.构建HIV-1 Tat重组慢病毒表达载体pCDH-GFP-Tat-F后,将构建的pCDH-GFP-Tat-F与慢病毒包装质粒混合物共转染293T细胞,组装HIV-1 Tat重组慢病毒pCDH-GFP-Tat-F,同时组装含pCDH-GFP空载体的慢病毒作为对照;2.HIV-1 Tat重组慢病毒pCDH-GFP-Tat-F感染BCBL-1细胞,通过荧光显微镜观察病毒感染效率;应用Western blotting检测Tat蛋白在宿主细胞的表达;利用Tat蛋白可激活HIV-1长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)的特性,采用含LTR启动的氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因的pTZIII-CAT质粒转染重组病毒感染24h的BCBL-1细胞后,以CAT-ELISA试剂盒检测Tat诱导的CAT表达,从而检测Tat蛋白的转录激活活性;3.利用real time PCR检测KSHV的裂解期及潜伏期基因的表达,分析Tat重组病毒感染对KSHV裂解复制周期的影响;4.应用重亚硫酸盐处理的第二代高通量DNA甲基化测序技术筛选表达Tat蛋白的BCBL-1细胞中宿主基因组的甲基化位点。结果:1.成功构建了pCDH-GFP-Tat-F慢病毒表达载体,并能在293T细胞内正确进行RNA转录与蛋白质表达,进一步包装获得重组慢病毒;2.组装好的慢病毒感染BCBL-1细胞,荧光显微镜观察感染效率达到80%以上。应用Western blotting技术检测到重组病毒感染的BCBL-1细胞内能正确表达Tat蛋白。同时用pTZIII-CAT质粒转染后,可检测到细胞中CAT表达,表明重组病毒表达的Tat蛋白具有活性。3.利用Real time PCR检测KSHV的裂解期及潜伏期基因结果显示裂解期基因PAN上调,潜伏期基因LANA基因下调,表明Tat蛋白能激活KSHV裂解复制;4.重亚硫酸盐处理的第二代高通量DNA甲基化测序结果显示Tat蛋白表达使宿主细胞很多染色体区域发生了甲基化改变,同时还分别筛选出9个甲基化升高的区域和8个甲基化降低的区域;GO分析结果显示,Tat蛋白引起的宿主细胞甲基化状态改变涉及6个细胞信号通路;KEGG信号通路注释筛选到15个具有统计学差异(即q-value<=0.01)的信号通路。结论:1.本次研究证实Tat蛋白激活KSHV裂解复制。2.宿主细胞的染色体区域甲基化可能参与Tat蛋白激活KSHV裂解复制。(本文来源于《右江民族医学院》期刊2018-03-05）
齐燕[2]（2018）在《LANA通过let-7a/RBPJ信号通路抑制KSHV的裂解复制》一文中研究指出背景:卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)是卡波氏肉瘤(KS)等疾病的病因,在感染宿主细胞内有潜伏(latent)和裂解(lytic)两个生命周期。潜伏相关核抗原(LANA)是建立和维持潜伏的关键因子和复制转录激活因子(RTA)是潜伏到裂解的开关。抑制RTA表达是LANA维持潜伏感染的重要机制。宿主细胞表达的重组信号结合蛋白免疫球蛋白J区(RBPJ)与LANA结合在抑制RTA的表达中发挥了重要作用。但RBPJ表达水平是否受KSHV调控以及RBPJ表达水平与KSHV裂解复制的关系尚不清楚。目的:明确LANA对let-7a/RBPJ信号通路的影响;阐明LANA调控let-7a表达的机制以及let-7a与RBPJ的直接靶向关系;研究let-7a及RBPJ对KSHV裂解复制的影响。方法:首先采用过表达和RNA干扰技术检测LANA对let-7a/RBPJ信号通路分子表达水平的影响:脂质体法转染LANA到293T细胞,以转染相应空载体为对照,northern-blot和实时荧光定量PCR(quantative real-time PCR,qPCR)检测let-7a的表达水平,pri-let-7afd、LIN28B、NF-κB和RBPJ的转录水平,western-blot检测LIN28B、NF-κB和RBPJ的蛋白水平;脂质体法转染si-LANA到iSLK.219细胞,以转染非特异siRNA为对照,检测上述指标。