导读:本文包含了核转运蛋白论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:核转运蛋白,骨肉瘤细胞,细胞增殖,肿瘤血管生成
核转运蛋白论文文献综述
葛乔枫,张龙,孙晓娟,吕智[1]（2019）在《敲低核转运蛋白对人骨肉瘤细胞增殖和血管生成的体内影响》一文中研究指出目的探讨核转运蛋白2(karyopherina 2,KPNA2)对人骨肉瘤(osteosarcoma,OS)细胞增殖和血管生成的影响,并从分子层面分析其可能的作用机制。方法构建Sh-KPNA2慢病毒载体(Sh-KPNA2组)及空载体Sh-Control(Sh-Control组)转染骨肉瘤细胞Saos-2,观察敲低KPNA2后对Saos-2细胞增殖的影响;利用转染Sh-KPNA2和空载体Sh-Control的Saos-2细胞分别构建OS动物模型,小动物活体荧光分子断层成像系统(fluorescence molecular tomography,FMT)验证KPNA2对瘤体血管生成的影响;qRT-PCR和Western blot验证瘤体内KPNA2和睾丸决定因子Y染色体性别决定区基因(SRY related HMG box-2,Sox2)的mRNA和蛋白表达水平。结果 Sh-KPNA2组细胞增殖能力较Sh-Control组明显降低(P<0.05);Sh-KPNA2组荷瘤小鼠瘤体积显着小于Sh-Control组(P<0.05);免疫组化和FMT扫描结果显示,Sh-Control组的血管生成能力显着高于Sh-KPNA2组(P<0.05);瘤体qRT-PCR和Western blot检测结果均显示Sox2在Sh-Control组中表达显着高于Sh-KPNA2组(P<0.05)。结论敲低KPNA2可抑制OS增殖和血管生成,其机制可能与KPNA2影响Sox2的表达有关。(本文来源于《第叁军医大学学报》期刊2019年14期）
宋毓平,张庆华,李瑞,李贺梅,曾真[2]（2019）在《核转运蛋白基因2的表达在皮肤恶性黑素瘤临床预后中的作用》一文中研究指出目的:探讨核转运蛋白基因(karyopherin, KPNA)2在皮肤恶性黑素瘤临床预后中的作用。方法:应用GEO数据库数据分析,比较KPNA2 mRNA在正常皮肤组织、恶性黑素瘤中表达的差异,并进一步利用两种在线数据库进行生存分析,分析KPNA2 mRNA与皮肤恶性黑素瘤的预后之间的关系。结果:KPNA2 mRNA水平在正常皮损组织中明显要低于恶性黑素瘤组织,差异有统计学意义(P<0.05);同时生存分析显示KPNA2 mRNA表达水平与皮肤恶性黑素瘤的预后具有的显着相关性,其表达水平高则预后差(P<0.05)。结论:KPNA2与皮肤恶性黑素瘤临床预后密切相关,为皮肤恶性黑素瘤治疗提供潜在靶点。(本文来源于《临床皮肤科杂志》期刊2019年03期）
魏正茂,范龙龙,李维清,欧龙华,王燕[3]（2019）在《核转运蛋白基因2在265例上尿路尿路上皮癌中的表达及其与预后的关系》一文中研究指出目的探究核转运蛋白基因2(KPNA2)表达与上尿路尿路上皮癌(UTUC)患者临床病理参数和预后之间的关系。方法采用组织芯片结合免疫组化染色法检测KPNA2在265例上尿路尿路上皮癌组织和146例癌旁正常上尿路上皮组织中的蛋白表达水平,分析其表达水平与患者年龄、性别、T分期、G分级、肿瘤大小、肿瘤边侧和术后膀胱复发等临床病理参数之间的关系,探讨KPNA2对患者预后的影响。结果 KPNA2在上尿路尿路上皮癌组织中的高表达率(74.34%)明显高于其对应的癌旁组织中的高表达率(24.66%)(P<0.05)。KPNA2蛋白表达水平与患者的T分期(P=0.000)、G分级(P=0.033)和术后有无膀胱复发(P=0.004)有关,而与患者的年龄(P=0.265)、性别(P=0.312)、肿瘤大小(P=0.582)和肿瘤边侧(P=0.386)无关。术后随访12～108个月(平均36个月),共有56例出现膀胱复发,总复发率为21.1%。高表达KPNA2的患者5年总体生存率显着低于无或低表达KPNA2的患者(P=0.007 6)。结论 KPNA2在上尿路尿路上皮癌组织中高表达,其表达水平与上尿路尿路上皮癌的临床分期和病理分级密切相关,并影响患者预后。(本文来源于《现代泌尿外科杂志》期刊2019年05期）
