导读:本文包含了催化表达论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:外泌体,膜蛋白,磁珠法,催化发夹组装
催化表达论文文献综述
陈贤华[1]（2019）在《基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体蛋白共表达检测平台的构建及应用》一文中研究指出目的构建基于磁性分离和催化发夹组装信号放大策略的外泌体双膜蛋白共表达检测平台。研究方法1.外泌体纯化及表征:以MDA-MB-231细胞为实验对象。细胞上清液经超速离心机分离得到外泌体。透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)拍摄鉴定分析外泌体形态和大小;纳米粒子跟踪分析仪Nanoparticles Tracking Analysis,NTA)检测外泌体粒径和浓度;免疫印迹(Western Blot,WB)检测外泌体蛋白表达情况;外泌体实时荧光定量核酸扩增试验。2.催化发夹组装(Catalytic Hairpin Assembly,CHA)筛选:叁组 CHA(CHA1、CHA2、CHA3)根据电泳结果和荧光检测选择最佳。3.基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体蛋白共表达检测平台可行性:以MDA-MB-231细胞为实验对象,①超分辨成像技术与免疫印迹实验验证CD63在其外泌体膜上的表达。②多维高清流式细胞分析仪验证外泌体磁珠法富集及效率。③不同浓度外泌体与 AptEpCAM-T 催发链(Aptamer,Apt;Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)反应电泳图验证AptEpCAM-T与外泌体结合。4.基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体蛋白共表达检测平台检测原理及可行性验证:①不同浓度AptEpCAM-T催发链荧光检测;②CHA检测平台电泳。5.CHA优化反应条件:对反应缓冲液、反应pH、反应温度和反应时间进行优化。6.检测平台特异性试验:在最优反应条件下,用本检测平台对不同细胞来源的外泌体(人正常乳腺上皮细胞、乳腺癌细胞、人支气管上皮细胞、人非小细胞肺癌)进行荧光检测,同时记录其荧光响应值信噪比。实验重复两次。实验结果1.外泌体纯化及表征:MDA-MB-231细胞外泌体的TEM图像为具有完整的膜性脂质双分子层结构,直径在100 nm左右;NTA平均粒径为155nm,浓度为4.01×1011/ml,WB结果:蛋白TSG101、蛋白CD63在其外泌体表达,而蛋白Cαlnexin不表达。外泌体实时荧光定量核酸扩增检测CT(Cycle threshold,CT)值小于30。2.CHA筛选:CHA2为最佳,电泳显示发夹结构H1、H2稳定,两者无明显自反应现象,在催发链T的作用下可发生无酶反应且条带明显,荧光检测信噪比高。3.基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体蛋白共表达检测平台可行性:①超分辨成像技术与免疫印迹实验显示MDA-MB-231细胞来源外泌体富含CD63膜蛋白。②磁珠法捕获外泌体效率为90%;③不同浓度外泌体与APtEpCCAM-T催发链反应电泳结果显示AptEpCAM-T能够识别并结合外泌体。4.基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体蛋白共表达检测平台检测原理及可行性验证:①随着AptEpCAM-T浓度增加荧光响应值明显增加。②电泳显示CHA组分稳定,H1-H2无明显自反应现象,在催发链T的作用下可发生无酶反应且条带明显。5.CHA条件优化试验:选择pH 7.4缓冲液Tris-HC1为反应液,37℃下,CHA达到荧光响应最大值需60 min。6.检测平台特异性试验:人正常乳腺上皮细胞荧光检测响应值信噪比:1.10±0.01,乳腺癌细胞外泌体荧光检测响应值信噪比:2.09±0.08。人支气管上皮细胞外泌体荧光检测响应值信噪比:1.17±0.10,人非小细胞肺癌外泌体荧光检测响应值信噪比:1.19±0.01。结论构建了基于磁性分离和催化发夹组装信号放大策略的外泌体双膜蛋白共表达检测平台。检测平台可同时检测外泌体膜上表达的两种蛋白:CD63和EpCAM。乳腺癌细胞外泌体与人正常乳腺上皮细胞外泌体的蛋白CD6和蛋白EpCAM表达有区分度。该检测平台为具有诊断价值的外泌体膜蛋白的双重检测提供通用平台,也为多靶标膜蛋白检测提供可能性。(本文来源于《南方医科大学》期刊2019-12-03）
