导读:本文包含了初步晶体学论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:犬呼吸道冠状病毒,主蛋白酶,蛋白质结晶,蛋白质结构
初步晶体学论文文献综述
谭宇声[1]（2017）在《CRCoV主蛋白酶与抑制剂复合物晶体学初步研究及活性测定》一文中研究指出冠状病毒能够感染人类和多种动物,主要引发人类和不同种类动物的呼吸系统和肠道疾病。其中SARS-CoV和MERS-CoV都曾引发人类社会的强烈关注,给人类健康带来巨大威胁。犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)与上述两种极具威胁的冠状病毒共同被划分在冠状病毒亚科Beta属之中,是引发犬类传染性呼吸道疾病(CIRD)的主要病原体之一,给犬饲养者带来不小的经济损失。当冠状病毒附着并侵入宿主细胞后,病毒劫持宿主的核糖体并用于翻译其自身的复制酶多蛋白链(pp1ab、pp1ab)。由于在切割复制酶多蛋白链的过程中,主蛋白酶(nsp5)负责切割复制酶多蛋白链的11保守的切割位点,因此主蛋白酶在冠状病毒的复制过程中起到了关键作用,也是病毒组装自身复制转录复合物(RTC)的前提。针对此靶点,我国研究团队曾基于已解析的SARS-CoV主蛋白酶原子分辨率的叁维结构,分析和研究SARS-CoV主蛋白酶的关键氨基酸的位置和功能,进而设计、合成出一种利用亲核进攻主蛋白酶半胱氨酸进行迈克尔加成反应的先导化合物N3。本论文中我们将犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)主蛋白酶作为研究对象,完成了犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)主蛋白酶的克隆、表达和纯化、结晶筛选和晶体优化、晶体衍射、数据收集和结构初步解析以及相关酶学实验。论文详细阐述和重点分析了:1、分子克隆构建载体表达真实N端和C端CRCoV主蛋白酶的分子设计、蛋白质表达和纯化过程,讨论了还原剂对蛋白质的影响;2、结晶实验、数据收集以及结构初步解析;3、测定CRCoV主蛋白酶活性、抑制剂N3抑制效果。本论文为深入理解冠状病毒家族的主蛋白酶的结构和功能提供了新的信息,也为进一步基于结构进行后续的药物开发提供了重要依据。(本文来源于《天津大学》期刊2017-05-01）
王飞[2]（2017）在《远红外荧光蛋白smURFP的初步晶体学研究》一文中研究指出1962年下村修等人分离得到的绿色荧光蛋白及其各种突变体在生物科学研究中主要用于标记和示踪。但是绿色荧光蛋白发射光谱仅仅局限在440-529nm,细胞内成像时背景高,应用于活体生物的标记和示踪效果不够好。在1999年首次报道的红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白相比其优点非常明显。而本论文中所研究的远红外红色荧光蛋白能够很好的解决生物体内成像背景高的问题。2016年Erik A Rodriguez等人用TeAPCα经过突变产生了符合要求远红外红色荧光蛋白smURFP。突变体smURFP不仅亮度高而且能够在642-670nm范围内激发荧光,满足用于生物体内研究的需求。如何了解该蛋白质发光的结构机制,并利用其生化特性改造、设计新一代远红外红色荧光蛋白具有重要的科学价值和应用前景。而本文将smURFP作为研究对象,通过分子克隆等手段成功构建了一系列克隆,并在大肠杆菌中实现了目的蛋白进行了过量表达。通过亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等手段对目的蛋白进行了纯化,并获得了纯度较高的smURFP蛋白。