一、BNIP3L基因在肺癌组织中的表达及结构分析（论文文献综述）
赵留芳[1]（2020）在《FAM136A表达与肺癌预后相关性及其生物学功能研究》文中提出[目 的]中国是全球肺癌发病率和死亡率最高的国家之一,其中云南宣威地区肺癌尤为突出。尽管改炉改灶工程使其发病率和死亡率有所下降,但相较于其他地区仍是最高发地区。有研究显示,生物学因素在区域肺癌发病过程发挥关键作用。本研究旨在期望筛查发现与该地区肺癌生存及预后相关性致病关键基因,并探讨其在体内外生物学效应中的作用及影响,为进一步深入研究其生物信号传导机制,为肺癌临床精准治疗提供理论基础。[方 法]一、区域肺癌差异表达基因的筛选及其生物信息学分析收集昆明医科大学第三附属医院胸外科手术后经病理诊断确诊的宣威地区代表性肺癌9例、非宣威地区肺癌6例,利用Agilent mRNA表达谱芯片测序结果,筛选差异表达基因（Different expressed genes,DEGs）;利用注释及可视化数据库（Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,DAVID）工具进行基因本体（gene ontology,GO）功能富集度分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析。利用基因相互作用检索工具（The Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,STRING）数据库进行蛋白网络互作（protein protein interaction network,PPI network）网络分析,利用Cytoscape软件进行具体可视化分析,同时利用该软件内置的插件CytoHubba筛选出核心基因（Hub genes,HB）。最后利用Kaplan-Meierplotter软件进行生存分析预测,从中挑选获得具有实验研究价值及潜在临床意义的候选癌基因FAM136A。二、候选癌基因FAM136A的临床表达研究与患者预后的相关性分析扩大样本量,选取177例肺癌组织（宣威组72例,非宣威组105例）,并以相应的癌旁形态学正常肺组织为对照,利用免疫组化SP法检测177对肺癌及对照组织中FAM136A的表达强度与分布面积。统计分析其表达情况与患者临床病理特征之间的相关性,并进行生存预后相关性分析。三、体外细胞生物学功能实验1.首先选取 6 株肺癌细胞 A549、H1975、H2342、H522、XLA-07、PC-9,病毒转化人支气管上皮细胞系BEAS-2B、转化人支气管上皮样细胞16HBE,用Western blot方法检测各株细胞内FAM136A蛋白的基础表达水平,从中挑选出A549和PC-9两株肺腺癌细胞进行后续体外、内细胞学实验研究。2.靶向合成特异性敲减小干扰RNA即siRNA-FAM136A,进一步合成并包装敲减慢病毒LV-SiRNA-FAM136A,并以无关敲减序列（scramble）为对照,瞬时感染细胞株A549和PC-9后,进行后续功能实验:2.1采用CCK8实验法检测敲减FAM136A后对细胞增殖活力的影响;2.2采用Wound Healing实验检测敲减FAM136A对细胞迁移功能的影响;2.3采用流式细胞技术检测敲减FAM136A后对细胞周期分布变化及细胞凋亡的影响;2.4采用ATP试剂盒检测减FAM136A后对细胞ATP代谢水平的影响;2.5采用LDH试剂盒检测敲减FAM136A后对细胞LDH代谢水平的影响;2.6采用透射电镜观察敲减FAM136A后对细胞自噬的形态学影响;2.7采用Western blot检测敲减FAM136A后对细胞增殖信号通路关键节点蛋白的影响;对细胞周期关键蛋白的影响;对细胞自噬相关核心蛋白表达变化水平。四、动物学水平体内实验用慢病毒LV-shFAM136A感染细胞株A549后,扩增细胞。在裸鼠适当周龄时,于裸鼠腋下皮下注射感染细胞,构建肺癌移植瘤模型;每天测量裸鼠移植瘤长、短径;称量裸鼠体重,观察裸鼠生长状态。饲养适当时间后,断颈脱臼处死裸鼠,解剖瘤体,测量长短经,称取瘤体净重量,统计分析。[结 果]一、我们首先通过15对（宣威地区代表性肺癌9例、非宣威地区肺癌6例）肺癌组织及其癌旁形态学正常肺组织mRNA表达谱芯片数据库筛选获得差异表达基因,其中宣威肺癌组表达上调基因1440个,表达下调基因2120个;非宣威肺癌组表达上调基因1182个,表达下调基因1661个。对所筛选宣威组差异表达基因芯片结果通过生物信息学分析,利用DAVID工具进行GO富集度、KEGG通路富集分析后,发现差异表达基因生物学功能主要涉及血管生成、细胞粘附、环一磷酸腺苷应答、细胞外基质、药物应答、血液凝固、细胞外间隙、细胞外基质蛋白、细胞表层、胞外区域、细胞质膜、胞质膜外侧面、细胞外基质、细胞间连接、钙通道结合、肝素结合、磷酸化蛋白、相关基因主要与补体与凝血系统等调控通路有关。用STRING数据库进行蛋白网络互作分析,进一步利用Cytoscape软件筛选出核心基因（Hub）基因。获得蛋白互作网络结构关系连接度前十位的核心基因为:FAM136A、LPAR3、ACTN2、GNAI1、PBP、JUN、ANXA1、EGF、PIK3R1、AGTR1。最后利用Kaplan-Meier plotter在线软件进行生存分析预测,预测结果显示,FAM136A与患者总生存期、无疾病进展期均密切相关。这为后续研究提供了新的切入点。二、进一步扩大筛选样本量,收集获得177例（宣威组75例,非宣威组102例）包含患者完整随访信息的肺癌样本组织,利用免疫组化SP法检测FAM136A的表达强度与分布。统计分析其表达情况患者临床病理特征之间的相关性,结果显示:FAM136A在宣威与非宣威癌组织间表达并无统计学差异;而宣威组、非宣威组内癌组织与正常组织间表达均有统计学差异性;综合统计发现有79例（44.6%）样本组织可检测到FAM136A呈阳性表达,并且FAM136A阳性表达与TNM分期、淋巴结转移具有相关性;其中更为重要的是,我们发现在淋巴结转移肺癌患者中,FAM136A 阳性表达患者总生存期缩短且具独立相关性,可作为这部分患者预后不良的的独立预后因素。三、体外实验结果A549和PC-9细胞感染慢病毒LV-shFAM136A后,依次进行以下实验:1)CCK8实验检测发现A549和PC-9细胞增殖活力受抑制,2)Wound healing实验检测发现细胞迁移能力降低,3)流式细胞技术检测发现细胞凋亡增加,其中A549细胞较为显着,细胞周期分布变化主要为G1期细胞增加,S期细胞减少,4)ATP检测试剂盒检测发现细胞ATP合成水平增加,5)LDH检测试剂盒检测发现细胞LDH代谢水平减少,6)透射电镜观察提示对细胞自噬的形态学影响并不显着,7)Western blot检测发现细胞增殖信号通路关键节点蛋白c-jun表达水平降低细胞周期关键蛋白CDK4/CDK6表达水平降低。五、体内动物学实验随时间延长,实验组、对照组裸鼠移植瘤体积均呈逐渐增大趋势,但慢病毒LV-shFAM136A感染细胞株移植瘤瘤体明显增殖速度明显慢于无关序列慢病毒感染组移植瘤。在裸鼠适当周龄时,断颈处死裸鼠,解剖瘤体,测量长短经,统计分析显示实验组移植瘤体积明显小于对照组。观察裸鼠生长状态没有异常变化,裸鼠体重变化差异没有统计学显着性。[结 论]一、宣威肺癌组织mRNA表达谱的差异基因功能主要集中于血管生成、细胞粘附、环一磷酸腺苷应答、细胞外基质、药物应答等方面;主要参与细胞增殖、细胞周期调控、补体与凝血系统等调控通路。二、FAM136A的表达与淋巴结转移患者的总生存期预后独立相关,可作为判断该部分患者生存期的一个独立预后因子。三、FAM136A可促进肺癌细胞株A549和PC-9的增殖、提高细胞的迁移能力。影响A549和PC-9的细胞周期分布,并在抑制细胞凋亡的生物学效应中发挥作用;FAM136A参与了 A549和PC-9细胞的ATP代谢、LDH代谢。四、FAM136A可以通过提高细胞周期蛋白CDK4/CDK6表达水平,调控细胞周期分布;Myc-FAM136A-CDK4/CDK6调控轴可能是一个潜在增殖信号通路。五、FAM136A可以在裸鼠体内促进肺癌细胞增殖。
李文芳[2]（2019）在《基于衍生基质/复合支架的肿瘤模型构建和黄芪多糖抗乳腺癌活性及机制研究》文中进行了进一步梳理近年来,植物多糖因具有多途径、多靶点及多环节的特点在抗肿瘤方面的研究一直比较活跃。黄芪多糖（Astragalus polysaccharides,APS）因可通过直接的杀伤肿瘤细胞或增强机体免疫活性途径发挥抗肿瘤的作用受到研究者的关注。药物抗肿瘤活性的研究离不开肿瘤模型,其中三维体外组织工程肿瘤培养系统因能更好模拟体内肿瘤微环境,逐渐成为研究肿瘤生物学及预测新型药物的重要组成部分。作为构建组织工程肿瘤基本因素之一,支架的选择尤为重要。脱细胞支架因可较好保留原细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）成分、生理生化及机械性能,已被广泛用于肿瘤模型的构建。本研究制备一种新型的脱细胞猪肺衍生支架并进一步构建3D肿瘤模型,从体外2D、3D培养和小鼠皮下种植瘤等多种肿瘤模型综合考察了 APS的抗乳腺癌作用及机制。同时,利用网络拓扑的生物信息学方法获得枢纽基因并实验验证APS体内抗乳腺癌的其它可能机制,以便为APS的临床应用提供更多的实验及理论依据。多糖的结构及组成与其生物活性有直接关系,本研究选用美国泛华医药的同一批次APS作为研究对象,通过紫外光谱、IR光谱、NMR及HPLC等多种方法,结果表明APS具有典型的多糖特征吸收峰,组成单元主要为α-型吡喃型糖苷键。APS不含核酸和蛋白质,主要由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成。SEM发现APS为球形或类球形颗粒无规则地堆积在一起,多数颗粒为纳米尺度,这与其后续激活巨噬细胞并进一步发挥抗癌活性有直接的关系。以上结果表明APS纯度较高,性状良好,适合后续实验研究。多糖抗肿瘤机制主要包括直接的杀伤作用和通过提高机体免疫间接抗肿瘤两个方面。本研究首先选用传统的2D肿瘤培养模型,最初确定APS体外对乳腺癌细胞株（MCF-7和4T1）无直接的细胞毒作用后,从其提高机体免疫发挥抗肿瘤活性出发,体外考察APS介导巨噬细胞上清（Conditioned medium,CM）对MCF-7和4T1细胞的抑制效果及机制。结果表明APS介导CM可显着抑制MCF-7和4T1细胞的生长,其机制可能与APS与巨噬细胞表面Toll-样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）结合后激活巨噬细胞,并进一步促进肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）和一氧化氮（Nitric oxide,NO）的分泌有关。APS介导CM抗乳腺癌细胞株MCF-7和4T1的活性主要通过诱导细胞周期阻滞（G1和G2期）和促进细胞凋亡实现。CM可通过调节线粒体凋亡途径进而促进MCF-7和4T1细胞的凋亡。基于3D培养模型较传统2D培养更能模拟体内肿瘤生长微环境且提高药物筛选效率和准确性,本研究进一步评估CM对3D培养MCF-7细胞的抑制作用。本章首先制备脱细胞处理后的猪肺衍生支架并进一步构建体外3D乳腺癌模型,考察MCF-7在脱细胞猪肺支架上的多种细胞行为及乳腺癌特定蛋白的表达。脱细胞猪肺衍生支架具有良好的生物相容性,MCF-7细胞可在脱细胞猪肺支架不断生长增殖形成肿瘤球。相比2D培养,3D脱细胞猪肺基质培养环境可显着提高乳腺癌细胞的恶性程度,具体表现为降低的细胞生长速率和提高的乳腺癌特定蛋白的表达。