李元,刘珊,游淳[2]（2019）在《利用共表达耐高温酶的全细胞催化合成鲨肌醇》一文中研究指出鲨肌醇(scyllo-inositol,SI)是肌肉肌醇(myo-inositol)的一种异构体,是治疗阿尔兹海默症潜在的活性物质。本研究构建了共表达耐高温来源的肌肉肌醇脱氢酶(IDH)和鲨肌醇脱氢酶(SIDH)的大肠杆菌全细胞,并将其进行细胞膜通透性处理后催化肌肉肌醇合成鲨肌醇。实验结果表明,使用经过通透性处理的(本文来源于《第十二届中国酶工程学术研讨会论文摘要集》期刊2019-08-08）
匡素芳,彭仁[3]（2019）在《赤红球菌定量蛋白质组学及其二鸟苷酸环化酶的融合表达和催化特性研究》一文中研究指出二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase,DGC),可催化2分子GTP合成c-di-GMP,从而维持多种生物功能的稳态,但该蛋白在微生物有机溶剂应激中的作用和机理尚未阐述。本文通过iTRAQ标记技术和液相色谱-串联质谱方法分析了赤红球菌SD3菌株在甲苯和苯酚胁迫下响应情况,挖掘了赤红球菌SD3菌株的有机溶剂耐受性相关的应激蛋白、膜蛋白、调控系统和代谢途径。经qPCR分析发现在甲苯和苯酚胁迫下R.ruber SD3中dgc基因转录水平分别提高了1.57倍和8.71倍。此外,通过融合GST标签帮助DGC蛋白的折迭,首次异源表达得到红球菌中含有6段跨膜区的完整二鸟苷酸环化酶。GST-DGC融合蛋白的最适反应pH值和最适反应温度分别为8.0和47℃,并且表现出高热稳定性和良好的pH稳定性,在87℃孵育1h后,依然保留了94%的活性。该酶催化反应动力学分析表明,其Km、Vmax和Kcat值分别为9.8μM、0.7μM/min和1.3S~(-1)。与已报道的海栖热袍菌嗜热二鸟苷酸环化酶的Kcat值2.6 min~(-1)相比,本研究纯化得到GST-DGC融合蛋白催化合成c-di-GMP效率提高了约30倍。一些金属离子如Zn~(2+)、Mn~(2+)、Fe~(2+)、Ni~(2+)和Co~(2+)对GST-DGC蛋白质有抑制作用,而金属离子Mg~(2+)、K~+和Na~+和螯合剂EDTA则对GST-DGC蛋白质有激活作用。更重要的是,该融合蛋白在甲苯、环己烷和正己烷存在下也显示出相当高的稳定性。本研究为大规模催化合成c-di-GMP提供了可能,为揭示二鸟苷酸环化酶与微生物有机耐受性的关联机制奠定基础。(本文来源于《华东六省一市生物化学与分子生物学会联盟2019年学术与教学交流会摘要集》期刊2019-07-12）
邱锦,黄火清,姚斌,罗会颖[4]（2019）在《解淀粉芽孢杆菌淀粉酶催化活力改良及其在枯草芽孢杆菌中的高效表达》一文中研究指出α-淀粉酶(α-amylase)是一类作用于淀粉内部水解其α-1,4糖苷键从而将淀粉水解为糊精、低聚糖和单糖的酶。该类酶已被广泛应用于面包生产及洗涤等工艺中。从分子水平上改造淀粉酶,以提高水解活力及催化效率,已经成为多年的目标,也具有重要的研究意义。以目前广泛应用的来源于解淀粉芽孢杆菌的中温中性淀粉酶BAMYA出发,通过理性设计在该淀粉酶的C端结构域设计突变位点,利用定点突变提高其水解活力,并在枯草芽孢杆菌中实现高效表达。野生型酶BAMYA的最适作用温度和pH分别为55℃和6.0,比活为6 835 U/mg。突变体BAMYA-L473K/K474H/N475K最适作用温度为60℃,较野生型提高了5℃,作用的最适p H没有发生变化。突变体比活为10 148 U/mg,比野生型提高48%。野生型BAMYA和突变体BAMYA-L473K/K474H/N475K的Km值、催化效率分别为3.58 mg/mL和2.21 mg/mL,以及1 577 mL/(s·mg)和4 760 mL/(s·mg)。催化效率较野生型相比提高了2倍以上。该突变体应用于工业生产可有效提高其水解效率,降低应用成本。(本文来源于《生物技术通报》期刊2019年09期）