通过对结晶条件的筛选我们获得了smURFP蛋白结晶。经过pH优化、添加剂优化等过程最终得到高质量的蛋白质单晶,并在上海同步辐射光源进行数据收集。虽然母体smURFP蛋白晶体衍射达到2.1?,在结构解析过程中利用分子置换法仍无法确定晶体相位。为了解决相位问题,我们后续对smURFP蛋白进行硒代甲硫氨酸标记,拟采用单/多波长反常散射的方式确定相位。在smURFP蛋白中有4个甲硫氨酸(除去起始的甲硫氨酸),通过硒标蛋白的制备和纯化,我们得到了的纯度较高的硒代甲硫氨酸标记的目的蛋白,并已获得较好的晶体。以上对smURFP蛋白的初步晶体学研究,有助于我们为后续解析其蛋白结构、了解其发光机制、进一步改造该荧光蛋白奠定了基础。(本文来源于《天津大学》期刊2017-05-01）
张琼林,Mark,Bartlam[3]（2016）在《牙龈卟啉单胞菌蛋白酶Tpr的表达、纯化和初步晶体学研究》一文中研究指出牙龈卟啉单胞菌是一种能够引起牙周炎的口腔病原菌,能够分泌许多种蛋白酶.这些蛋白酶在获得营养、逃脱宿主免疫、粘连组织细胞和其它疾病进程中发挥了重要作用,被认为是牙周炎的重要致病因子.其中一种蛋白酶是巯基蛋白酶Tpr,它能够降解许多常见蛋白酶的底物,其活性受到营养状态和钙离子浓度的调节.本实验在大肠杆菌中表达得到Tpr蛋白,经多种方法纯化后筛选获得蛋白质晶体.通过X射线衍射实验收集到分辨率达到0.20 nm的衍射数据,并使用软件HKL2000进行了处理.这些数据为解析Tpr3维晶体结构奠定了基础.(本文来源于《南开大学学报(自然科学版)》期刊2016年05期）
张影[4]（2016）在《一、B型链球菌毒力因子的初步晶体学研究 二、免疫卡控点TIGIT抗原表位和抗体CDR序列的初步研究》一文中研究指出1.B型链球菌毒力因子的初步晶体学研究B型链球菌(GBS)是导致围产期和新生儿感染的主要病原菌,主要存在于大约25%健康女性的生殖道中。GBS在子宫内的上行感染增加了新生儿患肺炎,败血症,脑膜炎的风险。目前,国内外对于GBS的预防方案采用的主要是抗生素预防,但是近些年出现的GBS对抗生素的耐受性引起了对GBS感染治疗的关注。目前还没有有效的措施预防GBS的上行感染,因此新型疫苗和抗菌药物的开发已经迫在眉睫,而针对GBS毒力蛋白或其合成途径设计抑制性药物是一种较为有效且可行的方案。GBS基因组测序已经完成,结合文献的报道,我们筛选了十种与GBS毒力作用相关的蛋白进行结构生物学研究,这十种蛋白包括负责合成GBSβ-haemolysis的cyl操纵子上的cylA、cylB和cylE,还有一些与GBS毒性相关的表面蛋白,这些表面蛋白对GBS的生长和毒性具有不可或缺的作用。我们试图利用结构生物学的手段探究这些蛋白发挥毒力作用的结构基础,希望通过结构分析找到这些蛋白上的潜在靶向药物作用位点,为新型抗菌药物的开发与设计提供理论依据。于是,我们将这十种毒力蛋白分别进行了分子克隆、大量表达与纯化,并对纯化得到的高纯度蛋白进行大规模的晶体筛选。最后,有两种表面蛋白收集了衍射数据,通过对衍射数据的处理获得了初步的结构信息。2.免疫卡控点TIGIT抗原表位和抗体CDR序列的初步研究近年来,针对免疫细胞共抑制性受体的免疫卡控点治疗在肿瘤免疫治疗中取得了巨大进展。免疫卡控点治疗与传统治疗方法的区别在于,它不是以肿瘤细胞作为靶点,而是以免疫细胞表面的抑制性受体为靶点,通过抑制这种受体来激活免疫细胞抗肿瘤活性,研究最多的这种抑制性受体是CTLA4,PD-1,目前针对它们的单抗药物已经在临床实验中取得了初步成功。