此外,3D脱细胞猪肺衍生支架显着促进肿瘤细胞的局部缺氧环境。基于此,利用脱细胞猪肺衍生支架构建的肿瘤模型对于进一步研究CM对3D乳腺癌细胞的抑制活性提供了更可靠的平台。CM给药可显着降低细胞活率,减小MCF-7所发展成的肿瘤球尺寸。CM可通过调节Bcl-2和Bax蛋白的表达促进3D培养MCF-7细胞的凋亡。为了评估本研究所制备新型脱细胞猪肺支架与目前常用的天然及合成材料所构建肿瘤模型的差异,本研究制备壳聚糖/明胶（Chitosan/Gelatin,Chi/Gel）及左旋聚乳酸（Poly（L-lactide）,PLLA）支架,并进一步比较了 MCF-7细胞体外在2D培养及三种支架上的细胞行为、乳腺癌蛋白表达、药物敏感性及4T1细胞在2D和3D支架上的体内致瘤性及血管形成情况。结果表明3D培养显着降低了 MCF-7细胞对5-FU的敏感性及促进乳腺癌恶性程度。MCF-7细胞在2D和3D培养条件下的细胞形态具有明显差异,MCF-7细胞在三种支架均形成“葡萄串”样式堆叠的肿瘤球。PLLA支架因表面最为粗糙且孔径最小,MCF-7细胞体外在PLLA支架生长增殖最快。相反地,将接种4T1细胞的三种支架植入BALB/c小鼠皮下4周后,PLLA支架因在体内降解成乳酸引发炎症,其在体内肿瘤的发展及血管生成方面效果最差。MCF-7细胞在脱细胞猪肺衍生支架上体外生长增殖优于其在Chi/Gel支架上的,而4T1细胞在脱细胞猪肺衍生支架上体内肿瘤的发展优于其在PLLA支架上的。结果表明本实验所制备的脱细胞猪肺衍生支架较之天然和合成材料支架在体外体内肿瘤发展方面呈现出一定优势,适合用于肿瘤生物学研究。机体的免疫系统十分复杂,涉及多种免疫细胞及其分泌的细胞因子。相比较体外仅从APS激活巨噬细胞后发挥抗乳腺癌细胞活性,本研究经BALB/c小鼠皮下接种4T1细胞肿瘤造模成功后,从对小鼠的免疫器官、免疫细胞及细胞因子分泌的影响评估APS体内抗乳腺癌的作用机制。结果表明连续腹腔注射APS两周后,APS（200 mg/kg）、5-FU（20 mg/kg）及联合给药组（APS+5-FU）虽然均可显着抑制小鼠肿瘤的生长,但对免疫器官结构和功能的影响明显不同。APS可显着提高小鼠胸腺和脾脏指数,对破坏的胸腺组织及脾脏组织结构有明显的修复作用。相反地,5-FU组小鼠脾脏和胸腺指数明显下降,且对胸腺和脾脏结构的损伤程度进一步加重。同时,APS能够显着提高小鼠的脾淋巴细胞的增殖能力和提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力。另外,APS能够提高小鼠外周血中IL-2、TNF-α和IFN-γ的表达水平。以上结果表明APS可能通过修复免疫器官、调控细胞免疫应答和提高细胞因子水平而发挥抗肿瘤作用。APS联合5-FU可提高抗肿瘤效果,缓解5-FU对免疫体统的损伤,适合作为化疗的免疫辅助药物。本研究进一步基于网络拓扑生物信息学方法研究APS体内抑制肿瘤生长的其它可能机制。本研究从EMBL-EBI数据库中下载7组乳腺癌基因芯片表达谱数据,通过分析筛选出201个共同差异表达基因（Differential expressed gene,DEG）,调节一致的有189个DEGs,其中上调基因73个,下调基因116个。基因本体功能注释（Gene ontology,GO）富集分析表明DEGs主要参与细胞周期、细胞增殖、染色体分离、细胞分化等生物过程。考虑到本研究前面所发现的APS介导CM抑制体外乳腺癌细胞生长的作用机制,特别对涉及细胞周期、增殖和凋亡等生物过程条目所在DEGs构建蛋白交互作用（Protein-protein interaction）网络,并对网络各个节点进行度值分析筛选枢纽基因。结果表明EGFR和ANXA1基因为枢纽基因及共同基因,文献检索结果也表明这两个基因在多数癌症中异常表达。本研究免疫组化实验结果发现APS对EGFR和ANXA1蛋白在乳腺癌组织中的表达具有反调节作用,揭示这可能是APS体内抑制乳腺癌生长其它可能的机制之一。综上所述,本研究制备了一种新型3D脱细胞猪肺衍生支架并证明其在组织工程肿瘤模型应用的可行性。在此基础上,本研究通过体外2D、3D培养、动物体内种植瘤等多种肿瘤模型表明APS体内主要通过提高机体免疫功能发挥抗乳腺癌活性,而且其可有效提高化疗药物的协同作用。体外则是激活巨噬细胞后通过促进细胞凋亡及阻滞细胞周期抑制乳腺癌细胞的生长。生物信息学分析表明APS可下调EGFR和上调ANXA1蛋白的表达,这可能是APS体内抗乳腺癌的另一机制。本研究可为临床使用APS及其协助化疗药物发挥抗乳腺癌活性提供更多实验及理论依据。
张国培[3]（2018）在《ERCC1基因3’UTR可变剪接影响邻近重叠基因表达及其与肺癌对顺铂敏感性的关联研究》文中进行了进一步梳理目的:恶性肿瘤是一种世界范围内的公共卫生问题,而肺癌作为目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,已经严重危害人类的健康,因此寻找有效的预防标志物和治疗靶点,从而提高肺癌患者的生存率和生存质量具有重要的研究意义和实际应用价值。化学药物治疗是作为肿瘤患者术后辅助治疗的一种主要手段,针对肺癌患者的化疗主要是以铂类药物为基础,顺铂（cis-dichlorodiamine platinum,cisplatin,CDDP）是一种广泛应用在临床上的一线铂类药物,其主要作用靶点是肿瘤细胞的基因组DNA。尽管目前对肺癌的化学治疗取得了一定的进展,但是由于肿瘤细胞的耐药问题,顺铂类化疗药物的应用并未使肺癌患者的5年生存率得到明显提高。DNA损伤修复功能是影响细胞对顺铂产生耐药性的主要机制之一,DNA损伤修复功能异常的增强会使肿瘤细胞对化疗药产生拮抗,甚至导致化疗失败。DNA损伤修复系统会对受损伤的DNA进行修复,在保持细胞基因组稳定性中发挥关键作用。核苷酸切除修复系统（nucleotide excision repair,NER）是最重要而灵活的一种与耐药相关的DNA损伤修复机制,对顺铂等铂类药物引起的铂-DNA加合物发挥主要的切除修复作用。切除修复交叉互补基因1（excision repair cross-complementation group 1,ERCC1）是一种高度保守的核酸内切酶,在NER中起到限速和调解的重要作用。ERCC1常常在肿瘤易感和治疗的不同阶段被作为关键分子标志用于预测肿瘤的发生风险及预后结局。以往研究表明ERCC1基因的表达水平在肺癌中对于以顺铂为基础的术后辅助化疗具有预测疗效和生存率的潜在价值。然而,尽管已经获得ERCC1作为生物标志预测顺铂治疗肺癌预后效果的直接或间接证据,但众多研究结论尚未得到统一,相关机制有待阐明。mRNA的选择性剪接（Alternative Splicing,AS）作为真核生物转录组和蛋白质组多样性的主要来源,在细胞分化、发育等过程中发挥重要的基因表达调控作用。同一个基因在不同细胞和组织具有不同的可变剪接模式。选择性剪接的可塑性常常被癌细胞利用,从而产生促进癌细胞存活、增殖、转移和耐药性的亚型。在人类肿瘤细胞基因剪接异构体的表达与肿瘤进展相关。在肺癌组织和细胞系中,ERCC1不同的剪接异构体会同时表达,因此鉴别各个亚型与铂-DNA加合物修复相关的功能显得尤为重要。剪接异构体ERCC1-202与ERCC1-208具有相同的CDS区,其翻译的297aa蛋白质产物是唯一具有DNA损伤切除修复功能,不同的是ERCC1-202具有全长3’UTR。3’UTR是基因的重要功能元件,在基因表达调控中发挥重要作用,而其一级结构或二级结构的改变可以影响一个或多个基因的表达。全基因组关联研究GWAS及经典流行病学调查研究发现人染色体l9q13与肿瘤遗传易感及预后治疗相关,这一区域突变可以影响细胞的修复、增殖和凋亡,与肿瘤的发生发展及预后转归相关。ERCC1、CD3EAP、PPP1R13L共同位于人染色体l9q13,其中ERCC1参与细胞对环境致癌因子所致DNA加合物的核苷酸切除修复系统。CD3EAP是RNA聚合酶I的亚单位,参与细胞增殖。PPP1R13L是确切的TP53抑制剂,对T P53介导的细胞凋亡具有重要调控作用。ERCC1-202的3’UTR末端位于PPP1R13L同一链上游,距离不足1KB,同时,CD3EAP位于互补链。ERCC1-202与CD3EAP的3’端重叠,CD3EAP与PPP1R13L在各自5’端的转录起始位置相互重叠,形成反向重叠基因构象。这一区域基因独特的空间关系及其鲜明的功能特点在对外界基因毒有害因子刺激下细胞的命运转归可能具有重要的意义。与以往研究3’UTR对基因转录后调控机制的影响不同,本研究通过生物信息学和实验验证相结合的方法,着重研究ERCC1基因3’UTR在转录水平上对邻近基因表达的影响。探索肺癌中ERCC1基因可变剪接所致的个体差异与顺铂耐药之间的关联。肺癌细胞的顺铂耐药机制是由多种通路共同参与的,任何一种机制都不可能充分地解释耐药发生的全过程。目前临床应用中ERCC1还不足以作为预测化疗疗效和预后生存率的有效生物标志物,因此,有必要对肺癌的顺铂耐药机制做进一步的深入研究,为ERCC1这一生物标志物的精确应用给出新的提示线索。方法:1、首先本研究从2017年8月至2017年12月共收集来自辽宁省肿瘤医院初次确诊为肺癌患者的病例20例,术中采集候选NSCLC患者的癌组织及其癌旁组织,进行肿瘤细胞的原代培养,应用MTT法进行顺铂药敏实验;同时提取癌组织及癌旁组织中的总RNA,通过实时定量PCR检测ERCC1mRNA总体表达量和ERCC1-202 mRNA的表达量,分析ERCC1 3’UTR可变剪接与顺铂敏感性之间的关联。其次,构建两种ERCC1可变剪接异构体ERCC1-202与ERCC1-208的过表达载体,转染肺腺癌细胞A549和工具细胞293T,构建转染细胞系,Western blotting检测3’UTR可变剪接对ERCC1自身蛋白质表达的影响,CCK8细胞抑制率实验、γH2AX免疫荧光实验比较可变剪接异构体ERCC1-202与ERCC1-208对顺铂所致DNA损伤修复中的功能差异。2、生物信息学数据库提供了丰富的癌症数据资源,本研究利用多种生物信息数据库对ERCC1、CD3EAP和PPP1R13L基因重叠区域进行特征性结构分析和表观遗传学调控模式分析,预测双向启动子所在的基因组区域,通过构建双向启动子验证质粒转染293T细胞进行验证。同时获取TCGA癌症基因组数据库和GEO数据库中肺癌相关的转录本表达数据,分析ERCC1、CD3EAP和PPP1R13L基因表达的相关关系,加深对ERCC1-202的转录过程与下游重叠基因转录调控网络相互作用的理解,进而为研究顺铂耐药的生物学机制提供线索。3、应用顺铂处理16HBE、A549及LK2建立DNA损伤细胞模型,利用Affymetrix全转录芯片检测不同细胞系在给予顺铂处理24h后,ERCC1、CD3EAP和PPP1R13L基因转录本的变化。在分析全转录本芯片数据的基础上,利用3’RACE与Real time-PCR相结合的方法对ERCC1、CD3EAP和PPP1R13L基因3’端长度和表达量进行检测。结果:1、肺癌组织样本顺铂药敏实验分析表明,ERCC1-202的mRNA在癌旁组织中高表达,在肿瘤组织中低表达;并与顺铂敏感性(IC50)具有较强的正相关关系（P<0.05）。提示ERCC1基因的3’UTR可变剪接在DNA修复所致的顺铂药物敏感性个体差异中具有重要的作用。通过构建有无ERCC13’UTR两种剪接异构体的过表达质粒,分别转染靶细胞A549和工具细胞HEK293T细胞,给予不同浓度顺铂处理后,两种过表达转染细胞的细胞存活率及DNA损伤修复没有显着的统计学差异,提示ERCC1基因3’UTR可变剪接可能对自身蛋白质功能没有影响。