然后,采用过表达和RNA干扰技术改变LIN28B和NICD表达水平,检测let-7a、pri-let-7afd、RBPJ的表达水平,分析LANA调控let-7a的分子机制。进一步的,采用荧光素酶报告实验检测let-7a与RBPJ 3’UTR的靶向关系,并检测转染let-7a表达载体(过表达)或let-7 sponge(下调let-7a)对RBPJ mRNA和蛋白水平的影响,证实let-7a直接抑制RBPJ的表达。最后,分别在过表达let-7a和下调RBPJ的iSLK.219细胞中,倒置显微镜观察RFP表达以判断病毒激活状态;qPCR检测细胞内KSHV基因组的拷贝数以判断病毒复制水平;qPCR检测培养液中KSHV基因组的拷贝数以及培养液感染293T细胞的能力分析病毒子产量及感染力。结果:1.过表达LANA上调let-7a及其初始转录体pri-let-7afd,同时下调RBPJ;下调LANA则反之。2.LANA下调NF-κB、LIN28B;干扰LIN28上调let-7a,而同时干扰LANA和LIN28B则下调let-7a表达。3.LANA可上调NICD,NICD上调let-7a及其初始转录体pri-let-7afd。4.Let-7a以剂量依赖的方式抑制RBPJ 3’UTR荧光素酶报告基因活性,但对结合位点突变的RBPJ 3’UTR荧光素酶告基因活性没有影响;let-7a抑制RBPJ的表达。5.过表达let-7a以剂量和时间依赖的方式抑制KSHV的裂解激活,下调病毒复制水平和有感染力病毒子的产量。6.下调RBPJ以剂量和时间依赖的方式抑制KSHV的裂解激活,下调病毒复制水平和有感染力病毒子的产量。结论:1.LANA通过上调let-7a抑制RBPJ表达。2.LANA通过NF-κB/LIN28B调控let-7a的水平,通过NICD控制pri-let-7afd的转录。3.调控let-7a/RBPJ信号在LANA抑制KSHV裂解复制中发挥了重要作用。(本文来源于《杭州师范大学》期刊2018-03-01）
张锡平[3]（2017）在《芒果苷对BCBL-1细胞增殖、凋亡、分泌IL-4及KSHV裂解复制的影响》一文中研究指出目的:本研究旨在探索芒果苷(mangiferin)于体外对BCBL-1细胞株增殖、凋亡、分泌IL-4和胞内KSHV的影响,以及可能的作用机制。方法:1.采用CCK-8细胞活性实验分别检测不同芒果苷浓度对体外培养的BCBL-1细胞的生长抑制作用,并计算半数抑制浓度(IC50);2.用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)来检测800μmol/L的芒果苷作用不同时间段(12h,24h,48h)对BCBL-1细胞株分泌IL-4的影响;3.用Annexin V/PI-FITC标记400,800和1600μmol/L浓度的芒果苷作用24h后的BCBL-1细胞,并用流式细胞仪分析,计算Annexin V/PI-细胞比率,了解BCBL-1细胞凋亡情况;4.将400、800和1600μmol/L芒果苷作用于BCBL-1细胞24h、48h、72h后,利用荧光定量PCR法检测病毒复制周期相关的基因(LANA、ORF50和PAN)表达量,观察芒果苷对KSHV复制周期的影响;5.800μmol/L芒果苷干预BCBL-1细胞12h后,利用RT2 Profiler PCR ArraysHuman Apoptosis基因芯片筛选与细胞凋亡相关信号通路中异常表达的基因。结果:1.芒果苷具有抑制BCBL-1细胞生长的作用,具有剂量依赖性(P<0.05),计算出芒果苷对BCBL-1细胞的IC50分别为979.89μmol/L(24h)、739.19μmol/L(48h);2.