但是这些抗体药物还具有局限性和副作用,所以发现和验证新的共抑制性受体成为一个全球竞争性的热点。TIGIT是2009年被发现的位于NK细胞和T细胞表面的共抑制性受体,目前研究表明阻断TIGIT的单克隆抗体,在动物模型中具有很好的抗癌效果,所以TIGIT是一个很具潜力的免疫治疗新靶点,但国内外还没有针对TIGIT受体的抗体药物上市,因此亟须开展高效特异性TIGIT单克隆抗体的研发。该研究课题主要围绕TIGIT单克隆抗体与TIGIT复合物结构展开,希望能通过解析复合物晶体结构来发现TIGIT单抗高变识别区(CDR)序列和TIGIT靶点的抗原表位,然后再基于结构改造获得更高亲和力的TIGIT单抗序列。在本课题中,我们构建了鼠和人TIGIT的原核表达体系,对TIGIT进行了表达和纯化；从裸鼠腹水中纯化TIGIT单抗,并构建了抗体Fab段的原核分泌型表达体系,进行原核纯化。(本文来源于《中国科学技术大学》期刊2016-09-30）
范颖芝[5]（2016）在《Ikaros家族蛋白异源表达、纯化及初步晶体学研究》一文中研究指出白血病是造血系统的一种恶性疾病,目前在我国具有较高的发病率和死亡率,而且发病率还在不断攀升,因此与白血病发生相关的分子机制的研究备受关注。Ikaros家族蛋白是主要分布在血细胞中的一类转录因子蛋白,可调控血细胞分化发育中多种重要基因的转录和表达,对多种血细胞,尤其是淋巴系白细胞的发育有着重要影响。它们的表达或功能异常与多种血液系统恶性肿瘤高度相关。Ikaros家族蛋白的N端和C端各具有一组C2H2型锌指结构域：N端部分的四个锌指主要负责结合特定的DNA序列；而C端的两个锌指参与介导蛋白蛋白之间的相互作用,并对N端功能和蛋白寿命起到一定的调控作用。Ikaros家族蛋白可以从染色体、核小体、RNA聚合酶叁个层面,通过直接结合目的基因的调控元件、招募染色质重塑复合物以及将目的基因调控区域募集至细胞核异染色质区域等方式,调控下游蛋白的转录。其中,C端锌指介导的蛋白蛋白相互作用对转录调控的完成起重要作用。本论文选取该家族的Ikaros 和 Aiolos的C端保守部分作为研究对象,进行质粒构建、表达、纯化及初步的晶体学研究。已获得的研究结果包括：1.通过分子克隆的方法成功构建了多种表达质粒。在原核系统中,质粒携带的编码基因能够表达出含有不同长度柔性连接区域的MBP融合蛋白,且经酶切验证,各融合蛋白呈现不同的酶切效果；2.根据目的蛋白的特异标签亲和性、表面电荷、疏水性、分子量及分子形状等特征,采取不同的层析方式分别对4BP-IkarosC/AiolosC 及 Ikaros/Aiolos的C端蛋白进行分离纯化,获得了大量高纯度的MBP-IkarosC/AiolosC融合蛋白；3.进一步实验证明Ikaros/Aiolos 的 C端蛋白可能与层析填料基质发生相互作用,导致目的蛋白难于洗脱纯化；4.针对MBP-IkarosC/AiolosC筛选得到多个潜在的晶体生长条件,完成初步条件优化,可重复性很强,目前实验仍在继续进行中。论文的另一部分对双孔钾离子通道TREK1进行了研究。该蛋白主要分布在中枢和外周神经系统中。TREK1属于机械门控性钾离子通道,同时受到化学或生理性刺激,包括脂质、磷酸化、温度、pH值等多种因素的调节。它在体内具有重要的生理意义,与神经保护、疼痛、麻醉、抑郁症等具有一定的相关性。哺乳动物双孔钾离子通道TREK1亚群以二聚的形式发挥功能,其单体具有典型的结构特征：4个跨膜片段(M1～M4),2个孔道区域(2P),胞浆内侧有较短的氨基端和较长的羧基端。有报道称,TREK1 C端部分是各种因素调控TREK1活性的一个重要部位。本论文以TREK1的C端蛋白部分作为研究对象,进行了一系列分子克隆、表达、纯化及初步晶体学实验。