袁超,孙鑫,吴燕芝,赵佳福,阮涌[4]（2018）在《鸡核转运受体β1蛋白重组真核表达载体的构建与亚细胞定位分析》一文中研究指出引言核转运受体β1(importin β1)蛋白是核输入蛋白家族中的一员,是真核生物中广泛分布的核质转运受体蛋白,其在细胞的基因转录、细胞周期调控以及增殖分化等过程中发挥着重要作用。近年来的研究发现,importin β1可直接介导携带不同类型NLS的靶蛋白进入细胞核,并且这种转运速度要高于importin α/β1共同介导的靶蛋白入核转运。鉴于importin β1蛋白在病毒蛋白细胞核定位以及病毒复制和致病方(本文来源于《中国畜牧兽医学会2018年学术年会禽病学分会第十九次学术研讨会论文集》期刊2018-11-21）
李杰,何东,张睿,杨帆,冯少滨[5]（2018）在《核转运蛋白α2在胶质瘤中的表达及对其生物学行为的影响》一文中研究指出目的探讨核转运蛋白α2(KPNA2)在胶质瘤中的表达与临床意义以及KPNA2对胶质瘤细胞生物学活性的影响。方法收集脑星形胶质细胞瘤Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级各30例,癌周相对正常脑组织15例,qRT-PCR及免疫组化分析KPNA2的表达;制备KPNA2干扰质粒,并以慢病毒为载体转染进入胶质瘤细胞系U87、U251,CCK8、Ed U法检测KPNA2敲除后对细胞增殖的影响,Transwell小室法检测KPNA2对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响。结果KPAN2在胶质瘤中表达升高,表达量与胶质瘤WHO分级呈正相关(rs=0.559,P<0.001),与患者预后呈负相关(总生存率:χ~2=21.39,P<0.001;无进展生存率:χ~2=8.057,P=0.004)。KPNA2敲除后胶质瘤细胞系的增殖、迁移和侵袭能力均明显减弱。结论 KPNA2在胶质瘤的发生发展中具有重要作用,可能成为新的临床诊治的标记物和治疗靶点。(本文来源于《山东大学学报(医学版)》期刊2018年12期）
周丽娜[6]（2017）在《核转运蛋白Karyopherin α2（KPNA2）表达水平与部分实体肿瘤预后关系的Meta分析》一文中研究指出背景:在恶性肿瘤细胞发生、发展、转化过程中,调控大分子物质进入细胞核对改变细胞表型有着极为重要的作用,癌细胞经常会出现细胞物质转运功能异常。细胞质和细胞核之间蛋白转运主要是由karyopherins介导的,KPNA2(karyopherinα2)是核转运蛋白家族成员之一,在很多恶性肿瘤中都可见KPNA2过表达,有的研究发现在实体肿瘤中KPNA2过表达与不良预后有关,但也有研究显示低水平KPNA2与肿瘤不良预后有关,KPNA2到底是促进还是抑制肿瘤发展,目前还存在着争议。所以我们将相关文章进行了Meta分析,研究KPNA2的表达和肿瘤进展之间的关系。方法:按照Cochrane协作网推荐的检索策略以―KPNA2‖,―neoplasms‖,―cancer‖,―prognosis‖,―mortality‖,―survival‖,―predict‖,―outcome‖,―life‖,―alive‖英文检索词电子检索PubMed,Embase,Web of Science等外文数据库。按照制定的纳入和排除标准进行文献筛选,用纽卡斯尔-渥太华文献质量评价表(Newcastle-Ottawa quality assessment scale,NOS)对纳入研究的质量进行评价,评分高于6分的,定义为高质量文献。由两名研究者对符合标准的文献独立进行数据提取并对其进行统计学分析,通过入选文献的HR及其相应的95%CI来计算合并HR,并可用森林图显示出来,以此来评价KPNA2表达与实体肿瘤预后指标之间的关系。菱形、短横线如果与无效线相交或者相接触代表KPNA2是否表达异常与肿瘤患者生存期不相关,菱形、短横线如果不与无效线接触或者相交,且位于无效线的右边(即HR>1)则代表KPNA2为危险因素,其高表达与肿瘤不良预后有关;在左边(即HR<1)提示KPNA2为保护因素,其高表达与肿瘤预后良好有关。