2、UCSC数据库对基因特征性结构分析显示,多个CpG岛位于ERCC1-202转录本的转录终止位点附近。CD3EAP和PPP1R13L重叠区域CpG岛附近存在H3K27乙酰化和H3K4三甲基化峰,而这通常是代表转录活性调控元件,有利于DNA解开双螺旋。这表明CD3EAP和PPP1R13L基因重叠区域是一个转录激活结构域,可能受到双向启动子的转录调控。DBTSS数据库分析显示,CD3EAP基因与PPP1R113L基因在多种组织和细胞系中有双向转录起始信号。支持CD3EAP与PPP1R113L基因间的双向启动子假设。下载GEO数据库肺癌相关分析的芯片数据,分离出ERCC1基因不同探针集的表达信号,与下游CD3EAP和PPP1R13L的3’端探针集的表达进行相关性分析。结果显示ERCC1-202与PPP1R13L的3’端表达量在多个数据集中正相关。ERCC1-202与CD3EAP的3’端在鳞癌中显着正相关。CD3EAP的3’端与PPP1R13L的3’端显着正相关,并在鳞癌中相关性最强,提示存在双向转录。利用R3.3.3下载TCGA数据库测序数据在肺癌肿瘤组织和癌旁组织中准确描绘ERCC1、CD3EAP和PPP1R13L差异表达的外显子。结果显示ERCC1的第11外显子在肺癌组织和癌旁组织之间存在显着差异表达,肺癌组织中的ERCC1-208表达量较高。基因水平的转录相关分析表明CD3EAP与PPP1R13L基因表达在癌旁组织和肿瘤组织中均显着正相关。而ERCC1与CD3EAP只在肿瘤组织中显着正相关。外显子水平的转录相关分析表明,CD3EAP基因第一外显子与PPP1R13L第一外显子表达显着正相关。进一步说明CD3EAP与PPP1R13L基因之间可能存在双向启动子的转录激活区域。将CD3EAP与PPP1R13L重叠区双向启动子预测位点附近序列构建体外表达载体,进行双向启动子验证,结果可见双向荧光蛋白表达。研究表明共表达基因之间往往也存在蛋白质层面的功能相关,STRING蛋白质相互作用网络的生物信息学分析表明,CD3EAP和ERCC1可以与TBP直接结合,PPP1R13L也通过SP1的间接作用与转录起始复合物结合。ERCC1、CD3EAP、PPP1R13L各自具有鲜明的功能特点,参与不同细胞通路,但在转录起始过程中却又功能相关,这提示三个重叠基因可能共同参与了某种细胞通路来发挥功能。3、经顺铂处理16HBE、A549及LK2细胞建立DNA损伤的细胞模型,发现A549与16HBE细胞对顺铂敏感性不同,并且细胞死亡方式也有较大差异。利用Affymetrix全转录芯片检测不同细胞系在给予顺铂处理后,ERCC1、CD3EAP和PPP1R13L基因转录本的变化。结果表明A549中ERCC1-208表达量升高,而16HBE细胞中ERCC1-202的表达量升高,并存在CD3EAP与PPP1R13L第一外显子表达量的共同升高。尽管芯片数据具有非常高的参考价值,但更清晰的基因3’UTR数据通常需要通过RACE方法得到。在本研究中,我们在分析全转录本芯片数据的基础上,利用3’RACE与Real time-PCR结合的方法对ERCC1、CD3EAP和PPP1R13L基因的3’UTR的长度和表达量进行了精确测定。ERCC1-202的3’末端与CD3EAP和PPP1R13L基因的3’末端在给予顺铂处理后表达量共同升高,结果提示ERCC1-202引起下游重叠基因共表达的模式可能影响细胞的死亡方式和对顺铂的敏感性。结论:1、肺癌临床标本分子特征分析提示包含3’UTR的ERCC1可变剪接体ERCC1-202在癌旁组织中高表达,并与顺铂敏感性相关联,表达越高,敏感性越差。但体外转染试验提示ERCC1基因3’UTR对自身蛋白质功能没有影响。2、ERCC1的下游重叠基因CD3EAP与PPP1R13L呈分离型重叠模式,通过共用双向启动子相互促进转录,在转录水平呈显着相关性。CD3EAP与PPP1R13L基因之间存在具有双向启动子功能的转录激活区域。3、ERCC1-202可变剪接体的表达可以激活下游双向启动子,使重叠基因CD3EAP与PPP1R13L通过共转录的模式影响细胞对顺铂的敏感性。转录过程存在时空特异性,ERCC1-202表达会在转录水平对下游基因的转录产生影响,甚至起到转录开关的作用,将三个基因的转录过程连接成为一个由特殊的空间关系产生的整体表达模式,实现基因各自所在功能网络的协作。4、研究ERCC1、CD3EAP、PPP1R13L重叠基因的转录调控模式,对于阐明细胞在顺铂所致DNA损伤后不同的命运转归这种复杂调控机制是至关重要的。共享表观遗传修饰或许是基因共表达模式的一个潜在的机制,这种转录调控模式可能被用作肺癌生物标记,用于预测肺癌患者对铂类化学治疗的反应。在攻读博士学位期间,除了上述对ERCC1基因3’UTR可变剪接及其对下游重叠基因表达影响的系统研究之外,还对ERCC1基因5’端的反向重叠基因FOSB做了初步的探索性分析,以期评价其可变剪接的特征及差异表达作为非小细胞肺癌生物标志的可能性。故在本文的第四部分记录了这部分工作内容。首先进行生物信息学研究:应用TCGA数据库,对FOSB与ERCC1基因表达量之间进行相关分析;比较非小细胞肺癌组织及癌旁组织之间FOSB的差异表达及其对肺癌患者预后生存率的影响;其次进行实验研究:收集肺癌病例的临床标本,检测癌组织和癌旁组织FOSB基因mRNA和蛋白表达。结果表明,FOSB基因的mRNA表达水平在癌旁组织中显着高于癌组织,FOSB基因mRNA的表达在预测肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌（LUSC）患者生存率中具有不同的意义,FOSB在LUAD表达越高提示预后生存期越长,而在LUSC中则相反,差异具有统计学意义（P<0.05）。FOSB基因第二外显子存在多种可变剪接形式。FOSB基因mRNA与其蛋白表达不一致。初步分析表明FOSB基因可能在肺癌的发生和发展中具有重要作用,具有作为肺癌生物标志物或治疗靶标的潜在价值,但深入机制研究尚需进一步证实。
陆艳荣[4]（2017）在《HIF-1α通过调控与血管生成相关基因对食管癌组织血管生成及食管癌细胞放射敏感性的影响研究》文中指出目的:本研究拟探讨HIF-1α及其调控的血管生成相关基因对食管癌组织血管生成及预后的影响;同时探讨其对食管癌Eca109细胞放射敏感性的影响,并观察加用HIF-1α抑制剂2ME2后对食管癌Eca109细胞放射敏感性的影响。方法:1、收集共6例食管癌及癌旁组织标本,使用基因芯片技术检测食管癌（n=3）和癌旁组织（n=3）的m RNA表达,通过在线软件DAVID对差异基因进行基因本体论和信号通路富集分析,从中筛选与血管生成相关的差异表达基因,再通过q RT-PCR验证基因芯片数据。2、采用免疫组化SP法,研究的对象为2011年1月至2015年6月到新疆医科大学附属肿瘤医院接受治疗的70例食管癌患者和30例正常食管组织,检测其VEGF、HIF-1α以及AGGF1的表达,根据随访得到的资料以及临床病例特征进行研究分析。3、模拟食管癌细胞在体内的缺氧环境,在缺氧培养及缺氧合并照射以及2ME2干预情况下,分别用CCK-8观察细胞的增殖活性,RT-PCR方法检测HIF-1α、VEGF和AGGF1 m RNA的转录水平,Western blotting检测HIF-1α、VEGF和AGGF1蛋白表达情况,使用流式细胞仪检测细胞凋亡以及周期的变化规律,并用克隆形成试验观察食管癌细胞的放射敏感性变化。结果:1、与癌旁组织相比:1)食管癌显着差异表达基因共936个,其中上调的差异基因数目为306个,下调的差异基因数目为630个。2)基因本体论分析结果:差异表达基因的基因本体论富分析结果表明,细胞分裂、DNA修复,血管生成、细胞周期、DNA复制等为上调的差异表达基因生物学过程,肌肉收缩、血管收缩调控、信号传导、炎症反应等为下调的差异表达基因涉及的生物学过程。3)信号通路富集分析结果:上调基因Pathway主要富集于DNA复制、血管生成、Fanconi贫血通路、细胞周期等,下调基因Pathway富集于c GMP-PKG信号通路、血管平滑肌收缩、c AMP信号通路、MAPK信号通路等。2、70例食管鳞癌中AGGF1（χ2=8.129,P=0.004）、HIF-1α（χ2=21.212,P=0.000）和VEGF（χ2=4.116,P=0.042）的表达有所不同,从结果来看70位食管鳞癌患者中的AGGF1、HIF-1α、VEGF要明显高于正常食管组织。对于食管鳞患者而言,VEGF、HIF-1α和AGGF1的表达与分化程度、T分期、N分期、临床分期、放疗反应等均密切相关（P均<0.05）。食管鳞癌中的VEGF与AGGF1、HIF-1α的表达均呈现显着正相关,（r=0.333,P=0.003,r=0.290,P=0.015）。放疗近期疗效和VEGF、HIF-1α的表达均呈现显着负相关（r=-0.288、-0.241,P=0.016、0.044）。OS方面,HIF-1α阳性表达组要小于阴性组（P=0.022）。利用Cox多因素回归的方式进行分析,结果发现HIF-1α阳性表达（P=0.000）、浸润深度（P=0.049）和加用化疗（P=0.037）是食管鳞癌患者预后的影响因素。3、随着Co Cl2浓度的增加（0、50、100、150、200μmol/L）,Eca109细胞的增殖活性逐渐减慢（P<0.05）。缺氧可使G0/G1期阻滞,降低S期阻滞。缺氧处理24h及48h组的G0/G1及S期Eca109细胞比例与对照组及缺氧处理6h、12h组差异有统计学意义（P<0.05）。在缺氧状态下放疗+2ME2组中,Eca109存活细胞减少的更为明显,且各组比较差异均有统计学意义（P均<0.05）。2ME2+放疗组细胞凋亡明显多于单纯放疗组（P<0.05）。经过给予0.5m M和1m M的2ME2后,升高的HIF-1α、VEGF和AGGF1的m RNA表达均有所下降（P<0.001）。当缺氧24h时给予2ME2后,升高的HIF-1α、VEGF和AGGF1的蛋白表达均明显下降（P<0.001）。结论:1、1)与癌旁组织相比,一共有936个差异表达基因,上调差异基因和下调差异基因数目分别为306个和630个。2)与食管癌血管生成相关的差异表达基因有:WNT5A,VEGFC,CHRNA7,ANG,ECM1,VEGFA,HOXB13,AGGF1,HIF1A,VEGFB,HEY1,HIF3A,MMP27等,其中HIF3A,MMP27为下调的差异基因,其余均为上调的差异基因。3)部分差异表达基因经过q RT-PCR验证后与基因芯片数据分析结果一致。2、食管鳞癌组织中HIF-1α、AGGF1以及VEGF表达明显高于正常食管组织,且与食管癌临床分期、分化程度等相关,若三者均为高表达,可能不利于食管鳞癌患者的治疗与预后。为以HIF-1α,VEGF及AGGF1为靶点的食管鳞癌的靶向治疗提供新的思路和方法。3、1)Co Cl2诱导Eca109细胞缺氧后,使HIF-1α、VEGF和AGGF1m RNA、蛋白表达将随之增加,蛋白表达量与缺氧呈时间依赖性。2)放疗能够使食管癌Eca109细胞在缺氧条件下HIF-1α、VEGF及AGGF1 m RNA的表达降低。缺氧引起Eca109细胞出现G0/G1期阻滞可能与食管癌Eca109细胞对放射线的敏感性降低有关。3)HIF-1α抑制剂2ME2可在体外提高Eca109细胞放射敏感性。