目前,利用pET28a、pET30a、pMAL、pFN18α等载体,分别连接不同长度TREK1C截短片段的编码基因,已成功构建11种表达质粒。通过诱导表达试验,筛选出表达较好且融合蛋白可溶性较高的pMAL-TREK1C质粒进行大量表达。选用MBP亲和层析及分子筛对MBP-TREK1C进行分离纯化,最终得到足量且纯度较高的融合蛋白。使用Index及Wizard两种结晶试剂盒进行晶体条件的初步筛选,结果尚在观察中。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2016-05-01）
单海焕[6]（2016）在《N-酰基高丝氨酸内酯酶AidE的初步晶体学研究》一文中研究指出在一些革兰氏阴性病原菌如绿脓假单胞菌和胡萝卜软腐欧文氏菌中,毒力因子产生、生物膜形成、生物发光、抗生素合成、粘附、群游现象、孢子形成等行为与群体感应系统有着密切的联系。群体感应参与微生物分泌特定分子如自体诱导剂来调节种内和种间密度。介导细胞间通路的小分子的结构是多样的,其中一大类信号分子由N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)组成。群体感应系统以可扩散的N-酰基高丝氨酸内酯作为细胞间信号传递分子,AHL的浓度在调节病原细菌的毒力基因表达和相关重要生物功能上发挥着关键作用。一些生物含有编码AHL内酯酶的基因,编码的内酯酶可破坏AHLs的内酯环,从而阻断群体感应系统。AidE是一种来源于苍白杆菌属的AHL内酯酶,目前没有关于AidE结构与功能方面的报道。本研究运用分子生物学技术构建AidE重组蛋白,过表达、运用Ni亲和层析、凝胶过滤层析和离子交换层析进行蛋白样品的纯化和制备,获得电荷均一、分子量大小以及聚体形式均一的AidE蛋白。进一步通过优化Ni亲和层析、凝胶过滤层析和离子交换层析的纯化步骤,获得两相均一的硒代AidE蛋白。AidE是一种对AHL酰胺链长度和C3位取代基具有底物宽泛性的锌离子依赖型AHL内酯酶。一级序列比对分析表明,AidE与其它已知的AHL内酯酶的同源度小于25%。根据该系统进化树的拓扑结构,AidE属于金属-β-内酰胺酶家族,为金属依赖蛋白,含有金属结合基序"HXHXDH"。运用坐滴法和悬滴法对AidE蛋白进行晶体生长条件的筛选,获得最初微晶生长条件,最终在1575 M ammonium sulfate,0.1 M sodium cacodylate trihydrate pH6.6,0.01 M cobalt (Ⅱ) chloride条件下获得了AidE的单晶,并收集衍射数据。运用衍射数据处理软件HKL2000处理得到AidE初步晶体学数据。AidE蛋白晶体属于正交晶系,空间群为P2221。在其结构解析的过程中,由于AidE晶胞的一个不对称单位里存在10个分子,因此不能用分子置换法进行求解,而必须用实验相角(重原子浸泡法或硒代)的方法进一步获得正确的结构。目前已获得硒代AidE蛋白微晶的生长条件,待优化以获得可用于衍射数据收集和结构解析的单晶。(本文来源于《扬州大学》期刊2016-04-01）