王馨叶[5]（2019）在《普鲁兰酶催化效率强化的分子改造及其分泌表达调控》一文中研究指出普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)是一类催化支链淀粉、普鲁兰多糖及相关聚合物的a-1,6糖苷键水解的淀粉脱支酶。由于普鲁兰酶水解支链淀粉分支点的特性,在糖化过程中添加普鲁兰酶,将减少所需的糖化酶用量以及糖化反应时间,从而显着提高淀粉生物质的水解效率。因此,普鲁兰酶在食品、制药、能源和高聚物材料等领域有重要的商业价值。而且,作为研究糖类物质结构的工具,普鲁兰酶也受到了极大的关注。然而,多数普鲁兰酶的催化效率和稳定性较低,因此面临着生产成本提高,无法大规模应用于工业化生产的问题。长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)来源的普鲁兰酶具有耐酸耐热的酶学特性,在pH 4.5,60°C条件下酶活水平最高。本论文基于序列结构信息对B.naganoensis普鲁兰酶进行蛋白质工程改造。通过截断氨基酸序列的无序区域、进化偶联位点饱和突变、叁密码子饱和突变等策略,提高了B.naganoensis普鲁兰酶的酶活、比活、催化效率以及应用效果。此外,分别通过在酶分子N-末端融合带负电的多肽和过量表达羧肽酶的方式提高了其在E.coli中的胞外分泌效率。主要研究结果如下:(1)基于B.naganoensis普鲁兰酶氨基酸序列无序性分析的截短改造。通过酶的二级结构预测以及无序性分析,依次删除普鲁兰酶N-末端或C-末端的无序区域,构建了8个截短突变体。突变体DN5和DN106的比活力分别为410 U·mg~(-1)和490 U·mg~(-1),分别是野生型的1.1倍和1.3倍。对动力学参数以及酶学性质的进一步研究表明,DN5和DN106的催化效率都有提高,其k_(cat)/K_M值分别为野生型的2.2倍和1.4倍。DN5的最适反应温度和最适反应pH分别为60°C,pH 4.5,与野生型一致。DN106的最适反应温度和最适反应pH分别为55°C,pH 5.0。DN5和DN106的半衰期均比WT延长了1 h。(2)B.naganoensis普鲁兰酶氨基酸序列进化偶联分析及共变残基对饱和突变。依据蛋白质氨基酸序列在自然进化过程中存在进化偶联关系以维持其结构-功能的理论基础,建立进化偶联饱和突变的策略对B.naganoensis普鲁兰酶进行改造。利用进化偶联分析工具EVcouplings分析普鲁兰酶的氨基酸全序列的进化偶联位点。对进化偶联强度高的残基对进行分区,根据进化偶联强度以及空间分布位置选择残基对进行饱和突变,构建相应的突变文库。筛选得到催化效率提高的突变体A232G/I226A,其比活力提高到了550 U·mg~(-1),为野生型的1.5倍,k_(cat)/K_M值为野生型的2.2倍。A232G/I226A的最适反应温度和最适反应pH分别为60°C,pH 5.0。突变体的半衰期均短于野生型。(3)B.naganoensis普鲁兰酶催化结构域、底物结合结构域CBM48的氨基酸序列进化偶联分析及饱和突变。使用EVcouplings分别分析催化结构域、CBM48和催化结构域、催化结构域和C-末端区域的氨基酸序列内的进化偶联位点。并且,使用EVcomplex分析催化结构域与CBM48氨基酸序列之间的进化偶联位点。比较分析进化偶联强度较高的残基对在蛋白空间结构的分布情况,选择目标残基对进行饱和突变,构建相应的突变文库。通过筛选得到双位点突变体V328L/I565L的比活力提高到了870 U·mg~(-1)是野生型的2.3倍,突变体K631V/Q597S的k_(cat)/K_M值为野生型的5.6倍。选择比活力最高的五个突变体两两组合,得到的四位点突变体K631V/Q597K/D541I/D473E的比活力提高到1,000 U·mg~(-1),是野生型的2.7倍;其k_(cat)/K_M值也是所有突变体中最高的,为野生型的6.3倍。突变体的最适反应pH与野生型一致,而其中D541I/D473E,D541I/D473Q,K631V/Q597K/D541I/D473E,K631V/Q597S/D541I/D473E的最适反应温度降为55°C。在位点D541/D473的突变会引起普鲁兰酶半衰期的缩短,其他突变体的半衰期与野生型基本一致。(4)B.naganoensis普鲁兰酶催化口袋活性位点组合饱和突变。与已有3D晶体结构的普鲁兰酶进行结构以及序列比对,选择B.naganoensis普鲁兰酶催化口袋内的9个潜在功能位点进行突变。结合同源序列比对信息,选择相应位点保守性高的色氨酸,酪氨酸和天冬酰胺作为建构单元进行叁密码子饱和突变。根据实验结果推测出与催化相关的未知功能位点D787和M621,进一步对其进行饱和突变,构建突变文库。最终筛选得到催化效率提高的突变体D787C,其比活力提高到了550 U·mg~(-1),是野生型的1.5倍,k_(cat)/K_M值为野生型的1.8倍。突变体D787C的最适反应温度、pH和半衰期与野生型一致。(5)提高B.naganoensis普鲁兰酶在Escherichia coli中的分泌调控及突变体的应用。