芒果苷浓度在800μmol/L时IL-4分泌水平有上升的趋势,差异有统计学意义(P<0.01);3.Annexin V/PI-FITC标记的细胞凋亡实验证明:与对照组相比,芒果苷组中的晚期死亡细胞(Annexin V+/PIFITC+)数量增加(P<0.05),早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-FITC-)的数量变化并没有差异(P>0.05);4.芒果苷处理细胞后病毒潜伏期基因LANA表达量变化不明显,病毒裂解期基因ORF50和PAN表达量有上升的趋势(P<0.01);5.RT2 Profiler PCR Arrays基因芯片筛选出:细胞凋亡相关的基因CASP5(-2.32,P=0.049)、FASLG(-2.69,P=0.040)表达量下调。结论:1.芒果苷对BCBL-1细胞具有抑制生长增殖的作用,其机制可能与芒果苷促进IL-4因子分泌有关;2.芒果苷可以诱导BCBL-1细胞死亡坏死,但芒果苷诱导细胞凋亡作用较弱,其机制可能是病毒干扰作用使细胞凋亡相关的基因CASP5和FASLG转录水平下调有关;3.芒果苷可以促进BCBL-1细胞内KSHV病毒部分进入裂解期。(本文来源于《右江民族医学院》期刊2017-06-16）
马新廷[4]（2012）在《HSV-1通过活化PI3K/AKT和ERK MAPK信号通路诱导KSHV裂解性复制》一文中研究指出背景：卡波济肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）感染与获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）相关的多种恶性肿瘤发病密切相关，这些肿瘤包括卡波济肉瘤（Kaposi’s sarcoma，KS），原发性渗出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）和多中心卡斯特莱曼病（multicentric Castleman’s disease，MCD）。KSHV裂解性复制的调控对于KS的发生和发展至关重要。课题组先前的研究发现，在PEL细胞中，单纯疱疹病毒1型（herpes simplex virus1，HSV-1）能够上调IL-10、IL-4的表达激活KSHV裂解性复制，但是详细的机制目前尚不清楚。目的：本研究旨在深入探讨HSV-1激活KSHV裂解性复制的分子机制，对可能涉及到的信号通路进行一系列研究。方法：运用Western blot检测JAK1/STAT3、JAK1/STAT6、PI3K/AKT和ERKMAPK信号通路中关键激酶的磷酸化水平在HSV-1感染BCBL-1细胞前后的变化。将STAT3和STAT6显性负向调控质粒分别转染BCBL-1细胞后进一步使用HSV-1感染，运用RT-qPCR检测抑制JAK1/STAT3及JAK1/STAT6通路对HSV-1诱导的KSHV裂解期基因mRNA表达的影响。采用PI3K特异性化学抑制剂LY294002预处理BCBL-1细胞或显性负向调控质粒PI3K-DN转染BCBL-1细胞，Western blot和RT-qPCR分别检测KSHV裂解期基因蛋白和mRNA的表达水平，初步探讨PI3K/AKT信号通路对HSV-1诱导的KSHV复制的影响。再使用AKT的显性负向调控质粒AKT-DN、PTEN和GSK-3β过表达质粒转染BCBL-1细胞，通过Western blot、免疫荧光测定（immumofluorescence assay，IFA）及病毒释放试验分别检测KSHV裂解期基因蛋白、mRNA的表达水平和培养上清中KSHV的病毒载量，进一步探究PI3K/AKT信号通路在HSV-1诱导KSHV复制中的作用。最后，使用ERK的抑制剂Peptide II和MEK1/2的显性负向调控质粒处理BCBL-1细胞后，通过Western blot、IFA和病毒释放试验分别检测KSHV裂解期蛋白、mRNA的表达水平以及培养上清中KSHV的病毒载量，研究ERK MAPK通路在HSV-1诱导KSHV复制中的作用。