杨伟[7]（2015）在《人热休克蛋白质GRP78的表达纯化与ATP酶活性及初步晶体学研究》一文中研究指出背景:人GRP78,属于热休克蛋白70(HSP70)家族,它是唯一定位在内质网上的蛋白质。在热休克蛋白70家族里GRP78是最早被认定与已知配体有特殊关系的基本物质。GRP78是广泛存在于各种生物中的一种内质网的分子伴侣,是促进正常生长状态下细胞蛋白质成熟、维系细胞功能和生命的关键性调节物质。目的:构建GRP78原核表达重组质粒pW28-GRP78,在大肠杆菌BL21中表达并纯化获得GRP78蛋白质,初步检测其ATP酶活性及其与preS1的结合能力,并培养获得GRP78蛋白质晶体,收集x-光晶体衍射数据,为其叁维结构解析提供重要的实验基础。方法:1)通过NCBI数据库得到GRP78基因序列,PCR扩增获得GRP78基因片段,并插入到带有His标签的载体pW28中,构建重组质粒pW28-GRP78,然后转入大肠杆菌BL21中进行表达,利用镍离子亲和层析纯化目的蛋白。利用晶体筛选试剂盒对GRP78蛋白质进行晶体筛选,对初步筛选得到的晶体进行优化,以获得高质量的单晶,通过x-光衍射技术收集单晶的衍射数据。2)HSP70家族在N端有44-kDa的ATP酶结构域。利用ATP酶活性检测试剂盒对GRP78进行ATP酶活性检测,并检测GRP78蛋白浓度、反应温度对GRP78蛋白ATP酶活性的影响。3)PCR扩增获得preS1基因片段,并插入到带有GST标签的载体pGEX-6P-1中,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-preS1,将重组表达质粒,转入大肠杆菌BL21中进行表达;用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析柱(Glutathione-Sepharose-4B层析柱)纯化目的蛋白,利用SDS-PAGE分析GRP78与preS1体外相互作用情况。结果:1)GRP78蛋白在大肠杆菌BL21中获得大量上清表达,并成功纯化了目的蛋白;2)通过GRP78蛋白质晶体的初筛和优化得到高质量单晶;3)ATP酶活性检测实验发现GRP78具有ATP酶活性,其酶活性与GRP78蛋白浓度、反应温度有关;4)体外相互作用实验发现GRP78与preS1发现两种蛋白能在体外结合。(本文来源于《2015浙江省检验医学学术年会论文汇编》期刊2015-08-19）
陈琼珍[8]（2015）在《Pseudomonas putida DLL-E4降解对硝基苯酚的调控机制和关键酶PnpA的晶体学初步研究》一文中研究指出对硝基苯酚(PNP)是一类重要的硝基酚类化合物污染物,具有“叁致”作用,可对人或动物的血液、肝及中枢神经系统产生毒害作用,已被中国和美国的环保机构列入“优先控制污染物名单”。目前已有大量降解PNP的微生物被分离,同时其降解PNP的代谢途径及PNP降解基因已被广泛研究。本文以本实验室分离保存的PNP及其中间代谢产物对苯二酚(HQ)的高效降解菌株Pseudomonasputid.DLL-E4及其pnpR敲除突变株DLL-△pnpR为原始材料,通过反转录PCR、5'-RACE、RNA-Seq、基因敲除、荧光定量PCR和蛋白质结晶等技术手段进行研究,以期阐明PNP降解的调控机制和PNP关键降解酶PnpA的晶体结构、催化机制,为全面了解P.putida DLL-E4对PNP降解的调控模式奠定基础。菌株DLL-E4的基因组序列分析结果显示该菌株具有两套PNP降解基因簇。反转录PCR结果表明在PNP或HQ诱导下,两套基因簇均发生转录。利用Rockhopper软件预测和反转录PCR分析,确定了两套PNP降解基因簇的组织形式,并将两套基因簇划分为 6 个操纵元 pnpAb、pnpA、pnpB、pnpR、pnpC1C2DECX1X2 和pnpC1bC2bDbEbCbX1bX2b。利用5'-RACE法确定了 pnpR的转录起始位点位于起始密码子上游31bp处(G),pnpC1的转录起始位点位于起始密码子上游30bp处(A)。