用Cochran’s Q检验和Higgins’s I~2统计来检测纳入的不同文献间的异质性,P值>0.10并且I~2<50%提示没有异质性,在这种情况下,应用固定效应模型(fixed-effects model)进行效应量的合并,否则就应用随机效应模型(random-effects model)。如果分析结果显示各个研究间存在异质性,我们通过亚组分析和敏感性分析对异质性的来源进行检测。用漏斗图(funnel plot)和Egger’s检验来评价纳入的研究是否存在着发表偏倚。如果呈现对称的漏斗图,提示没有偏倚;如果呈现不对称的漏斗图,提示存在偏倚,不对称越明显,提示偏倚的程度越大。Egger’s检验如果截距等于0,提示不存在发表偏倚,如果接近于0,提示发表偏倚较小。如果确实有发表偏倚,那么就用Duval和Tweedie的剪补法(trim and fill)来评价其对总的结果的影响。剪补法是估算缺失的研究的数目并添加进研究中,剔除权重低、较极端的研究,经过剪补以后重新进行Meta分析,如果干预前和干预后的合并效应量变化不甚明显或者结论不变,说明发表偏倚对结果影响不大,结果较稳定可信。结果:共纳入24篇文献,包含6164个病例。结果表明KPNA2表达水平是实体肿瘤预后的独立预测因子。KPNA2表达上调的患者OS、TTR、RFS、PFS缩短。然而,KPNA2表达水平与DFS无明显关系。纳入文献中共有20篇文献研究关注的是主要结果OS,HR=1.767,95%CI=1.503-2.077,P<0.001,提示KPNA2过表达与OS差有关。共有5篇文献研究关注的是次要结果DFS,HR=1.653,95%CI=0.903-3.029,P=0.104,提示KPNA2表达水平与DFS没有显着关系。分别有5组和3组数据研究的是次要结果RFS和PFS。结果分别为HR=1.835,95%CI=1.530-2.200,P<0.001和HR=2.921,95%CI=1.493-5.715,P=0.002,提示KPNA2过表达与RFS和PFS差有关。只有一篇文献研究TTR,其HR=1.464,95%CI=1.023-2.096,P=0.037,提示KPNA2过表达与TTR差有关。按不同患者来源进行分组分析的亚组中,研究对象为东亚患者的研究共有12个,其合并HR=1.962,95%CI=1.525-2.525,P<0.001。研究对象为欧洲患者的研究共有8个,其合并HR=1.562,95%CI=1.407-1.734,P<0.001。这两个亚组分析均提示KPNA2过表达与OS差有关。按不同肿瘤类型进行的亚组分析显示,在胃癌(HR=2.353,95%CI=1.048-5.284,P=0.038)和结直肠癌(HR=3.252,95%CI=1.82-5.811,P<0.001)患者中,KPNA2过表达与OS差有关。而在乳腺癌(HR=1.588,95%CI=0.996-2.531,P=0.052)患者中,KPNA2表达水平与OS没有显着关系。我们用漏斗图和Egger’s检验来评估可能出现的发表偏倚。结果显示漏斗图不对称,且Egger’s检验的P值<0.01,均提示这些研究间存在发表偏倚。于是我们运用剪补法来纠正发表偏倚对Meta分析结果的影响,结果显示发表偏倚对总的结果影响不大,结果稳定可靠。结论:在肿瘤中KPNA2过表达与不良预后有关,KPNA2表达可能是一个有用的恶性肿瘤预后监测指标,有待更大样本量的前瞻性的研究来证实我们的发现。(本文来源于《苏州大学》期刊2017-05-01）
杜少静,贺慧颖[7]（2016）在《核转运蛋白KPNA2与肿瘤关系的研究进展》一文中研究指出KPNA2作为核转运蛋白家族成员之一,通过核浆运输功能调节多种蛋白的核转位,而参与细胞分化、增殖凋亡、转录调节、免疫反应和病毒感染等多种生命活动。近年来研究表明KPNA2在多种肿瘤组织中表达上调,并且KPNA2的异常表达与患者预后差相关,提示KPNA2在肿瘤形成和进展过程中扮演重要角色。经细胞学研究证实,KPNA2亦参与细胞的恶性转化。因此,本文对KPNA2的功能及在肿瘤中的研究进展进行综述。(本文来源于《中国肿瘤临床》期刊2016年17期）