结果：通过使用一系列显性负向突变体、过表达质粒及化学抑制剂发现，JAK1/STAT3和JAK1/STAT6信号均不参与HSV-1诱导的KSHV复制。HSV-1感染BCBL-1细胞后可以活化PI3K/AKT、抑制PTEN和GSK-3β。抑制PI3K/AKT信号通路、过表达PTEN或GSK-3β均可以抑制HSV-1诱导的KSHV复制。另外，HSV-1感染BCBL-1细胞后还可以激活MAPK通路，抑制ERK MAPK通路能够有效抑制HSV-1诱导的KSHV复制。结论：当HSV-1和KSHV发生共感染时，HSV-1通过激活PI3K/AKT和ERKMAPK信号通路介导KSHV发生裂解性复制。(本文来源于《南京医科大学》期刊2012-05-01）
李嵬,罗湘建,胡哲煜,曹亚[5]（2011）在《EBV裂解复制周期调控机制研究新进展》一文中研究指出EBV与许多恶性疾病包括霍奇金病、伯基特淋巴瘤、鼻咽癌等恶性肿瘤发病有关人类B淋巴细胞是EBV天然宿主,其在宿主细胞中的生活周期分为潜伏感染和裂解感染。EBV潜伏感染时,为逃避宿主细胞的免疫杀伤,仅表达少量基因产物。而在外界条件如化学、物理或宿主细胞分化的刺激下,EBV可由潜伏感染进入到裂解复制(Lytic Replication)感染周期,促进病毒在宿主细胞中播散。根据EBV裂解复制产物出现的时间顺序可将裂解复制周期分为裂解复制立即早期、早期和晚期。1 EBV裂解复制不同时期产物的调控作用(本文来源于《病毒学报》期刊2011年06期）
刘素芳,杨力芳,邓锡云,曹亚[6]（2010）在《EGCG抑制EB病毒裂解复制及其分子机制的实验研究》一文中研究指出目的:研究以绿茶中自然提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG),阻断鼻咽癌细胞中ERK1/2及PI3-K/Akt信号通路,抑制EBV裂解复制。方法与结果:在鼻咽癌细胞CNE1-LMP1中,特异性的小分子抑制剂PD98059及LY294002处理后,以Western blotting检测表明上述信号转导通路参与EB病毒裂解复制;采用EGCG处理细胞24-48 h后,以磷酸化抗体及激酶检测表明EGCG抑制该细胞中上述信号通路的活性;以real-time PCR、报道基因及Western blotting进行检测,表明EGCG(0-20μmoL/L)呈剂量依赖性地抑制EBV DNA复制、EBV裂解复制基因BZLF1及BMRF1转录活性及蛋白表达水平。结论:EGCG通过抑制参与EBV裂解复制调控的ERK1/2及PI3K/Akt信号通路,从抑制鼻咽癌细胞中EBV裂解复制;为预防和治疗EBV裂解复制相关恶性疾病提供实验依据。(本文来源于《中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要》期刊2010-11-04）
刘素芳,杨力芳,邓锡云,曹亚[7]（2010）在《EGCG抑制EB病毒裂解复制及其分子机制的实验研究》一文中研究指出目的:研究以绿茶中自然提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG),阻断鼻咽癌细胞中ERK1/2及PI3-K/Akt信号通路,抑制EBV裂解复制。方法与结果:在鼻咽癌细胞CNE1-LMP1中,特异性的小分子抑制剂PD98059及LY294002处理后,以W(本文来源于《中国病理生理杂志》期刊2010年10期）
贾雪梅[8]（2010）在《艾滋病毒Vpr蛋白抑制KSHV裂解性周期复制：GSK-3β信号通路的作用》一文中研究指出目的:研究人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)病毒蛋白R(viral protein R,Vpr)对卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)裂解性周期复制的影响,并对此过程所涉及到的信号通路进行鉴定。方法:1、包装和鉴定含Vpr基因的重组慢病毒,并进行滴度测定。