周立江[5]（2016）在《肺积宁方对Lewis肺癌抗肿瘤作用及自噬效应的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:通过体外实验,研究肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞增殖和凋亡的影响,并检测与凋亡密切相关的自噬基因Beclin1、LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ、Atg5蛋白水平表达及RNA水平的影响,探讨肺积宁方的抗癌作用及其对自噬的关系;并通过体内实验,运用裸鼠lewis移植瘤模型,分析肺积宁方在体内代谢后抗癌效果,观察其对Lewis肺癌细胞形态学影响、对自噬相关基因Beclin1、LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ、Atg5蛋白表达的影响。最终通过体内体外实验,了解肺积宁方对Lewis肺癌细胞抗癌效果及其作用机制。材料与方法:体外实验:制备含药血清,作用于Lewis肺癌细胞。40只大鼠按随机数字表法分为肺积宁方高剂量组、肺积宁方大剂量组、肺积宁方中剂量组、肺积宁方低剂量组和对照组。各组动物分别给予高、大、中、低剂量组肺积宁方及等量生理盐水灌胃,每天1次,连续3天,第3天晚上禁食不禁水12h,次日断头取血;用铡刀断头取血,制备肺积宁方含药血清。MTT法检测肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞的增殖抑制效应,分为肺积宁方含药血清高剂量组、含药血清大剂量组、含药血清中剂量组、含药血清低剂量组和对照血清组。同时设置不加细胞的空白孔。分别加不同浓度肺积宁方含药血清及正常对照组含药血清,分别于培养24 h、48 h、72h收集细胞进行MTT检测,观察肺积宁方含药血清抑制Lewis肺癌细胞增殖的最佳药量和作用时间,筛选出最佳含药血清剂量组,进行后续实验;流式细胞术检测对照组,肺积宁方组,顺铂组,联合组作用48h,细胞凋亡率。GFP-LC3转染定位法检测各组细胞自噬情况:将Lewis细胞以6×105细胞/孔的密度接种于6孔板,分为4组,对照组每孔加入含20%对照组血清DMEM培养液、肺积宁方组为20%肺积宁方含药血清DMEM培养液、顺铂（1μg/ml）组、联合组（20%肺积宁方含药血清+顺铂1μg/ml）。将GFP-LC3转染后的Lewis肺癌细胞正常培养条件下培养24 h,对照组加对照血清、肺积宁方组加肺积宁方含药血清、顺铂组加顺铂、联合组加顺铂和肺积宁方含药血清。正常培养24h,荧光显微镜下观察,调整显微镜发射波长395nm,激发滤色镜的波长509nm,拍照,计数。免疫印迹法检测Beclin1蛋白、Atg5和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比例来判断自噬是否被诱导,对照组每孔加入含20%对照组血清DMEM培养液、肺积宁方组为20%肺积宁方含药血清DMEM培养液、顺铂组为顺铂（1μg/ml）组、联合组（20%肺积宁方含药血清+顺铂1μg/ml）,培养48h,收集细胞。免疫印迹的定量,用Bio-Rad提供的分析软件进行灰度分析。计算Beclin1、LC3B-I、LC3BII、Ag5和内参照β-actin比值,评价自噬情况。real time PCR检测Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5的m RNA表达。体内实验:建立裸鼠荷瘤模型,Lewis瘤株,液氮保存,于37℃,水浴中复苏,放入37℃、5%C02细胞培养箱中,台盼蓝染色观察记录活细胞数（>95%）,调整细胞浓度至1x107/m1的瘤细胞悬液,碘伏消毒,使用1ml注射器,在每只小鼠右腋窝皮下接种瘤细胞0.2ml,共接种50只。一般状态及自主活动次数观察:每日观察精神、饮食、活动、大小便等一般情况,每隔两日称小鼠体重,分别于用药前、d8、d17检测小鼠活动,于每天的同一时刻,小鼠自主活动测试仪测小鼠平行移动和站立次数,计算出每组裸鼠每分钟自主活动次数。实验结束,剥离瘤体,称瘤重及抑瘤率:抑瘤率=（对照组平均瘤重一实验组平均瘤重）/对照组平均瘤重x100%,肿瘤组织病理形态学观察,各组瘤组织,包埋,完成石蜡组织块制作,用显微镜观察染色结果:细胞核呈现鲜艳的蓝色,细胞质及细胞间质呈粉红至红色。透射电镜观察瘤组织细胞的自噬小体,将取下的瘤组织快速切成1mm3大小,固定,超薄（70nm）切片,铀、铅双重染色,电镜下观察瘤组织细胞中的自噬小体,照相、记录。Western blotting检测瘤组织中Beclin1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、Atg5的蛋白表达。结果:1.肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞增殖的影响肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞的增殖有显着抑制作用,同一时间随着浓度的增加或者同一种浓度随着时间的延长其抑瘤作用增强（P<0.01）。分别在24h,48h,72h检测对lewis细胞的抑制作用,结果发现和对照组相比,肺积宁方含药血清抑制Lewis细胞的增殖,且抑制效果随着浓度、时间的增加而增强。中剂量组抑制率在24h、48h时相抑制率分别为19±1.84%,24±1.93%,与对照组的15±1.08%,20±2.06%比较,均有统计学显着差异（P<0.05）,并且其抑制效果有随着浓度增加和时间延长而增强的趋势。大剂量组的抑制率分别为28±2.03%、32±2.04%,与中计量组比较有明显增加（P<0.05）。高剂量组在各个时相的抑制率与大剂量组比较,均无统计学意义。其最佳含药血清剂量组为大剂量组,进行后续实验。2.肺积宁方含药血清与顺铂联合对Lewis肺癌细胞增殖的抑制作用,肺积宁方组在不同作用时间,第24h、48h、72h抑制率分别为28%、32%、33%;顺铂组42%、66%、75%;联合组为58%、86%、91%。3.流式细胞仪检测流式细胞术检测对照组,肺积宁方组,顺铂组,联合组作用48h,细胞凋亡率,对照组、肺积宁方组、顺铂组及联合组对Lewsi肺癌细胞作用48h后的凋亡率分别为3.20%、10.36%、18.31%、30.18%,凋亡率以联合组作用为最高。与对照组比较,肺积宁方组促进凋亡作用明显,P<0.01;与顺铂组比,联合组明显提高了凋亡比例,统计学差异显着,P<0.01。处于G0/G1期,肺积宁方组处于此周期细胞较多比例为38.69%,顺铂组为56.12%,联合组最高,68.35%。4.自噬GFP-LC3转染及计数结果显示,对照组细胞中GFP-LC3融合蛋白弥散在包浆中,但代表自噬体的荧光斑点很少观察到;肺积宁方组有较为明显的绿色荧光聚集,可以观察到自噬体形成,荧光的强度比对照组明显高亮。经肺积宁方含药血清处理的,大多数细胞发生自噬（37.5%）,而对照组自噬率较低（17.6%）,具有显着差异,P<0.05。与顺铂组的自噬率（56.4%）相比,联合组的荧光斑点也明显增多,自噬发生率77.9%,并进行统计分析,两组差异明显,P<0.05。5.Western blotting检测Beclin1、LC3B-Ⅱ/LC3B-I、Atg5的变化免疫印迹法检测结果显示:肺积宁组较对照组Beclin1、Atg5蛋白表达显着增强,灰度值分别为Beclin1（0.38 VS 0.24）,Atg5（0.31 VS 0.18）。LC3B-Ⅱ/LC3B-I灰度值比值（0.52 VS 0.2）,差异显着,P<0.05。联合组与顺铂组比较,Beclin1（0.62 VS0.44）、Atg5（0.63 VS 0.41）也表达增强,LC3B-Ⅱ/LC3B-I灰度值比值上升（0.98 VS0.81）,均有显着差异（P<0.05）。6.real time PCR检测Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5的m RNA表达引物验证,各引物扩增曲线均正常,溶解曲线无杂峰,均单峰,平均溶解温度一致,具有特异性。real time PCR结果提示,肺积宁方组细胞中的Beclin1、LC3B-Ⅱ、Ag5的m RNA表达增强,与对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;联合组细胞的Beclin1、LC3B-Ⅱ、Ag5的m RNA表达也明显高于顺铂组,差异显着（<0.05）。7.裸鼠成瘤情况、一般状态;各组药物对肿瘤生长的影响各组裸鼠瘤体大小较为相似、均衡。在平均肿瘤体积长到100mm3时,给药。B组（肺积宁方低剂量组）和C组（高剂量组）体重增长较为稳定,高低剂量组相差不大,精神及活动保持较好;A组（对照组）早期体重变化不明显,d10开始略有下降;D组（顺铂组）在给药3天后体重下降明显,精神萎靡,活动差;E组体重下降,与D组相比较下降较缓,但比B组和C组明显,后期下降不明现,精神和活动状态较D组表现好。B组和C组（单用肺积宁方组）自主活动次数较A组活跃,B组和C组比较,差异不显着;E组与D组比较,自主活动次数明显有优势。8.肺积宁方对裸鼠Lewis移植肿瘤生长的影响:B组、C组、D组和E组的肿瘤重量均低于对照组,与对照组比较有显着差异（p=0.000﹤0.01）,B组瘤重较C组要轻,但差异不显着;其中E组的瘤重最轻,明显低于单独用药组（p﹤0.01）,D组的瘤重组低于B组和C组,有统计学差异（p=0.031﹤0.05）。B组、C组、D和E组的抑瘤率分别为33.7%、40.6%、56.6%、66.9%,说明肺积宁方对Lewis移植肿瘤的生长有抑制作用,并与顺铂有协同作用。9.各组裸鼠移植瘤HE染色结果:肉眼瘤组织,较为规整,剥离较容易。部分瘤体的外区域可见坏死。HE染色光镜下可见,A组肿瘤细胞大,排列较为杂乱,紧密,核大深染,核浆比例失衡,处于分裂象细胞较多;B组及C组,肿瘤细胞大小较稍规整,可见坏死细胞明显较多,异型性较少见;D组可见大量坏死,可见少量纤维组织;E组坏死细胞大量出现,肿瘤细胞较小,分裂象比较少见,且周围有大量的淋巴细胞,白细胞浸润。10.各组裸鼠移植瘤电镜透视观察自噬小体各组均可见双层膜包裹的自噬体,可见典型的凋亡小体,其由膜包绕,小体内可见核的残片及细胞器。其中B组和C组可见较多散在的自噬体,D组也可见胞质内大量空泡,E组最为多见。依次增多:A组、B组、C组、D组、E组。11.Westen blot检测瘤组织中自噬相关蛋白Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5表达水平。采用Western blot蛋白免疫印迹法,检测各组裸鼠抑制瘤组织中自噬相关基因Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5的蛋白表达水平。Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5蛋白相对灰度值,B组分别为0.63、0.46、0.82,和C组的0.65、0.48、1.0比较无差异,P>0.05;B、C两组与A组0.42、0.38、0.43比较,显着增高,P<0.05;Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5蛋白相对灰度值在E组的统计值0.80、0.78、1.3,显着高于D组0.78、0.62、1.0,P<0.05。结论:1.肺积宁方含药血清能抑制Lewis肺癌细胞增殖,并能促进其凋亡。2.肺积宁方含药血清诱导Lewis肺癌细胞自噬,增强Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5蛋白和m RNA水平的表达,提高LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比例。3.肺积宁方能改善荷瘤裸鼠的一般状态、增加自主活动次数,抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长。4.肺积宁方上调荷瘤裸鼠瘤组织中Beclin1、LC3BB-Ⅱ、Atg5蛋白的表达,提高LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比例。5.肺积宁方具有抑制肿瘤作用,可能与诱导自噬有关。