通过在B.naganoensis普鲁兰酶的N-末端融合带负电荷的多肽,如天冬氨酸标签,纤维素酶催化结构域N-末端前20位氨基酸,超折迭绿色荧光蛋白,提高了普鲁兰酶在E.coli中的胞外分泌水平。此外,通过过量表达羧肽酶修饰E.coli细胞壁结构,从而提高普鲁兰酶在E.coli中的分泌效率。将前期构建的突变体DN5、DN106、K631V/Q597S/V328L/I565L、K631V/Q597K/D541I/D473E、D787C进行组合,得到比活水平最高的组合突变体DN106-K631V/Q597K/D541I/D473E/D787C。其比活力为1,100U·mg~(-1),是野生型的2.9倍,最适反应条件为pH 5.0,55°C,且半衰期与野生型一致。将突变体DN106-K631V/Q597K/D541I/D473E/D787C、野生型普鲁兰酶、商品普鲁兰酶分别与糖化酶进行复配。在反应时间达到72 h时,添加突变体的反应体系的DE值接近于添加商品普鲁兰酶的效果,与野生型相比DE值从99%提高到了99.4%。并且,在糖化反应的中后期,突变体参与的反应的IM值最低,即葡萄糖逆向聚合生成异麦芽糖的水平最低。(本文来源于《江南大学》期刊2019-06-01）
高云鹏[6]（2019）在《梅花鹿MMP-2催化域的克隆、表达及纯化》一文中研究指出目的:实现梅花鹿基质金属蛋白酶-2催化域(Catalytic domain of matrix metalloprotease2,cdMMP-2)的体外表达,为进一步研究基质金属蛋白酶-2催化域结构功能及产品开发应用奠定基础。方法:采用RT-PCR方法从鹿茸cDNA中扩增MMP-2的催化域基因,运用Nde I和Not I克隆位点连入原核表达载体pET30a中,构建原核表达质粒并转化到大肠杆菌BL21中,利用IPTG引导目的蛋白表达,通过使用金属螯合层析技术和柱上复性方法来纯化和复性目的蛋白,利用酶解底物法检测酶的活性。结果:1.重组表达的cdMMP-2 C端带有6×His标签,共有377个氨基酸,预测大小为42.04kD,理论等电点为4.95;2.cdMMP-2转化到感受态细胞BL21中并成功表达cdMMP-2蛋白,优化出最佳IPTG浓度为0.6 mM,最佳诱导时间为5 h;3.经过SDS-聚丙烯酰胺电泳检测和免疫印迹分析,发现目的蛋白主要表达在包涵体中。使用金属螯合层析技术纯化目的蛋白,柱上复性后由SDS-PAGE电泳检测,结果显示目的蛋白单一条带;5.测得蛋白浓度为2.0 mg/mL;6.通过酶解底物实验,证明目的蛋白具有显着的胶原水解活性。结论:本研究通过构建原核表达体系获得了高纯度,高效率,高活力的cdMMP-2。(本文来源于《长春中医药大学》期刊2019-06-01）
赵剑伟[7]（2019）在《转氨酶MVTA的克隆表达及其应用于级联催化合成手性β-氨基醇和邻二醇的研究》一文中研究指出手性β-氨基醇和邻二醇类化合物在手性医药、农药、精细化学品以及多功能新材料等方面具有重要的用途,同时作为手性助剂、拆分剂,手性配体广泛应用于不对称催化反应。生物催化剂因具有催化效率高、立体和区域选择性好、不需要保护基团步骤、反应条件温和以及对环境友好等优点,因此采用生物催化法制备手性β-氨基醇和邻二醇类化合物成为当今绿色化学研究的热点。级联催化的发展是建立环境友好和可持续化学过程的重要策略,与逐步合成相比,一锅多步组合催化反应减少了纯化步骤,有助于促进工艺合成路线和经济成本的改善。此外,级联催化可以提高立体化学控制来抑制副反应的发生,多个催化剂之间的协同效应大大提高反应催化活性和对映选择性,使平衡反应进行接近到完全转化。本课题通过一锅煮串联催化反应,合成得到了多种手性β-氨基醇和手性邻二醇。首先,利用TTC显色方法筛选出了一种具有高活性和选择性的R型特异性转氨酶MVTA,将MVTA重新构建到表达载体pET28a中,并在大肠杆菌中实现目的蛋白高效可溶表达。以L-苯甘氨醇为底物对纯化后的MVTA进行了酶学性质研究,实验结果表明MVTA最适反应pH为8.0,最适反应温度为55~oC;MVTA在pH 7.0和8.0缓冲液中表现出很好的稳定性,孵育24小时残余酶活仍可保持90%以上;MVTA在30~oC下都具有良好的稳定性,孵育24 h残余酶活可保留95%以上。MVTA在动力学拆分外消旋β-氨基醇过程中,表现出高效的催化活性和对映选择性,大多数底物转化率达到50-62%,ee值大于99%;通过MVTA不对称还原胺化α-羟基酮(10-300mM),得到转化率为80-99%和ee值大于99%值的(S)-β-氨基醇。