以重组慢病毒Vpr感染原发性渗出性淋巴瘤细胞系【primary effusion lymphoma,PEL,又称体腔淋巴瘤(body cavity-based lymphoma,BCBL)】来源的BCBL-1细胞,反转录RCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和免疫印迹(Western blot)分别检测Vpr基因的mRNA转录和蛋白表达。2、用病毒感染方法将Vpr基因导入PEL细胞系,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,real-time PCR)、RT-PCR和Western blot检测KSHV裂解期基因的mRNA转录和蛋白表达;进一步检测感染后细胞上清中KSHV病毒含量,并以RT-PCR和Western blot检测经上清感染的Vero细胞中KSHV裂解期和潜伏期基因mRNA转录和蛋白表达;将重组慢病毒Vpr感染PEL细胞系,然后转染含KSHV ORF50/ORF73基因启动子的虫荧光素酶(Luciferase)报告质粒,检测Luciferase活性。3、以重组慢病毒Vpr感染BCBL-1细胞,提取细胞总RNA进行人信号通路发现者PCR芯片操作,采用Western blot对基因芯片结果进行验证,加入信号通路上关键蛋白激酶抑制剂、过表达突变质粒后再检测KSHV裂解期蛋白的表达。结果:1、携带Vpr基因的慢病毒获得成功包装,病毒滴度为4×107Tu/ml。重组慢病毒Vpr感染BCBL-1细胞后可检测到Vpr基因的转录和表达。2、Vpr蛋白不但可以显着抑制BCBL-1细胞中KSHV裂解期基因ORF50(编码KSHV“分子开关”蛋白)、ORF26(编码KSHV次要衣壳蛋白)mRNA的转录,而且还能够显着降低KSHV裂解期蛋白病毒白细胞介素6(viral Interleukin-6,vIL-6)和KSHV复制与转录激活子(replication and transcription activator,Rta,即“分子开关”蛋白)的表达。BCBL-1细胞中过表达Vpr蛋白一方面能够显着下调KSHV的病毒拷贝数,同时明显地降低了Vero细胞中KSHV ORF73/LANA【潜伏相关核抗原,(latency-associated nuclear antigen)】、ORF26 mRNA的转录及vIL-6蛋白的表达。Vpr蛋白能够直接抑制ORF50和ORF73基因启动子的活化。3、Vpr蛋白降低了GSK-3β【糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)】信号通路中GSK-3β的磷酸化水平,应用GSK-3β抑制剂LiCl及过表达其突变质粒GSK-3β-S9A后,Vpr蛋白对KSHV vIL-6的抑制作用分别被进一步增强和部分阻断。Vpr蛋白下调了PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)信号通路中PTEN的磷酸化水平,应用其过表达质粒pTEN后,Vpr蛋白对KSHV vIL-6的抑制作用被进一步增强。Vpr蛋白还降低了Ras/c-Raf/MEK/ERK信号通路中c-Raf、MEK1/2及ERK1/2的磷酸化水平。结论:1、含Vpr基因重组慢病毒可以有效地感染BCBL-1细胞,并在其中大量表达目的蛋白。2、Vpr蛋白能够显着抑制KSHV裂解性周期复制及子代病毒颗粒的释放,作用机制可能是通过抑制ORF50和ORF73基因启动子的活化。3、Vpr蛋白通过抑制GSK-3β及PTEN信号通路的活化下调KSHV复制,Ras/c-Raf/MEK/ERK信号通路可能参与调控Vpr蛋白抑制KSHV复制过程。推测在AIDS相关的KS(AIDS-KS)患者体内,Vpr蛋白有可能通过抑制KSHV裂解性周期复制来避免KSHV感染细胞后过早地被免疫清除,从而有利于潜伏感染的形成和肿瘤的发生。(本文来源于《南京医科大学》期刊2010-06-30）