范开席,汪梅荣,杨锡贵,张维东,申洪明[6]（2010）在《老年胃癌患者中BNIP3L基因的表达及其与预后的关系》文中研究指明 BNIP3L基因是促凋亡家族的成员,它表达的蛋白能促进细胞凋亡。早期的研究认为它是肺癌的抑癌基因,之后发现在其他恶性肿瘤中也有表达,且与肿瘤的生物学行为有关,但在胃癌方面的研究极少。为此,我们收集了117例胃癌标本,应用免疫组化方法检测BNIP3L的表达,寻找它的表达规律,分析它与胃癌临床病理指标和生存期的关
王焕岭[7]（2006）在《从猪胚胎骨骼肌cDNA文库中分离、定位新基因并分析部分基因的功能》文中研究指明随着猪基因组研究工作的不断深入，许多与猪生产性状（生长、胴体与肉质性状）相关的新基因被证实。但相对猪整个基因组来说，仍然还有大量基因没有发现。而猪胚胎期形成的肌纤维数目与猪日增重及生长速度呈正相关，是动物产肉量的重要决定因素。因此，从猪胚胎cDNA文库中分离证实与猪生产性状相关的基因，必将会为分子育种实践提供重要的指导作用。本文从猪55天胚胎骨骼肌cDNA文库中筛选出15个功能基因，通过功能分析选出CA3和HUMMLC2B基因作进一步研究，并取得了如下结果：1．通过猪55天胚胎骨骼肌cDNA文库测序并结合猪EST数据库的信息分离出15个猪基因，即K-ALPHA-1、TUBB、MAPRE1、TUBA3、ATP6VOE、RPL6、RPL7、RPL10、HUMMLC2B、BNIP3L、NHP2L1、CA3、CCNT2、PC4和FLJ30294，并分析其cDNA及预测的蛋白质序列（CCNT2和FLJ30294除外）。2．在猪×仓鼠辐射杂种板中对上述所分离的基因进行染色体定位（HUMMLC2B除外），定位结果如下：K-ALPHA-1定位于SSC5p，TUBB定位于SSC7p11，TUBA3定位于SSC5p11-p15，MAPRE1定位于SSC17q21-23，RPL6定位于SSC14q22-24，RPL7定位于SSC4q11-14，RPL10定位于SSCXq26，ATP6VOE定位于SSC16q，BNIP3L定位于SSC14q21-22，CCNT2定位于SSC15q12-14，NHP2L1定位于SSC5p12-15，FLJ30294定位于SSC3q11-14，PC4定位于SSC16q11-14，CA3定位于SSC4q11-q14，同时用猪×啮齿类体细胞杂种板对CA3基因进行了区域定位（SSC4q11-q14）。3．对于CA3基因，通过猪cDNA文库测序和猪ESTs序列拼接分别获得了两个长短不同的cDNA序列，命为CA3b和CA3a，序列分析显示CA3b与CA3a之间存在一gap，预测的蛋白质显示CA3b缺少CA3a的C末端（78aa）。并且荧光共聚焦显微镜的观察结果显示GFP融合的CA3a蛋白位于整个细胞中，而CA3b仅位于细胞质中。4．获得了猪CA3和HUMMLC2B基因的全长基因组DNA序列，并分析了其基因组结构。结果显示CA3基因是由7个外显子和6内含子组成（相对CA3a的cDNA序列），约10.5kb。HUMMLC2B基因是由7个外显子和6个内含子组成，约2.9kb，包含多个重复序列。两个基因所有内含子和外显子的拼接位点都符合GT-AG规则。5．为了研究猪候选基因在骨骼肌发育中可能的作用，应用实时荧光定量PCR技术对候选基因进行了时空表达谱分析。结果显示，CA3基因在通城猪胚胎33天骨骼肌中表达量最低，65天达到最高，然后下降到一定程度并和出生后的表达量保持相对稳定的水平。而在大白猪胚胎骨骼肌中的表达模式和通城猪不同，即在33天表达量最低，但在65天和90天表达量没有明显差异。组织表达谱显示CA3在骨骼肌和肝脏中表达量最高，在肺脏、淋巴结、胃、大肠和小肠中表达量较低，而在心脏和脾脏中没有检测到表达。6．而HUMMLC2B基因在通城猪胚胎骨骼肌中的表达模式和长白猪相似（胚胎33天、65天、90天），但在通城猪出生后随年龄的增加其表达量不断降低（出生后2天、28天和成年）。组织表达谱分析显示HUMMLC2B基因仅在所有被检测的骨骼肌中表达，并且表达量较高，而其它组织中除脂肪中有极少量的表达外，都没有检测到表达。7．亚细胞定位结果显示GFP融合的HUMMLC2B蛋白位于整个细胞中。8．SNPs的检测结果证实CA3基因有两个可用于PCR-RFLP的SNPs位点，即BsuRI-PCR和Hinfl-PCR，分别位于第五和第六内含子中。而HUMMLC2B基因有23个潜在的SNPs，其中可用于PCR-RFLP的四个SNPs位点，即HinlI-PCR（两个），MspI-PCR和BglI-PCR，分别位于第三内含子，第四外显子和第五内含子中（MspI-PCR和BglI-PCR位点）；另外四个SNPs位点用DHPLC技术检测，两个SNPs位于第六内含子中，两个SNPs位于第七外显子中。9．对上述PCR—RFLP多态位点在五指山猪、香猪、巴马香猪三个小型猪品种以及莱芜猪、通城猪、大白猪、长白猪和杜洛克中分析基因型和等位基因频率以及各等位基因在不同猪品种中的分布差异。10．在我室与通城县畜牧局合作组建的试验群体中（三个纯繁群：通城猪、大白和长白猪及两个三元杂交群：长大通和大长通），分析猪CA3和HUMMLC2B基因的多态与部分经济性状的关联。结果显示：①对于CA3基因，G8603A位点多态与肌内脂肪含量呈极显着相关（P＜0.01），且与腿臀比率呈显着相关（P＜0.05）；G8371A位点GG基因型个体与GA基因型个体间大理石纹和肌内脂肪含量差异极显着（P＜0.01），而与三点平均背膘厚差异显着（P＜0.05）。②对于HUMMLC2B基因，G1094A和T1513C位点没有检测到与性状的关联；G1876A位点GG基因型个体和GA基因型个体间屠宰率和肉色差异显着（P＜0.05）；T2005G位点GG基因型个体与TG基因型个体肉色差异显着（P＜0.05），且TT基因型个体和TG基因型个体间红细胞数（RBC）、红细胞压积（HCT）、红细胞分布密度（RDW）差异显着（P＜0.05）。
梁晓华[8]（2006）在《Bnip3L与Bcl-2在非小细胞肺癌中的表达》文中提出Bnip3L（Bcl-2/E1B19kDa-interacting protein 3-like）基因是从人胎肝cDNA文库中克隆的具有抑瘤活性的新基因，定位于8p21肺癌高频杂合性丢失（loss of heterozygosity，LOH）区，属于Bcl-2家族中的BH3-only促凋亡家族成员，能与Bcl-2、Bcl-XL、E1B19K等抗凋亡蛋白相互作用，促进细胞凋亡。近期新的研究表明Bnip3L与p53在肿瘤生长过程中缺氧条件下的抑瘤作用有密切关系，可能为肿瘤的治疗提供一个新的突破点。本研究的目的是探讨Bnip3L与Bcl-2在人非小细胞肺癌中的表达及其与患者预后的关系。 目的：检测Bnip3L与Bcl-2在人非小细胞肺癌中的表达，并研究其与肺癌生物学特点及预后的关系。 方法：利用免疫组化组织芯片技术对128例非小细胞肺癌标本和64例非瘤性肺部疾病患者手术标本中的Bnip3L和Bcl-2进行检测，并对Bnip3L、Bcl-2的表达情况与临床病理特点、患者生存时间等关系进行回顾性队列研究。
吴汉林[9]（2005）在《人NIT1基因cDNA的克隆、原核表达及抗体制备》文中认为背景与目的:肺癌是当今世界上发病率和死亡率增长最快,对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤。近半个世纪来,世界上许多国家和地区肺癌的发病率和死亡率都明显增加,在我国绝大多数地区肺癌已占恶性肿瘤发病率和死亡率的首位。因此,研究肺癌癌变机理,探索肺癌发生的早期分子事件,就成了国内外肺癌工作者的研究重心和前沿课题之一。恶性肿瘤细胞最基本的特征是持续地无限制增殖和凋亡受抑制,而原癌基因的异常激活和抑癌基因的失活被认为是肿瘤发生的重要分子基础。FHIT基因现已证明是一个很重要的抑癌基因,它可以抑制肿瘤细胞的生长,促进肿瘤细胞的凋亡。FHIT基因异常可能是导致肺癌发生的一个重要早期分子事件。因此,研究和阐明FHIT基因在肺癌发生发展中的作用,一方面可以揭示肺癌细胞中FHIT基因细胞信号传导的调控机理,同时也可为开发抗肿瘤靶向药物和肺癌基因治疗提供理论基础和实验依据。以周清华教授为首的课题组长期以来从FHIT基因的DNA、RNA到蛋白水平进行了较系统和深入的研究,证明FHIT基因在肺癌的发生发展中起着重要的作用,
付军科[10]（2004）在《nm23-H1基因对肺癌细胞Wnt信号通路调控机制的实验研究》文中研究说明肺癌的侵袭和转移是肺癌的恶性标志和特征,也是导致肺癌患者治疗失败和死亡的主要原因。肺癌的侵袭和转移是一个多因素作用、多基因参与、涉及细胞多个信号通路改变,并经过多个阶段才最终形成的复杂生物现象。因此,探讨肺癌侵袭转移相关细胞信号传导通路的变化,不仅有助于揭示肺癌侵袭转移的分子机制,而且将为阻断肺癌侵袭转移的信号传导和逆转肺癌侵袭转移表型提供新的靶点和途径。已经证明肿瘤转移抑制基因nm23-H1的低表达和杂合性缺失与肺癌的高转移性和预后不良有密切关系,并在调控“肺癌转移抑制级联”中发挥上游关键基因的作用。在nm23-H1基因缺失的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中转染野生型nm23-H1基因后,nm23-H1可通过调控“肺癌转移抑制级联”中多个转移相关基因的表达,逆转肺癌细胞的转移表型。Nm23-H1基因对“肺癌转移抑制级联”的调控作用可能是通过细胞中一些关键的信号传导通路来实现的。近年来的研究发现,Wnt信号通路的异常与肿瘤发生和侵袭转移有密切关系。为了探讨nm23-H1基因在“肺癌转移抑制级联”中对Wnt信号传导通路的调控作用及其分子机制,本研究在已经筛
二、BNIP3L基因在肺癌组织中的表达及结构分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、BNIP3L基因在肺癌组织中的表达及结构分析（论文提纲范文）
（1）FAM136A表达与肺癌预后相关性及其生物学功能研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分、区域高发肺癌差异表达基因的筛选及生物信息学分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.2.1 差异基因的GO富集分析与KEGG富集分析 |
| 1.1.2.2 蛋白互作网络结构分析及核心基因(Hub gene)筛选 |
| 1.1.2.3 核心基因的生存分析预测 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 差异基因的GO富集分析与KEGG富集分析 |
| 1.2.2 蛋白互作网络/PPI结构分析 |
| 1.2.3 核心基因(Hub genes)筛选分析 |