包赈[8]（2016）在《核转运蛋白β1(karyopherinβ1)对Wnt/β-Catenin通路的调节作用及其对胶质瘤细胞增殖影响的研究》一文中研究指出目的:通过对100例人胶质瘤标本的处理和检测,研究核转运蛋白β1(Karyopherinβ1,KPNB1)与胶质瘤临床特征的相互关系,并进一步在细胞水平研究KPNB1对Wnt/β-Catenin通路的调节作用及其对胶质瘤细胞增殖能力的影响。方法:应用免疫印迹和免疫组织化学检测技术,在100例人胶质瘤标本中检测KPNB1与增殖细胞相关核抗原(Ki-67)的表达水平,结合患者的各项临床资料,明确KPNB1与胶质瘤恶性程度、增殖能力、临床预后等特征的相关性。应用U251和U87MG两种胶质瘤细胞系构建血清饥饿-释放细胞模型,应用免疫印迹技术检测各时间点KPNB1、β-Catenin及PCNA(proliferating cell nuclear antigen)、p27等细胞增殖能力标记物的表达水平,在细胞水平验证KPNB1与细胞增殖的相关性。然后,应用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA),构建KPNB1基因稳定沉默的细胞模型,分别应用流式细胞检测、细胞技术试剂盒(cell counting kit,CCK-8)、克隆形成计数等实验方案,验证KPNB1沉默对细胞增殖能力的抑制作用。接着,应用细胞核浆分离及免疫印迹,验证KPNB1沉默对β-Catenin核内转运的影响。最后,应用免疫共沉淀技术,验证KPNB1与β-Catenin是否存在直接的相互作用。结果:我们发现,在本课题所检测的100例人胶质瘤标本中,KPNB1的表达水平与人胶质瘤的WHO分级、Ki-67表达水平成正相关,与患者预后成反相关。在U251与U87MG细胞血清饥饿-释放实验中,我们都发现KPNB1、β-Catenin的表达水平与PCNA、p27等细胞增殖能力标记物成正相关,进一步证实KPNB1与胶质瘤细胞增殖能力相关,而且KPNB1极有可能通过调节WNT/β-Catenin通路影响胶质瘤细胞增殖。之后,在KPNB1稳定沉默的细胞模型中,多种实验方法都表明了KPNB1沉默可抑制胶质瘤细胞增殖。同时,β-Catenin在胞核内的表达水平明显低于胞浆,而在未经处理的细胞内,情况则与此相反。最后,免疫共沉淀实验表明KPNB1与β-Catenin确实存在直接相互作用。结论:1.KPNB1的表达水平与胶质瘤恶性程度成正相关,且与患者预后成相关关系。2.KPNB1可调控β-Catenin的核内转运,从而影响Wnt/β-Catenin通路,调节胶质瘤细胞增殖的能力。3.KPNB1与β-Catenin之间存在直接相互作用。(本文来源于《苏州大学》期刊2016-03-01）
李凤,蒲泽晏,刘方久,魏容,梁艳丽[9]（2014）在《核转运蛋白受体在肝癌中的表达水平研究》一文中研究指出目的了解肝癌组织中KPNA2的mRNA表达水平,探讨其与肝癌临床病理特征的关系,为预测肝癌的浸润、转移及早期治疗提供依据。方法收集遂宁市中心院肝胆外科2011年1月至2013年11月行手术治疗的肝癌病例30例的肝癌组织及癌旁正常组织;用RT-PCR法从转录水平上检测KPNA2在肝癌组织及癌旁正常组织中的表达情况。查阅病历资料,分析KPNA2与肝癌各临床病理因素的相互关系。结果在30例肝癌患者中,肝癌组织KPNA2mRNA与癌旁正常组织之比,25例(83.33%)肝癌组织KPNA2mRNA表达上调(灰度值大于2倍)。因此,肝癌组织KPNA2基因呈高表达;癌旁正常肝组织呈低表达。结论 KPNA2在肝癌组织中高表达,在癌旁正常肝组织中低表达;KPNA2的高表达与肝癌的分期、病理分级呈正相关;KPNA2可作为肝癌的早期诊断以及判断肝癌的恶性程度和潜在转移能力的重要指标。(本文来源于《国际检验医学杂志》期刊2014年15期）