利用重组MVTA静息细胞还原胺化300 mM 2-羟基苯乙酮制备的L-苯甘氨醇,分离得率71%,ee值大于99%。MVTA作为生物催化技术应用生产手性β-氨基醇具有很大的应用前景。其次,构建了转氨酶和羰基还原酶级联催化用于转化(R),(S)-β-氨基醇同时制备手性β-氨基醇和手性邻二醇的方法。通过两种转氨酶和两种羰基还原酶的模块化组合,可以灵活地制备四种类型的手性β-氨基醇和邻二醇立体异构体。利用全细胞转化10-60 mM外消旋β-氨基醇,底物转化率达50-52%,底物ee值大于99%,产物ee值为90-99%。混合全细胞进行50 mL规模制备得到的(R),(S)-苯甘氨醇和(R),(S)-苯乙二醇得率为40-42%,ee值大于99%。最后,首次构建了一种L-α-氨基酸不对称转化合成手性邻二醇的化学-生物组合催化体系。结合有机催化(NaBH_4-H_2SO_4体系)和共表达叁种酶(转氨酶,羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶)的重组大肠杆菌,成功的应用于六种常规的天然L-α-氨基酸一锅多步催化转化过程,获得具有高转化率(70-90%)和高ee值(91-99%)的手性邻二醇。本课题研究强调级联催化技术应用于合成重要的非天然手性化合物的巨大潜力。(本文来源于《太原理工大学》期刊2019-06-01）
莫红梅[8]（2019）在《基于split-GFP体内重组高通量筛选系统提高嗜热酯酶的可溶性表达及催化活力》一文中研究指出嗜热酯酶是最具有应用潜力的绿色生物催化剂之一,因其具有耐热性、pH稳定性和有机溶剂耐受性等特点广泛应用于各个行业。前期从超嗜热菌Aquiex aeolicus VF5(风产液菌)基因组中筛选得到一种嗜热酯酶基因Aaeo1,实现了其在大肠杆菌系统(Escherichia coli)中的异源表达,发现其存在包涵体及催化活力低的问题。为了得到高效的嗜热酯酶,利用定向进化对其进行分子改造,通过两步高通量筛选法得到可溶性表达和催化活力同时提高的突变株并进行酶学性质研究。具体包括:(1)建立了易错PCR(error-prone PCR,epPCR)突变反应体系。确定最优条件:Mg~(2+)7 mmol·L~(-1),Mn~(2+)0.2 mmol·L~(-1),平均突变率为0.31%,满足构建文库要求;(2)建立了灵敏、快速、高效的两步高通量筛选法。以split-GFP为报告基因结合定向进化手段构建突变文库,与以全长增强型GFP(EGFP)为报告基因相比,有效地降低了筛选过程中的荧光背景和假阳性程度,阳性突变率从88%提高至95%。根据荧光强度与酶活力/蛋白浓度之间良好的线性关系,通过流式细胞分选仪从库容量不小于10~4的突变文库中初筛得到可溶性表达提高的突变株,对初筛目的菌株进行酶活力复筛;(3)筛选获得了可溶性表达和酶活力同时提高的突变株。通过两步高通量筛选得到了2株优势突变菌株EP1和EP2,分别含有4个氨基酸突变位点:I8V/I51V/F127I/E170D、V17G/H22R/K92N/I158K。可溶性蛋白含量是野生型的2倍左右,纯化后的突变酶EP1和EP2的比活力分别是野生型的3.14、3.2倍左右。通过定点突变筛选得到突变株I51V、E170D和I51V/E170D的粗酶活分别是野生型的2.35、2.46、4.5倍。对两个位点分别构建小型饱和突变文库,筛选后进行组合得到突变株I51L/E170D的酶活力是野生型的4.8倍左右。纯化后突变酶I51V、E170D和I51L/E170D的比活力分别是野生型的6.86、10.01、14.86倍;(4)研究突变酶的一系列酶学性质。突变酶均在70 ~oC时测定最大酶活性,突变后仍保持嗜热性,且在高温条件下更稳定。突变酶的最适pH值均为8.0,且在微碱性环境下催化效果更佳。突变酶EP1和EP2的K_m值降低,说明突变酶对底物的亲和力增强,k_(cat)/K_m值分别是原始酶的2.42、2.35倍,因此催化活性增强。突变酶I51V、E170D和I51L/E170D的K_m值提高,k_(cat)/K_m值分别是野生型Aaeo1的5.65、4.79、10.7倍,催化效率提高的主要原因可能是由于底物结合口袋的变化导致突变酶的催化能力的提高;(5)通过同源建模分析了Aaeo1突变体酶活提高的机制。蛋白质分子空间结构模拟显示,推测E170D突变改变了Aaeo1的口袋。第170位点与活性位点Asp163的距离约为8.9?,第51位点与Ser62之间仅由一个β-sheet连接,可能会通过长距离或短距离影响酶活力的变化。(本文来源于《江南大学》期刊2019-06-01）