| 1.2.4 核心基因相关的生存期预测 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: FAM136A组织表达水平与患者生存预后之间的相关性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.1.1 临床标本资料收集 |
| 2.1.1.2 患者资料收集 |
| 2.1.1.3 主要试剂 |
| 2.1.1.4 实验仪器 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.2.1 免疫组织化学染色(IHC)方法 |
| 2.1.2.2 免疫组织化学染色评价标准 |
| 2.1.2.3 临床分期标准 |
| 2.1.2.4 统计方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 FAM136A在组织样本中的表达 |
| 2.2.2 FAM136A中的组织表达与临床病理参数之间的相关性 |
| 2.2.3 FAM136A表达状态与患者总生存期间的关系 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分: FAM136A对肺癌细胞相关生物学功能影响的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 细胞复苏 |
| 3.1.4 细胞培养 |
| 3.1.5 细胞传代 |
| 3.1.6 细胞冻存 |
| 3.1.7 细胞转染 |
| 3.1.8 慢病毒感染A549和PC-9细胞 |
| 3.1.9 CCK-8(细胞增殖)检测 |
| 3.1.10 细胞woundhealing实验 |
| 3.1.11 细胞克隆形成实验 |
| 3.1.12 细胞凋亡检测 |
| 3.1.13 透射电镜检测 |
| 3.1.14 流式细胞周期分布检测 |
| 3.1.15 细胞ATP浓度测定 |
| 3.1.16 LDH释放检测 |
| 3.1.17. 细胞总蛋白提取 |
| 3.1.18 Western blot检测蛋白表达步骤 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 FAM136A在肺癌细胞系及转化人支气管上皮细胞中的表达情况 |
| 3.2.2 SiRNA-FAM136A转染A549、PC-9敲减FAM136A后,其蛋白水平变化 |
| 3.2.3 感染慢病毒LV-shFAM136A后A549、PC-9细胞增殖活性的变化 |
| 3.2.4 感染慢病毒LV-shFAM136A后A549、PC-9肿瘤球形成能力检测 |
| 3.2.5 感染慢病毒LV-shFAM136A后A549、PC-9细胞迁移能力的变化 |
| 3.2.6 感染慢病毒LV-shFAM136A后A549、PC-9细胞凋亡水平的变化 |
| 3.2.7 感染慢病毒LV-shFAM136A后A549、PC-9细胞周期分布的变化 |
| 3.2.8 感染慢病毒LV-shFAM136A后A549、PC-9细胞ATP释放水平的变化 |
| 3.2.9 感染慢病毒LV-shFAM136A后A549、PC-9细胞LDH释放水平的变化 |
| 3.2.10 感染慢病毒LV-shFAM136A后A549、PC-9细胞自噬状态的改变 |
| 3.2.11 感染慢病毒LV-shFAM136A后A549细胞内主要细胞周期信号蛋白表达水平的变化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分、观察感染慢病毒LV-shFAM136A后肺癌细胞在裸鼠体内移植瘤形成能力的动物学实验 |
| 4.1. 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.1.1 实验细胞与裸鼠 |
| 4.1.1.2 仪器设备 |
| 4.1.1.3 试剂耗材 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.2.1 细胞扩大培养及病毒转染 |
| 4.1.2.2 裸鼠皮下移植瘤模型构建 |
| 4.1.2.3 裸鼠体重测量 |
| 4.1.2.4 瘤体积测量 |
| 4.1.2.5 取材及样本存储 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 裸鼠及其肺癌细胞移植瘤 |
| 4.2.2 瘤体体积统计 |
| 4.2.3 瘤体质量测定结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 全文总结 |
| 文献综述 FAM136A生物学信息及与肿瘤概述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 主持及参加科研项目 |
| 致谢 |
（2）基于衍生基质/复合支架的肿瘤模型构建和黄芪多糖抗乳腺癌活性及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 附录 英文缩略词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景和意义 |
| 1.2 多糖抗肿瘤研究进展 |
| 1.2.1 多糖结构与抗肿瘤的关系 |
| 1.2.2 多糖抗肿瘤机制 |
| 1.3 APS的生物活性研究 |
| 1.3.1 APS的结构及组成 |
| 1.3.2 APS的抗肿瘤活性 |
| 1.3.3 APS的其他活性 |
| 1.4 肿瘤模型 |
| 1.4.1 肿瘤模型种类 |
| 1.4.2 3D培养及其优势 |
| 1.4.3 3D肿瘤模型分类 |
| 1.5 基于生物信息学的功能富集及关键基因分析 |
| 1.5.1 生物信息学和基因表达数据库 |
| 1.5.2 差异表达基因的分析 |
| 1.5.3 功能富集分析 |
| 1.5.4 蛋白的相互作用及关键基因分析 |
| 1.6 本文选题依据及主要研究思路 |
| 2 APS的结构和组分分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 实验药品 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 APS理化性质及结构分析 |
| 2.3.1 多糖含量的测定 |
| 2.3.2 糖醛酸含量测定 |
| 2.3.3 UV分析 |
| 2.3.4 FTIR分析 |
| 2.3.5 NMR分析 |
| 2.3.6 场发射扫描电镜分析 |
| 2.3.7 HPLC分析 |
| 2.3.8 统计学分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 APS的多糖和糖醛酸含量 |
| 2.4.2 APS的纯度 |
| 2.4.3 APS的结构特征 |
| 2.4.4 APS的糖苷键构型 |
| 2.4.5 APS的微观结构及元素组成 |
| 2.4.6 APS的单糖组成 |
| 2.5 小结 |
| 3 APS介导巨噬细胞激活及其体外抗乳腺癌活性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 药品与试剂 |
| 3.2.2 实验仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 试剂配制 |
| 3.3.2 巨噬细胞和乳腺癌细胞的培养 |
| 3.3.3 APS对乳腺癌细胞株的作用 |
| 3.3.4 APS对巨噬细胞的免疫调节活性 |
| 3.3.5 CM对乳腺癌细胞毒作用的评价 |
| 3.3.6 统计学分析 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 APS对MCF-7和4T1无细胞毒性 |
| 3.4.2 APS介导巨噬细胞激活 |
| 3.4.3 CM抑制MCF-7和4T1细胞的增殖 |
| 3.4.4 CM诱导细胞周期阻滞 |
| 3.4.5 CM促进细胞凋亡 |
| 3.4.6 CM通过线粒体通路介导乳腺癌细胞凋亡 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 体外3D肿瘤模型的构建及CM对3D培养MCF-7细胞的抑制作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 药品与试剂 |
| 4.2.2 实验仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 试剂配制 |
| 4.3.2 脱细胞猪肺支架制备及脱细胞效率 |
| 4.3.3 脱细胞猪肺支架的物理性能检测 |
| 4.3.4 脱细胞猪肺支架的生物相容性 |
| 4.3.5 乳腺癌特定标志物的表达 |
| 4.3.6 CM对3D肿瘤细胞毒性作用的评估 |
| 4.3.7 统计学分析 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 脱细胞效率 |
| 4.4.2 交联前后脱细胞猪肺支架的物理性能 |
| 4.4.3 脱细胞猪肺衍生支架良好的生物相容性 |
| 4.4.4 3D脱细胞猪肺培养上调MCF-7乳腺癌特定蛋白的表达 |
| 4.4.5 CM抑制3D环境中MCF-7细胞的生长 |
| 4.4.6 CM促进3D培养MCF-7细胞的凋亡 |
| 4.4.7 CM上调Bax/Bcl-2比例 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 三种不同来源支架构建的肿瘤模型的评估及比较 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 药品与试剂 |
| 5.2.2 实验仪器与设备 |
| 5.2.3 实验动物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 试剂配制 |
| 5.3.2 三种材料的制备及微观形貌 |
| 5.3.3 细胞活性分析 |
| 5.3.4 乳腺癌特定标志物蛋白表达 |
| 5.3.5 体内局部组织反应 |
| 5.3.6 2D及3D培养的细胞对化疗药物的敏感性检测 |
| 5.3.7 统计学分析 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 三种支架的微观结构及元素组成 |
| 5.4.2 三种支架良好的生物相容性 |
| 5.4.3 3D培养提高乳腺癌特定蛋白表达 |
| 5.4.4 4T1细胞在3D支架不同的生长模式 |
| 5.4.5 3D培养促进小鼠体内致瘤性和血管形成 |
| 5.4.6 3D培养降低MCF-7细胞对5-FU的敏感性 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 APS体内抗乳腺癌作用及机制 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验试剂和设备 |
| 6.2.1 实验试剂 |
| 6.2.2 实验仪器 |
| 6.2.3 实验动物 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 试剂配制 |