张国伟[10]（2014）在《芳香烃受体核转运蛋白在结直肠腺癌的表达与临床研究》一文中研究指出研究背景：结直肠癌(Colorectal Cancer)是全球常见的消化道恶性肿瘤,在我国居第3位的最常见恶性肿瘤,发病率约为20.6/10万,且近年来其发病率有逐年上升的趋势。腺癌源性是结直肠癌最常见的病理组织类型。手术切除是结肠癌主要的治疗手段,然而,由于结直肠癌早期诊断滞后,以及术后有约40%-50%的患者会出现复发或转移,使得相当多的患者失去再治愈的机会。因此,加强结直肠癌机制的研究,寻找预防和治疗的有效靶点,是当今结直肠癌研究领域的重要焦点。研究显示：碱性螺旋-环-螺旋-PAS (basic helix-loop-helix Per-Arnt-Sim, bHLH-PAS)蛋白超家族的多个成员已证实参与肿瘤的发展。其分子作用机制的作用网络复杂,在肿瘤的发生、进展及转移中起着重要作用。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)通过影响肿瘤内糖酵解、增殖、凋亡、血管新生等方面促进其进展,已在大量的文献得到证实。AHR具有调节肿瘤细胞增殖的功能,并且在MCF-7和HepG2肝癌细胞株内分别出现抑制和促进肿瘤细胞生长的不同结果。转录因子蛋白SIM1常在乳腺癌中低表达或不表达,促进细胞的恶变及肿瘤的侵袭。最新研究显示,芳香烃受体抑制子(AHRR)已在多种人体肿瘤内证实发挥抑癌基因的作用。这些研究均提示bHLH/PAS类核转录因子在肿瘤的进展中的重要作用。芳香烃受体核转运子(arylhydrocarbon receptor nuclear translocator,ARNT),又名缺氧诱导因子-1p(HIF-1β),是具有bHLH-PAS结构域的重要蛋白成员,基因定位于1号染色体(1q21),DNA全长2604bp,开放阅读框2367bp,广泛在人体组织中表达,且细胞核、细胞质中均有表达。多种bHLH-PAS超家族的重要转录因子,包括芳香烃受体(AhR)、低氧诱导因子(HIF)1α、2α和3α、SIM蛋白等需要与ARNT结合组成专性二聚化配偶体,才能发挥生物活性作用,参与机体内如缺氧、芳香烃类物质代谢等一系列重要的生物学过程。Chang KY等研究提示ARNT可能与人类宫颈癌的发生有关；相关研究表明ARNT高表达与肝癌的生长、侵袭和转移呈负相关性。本课题组前期研究结果显示：应用重组慢病毒载体LV-ARNT-RNAi-3转染至人结肠癌HT29细胞,可阻断肿瘤细胞ARNT基因的表达；在下调人结肠癌HT29细胞ARNT基因的表达水平后,在体外常氧环境下促进细胞增殖、抑制其凋亡；裸鼠皮下肿瘤移植后,在体内促进移植瘤生长。结果提示在人结肠癌HT29细胞中ARNT基因具有抑制癌细胞进展的作用。尽管过去20年间研究结果证实ARNT参与肿瘤、血管生成；但ARNT于人体结直肠癌组织内的表达水平与肿瘤发生、发展的关联性及相关机制尚不清楚；且目前缺乏相关的研究报道。目的：收集人结直肠腺癌手术标本,包括肿瘤组织与相邻正常的无肿瘤细胞浸润的结直肠组织,应用实时定量RT-qPCR、Western Boltting、免疫组化等技术测量正常结直肠组织、结直肠癌组织中ARNT的表达情况,阐明ARNT在活体结直肠癌发生发展过程中的表达改变。并以此结合患者肿瘤的临床病理参数、随访数据等分析ARNT的表达对于结直肠癌患者的肿瘤进展、转移及预后的相关性分析。为进一步探讨ARNT在结直肠癌的诊疗中的临床价值提供工作基础。材料与方法：一、临床病例的选择本课题经广东省第二人民医院伦理委员会批准,每位患者均已签署知情同意书。选取2007年6月到2008年12月间于我院接受手术的结直肠腺癌患者共165例(结肠腺癌98例、直肠腺癌67例；年龄29-82岁,中位年龄59岁；男性87例、女性78例)的石蜡标本,并将患者纳入术后随访,获取患者术后的生存情况,记录包括肿瘤TNM分期、总生存时间、无瘤生存时间等参数。随访患者抗肿瘤治疗参照2007版《NCCN结、直肠癌临床实践指南》。另选取2012年08月至2013年02月在广东省第二人民医院普外二科确诊并行手术治疗共44例结直肠腺癌患者纳入研究(结肠腺癌26例、直肠腺癌18例；年龄36-78岁,中位年龄62岁；男性26例、女性18例)。研究病例标准：1.组织病理学确诊结直肠腺癌；2.接受结直肠肿瘤切除+淋巴结清扫术治疗获取标本；3.术前未接受放疗、化疗等抗肿瘤治疗；4.