通过半定量PCR方法分析在PNP、PNP+葡萄糖、HQ、HQ+葡萄糖作用下两套基因簇的转录差异,发现操纵元pnpA、pnpB的转录不受pnpR敲除的影响,操纵元pnpR、pnpA可本底转录;操纵元pnpC1C2DECX1X2的转录受pnpR正调控,可被PNP或HQ诱导表达。原始菌株与pnpR敲除菌株的菌体生长实验和PNP、HQ降解实验的比较分析结果表明pnpR的敲除对菌体生长和菌体形态无明显影响,但对菌体降解HQ或PNP的能力影响显着。pnpR敲除菌株只能使PNP发生脱硝基反应,并失去降解HQ的能力。BIOLOG实验分析发现pnpR的敲除会使菌株对L-丝氨酸、L-丙氨酸胺、琥珀酸的利用能力显着提高。由于两套PNP降解基因簇的转录情况有差异,且pnpR在菌株对PNP、HQ的降解和对碳源的利用上影响显着,因此采用RNA-Seq技术研究PNP降解的转录调控以及PNP降解与核心碳代谢间的联系。RNA-Seq结果显示,不论是野生菌株DLL-E4还是突变菌株DLL-△pnpR,当PNP存在时,大部分编码基因和ncRNAs都发生显着变化,说明PNP是一个全局性的效应物。当pnpR敲除且无PNP存在时,仅有极少数编码基因和ncRNAs发生变化,表明pnpR的调控范围较窄。RNA-Seq数据和qPCR结果显示PNP的存在可显着地诱导两套降解基因簇的转录。利用qPCR检测两套HQ降解相关操纵元在pnpA失活下的表达情况,发现PNP无法直接诱导操纵元pnpC1C2DECX1X2、pnpC1bC2bDbEbCbX1bX2b和pnpR的转录。RNA-Seq结果显示PNP的存在可使非编码ins1和ins2显着上调,但ins1无法被敲除,ins2的敲除仅能使PNP降解延迟3 h且对细胞生长没有明显影响。结合本实验室前期研究成果,可知操纵元pnpA、pnpR、pnpC1C2DECX1X2和ppnpR1是PNP降解的关键基因,操纵元pnpAb和pnpC1bC2bDbEbCbX1X2b不具备降解PNP和HQ的能力;pnpA的表达受多个转录因子调控,其效应物为PNP;操纵元pnpC1C2DECX1X2和pnpC1bC2bDbEbCbX1bX2b对效应物HQ的响应有明显差异;PnpR正调控操纵元pnpA和pnpC1C2DECX1X2, PnpR1正调控pnpA但对操纵元pnpC1C2DECX1X2没有调控作用。RNA-Seq数据的深入比较分析结果显示当菌株DLL-E4和DLL-△pnpR培养于PNP中时,参与PNP降解和TCA循环的基因发生显着上调,但同时参与ED途径和磷酸戊糖途径的基因却没有显着变化甚至下调。当菌株DLL-△pnpR只培养于葡萄糖中时,与核心碳代谢相关的基因的转录水平并未发生显着变化。RNA-Seq样品的葡萄糖利用实验结果显示在PNP降解前期,PNP的存在会促进菌株利用葡萄糖,但当PNP完全消失后葡萄糖的利用受阻。结合RNA-Seq数据,推测葡萄糖在PNP降解前期的利用加快可归结于外膜孔蛋白OprB和葡萄糖脱氢酶Gcd编码基因的转录上调,且它在PNP完全消失后的利用受阻可能是核糖体蛋白合成、rRNA合成和RNA聚合酶δ因子相关基因转录下调、葡萄糖转运系统被PNP中间代谢产物抑制的结果。RNA-Seq结果、PNP降解、HQ降解和qPCR实验结果显示,PNP降解、HQ代谢与葡萄糖利用之间存在着一定联系。葡萄糖对PNP降解的促进和对HQ降解的延迟可分别归因于代谢阻遏现象的减缓和加强。菌株在PNP和葡萄糖共同存在下对底物利用能力的变化和自身生长状态的变化是多方因素共同作用的结果。只利用Ni-NTA亲和层析对PnpA、Se-PnpA进行纯化,即可得到纯度较高、适合于晶体实验的蛋白溶液。