王平[9]（2010）在《艾滋病毒Vif蛋白抑制卡波济肉瘤相关疱疹病毒裂解性周期复制的初探》一文中研究指出背景:人类免疫缺陷病毒I型(又称艾滋病毒;human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)感染显着提高卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)感染者罹患卡波济肉瘤(Kaposi’s sarcoma,KS)的风险。KSHV与其它因素协同作用共同参与了KS的发生与发展。本课题组和其他小组的研究证实,HIV-1病毒颗粒、病毒编码的可溶性调节蛋白Tat及病毒感染诱生的细胞因子都能够调控KSHV裂解性周期复制。目的:本研究拟解决的问题是由重组慢病毒或腺病毒载体所介导的HIV-1病毒感染因子(viral infectivity factor,Vif)在原发性渗出性淋巴瘤【primary effusion lymphoma,PEL,又称体腔渗出性淋巴瘤(body cavity-based lymphoma,BCBL)】细胞系中的过表达对KSHV裂解性周期复制的影响,为阐明AIDS-KS的发病机制奠定基础。方法:首先分别构建含HIV-1 Vif基因的重组慢病毒和腺病毒,并利用梯度稀释法测定病毒滴度。然后以一系列不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)的重组病毒感染靶细胞BCBL-1,根据细胞中绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和Vif蛋白的表达水平验证重组病毒对BCBL-1细胞的感染能力。以一定MOI的重组病毒感染BCBL-1细胞,于感染后不同时间点提取细胞RNA和蛋白,分别利用RT-PCR和Western blot检测KSHV裂解期和潜伏期代表基因的mRNA转录和蛋白表达,初步探讨Vif对KSHV复制的影响。进一步以病毒颗粒释放实验评价Vif蛋白的过表达是否影响KSHV完整子代病毒颗粒的释放,检测指标包括经慢病毒感染后的BCBL-1培养上清中KSHV病毒载量、子代KSHV感染Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)的能力以及Vero细胞中KSHV mRNA转录和蛋白表达水平等方面的差异。为了实现对Vif影响KSHV复制机制的初步探讨,本文利用虫荧光素酶报告实验(luciferase reporter assay)检测了Vif蛋白对KSHV ORF50和ORF73启动子活性的调控作用,并对Vif影响KSHV复制过程中所涉及到的信号通路进行初步鉴定。结果:成功包装出含有HIV-1 Vif基因的重组慢病毒和腺病毒,滴度分别为4×107 TU/ml及2.5×108 TU/ml。以MOI为1.0的重组慢病毒或腺病毒感染靶细胞BCBL-1后,都能够检测到GFP和Vif蛋白表达。RT-PCR结果显示,Vif过表达能够抑制KSHV裂解期基因T1.1(即PAN,polyadenylated nuclear RNA)、ORF26(次要衣壳蛋白编码基因)的mRNA转录。Western blot同样证明Vif蛋白能够显着下调BCBL-1细胞中复制与转录激活子(replication and transcription activator,Rta)以及晚期基因病毒白细胞介素6(viral interleukin-6,vIL-6)的表达水平。病毒颗粒释放实验结果证实,Vif蛋白抑制了KSHV完整子代病毒颗粒的释放。机制方面的探索表明,Vif能够抑制ORF50和ORF73基因的启动子活性,并且下调ERK和GSK-3β的磷酸化水平。结论:Vif蛋白能够抑制KSHV的裂解性周期复制和完整子代病毒颗粒释放。Vif可能通过调控ORF50和ORF73的启动子活性影响KSHV复制。在Vif抑制KSHV裂解性周期复制的过程中,ERK MAPK和PI3K/Akt/GSK-3β信号通路可能起到了一定作用。提示,Vif可能通过调控KSHV启动子活性以及细胞内信号通路等方式抑制了KSHV裂解性周期复制,避免受感染细胞较大程度地激活免疫系统而被清除,从而有助于KSHV的潜伏感染和致瘤发生。(本文来源于《南京医科大学》期刊2010-06-30）