无明显的家族肿瘤病史,同期体内无其他恶性肿瘤(如胃肠道间质瘤、胃癌等)；5.排除肿瘤复发患者；6.围手术期内无死亡。44例患者后续治疗参照2011版《NCCN结、直肠癌临床实践指南》。二、结直肠癌组织标本收集与储存共44例新鲜的手术标本均包括结直肠腺癌组织(肠腔内肿瘤边缘区域)、正常结直肠组织(距肿瘤边缘6cm以上、病理检查证实未发现肿瘤细胞的吻合口处组织)。标本离体后分成3部分,分别用于PCR实验、蛋白检测与病理学检查。蛋白检测的标本离体后应置于冰盒保存,30min内放入液氮速冻,-80℃冰箱内保存；用于PCR的标本先用RNA保存液(QIAGEN),4℃浸泡过夜,使RNA保存液完全渗入标本内,然后转至-80℃冰箱长期保存；用于病理检查的手术标本常规福尔马林-石蜡固定,另有165例结直肠腺癌组织常规福尔马林-石蜡包埋固定,用于HE染色、免疫组化检测等分析。肿瘤离体后记录其大小、浸润程度、分化程度、TNM分期等数据。根据《世界卫生组织结直肠癌病理分级指南》进行病理学分级；肿瘤患者TNM分期标准参照国际抗癌联盟(UICC)的(2009版肿瘤分期手册》。叁、组织的总RNA提取、逆转录及实时荧光定量PCR应用RNAiso PLUS(Takara)提取约100mmg新鲜冰冻组织总RNA,具体操作步骤参照试剂盒说明书。NANO DROP ND-2000分光光度计(Thermo Scientific)检测样品总RNA的浓度、纯度；吸光度(A260nm/A280nm)大于1.8的RNA样本提示组织总mRNA质量良好,可用于mRNA的逆转录。参照标准操作流程,应用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)试剂盒将1μg总RNA样本逆转录成cDNA。合成的cDNA随即为模板进行实时荧光定量PCR。以GAPDH为内参,用于检测ARNT基因mRNA的相对表达量。对应引物序列为：人ARNT：正义链5'-TCATCTCCCGACACAACATT-3'反义链5'-AAGCTGCTGGTCTTCAGGAT-3';人GAPDH:正义链5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'反义链5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3';引物由上海瑞捷(GENERAY)生物公司合成。使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒(Takara)于Lightcycler480Real Time PCR仪(Roche)进行实时荧光定量PCR反应；反应体系：10.0μl SYBR Premix Ex Taq,0.4μl PCR Forward Primer(10μM),0.4μl PCR Reverse Primer(10μM),2.0cμlcDNA模板,7.2μl Rnase-free Water;荧光定量PCR步骤：1.预变性：95℃,30秒；2.特异性扩增：95℃,5秒--60℃,20秒,共40循环；3.熔解曲线分析：95℃、0秒,60℃、15秒,95℃、15秒。每个实验样本反应均独立重复3次,应用PCR仪自带软件计算各样本的Ct值,与对应内参基因的Ct值比较,计算出肿瘤组织与正常组织ARNT mRNA的表达情况。CT值通过2-ΔΔCt法比较各个标本ARNT mRNA的表达差异。四、组织总蛋白提取及(?)vestern blot技术测量ARNT的表达每份冰冻标本均取约100mg,于PBS液中制作组织匀浆,RIPA液裂解组织,高速离心(20000rpm、4℃、30min)分离溶解产物,获取实验标本的组织总蛋白。Bradford法测量其蛋白浓度,RIPA液配平各样本的蛋白浓度,加入SDS液保存。配制10%聚丙烯酰胺凝胶,每孔加约40mg的蛋白样品,常规SDS-PAGE电泳后将蛋白转至硝酸纤维素(PVDF)膜上；5%脱脂奶粉封闭60min,PVDF膜孵育ARNT一抗(Cell Signaling Technology,1:1000稀释)4℃过夜；TBST液洗膜3次,10min/次,室温加活化辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗(Forevergen,1：5000稀释)60min,TBST液洗膜(3次,10min/次),增强ELC(Pierce)化学发光显影获取图像。