经过多轮初筛、复筛、条件优化,得到了PnpA相关蛋白晶体的最适生长条件:native-PnpA晶体所需结晶池液为10%异丙醇、0.1 MTris-HClpH8.5、13.5%PEG4000、5%或7.5%甘油,蛋白浓度为5.2mg/ml; PnpA-PNP晶体所需最优结晶池液为 10%异丙醇、0.1MTris-HClpH8.5、12%PEG4000、0.5mMPNP,所需蛋白浓度为5mg/ml; PnpA-FAD/PNP晶体所需最优结晶池液为10%异丙醇、0.1 MTris-HCl pH8.5、12%PEG4000、0.5mMPNP、0.01mMFAD,所需蛋白浓度为5mg/ml; Se-PnpA所需最优结晶池液为 10%异丙醇、0.1 MTris-HClpH8.5、8.0～12.0%PEG4000、10 mMβ-巯基乙醇,蛋白浓度为3～5 mg/ml。使用坐滴气相扩散法,在293 K下培养约两天便可得到适合于X-ray衍射的蛋白晶体。native-PnpA晶体衍射分辨率可到1.7A,空间群为P21212,晶胞参数为:a = 54.2,b = 76.5, c = 208.8, α = 90.00°,β = 90.00°,γ = 90.00°; PnpA-PNP晶体衍射分辨率可到2.0A,空间群为P21212,晶胞参数为:a = 53.9, b = 76.4,c = 208.3,α = 90.00°, β= 90.00°,γ=90.00°; PnpA-FAD/PNP晶体衍射分辨率可到2.0A,空间群为P21212,晶胞参数为:a = 54.4,b = 77.6,c = 211.0,α = 90.00°,β = 90.00°,γ = 90.00°; Se-PnpA晶体衍射分辨率可到1.5 A,空间群为P21212,晶胞参数为:a = 54.3, b = 77.0, c = 208.7,a = 90.00°,β= 90.00°,γ = 90.00°。本文采用比较转录组学及蛋白质晶体学等手段,研究了PseudomonasputidaDLL-E4对硝基苯酚(PNP)的降解基因簇单元和降解关键酶PnpA的结构和功能,发现PNP的降解受到代谢阻遏及非编码RNA等多因素的调控,获得了 PnpA的高分辨率衍射晶体,为阐明PNP降解机制奠定了基础。(本文来源于《南京农业大学》期刊2015-07-01）
孙晓亮,刘雪梦,倪晓敏,王小艳,袁震[9]（2015）在《人源色氨酰tRNA合成酶H130R突变体的酶活和初步晶体学分析（英文）》一文中研究指出色氨酰t RNA合成酶(tryptophanyl-t RNA synthetase,Trp RS)催化色氨酸的活化及其特异性t RNA的氨酰化,为蛋白质合成提供原料。在IFN-γ刺激下,人源细胞中的Trp RS通过结合血红素增强其氨酰化活性,以调节吲哚胺2,3-双加氧酶表达水平增高所引起的色氨酸缺失。体外研究发现,锌离子和血红素竞争性结合人源Trp RS以增强其氨酰化活性。然而,由于一个氨基酸位点H130R的突变,牛和鼠的Trp RS以及人的H130R突变体都不再受锌离子和血红素的影响,并具有高氨酰化活性。H130R Trp RS模拟了一种结合着锌离子或血红素的高活性构象,但目前还没有对这种构象的结构描述。为了阐明H130R决定Trp RS氨酰化活性种属特异性的原因,以及锌离子和血红素的结合位点,作者对人H130R Trp RS进行了活性分析和初步晶体学研究,此工作将为锌离子和血红素调节Trp RS氨酰化活性的机制研究奠定基础。(本文来源于《生物物理学报》期刊2015年03期）