| 6.3.2 小鼠乳腺癌模型的建立 |
| 6.3.3 小鼠分组及给药 |
| 6.3.4 体重及脏器指数测定 |
| 6.3.5 小鼠肿瘤及免疫组织病理切片观察 |
| 6.3.6 小鼠巨噬细胞中性红吞噬实验 |
| 6.3.7 小鼠淋巴细胞的制备及增殖 |
| 6.3.8 APS对淋巴细胞分泌细胞因子的影响 |
| 6.3.9 肿瘤组织中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表达 |
| 6.3.10 数据统计 |
| 6.4 实验结果与讨论 |
| 6.4.1 APS抑制小鼠体内肿瘤的生长 |
| 6.4.2 APS提高小鼠体重和免疫器官指数 |
| 6.4.3 APS对小鼠肿瘤组织病理形态的影响 |
| 6.4.4 APS改善小鼠胸腺和脾脏组织结构 |
| 6.4.5 APS提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力 |
| 6.4.6 APS促进小鼠脾淋巴细胞的增殖 |
| 6.4.7 APS提高小鼠血清中细胞因子含量 |
| 6.4.8 APS对肿瘤组织Bcl-2,Bax和Caspase-3蛋白表达的影响 |
| 6.5 本章小结 |
| 7 APS体内抗乳腺癌作用的生物信息学研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验材料和设备 |
| 7.2.1 药品与试剂 |
| 7.2.2 实验仪器与设备 |
| 7.2.3 实验动物 |
| 7.3 研究方法 |
| 7.3.1 差异表达基因的筛选 |
| 7.3.2 差异表达基因的GO和KEGG富集分析 |
| 7.3.3 差异表达基因的蛋白质相互作用网络的构建 |
| 7.3.4 关键基因的筛选 |
| 7.3.5 小鼠乳腺癌模型的建立 |
| 7.3.6 小鼠给药 |
| 7.3.7 免疫组化分析 |
| 7.3.8 统计分析 |
| 7.4 研究结果与讨论 |
| 7.4.1 识别差异基因 |
| 7.4.2 差异表达基因的GO富集分析 |
| 7.4.3 差异基因的KEGG富集通路 |
| 7.4.4 特定BP差异基因的PPI网络 |
| 7.4.5 特定BP-PPI共同表达基因 |
| 7.4.6 APS对肿瘤组织中EGFR和ANXA1蛋白表达的影响 |
| 7.5 本章小结 |
| 8 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）ERCC1基因3’UTR可变剪接影响邻近重叠基因表达及其与肺癌对顺铂敏感性的关联研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 ：ERCC1基因3’UTR区可变剪接与肺癌对顺铂敏感性的关联性研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 质粒构建 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 研究对象的确定 |
| 2.2.2 顺铂药敏试验(MTT法) |
| 2.2.3 提取总RNA |
| 2.2.5 实时定量PCR检测ERCC1基因mRNA表达 |
| 2.2.6 PCR引物信息 |
| 2.2.7 细胞培养 |
| 2.2.8 细胞转染及转染细胞的鉴定 |
| 2.2.9 Westernblot检测ERCC1蛋白表达 |
| 2.2.10 γH2AX免疫荧光试验 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 ERCC1剪接异构体的确定 |
| 3.2 肺癌病例基本信息及顺铂IC_50分析 |
| 3.2.1 肺癌患者基本信息 |
| 3.2.2 肺癌与其癌旁组织对顺铂敏感性 |
| 3.2.3 肺癌组织对顺铂敏感性与患者资料间的关系 |
| 3.3 ERCC1-202表达量与顺铂敏感性的关联性分析 |
| 3.4 ERCC13'UTR可变剪接体的质粒构建及细胞转染 |
| 3.5 ERCC1在转染细胞中的表达 |
| 3.6 CDDP对各转染细胞细胞活性的影响 |
| 3.7 γH2AX免疫荧光实验测定转染细胞经CDDP处理DNA损伤 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 ：ERCC1-202与CD3EAP和PPP1R13L基因重叠区域转录特征分析 |
| 5 前言 |
| 6 材料与方法 |
| 6.1 主要试剂和仪器 |
| 6.1.1 主要试剂 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 ERCC1、CD3EAP、PPP1R13L基因结构及重叠区域调控元件分析 |
| 6.2.2 DBTSS转录起始位点数据库分析 |
| 6.2.3 GEO数据库分析 |
| 6.2.4 TCGA数据库可变剪接事件分析 |
| 6.2.5 TCGA基因外显子的表达及其相关性分析 |
| 6.2.6 双向启动子验证 |
| 6.2.7 ERCC1、CD3EAP、PPP1R13L蛋白质互作关系预测及验证 |
| 6.2.8 统计分析及可视化方法 |
| 7 结果 |
| 7.1 UCSC数据库特征性结构和组蛋白修饰分析 |
| 7.2 CD3EAP与PPP1R13L重叠区域启动子位置预测： |
| 7.3 转录起始位点(TranscriptionStartSites,TSS)分析 |
| 7.4 GEO数据库数据分析 |
| 7.4.1 GPL570:[HG-U133_Plus_2]AffymetrixHumanGenomeU133Plus2.0Array平台探针集位置与基因转录本位置信息比对 |
| 7.4.2 GEO数据库GPL570平台肺癌相关数据,探针集相关分析 |
| 7.5 TCGA数据库分析 |
| 7.5.1 TCGA数据库可变剪接事件分析 |
| 7.5.2 基因外显子水平的差异表达分析 |
| 7.5.3 基因外显子水平的转录相关分析 |
| 7.6 双向启动子验证 |
| 7.7 蛋白质互作分析 |
| 7.7.1 蛋白质互作网络预测 |
| 7.7.2 蛋白质免疫共沉淀 |
| 8 讨论 |
| 第三部分 ：ERCC1基因的3’UTR可变剪接对下游基因转录影响的实验研究 |
| 9 前言 |
| 10 材料与方法 |
| 10.1 主要试剂和仪器 |
| 10.1.1 主要试剂 |
| 10.1.3 细胞 |
| 10.2 实验方法 |
| 10.2.1 CCK-8细胞毒性分析 |
| 10.2.2 流式细胞仪检测细胞周期与凋亡 |
| 10.2.3 RNA的制备 |
| 10.2.4 Affymetrix基因芯片 |
| 10.2.5 Realtime-PCR |
| 10.2.6 3 ’RACEPCR |
| 10.2.8 统计学方法 |
| 11 结果 |
| 11.1 建立顺铂诱导的DNA损伤细胞模型 |
| 11.1.1 CCK8细胞存活率检测： |
| 11.1.2 细胞周期与凋亡检测 |
| 11.2 Affymetrix全转录组基因芯片分析 |
| 11.3 Real-timePCR检测共表达外显子 |
| 11.4 基因转录终止位点检测 |
| 12 讨论 |
| 第四部分 ：ERCC15’重叠基因FOSB在非小细胞肺癌中的差异表达研究 |
| 13 前言 |
| 14 材料和方法 |
| 14.1 TCGA基因表达谱数据分析 |
| 14.2 选择性剪接事件分析与蛋白质结构域分析 |
| 14.3 实时定量PCR |
| 14.4 逆转录-聚合酶链反应分析(RT-PCR) |
| 14.5 细胞培养 |
| 14.6 Westernblot分析 |
| 14.7 统计分析 |
| 15 结果 |
| 15.1 TCGA数据库中FOSB与ERCC1基因表达量相关分析 |
| 15.2 TCGA数据库FOSB基因mRNA差异表达谱和生存分析 |
| 15.3 FOSB基因剪接事件分析 |
| 15.4 RT-PCR分析验证FOSB基因第2外显子缺失事件 |
| 15.5 FOSB蛋白表达与mRNA的表达不一致性。 |
| 15.6 FOSB蛋白在LUAD和LUSC癌组织和癌旁组织中的表达 |
| 15.7 FOSB蛋白在LUAD和LUSC癌组织和癌旁组织中的表达 |
| 16 讨论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）HIF-1α通过调控与血管生成相关基因对食管癌组织血管生成及食管癌细胞放射敏感性的影响研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 基于基因芯片数据的食管癌血管生成相关基因生物信息学分析 |
| 1 研究内容和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 数据处理与统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 食管癌组织中HIF-1α、VEGF和 AGGF1 的表达及其与食管癌放疗疗效的关系 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 治疗方法 |
| 1.3 检测方法 |
| 1.4 结果判定 |
| 1.5 随访 |
| 1.6 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 2ME2通过抑制HIF-1α表达增加Eca109 细胞放射敏感性的实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 缺氧诱导因子-1与肿瘤放射敏感性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（5）肺积宁方对Lewis肺癌抗肿瘤作用及自噬效应的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 肺积宁方含药血清对Lewsi肺癌细胞增殖和凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 肺积宁方含药血清影响Lewis肺癌细胞自噬及其作用机制 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 肺积宁方对裸鼠移植瘤模型抑瘤作用及自噬相关蛋白的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（7）从猪胚胎骨骼肌cDNA文库中分离、定位新基因并分析部分基因的功能（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 文献综述 |
| 1.1 猪基因组的研究现状 |
| 1.2 cDNA文库在筛选新基因中的应用 |
| 1.3 CA3基因的研究进展 |
| 1.3.1 CA3基因的研究进展 |
| 1.3.1.1 CA3基因的特征 |
| 1.3.1.2 CA3基因的功能 |
| 1.3.2 CA家族其它成员的研究进展 |
| 1.4 HUMMLC2B基因的研究进展 |
| 1.5 分离的其它基因的研究进展 |
| 1.5.1 与微管组装有关的基因 |
| 1.5.2 核糖体蛋白基因 |
| 1.5.3 其它基因 |