许斌,姜彦多,孟媛[9]（2019）在《痰中端粒酶催化基团mRNA表达与肺癌发生及进展的相关性》一文中研究指出目的探讨痰中端粒酶催化基团mRNA表达与肺癌发生及进展的相关性。方法将首诊确诊肺癌患者75例纳入研究,并对患者进行为期1年的随访;研究同时选取同期可比的普通肺炎患者100例纳入研究作为对照组。收集受试对象痰液,分析痰中端粒酶及其催化基团mRNA表达与肺癌发生及进展的相关性。采用SPSS17. 0统计软件包分析处理数据。结果肺癌患者的痰中端粒酶及其催化基团mRNA表达均高于健康对照组,差别均有统计学意义(P <0. 05),与病情控制良好或好转患者比较,病情恶化或进展的患者以及出现死亡的患者痰中端粒酶及其催化基团mRNA表达阳性率均更高,差别均有统计学意义(P <0. 05)。结论肺癌病理背景下可见痰中端粒酶及其催化基团mRNA表达增高。痰中的端粒酶及其催化基团mRNA阳性检出具有提示肺癌的肿瘤标志价值,痰中的端粒酶及其催化基团mRNA高阳性率还同时提示病情恶化及不良的预后。(本文来源于《实用癌症杂志》期刊2019年05期）
唐白露[10]（2019）在《深海沉积物细菌胞外蛋白酶Pseudoalterin的诱导表达与分泌、催化特性、生态功能及其分子机制》一文中研究指出深海环境蕴含着数量巨大、种类丰富的微生物资源。微生物是深海生态系统的最主要成员,深海微生物之间存在着复杂的相互作用。但目前对深海微生物之间的相互作用类型及机制还了解很少。深海有机质大多是高分子量的颗粒有机质(particulate organic matter,POM),因此,深海微生物通过分泌胞外酶对胞外大分子的有机物进行降解并利用,是一种生存和适应环境的方式。来自细菌细胞壁的肽聚糖和来自动物的胶原蛋白是深海颗粒POM的重要成分,它们在深海中被微生物通过分泌蛋白酶降解和利用,进入深海碳氮循环。但目前我们对参与深海肽聚糖和胶原蛋白等有机质降解的微生物及其酶类的种类及降解机制还了解有限。假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)是一类广泛分布于海洋环境中的异养细菌。Pseudoalteromonas sp.CF6-2是一株分离自南中国海深海沉积物的产蛋白酶细菌。前期研究表明,该菌分泌的适冷蛋白酶Pseudoalterin是一个M23家族金属蛋白酶,能够降解弹性蛋白和革兰氏阳性菌肽聚糖。在此基础上,本论文首先建立了菌株CF6-2的遗传操作体系和蛋白酶Pseudoalterin的适冷表达体系,然后对蛋白酶Pseudoalterin的诱导表达机制、成熟机制、分泌机制和催化机制进行了研究,揭示了菌株CF6-2利用Pseudoalterin捕食海洋革兰氏阳性细菌的生态学现象,建立了利用CF6-2发酵生产Pseudoalterin的小试和中试工艺。另外,本论文还研究了来自胶州湾沉积物的细菌Photobacterium sp.A5-7分泌的一个新的S8家族丝氨酸蛋白酶P57的酶学性质及其PA结构域的功能。论文取得了如下研究结果:1.在基因组层面上分析海洋细菌胞外蛋白酶多样性为了在基因组层面分析海洋中产蛋白酶细菌的胞外蛋白酶的种类多样性,我们对两株海洋产蛋白酶细菌一深海沉积物细菌P.sp.CF6-2和北极表层海水细菌Flavobacterium arcticum SM1 502T的全基因组进行了测序,在基因组层面上揭示了这两株菌的胞外蛋白酶及其它胞外酶种类多样性。菌株CF6-2的基因组编码50种具有信号肽的肽酶,包括28个丝氨酸肽酶和22个金属肽酶。这些酶分布于9个丝氨酸肽酶家族和15个金属肽酶家族。菌株SM1502T的基因组编码29个具有信号肽的肽酶,包括14个丝氨酸肽酶、11个金属肽酶和4个半胱氨酸肽酶。这些酶分布于7个丝氨酸肽酶家族、5个金属肽酶家族和4个半胱氨酸肽酶家族。这些结果表明,这两株菌都含有大量的胞外蛋白酶基因,可能在海洋沉积物有机氮降解和循环中发挥重要作用。2.深海细菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin表达的诱导机制海洋细菌胞外蛋白酶大多是受胞外物质诱导表达的,但诱导细菌胞外蛋白酶产生的确切信号分子至今尚未被鉴定出。本文对诱导细菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin表达的信号分子进行了鉴定。由于蛋白酶Pseudoalterin能够高效地降解革兰氏阳性细菌肽聚糖的肽链部分,因此,我们的科学假设是:肽聚糖中的某些组分可能对Pseudoalterin具有诱导作用。