张宏鹏[10]（2015）在《肺炎链球菌热休克蛋白GrpE的初步晶体学研究》一文中研究指出目的 热休克蛋白GrpE是热休克蛋白超家族70重要成员之一,被认为是一种负性调控基因。该基因在肺炎链球菌的感染中有相关作用。对肺炎链球菌热休克蛋白GrpE进行克隆表达,纯化及热稳定性测定,以便于进一步分析肺炎链球菌感染的分子机制。方法设计特异性引物,通过PCR技术扩增目的基因。构建pW28-GrpE重组表达质粒。在大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli) B834中获得可溶性上清表达。利用Ni2+-NTA亲和层析柱、DEAE阴离子交换层析柱、Hiload Superdex 75凝胶层析柱对靶蛋白进行纯化。TSA法测定GrpE热稳定性,气相扩散法获得蛋白质晶体。结果重组构建质粒pW28-GrpE可以在表达菌E.coli B834中获得可溶性上清表达。GrpE蛋白具有较高纯度(95%以上),目的蛋白在溶液中以二聚体形式存在。发现重组GrpE蛋白在20 mM盐浓度、pH6.0缓冲液中有较高热稳定性。获得衍射能力为5A的蛋白质晶体。结论 利用蛋白质表达纯化的经典技术,获得了高表达、高纯度的GrpE蛋白。为下一步蛋白质晶体的优化及相关基础研究奠定了基础。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2015-05-01）
初步晶体学论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
1962年下村修等人分离得到的绿色荧光蛋白及其各种突变体在生物科学研究中主要用于标记和示踪。但是绿色荧光蛋白发射光谱仅仅局限在440-529nm,细胞内成像时背景高,应用于活体生物的标记和示踪效果不够好。在1999年首次报道的红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白相比其优点非常明显。而本论文中所研究的远红外红色荧光蛋白能够很好的解决生物体内成像背景高的问题。2016年Erik A Rodriguez等人用TeAPCα经过突变产生了符合要求远红外红色荧光蛋白smURFP。突变体smURFP不仅亮度高而且能够在642-670nm范围内激发荧光,满足用于生物体内研究的需求。如何了解该蛋白质发光的结构机制,并利用其生化特性改造、设计新一代远红外红色荧光蛋白具有重要的科学价值和应用前景。而本文将smURFP作为研究对象,通过分子克隆等手段成功构建了一系列克隆,并在大肠杆菌中实现了目的蛋白进行了过量表达。通过亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等手段对目的蛋白进行了纯化,并获得了纯度较高的smURFP蛋白。通过对结晶条件的筛选我们获得了smURFP蛋白结晶。经过pH优化、添加剂优化等过程最终得到高质量的蛋白质单晶,并在上海同步辐射光源进行数据收集。虽然母体smURFP蛋白晶体衍射达到2.1?,在结构解析过程中利用分子置换法仍无法确定晶体相位。为了解决相位问题,我们后续对smURFP蛋白进行硒代甲硫氨酸标记,拟采用单/多波长反常散射的方式确定相位。在smURFP蛋白中有4个甲硫氨酸(除去起始的甲硫氨酸),通过硒标蛋白的制备和纯化,我们得到了的纯度较高的硒代甲硫氨酸标记的目的蛋白,并已获得较好的晶体。以上对smURFP蛋白的初步晶体学研究,有助于我们为后续解析其蛋白结构、了解其发光机制、进一步改造该荧光蛋白奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
初步晶体学论文参考文献
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