以(APDH(HC301,1:5000)为内参,进行数据标准化；用ImageJ软件分析目标条带的光密度值,比较各患者肿瘤、正常组织标本间ARNT蛋白表达的差异。五、免疫组化技术检测结直肠癌组织ARNT的表达用免疫组织法检测肿瘤边缘组织和手术吻合口处(距离肿瘤≥6cm)组织切片的ARNT的表达情况。石蜡组织切片均用二甲苯和100%、95%、90%、80%、70%酒精实现再水化,PBS液冲洗(3次,3min/次)。应用3%过氧化氢溶液(GeneTech)封闭切片组织内生过氧化物；用微波热修复法将切片置于0.01M柠檬酸钠溶液(pH=6.0)微波炉煮沸20min进行抗原修复,暴露抗原决定簇。PBS液冲洗(3次,3min/次),在玻片上的组织滴加正常山羊血清封闭30min；加入ARNT一抗(Cell Signaling Technology,1:100稀释),4℃过夜；加入酶标羊抗兔(GeneTech,1：100)二抗37℃孵育30min。PBS液冲洗,加入二氨基联苯胺显色液(GeneTech)显色。用免疫组化法对肿瘤组织切片行CEA、Ki-67等项目进行检测。用Fromowitz标准(视野范围内的染色点)分析ARNT的表达水平,即随机抽取5个低倍镜视野,每个视野100个细胞进行观察,相应评分为每视野阳性染色点计数0、1、2、3、4分对应0-5%、6-25%、26-50%、51-75%、>75%；同时每个染色点评分：0、1、2、3分对应未显色、淡黄、棕色、深棕色。ARNT免疫组化评分=阳性计数得分×阳性点得分。相应评级为：“—”(阴性,0分),“+”(弱阳性,1-3分),“++”(阳性,4-6分),“+++”(强阳性,7-9分)。ARNT免疫组化评分>3为高表达；≤3为低表达。CEA、Ki-67蛋白的表达测量与评价法为常用方法。六、ARNT的表达水平与临床病理参数的分析应用免疫组化的方法检测2012年08月至2013年02月间手术获取的44例结直肠腺癌癌肿组织ARNT、CEA、Ki-67蛋白的表达等水平,记录相应的结直肠腺癌患者的的年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、TNM分期等临床病理参数。应用χ2检验方法探索ARNT的表达与个临床病理指标间的关联性。七、ARNT的表达与结直肠癌患者术后预后的生存分析2007年6月到2008年12月的手术患者共165例均随访到2013年12月,中位随访时间为51.2个月。患者在术后第一年内每隔3个月接受住院复查,此后6月随访一次接受电话随访,每1年返院检查肿瘤是否复发、转移；每次均行电子结肠镜、腹部增强CT检查,如果有可疑病例可进一步行磁共振或PET检查。对复发的患者根据相关NCCN指南继续规范治疗。随访指标为总生存时间(定义为手术日期至死亡日期,或随访截止日期)、无瘤生存时间,复发时间定义为手术日期至临床确诊肿瘤复发时间；复发患者随访至其死亡或最后随访日期。患者的生存时间、肿瘤复发时间与肿瘤组织ARNT的表达水平情况进行生存分析。数据采用Kaplan-Meire法进行生存分析,探讨ARNT表达水平对生存率和肿瘤复发的影响。八、统计方法应用配对t检验方法分析结直肠癌肿瘤组织与癌旁组织间的ARNT mRNA和蛋白表达情况；χ2检验分析ARNT表达与临床、随访的各个指标的关系；应用Kaplan-Meier法中的对数秩检验法来制作生存分析曲线。所有统计方法均用专业统计软件包SPSS13.0(SPSS Inc., USA)完成,P<0.05表示有统计学差异。结果：一、荧光定量PCR来分析ARNT mRNA表达应用荧光定量PCR法测定44组符合研究标准的结直肠腺癌手术标本(肿瘤组织、正常组织)测量ARNTmRNA的表达情况。扩增产物熔解曲线呈单峰状态,未发现非特异性扩增,2-ΔΔct法验证目的基因(ARNT)和内参基因(GAPDH)扩增效率相同。