黄敏,李久明,王平,卢春[10]（2010）在《人类免疫缺陷病毒-1 Rev蛋白调控卡波济肉瘤相关疱疹病毒的裂解性周期复制与潜伏感染》一文中研究指出目的:研究人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)Rev蛋白的表达水平对原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞BCBL-1中卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)裂解性周期复制与潜伏的影响。方法:自表达质粒pCI-neo-Rev中扩增出Rev基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen中构建成慢病毒载体pLenti-Rev,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞。荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(IZsGreen)表达;收集培养上清经0.45μm滤器过滤后即获得病毒悬液。梯度稀释法测定病毒滴度并感染细胞,RT-PCR和Western blot检测Rev在293T细胞中的表达。用慢病毒感染BCBL-1细胞,同时将表达质粒pCI-neo-Rev转染该细胞,采用Western blot分别检测Rev以及KSHV Rta和vIL-6蛋白的表达;Real-timePCR进一步从mRNA水平上定量验证Rev对KSHV复制的影响。结果:限制性内切酶酶切反应和基因测序证实成功构建了携带Rev基因的慢病毒表达载体,病毒滴度为2×107TU/ml。重组慢病毒感染BCBL-1细胞72h后,能够检测到Rev蛋白的表达。Western blot结果显示,低水平表达的Rev能够上调KSHV裂解期蛋白Rta、vIL-6的表达,而高水平表达的Rev则能够抑制Rta和vIL-6的表达。Real-time PCR进一步验证了该结果,表明高水平表达的Rev能够显着抑制BCBL-1中Rta的mRNA转录,96h尤为明显。结论:成功构建了含Rev基因的慢病毒表达载体,获得的病毒能够有效感染BCBL-1细胞,并在其中大量表达Rev蛋白。Rev蛋白的表达水平对KSHV的复制与潜伏可能起到复杂的调控作用。(本文来源于《南京医科大学学报(自然科学版)》期刊2010年06期）
裂解复制论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
背景:卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)是卡波氏肉瘤(KS)等疾病的病因,在感染宿主细胞内有潜伏(latent)和裂解(lytic)两个生命周期。潜伏相关核抗原(LANA)是建立和维持潜伏的关键因子和复制转录激活因子(RTA)是潜伏到裂解的开关。抑制RTA表达是LANA维持潜伏感染的重要机制。宿主细胞表达的重组信号结合蛋白免疫球蛋白J区(RBPJ)与LANA结合在抑制RTA的表达中发挥了重要作用。但RBPJ表达水平是否受KSHV调控以及RBPJ表达水平与KSHV裂解复制的关系尚不清楚。目的:明确LANA对let-7a/RBPJ信号通路的影响;阐明LANA调控let-7a表达的机制以及let-7a与RBPJ的直接靶向关系;研究let-7a及RBPJ对KSHV裂解复制的影响。方法:首先采用过表达和RNA干扰技术检测LANA对let-7a/RBPJ信号通路分子表达水平的影响:脂质体法转染LANA到293T细胞,以转染相应空载体为对照,northern-blot和实时荧光定量PCR(quantative real-time PCR,qPCR)检测let-7a的表达水平,pri-let-7afd、LIN28B、NF-κB和RBPJ的转录水平,western-blot检测LIN28B、NF-κB和RBPJ的蛋白水平;脂质体法转染si-LANA到iSLK.219细胞,以转染非特异siRNA为对照,检测上述指标。