为此,我们尝试从肽聚糖肽链组分中鉴定Pseudoalterin表达的诱导信号分子。首先检测了海洋典型革兰氏阳性菌Staphylococcus warneri MCCC0423的肽聚糖在转录水平上对Pseudoalterin的诱导作用。然后根据MCCC0423肽聚糖肽链的序列合成19种小肽,检测这19种寡肽及其中所含单个氨基酸对Pseudoalterin转录的诱导作用。实验结果表明含Gly寡肽及Gly对Pseudoalterin有诱导作用,为CF6-2表达Pseudoalterin的诱导信号分子。Gly的有效诱导浓度在0.25 mM-20 mM。这是首次揭示了微生物胞外蛋白酶的确切诱导信号分子并确定了其有效诱导浓度。另外,我们还确定了 Pseudoalterin的转录起始位点,为进一步阐明细菌CF6-2对Pseudoalterin合成的胞内调控机制奠定了基础。3.深海细菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin的成熟和分泌机制前期研究表明,M23家族蛋白酶Pseudoalterin没有自成熟的能力,需要其他蛋白帮助其切割前导肽。但哪些蛋白辅助Pseudoalterin成熟还不清楚。为了鉴定Pseudoalterin成熟的辅助蛋白和阐明其成熟机制,我们首先建立了菌株CF6-2的遗传操作体系,然后通过分析其他M23家族蛋白酶的成熟过程找出可能在Pseudoalterin成熟过程中起作用的辅助蛋白。利用菌株CF6-2的遗传操作体系对这些辅助蛋白进行基因敲除,然后分析突变对胞外Pseudoalterin的影响,从而确定了叁个对Pseudoalterin成熟有辅助作用的蛋白酶,Lysyl、Serine1和Serine5。信号肽预测结果表明这叁个蛋白酶可能位于周质空间。通过Western blot检测发现,全细胞上清中存在Pseudoalterin的成熟形式,因此推测Pseudoalterin前导肽的切割发生在周质空间。通过分析菌株CF6-2的基因组,发现其具有完整的II型分泌系统(Type II secretion system,T2SS)。我们推测CF6-2可能通过T2SS分泌Pseudoalterin。我们将T2SS中的关键基因gspE缺失突变后,CF6-2的发酵液几乎检测不到Pseudoalterin,回补缺失基因后,Pseudoalterin的分泌得到了恢复。因此可以确定Pseudoalterin是通过T2SS分泌到胞外的。4.深海细菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin结合和催化降解肽聚糖的机制前期研究表明,菌株CF6-2分泌的蛋白酶Pseudoalterin有两个功能结构域,含Zn离子的催化结构域能水解肽聚糖的肽链,另一个与催化结构域呈T字形紧密排列的C端结合结构域能结合肽聚糖糖链。Pseudoalterin能够降解革兰氏阳性细菌肽聚糖,但其结合和催化肽聚糖降解的分子机制尚未揭示。为了研究Pseudoalterin结合和催化肽聚糖降解的分子机制,我们通过分子对接的方法,将肽聚糖肽尾AeKaA和肽桥AGGGGG与Pseudoalterin催化腔进行分子共模拟,并结合同源序列分析,预测了 Pseudoalterin参与催化肽聚糖降解的关键氨基酸残基。然后,我们构建了 Pseudoalterin的在海洋适冷细菌中的适冷表达体系,并利用该体系对关键氨基酸残基进行了突变表达和纯化,并构建及纯化了C端结合结构域缺失突变体。通过测定Pseudoalterin突变体对肽聚糖的降解活性和吸附能力的变化,阐明了 Pseudoalterin结合和催化降解肽聚糖的机制。这是首次揭示了一个深海细菌蛋白酶对细菌肽聚糖降解的分子机制。5.深海细菌CF6-2及其胞外蛋白酶Pseudoalterin的生态功能细菌分泌的M23家族蛋白酶可以裂解细菌细胞壁肽聚糖,从而可为细菌获取食物并进行防御和竞争提供优势。为了阐明菌株CF6-2与海洋革兰氏阳性细菌之间的相互作用,我们通过平板实验对菌株CF6-2与海洋革兰氏阳性细菌进行了共培养,发现菌株CF6-2能够裂解多种海洋革兰氏阳性细菌并利用裂解细菌产生的营养物质进行生长,表明菌株CF6-2可能具有捕食海洋革兰氏阳性细菌的能力。然后,以 Staphylococcus warneri MCCC1A00423为对象,研究了P.sp.CF6-2通过分泌蛋白酶Pseudoalterin对革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖进行降解,导致细菌裂解和死亡,从而从中获取营养进行生长和繁殖的机制。