2-Δct法比较癌肿组织与正常组织的ARNT mRNA的表达,结果显示有33组肠癌组织中ARNT表达较正常组织表达减低,结果有统计学意义(P=0.0238)。二、Western Blot法测定ARNT蛋白的表达应用Western Blot技术检测各组手术标本(结直肠腺癌组织、正常结直肠组织)中ARNT基因编码的蛋白的表达情况。结果显示,ARNT编码蛋白分子量约87kDa,与文献报道吻合；同时应用灰度值进行进一步测量蛋白含量,并通过与内参GAPDH条带比较。44组手术标本中,与同体的正常结直肠组织比较,有28(63.6%)例ARNT编码蛋白表达减低。提示结直肠腺癌组织中,ARNT蛋白表达下调；与荧光定量PCR的结论相一致。叁、免疫组化法分析ARNT的表达级别免疫组化方法对44例肠癌手术石蜡标本(肠癌组织、正常组织)进行检测。结果显示：ARNT蛋白主要表达于细胞核内,偶可见表达于细胞质；与文献报道的研究结果相符合。根据实验方法计算各个组织切片的ARNT的免疫组化表达评分；其中22例(50.0%)肿瘤组织ARNT为高表达,正常组织中有37例ARNT为高表达；正常肠道组织ARNT表达水平明显高于与对应的结直肠腺癌肿瘤组织(P<0.01)。四、ARNT的表达级别与临床病理特点的联系分析免疫组化切片中结直肠腺癌组织中ARNT的蛋白表达水平与对应患者的年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、TNM分期等病理指标的相关性,以及CEA、Ki-67蛋白的表达等的临床联系。结果显示：ARNT的高表达与肿瘤的分化程度呈正相关(P=0.0283),与TMN分期(Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期)呈负相关(P=0.0331),与患者的性别、年龄、肿瘤大小、CEA、Ki67等指标无明显相关性。五、ARNT表达水平与结直肠癌患者的生存分析分析2007年6月到2008年12月的手术患者共165例结直肠癌患者肿瘤石蜡切片ARNT的表达情况；其中98/165例为ARNT高表达。肿瘤组织ARNT高表达患者的总生存时间明显高于ARNT低表达的患者(55.7个月VS39.4个月；P<0.01)；患者平均无瘤生存时间,ARNT高表达患者明显高于ARNT低表达患者(46.5个月,28.3个月；P<0.01)。67名肿瘤组织ARNT低表达的患者在术后五年内出现复发50例,同期98例ARNT高表达组只有58名患者出现复发；提示肿瘤内ARNT的表达水平是影响总生存时间和复发率和预后因素。结论一、ARNT在人结直肠组织、结直肠腺癌组织内均有表达,以细胞核表达为主。二、应用PCR、Western Blot与免疫组化检测技术,与人正常结直肠组织对比,结直肠腺癌内ARNT呈低表达状态。叁、ARNT在结直肠腺癌低表达与肿瘤的分化程度呈负相关,与肿瘤的TNM分期呈正相关。四、结直肠腺癌组织ARNT高表达的患者拥有更好的术后的生存时间与无瘤生存时间,可能为预后的影响因素。(本文来源于《南方医科大学》期刊2014-05-19）
核转运蛋白论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:探讨核转运蛋白基因(karyopherin, KPNA)2在皮肤恶性黑素瘤临床预后中的作用。方法:应用GEO数据库数据分析,比较KPNA2 mRNA在正常皮肤组织、恶性黑素瘤中表达的差异,并进一步利用两种在线数据库进行生存分析,分析KPNA2 mRNA与皮肤恶性黑素瘤的预后之间的关系。结果:KPNA2 mRNA水平在正常皮损组织中明显要低于恶性黑素瘤组织,差异有统计学意义(P<0.05);同时生存分析显示KPNA2 mRNA表达水平与皮肤恶性黑素瘤的预后具有的显着相关性,其表达水平高则预后差(P<0.05)。结论:KPNA2与皮肤恶性黑素瘤临床预后密切相关,为皮肤恶性黑素瘤治疗提供潜在靶点。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
核转运蛋白论文参考文献
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