| 1.6 实时荧光定量PCR的原理及应用 |
| 1.6.1 实时荧光定量PCR相关的概念 |
| 1.6.2 实时荧光定量PCR的原理 |
| 1.6.3 实时荧光定量PCR的方法 |
| 1.6.4 实时荧光定量PCR的应用 |
| 1.7 亚细胞定位在基因功能研究中的地位及定位方法 |
| 2 本研究的目的和意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样品 |
| 3.1.1.1 DNA样品 |
| 3.1.1.2 组织样品 |
| 3.1.2 载体和菌株 |
| 3.1.3 试剂盒及酶 |
| 3.1.4 主要试剂及配制 |
| 3.1.4.1 主要试剂 |
| 3.1.4.2 试剂的配制 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.1.6 主要分子生物学软件 |
| 3.1.7 主要数据库 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 候选基因cDNA全长序列的分离方法 |
| 3.2.2 候选基因基因组全长序列的分离方法 |
| 3.2.2.1 引物设计 |
| 3.2.2.2 PCR扩增的条件 |
| 3.2.2.3 PCR产物的纯化回收和克隆测序 |
| 3.2.2.4 DNA序列同源性检索鉴定 |
| 3.2.3 基因染色体定位的SCHP和RH法 |
| 3.2.3.1 基因定位的引物设计 |
| 3.2.3.2 PCR分型方法 |
| 3.2.3.3 数据分析方法 |
| 3.2.4 目的基因表达谱分析 |
| 3.2.4.1 总RNA的提取 |
| 3.2.4.2 cDNA的合成 |
| 3.2.4.3 Real-time PCR引物和TaqMan探针的设计 |
| 3.2.4.4 目的基因的组织表达谱分析 |
| 3.2.4.5 目的基因在骨骼肌发育不同时期的表达谱分析 |
| 3.2.4.6 表达谱的数据分析 |
| 3.2.5 融合蛋白的亚细胞定位 |
| 3.2.5.1 CA3和HUMMLC2B基因真核表达载体的构建 |
| 3.2.5.2 细胞培养和转染 |
| 3.2.5.3 细胞染色和融合蛋白的观察 |
| 3.2.6 猪基因的多态性检测 |
| 3.2.6.1 用PCR-RFLP方法检测基因多态 |
| 3.2.6.2 用DHPLC方法检测基因多态 |
| 3.2.7 猪基因与性状的关联分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 分离基因的全长cDNA序列结果 |
| 4.1.1 猪CA3基因的序列分析结果 |
| 4.1.1.1 猪CA3基因的序列特征 |
| 4.1.1.2 猪CA3基因的进化树分析 |
| 4.1.2 猪HUMMLC2B基因的序列分析结果 |
| 4.1.3 分离的其它新基因的序列分析结果 |
| 4.2 分离基因的染色体定位 |
| 4.2.1 猪CA3基因的定位结果 |
| 4.2.2 分离的其它新基因的定位结果 |
| 4.3 目的基因的基因组序列分析结果 |
| 4.3.1 猪CA3基因的基因组DNA序列分析结果 |
| 4.3.2 猪HUMMLC2B基因的基因组DNA序列分析结果 |
| 4.4 表达谱分析结果 |
| 4.4.1 总RNA的提取和检测结果 |
| 4.4.2 猪CA3基因的时空表达谱分析结果 |
| 4.4.2.1 猪CA3基因的组织表达谱分析结果 |
| 4.4.2.2 猪CA3基因在骨骼肌发育不同时期的表达谱分析结果 |
| 4.4.3 猪HUMMLC2B的时空表达谱分析结果 |
| 4.4.3.1 HUMMLC2B基因的组织表达谱分析结果 |
| 4.4.3.2 HUMMLC2B基因在骨骼肌不同发育时期的表达谱分析结果 |
| 4.5 融合蛋白的亚细胞定位 |
| 4.5.1 猪CA3融合蛋白的亚细胞定位结果 |
| 4.5.2 猪HUMMLC2B融合蛋白的亚细胞定位结果 |
| 4.6 基因的多态性检测 |
| 4.6.1 猪CA3基因的遗传多态性检测 |
| 4.6.1.1 CA3基因G8603A位点的遗传多态性检测 |
| 4.6.1.2 CA3基因G8370A位点的遗传态性检测 |
| 4.6.1.3 G8371A和G8603A多态位点组成的单倍型分析 |
| 4.6.2 猪HUMMLC2B基因的遗传多态性检测 |
| 4.6.2.1 G1876A和T2005G位点的遗传多态性检测结果 |
| 4.6.2.2 T1513C位点的遗传多态性检测结果 |
| 4.6.2.3 G1094A位点的遗传多态性检测结果 |
| 4.6.2.4 T1513C、G1876A和T2005G位点组成单倍型的分析结果 |
| 4.6.2.5 C2672T、C2691T、C2731T和C2840T位点多态性检测结果 |
| 4.7 猪基因多态与部分性状的关联分析 |
| 4.7.1 CA3基因多态性与部分性状的关联分析 |
| 4.7.1.1 CA3基因G8603A位点多态与部分性状的关联分析 |
| 4.7.1.2 CA3基因G8371A位点多态与部分性状的关联分析 |
| 4.7.2 猪HUMMLC2B基因多态.与部分性状的关联分析 |
| 4.7.2.1 T2005G位点不同基因型与部分性状的关联分析 |
| 4.7.2.2 G1876A位点不同基因型与部分性状的关联分析 |
| 4.7.2.3 T1513C和G1094A位点多态与部分性状的关联分析 |
| 5 讨论 |
| 5.1 关于新基因定位 |
| 5.2 关于SNPs检测 |
| 5.3 关于Real—time PCR技术 |
| 5.3.1 PCR引物及TaqMan探针的设计 |
| 5.3.2 扩增条件的优化 |
| 5.3.3 表达谱的数据分析 |
| 5.4 关于基因的表达谱分析 |
| 5.4.1 猪CA3基因的表达谱分析 |
| 5.4.2 猪HUMMLC2B基因的表达谱分析 |
| 5.5 关于亚细胞定位 |
| 5.5.1 细胞的染色 |
| 5.5.2 HUMMLC2B融合蛋白在细胞中的位置 |
| 5.6 关于猪CA3基因的分析 |
| 5.7 关于HUMMLC2B的基因组结构分析 |
| 5.8 关于基因与性状的关联分析 |
| 5.8.1 猪CA3基因多态与性状的关联分析 |
| 5.8.2 猪HUMMLC2B基因多态与性状的关联分析 |
| 5.9 SNPs分型技术用于近交程度的检测 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 缩略词表 |
| 附录2 主要性状的中英文对照和缩写 |
| 在读期间发表论文题录 |
| 致谢 |
（8）Bnip3L与Bcl-2在非小细胞肺癌中的表达（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1.Bcl-2基因家族 |
| 2.Bnip3L与肿瘤 |
| 3.Bcl-2与肿瘤 |
| 4.组织芯片及其应用 |
| 正文 |
| 1.实验一：组织芯片的制作 |
| 2.实验二：Bnip3L在非小细胞肺癌中的表达 |
| 3.实验三：Bcl-2在非小细胞肺癌中的表达 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（9）人NIT1基因cDNA的克隆、原核表达及抗体制备（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 人NIT1基因cDNA的克隆、重组原核表达载体的构建及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 人NIT1融合蛋白的原核表达及纯化 |
| 材料与方 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 兔抗人NIT1蛋白多克隆抗体的制备 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 人NIT1蛋白在正常胎盘组织细胞中的分布 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 简历 |
| 致谢 |
| 四川大学博士论文研究创新自我评价 |
（10）nm23-H1基因对肺癌细胞Wnt信号通路调控机制的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 人肺癌细胞株中Wnt信号通路相关蛋白的表达水平研究 |
| 一、人肺癌细胞株GSK-3β、β-catenin以及磷酸化β-catenin的蛋白表达水平 |
| 材料 |
| 方法 |
| 统计处理 |
| 结果 |
| 二、LiCL处理肺癌细胞株后胞浆胞核GSK-3β、β-catenin以及磷酸化β-catenin蛋白的表达状态 |
| 材料 |
| 方法 |
| 统计处理 |
| 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 第二部分 人肺癌细胞株中GSK-3β活性的研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 统计学处理 |
| 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 第三部分 人肺癌细胞株生物学特性的测定 |
| 材料 |
| 方法 |
| 统计学处理 |
| 结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述一 Wnt信号通路与肿瘤 |
| 综述二 连环蛋白在肺癌中的研究进展 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 四川大学博士论文创新自我评述 |
四、BNIP3L基因在肺癌组织中的表达及结构分析（论文参考文献）
- [1]FAM136A表达与肺癌预后相关性及其生物学功能研究[D]. 赵留芳. 昆明医科大学, 2020
- [2]基于衍生基质/复合支架的肿瘤模型构建和黄芪多糖抗乳腺癌活性及机制研究[D]. 李文芳. 大连理工大学, 2019(06)
- [3]ERCC1基因3’UTR可变剪接影响邻近重叠基因表达及其与肺癌对顺铂敏感性的关联研究[D]. 张国培. 中国医科大学, 2018(01)
- [4]HIF-1α通过调控与血管生成相关基因对食管癌组织血管生成及食管癌细胞放射敏感性的影响研究[D]. 陆艳荣. 新疆医科大学, 2017(08)
- [5]肺积宁方对Lewis肺癌抗肿瘤作用及自噬效应的实验研究[D]. 周立江. 辽宁中医药大学, 2016(01)
- [6]老年胃癌患者中BNIP3L基因的表达及其与预后的关系[J]. 范开席,汪梅荣,杨锡贵,张维东,申洪明. 中华消化杂志, 2010(11)
- [7]从猪胚胎骨骼肌cDNA文库中分离、定位新基因并分析部分基因的功能[D]. 王焕岭. 华中农业大学, 2006(11)
- [8]Bnip3L与Bcl-2在非小细胞肺癌中的表达[D]. 梁晓华. 第四军医大学, 2006(12)
- [9]人NIT1基因cDNA的克隆、原核表达及抗体制备[D]. 吴汉林. 四川大学, 2005(01)
- [10]nm23-H1基因对肺癌细胞Wnt信号通路调控机制的实验研究[D]. 付军科. 四川大学, 2004(11)