根据研究结果提出了海洋革兰氏阴性菌CF6-2捕食海洋革兰氏阳性菌的模型。通过生物信息学分析,我们发现多株来源于海洋的细菌(大多数为革兰氏阴性菌)含有蛋白酶Pseudoalterin的同源序列,因此推测我们揭示的革兰氏阴性菌通过胞外蛋白酶捕食革兰氏阳性细菌的现象在海洋生态环境中可能具有普遍性,这是一种新的存在于海洋细菌之间的相互作用关系。6.深海细菌CF6-2产胞外蛋白酶Pseudoalterin的小试和中试发酵M23家族蛋白酶能够降解肽聚糖和弹性蛋白,因此在生物医学和生物技术上具有一定的应用潜能。为了降低发酵成本并同时提高Pseudoalterin的产量,在前期优化的基础上,我们通过单因子实验对发酵培养基的成分和发酵培养条件进行了进一步优化。以0.5%的蔗糖为碳源,将牛心管粉的用量从1.2%减少到0.6%,将Pseudoalterin的产量提高了 161%(161.2± 3.1 U/mL)。在发酵培养基优化的基础上,对小试5 L发酵罐和中试50 L发酵罐发酵CF6-2生产Pseudoalterin的通气量和搅拌速度进行了优化,建立了深海细菌CF6-2产胞外蛋白酶Pseudoalterin的小试和中试发酵工艺。小试和中试中Pseudoalterin的产量分别达到155.6±10.5 U/mL和103.5±8.6 U/mL。研究结果为Pseudoalterin的工业化生产和其在生物医学和生物技术上的应用奠定了坚实的基础。7.新型S8家族丝氨酸蛋白酶P57的酶学性质和PA结构域的功能在系统开展海洋细菌蛋白酶Pseudoalterin研究的基础上,本论文对海洋细菌分泌的另外新型S8家族丝氨酸蛋白酶P57的酶学性质和PA结构域的功能进行了研究。Photobacterium sp.A5-7是一株分离自胶州湾沉积物的产蛋白酶细菌。本文对Photobacterium sp.A5-7分泌的一个蛋白酶P57进行了纯化和表征。P57是一个新的S8家族枯草杆菌素类蛋白酶,能水解酪蛋白、明胶和胶原蛋白。成熟的P57具有一个催化结构域和一个PA结构域。对异源表达融合蛋白PA-EGFP的分析表明,PA结构域对胶原具有吸附能力。通过Fe3+抑制P57的酶活,检测到了 P57与胶原的结合。通过定点突变分析,发现Phe349和Tyr432是P57结合胶原的关键氨基酸残基。这些结果表明P57能通过PA结构域结合胶原底物。该部分实验结果首次提供了枯草杆菌素类蛋白酶的PA结构域能结合不溶性底物的直接证据,对更好地了解来自海洋沉积物中细菌胞外蛋白酶和枯草杆菌素蛋白酶PA结构域的功能具有重要意义。综上所述,本论文对深海细菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin在海洋肽聚糖降解和海洋生物竞争的生态学功能方面进行了较为深入的研究,同时研究了Pseudoalterin的诱导、成熟、分泌和催化机制,这些研究有助于我们更好地了解细菌及其胞外蛋白酶在深海物质循环和微生物相互关系中的作用。能够降解肽聚糖的蛋白酶Pseudoalterin在生物医学和生物技术上具有很好的应用价值,因此对本文建立的其进行的生产Pseudoalterin的中试发酵工艺为其大规模工业化生产奠定了坚实的基础。另一方面,在研究胞外蛋白酶Pseudoalterin的同时此外,我们本文建立了菌株CF6-2的遗传操作体系和适冷蛋白酶的适冷表达体系,这对研究深海细菌其它适冷菌和适冷蛋白具有重要意义。本文对蛋白酶P57的酶学性质及PA结构域的研究,对更好地了解来自海洋沉积物中细菌胞外蛋白酶和枯草杆菌素蛋白酶PA结构域的功能以及阐明海洋沉积物中颗粒有机氮降解具有重要意义。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-25）
催化表达论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
鲨肌醇(scyllo-inositol,SI)是肌肉肌醇(myo-inositol)的一种异构体,是治疗阿尔兹海默症潜在的活性物质。本研究构建了共表达耐高温来源的肌肉肌醇脱氢酶(IDH)和鲨肌醇脱氢酶(SIDH)的大肠杆菌全细胞,并将其进行细胞膜通透性处理后催化肌肉肌醇合成鲨肌醇。实验结果表明,使用经过通透性处理的
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
催化表达论文参考文献
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