然后,采用过表达和RNA干扰技术改变LIN28B和NICD表达水平,检测let-7a、pri-let-7afd、RBPJ的表达水平,分析LANA调控let-7a的分子机制。进一步的,采用荧光素酶报告实验检测let-7a与RBPJ 3’UTR的靶向关系,并检测转染let-7a表达载体(过表达)或let-7 sponge(下调let-7a)对RBPJ mRNA和蛋白水平的影响,证实let-7a直接抑制RBPJ的表达。最后,分别在过表达let-7a和下调RBPJ的iSLK.219细胞中,倒置显微镜观察RFP表达以判断病毒激活状态;qPCR检测细胞内KSHV基因组的拷贝数以判断病毒复制水平;qPCR检测培养液中KSHV基因组的拷贝数以及培养液感染293T细胞的能力分析病毒子产量及感染力。结果:1.过表达LANA上调let-7a及其初始转录体pri-let-7afd,同时下调RBPJ;下调LANA则反之。2.LANA下调NF-κB、LIN28B;干扰LIN28上调let-7a,而同时干扰LANA和LIN28B则下调let-7a表达。3.LANA可上调NICD,NICD上调let-7a及其初始转录体pri-let-7afd。4.Let-7a以剂量依赖的方式抑制RBPJ 3’UTR荧光素酶报告基因活性,但对结合位点突变的RBPJ 3’UTR荧光素酶告基因活性没有影响;let-7a抑制RBPJ的表达。5.过表达let-7a以剂量和时间依赖的方式抑制KSHV的裂解激活,下调病毒复制水平和有感染力病毒子的产量。6.下调RBPJ以剂量和时间依赖的方式抑制KSHV的裂解激活,下调病毒复制水平和有感染力病毒子的产量。结论:1.LANA通过上调let-7a抑制RBPJ表达。2.LANA通过NF-κB/LIN28B调控let-7a的水平,通过NICD控制pri-let-7afd的转录。3.调控let-7a/RBPJ信号在LANA抑制KSHV裂解复制中发挥了重要作用。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
裂解复制论文参考文献
[1].陈玉礼.参与HIV-1Tat激活KSHV裂解复制周期的宿主细胞甲基化基因筛选[D].右江民族医学院.2018
[2].齐燕.LANA通过let-7a/RBPJ信号通路抑制KSHV的裂解复制[D].杭州师范大学.2018
[3].张锡平.芒果苷对BCBL-1细胞增殖、凋亡、分泌IL-4及KSHV裂解复制的影响[D].右江民族医学院.2017
[4].马新廷.HSV-1通过活化PI3K/AKT和ERKMAPK信号通路诱导KSHV裂解性复制[D].南京医科大学.2012
[5].李嵬,罗湘建,胡哲煜,曹亚.EBV裂解复制周期调控机制研究新进展[J].病毒学报.2011
[6].刘素芳,杨力芳,邓锡云,曹亚.EGCG抑制EB病毒裂解复制及其分子机制的实验研究[C].中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要.2010
[7].刘素芳,杨力芳,邓锡云,曹亚.EGCG抑制EB病毒裂解复制及其分子机制的实验研究[J].中国病理生理杂志.2010
[8].贾雪梅.艾滋病毒Vpr蛋白抑制KSHV裂解性周期复制：GSK-3β信号通路的作用[D].南京医科大学.2010
[9].王平.艾滋病毒Vif蛋白抑制卡波济肉瘤相关疱疹病毒裂解性周期复制的初探[D].南京医科大学.2010
[10].黄敏,李久明,王平,卢春.人类免疫缺陷病毒-1Rev蛋白调控卡波济肉瘤相关疱疹病毒的裂解性周期复制与潜伏感染[J].南京医科大学学报(自然科学版).2010
标签：I型人类免疫缺陷病毒; Tat蛋白; 慢病毒表达载体; 卡波济肉瘤相关疱疹病毒;