导读:本文包含了毕赤酵母表面展示论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:毕赤酵母表面展示,非水相酶催化,南极假丝酵母脂肪酶B,南极假丝酵母脂肪酶A
毕赤酵母表面展示论文文献综述
张锟[1]（2018）在《毕赤酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶催化体系及其应用》一文中研究指出酵母表面展示技术又被称为“Arming yeast”技术,使外源蛋白或短肽的表达、纯化、固定化于一体,可以直接应用于全细胞催化,从而省去分泌外源蛋白提取纯化和固定化的繁琐工艺流程,节约成本。酵母表面展示酶在生物催化和生物转化制造生化产品等方面表现出良好的性能,是绿色生物制造领域的研究热点。本论文基于毕赤酵母展示技术进一步研究毕赤酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)和毕赤酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶A(CALA)的非水相催化体系,并通过改造拓展应用范围,为开发酵母表面展示脂肪酶全细胞催化剂在绿色生物制造领域的潜在应用提供理论和技术基础。具体研究内容及结果如下:(1)毕赤酵母展示CALB催化酯化柑橘精油增香以13种柑橘精油为反应的底物和溶剂,研究酵母展示CALB催化以复杂成分混合物为底物时的酯化体系,解决复杂底物不同组分对于酶催化的影响。结果表面酶催化柑橘精油中酯类物质的含量有10%到1170%不等的增幅,且表现出新的芳香特性,抑菌性质也稍微增强。柑橘精油中的羧酸成分为酶催化精油中新增乙酯的酰基供体。(2)毕赤酵母酵母展示CALB催化转酯化体系及萜烯醇芳香酯合成以苯甲醇为底物,研究酵母展示CALB催化转酯化合成的体系。苯甲醇的摩尔转化率达到97.2%,重复反应5次,酵母展示CALB仍保留初始活力的82.3%。酵母展示CALB应用于多种萜烯醇和含苯环的芳香醇的合成,转化率大于80%。并初步探讨了酵母展示CALB催化酶法拆分顺反式同分异构体香叶醇-橙花醇的能力。(3)毕赤酵母表面展示CALB转酯化动力学拆分仲醇的立体选择特性在酵母展示CALB催化转酯化体系的基础上,研究有机溶剂中酵母展示CALB动力学拆分仲醇的催化体系,探讨CALB展示在毕赤酵母表面对于其立体选择特性的影响。毕赤酵母展示CALB催化拆分多种仲醇的对映体选择性值大于600,且该酶对于短直链仲醇具有偏好性,但不能催化空间位阻较大的仲醇。通过与商品酶Novozyme 435比较,毕赤酵母表面脂肪酶不影响酶的立体选择特性。研究在无溶剂和高浓度底物体系中评价酵母展示CALB催化仲醇的动力学拆分,结果发现该酶在无溶剂体系较有机溶剂体系具有更高的时空效率。(4)连接肽提高毕赤酵母展示CALB的催化活力在以上催化反应体系构建的基础上,通过在酵母展示CALB的锚定蛋白和展示蛋白之间插入连接肽改进细胞展示脂肪酶的催化活力。研究发现插入PAPAP连接肽的重组菌水解酶活力最高提升了114.8%,且重组菌的非水相酯化活力和转酯化活力最高分别提升了6.6倍和1.3倍。通过流式细胞仪分析和脂肪酶活性中心滴定方法证明插入连接肽提高了酵母展示CALB的载酶量,说明酵母展示CALB催化活力的提高与CALB载酶量的提高相关。(5)毕赤酵母表面展示CALA的构建及其非水相转酯化特性CALA与CALB不同对于大位阻的仲醇和叔醇有较高的催化能力。首先成功构建了毕赤酵母表面展示CALA菌株,其菌体水解活力达到6331.6 U/g,高于目前报道的80.4 U/g。同时探讨了其在非水相体系中的底物醇的选择性,并将其应用于催化转酯化合成丁酸橙花酯和动力学拆分DL-薄荷醇。并通过定点突变技术提高CALA催化拆分DL-薄荷醇的立体选择性,CALAL367I突变蛋白展示菌株动力学拆分DL-薄荷醇产物ee值由野生菌的63%提升至72.9%。(本文来源于《华南理工大学》期刊2018-04-12）
徐晓敏,黄奎,韩双艳[2]（2018）在《无溶剂体系中毕赤酵母表面展示CALB全细胞催化合成肉桂醇酯》一文中研究指出利用表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)的毕赤酵母细胞(Pp-CALB)为全细胞催化剂,以不同脂肪酸作为酰基供体,在无溶剂体系中和肉桂醇发生酯化反应合成肉桂醇酯。探究了Pp-CALB对于不同酰基供体的选择性,并且对反应温度、摇床转速、酶加量、底物摩尔比、酶的水活度和反应体系等一系列影响酶催化反应的因素进行了优化,建立了无溶剂体系中肉桂醇酯的酶法合成工艺。结果表明,在底物摩尔比为2:1,摇床转速为120 r/min,反应温度为50℃的条件下,添加初始水活度为0.53的Pp-CALB 0.05 g,反应3h,肉桂醇的酯化率可达81.34%,在最适反应条件下,使用Pp-CALB连续反应8次后,肉桂醇的酯化率仍然能达到70.00%以上,具有较好的操作稳定性。(本文来源于《现代食品科技》期刊2018年05期）
余道兵,程学松,王群,史艳可,张昕[3]（2018）在《植酸酶基因的定点突变及其在巴斯德毕赤酵母表面展示》一文中研究指出为解决植酸酶在制粒过程中易变性失活的问题,以黑曲霉(Aspergillus niger)ZJUY中的植酸酶基因phy A为亲本,借助聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)介导的定点突变,对植酸酶基因的关键位点进行密码子优化、引入氢键以及二硫键Cys196-Cys446的缺失突变;凭借无缝克隆成功将锚定片段FS和携带标签Flag的目的片段phy A插入酵母表达载体pPICZαC中;采用氯化锂转化法,将构建的8个表达载体pPICZαC-FS/phy A通过同源重组的方式整合到巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)GS115基因组上。细胞免疫荧光染色和流式细胞仪检测证实,基因改良后的植酸酶在巴斯德毕赤酵母细胞表面成功展示。重组菌株A31、A61和A84的植酸酶活性均可达7 000 U/g。与分泌型植酸酶相比,展示酶具有更好的高温和酸碱耐受性,其中菌株A61在90℃水浴处理1h后仍有18%的酶活,在pH 1.6~4.0范围内,残余酶活保持在80%以上。菌株A61这一特性可以克服制粒过程中(60~90℃)植酸酶变性失活的不足,能够较好地满足动物饲料用酶的需求。(本文来源于《浙江大学学报(农业与生命科学版)》期刊2018年01期）
王框[4]（2018）在《表面展示α-葡萄糖苷酶毕赤酵母的固定及其在低聚异麦芽寡糖合成中的应用》一文中研究指出低聚异麦芽寡糖(IMO)作为一种功能性食品添加剂,受到越来越广泛的关注。毕赤酵母表面展示酶技术,是将生物酶固定在毕赤酵母表面,以提高酶的稳定性及重复利用性。以毕赤酵母表面展示酶细胞为催化剂,在固定床中连续催化麦芽糖底物合成IMO反应过程,毕赤酵母均匀分散在反应液,不能实现连续化操作。因而需要对毕赤酵母展示酶进行二次固定,即对酵母细胞进行固定,以加速毕赤酵母的沉降速度。本文以毕赤酵母表面展示α-葡萄糖苷酶(黒曲霉来源)催化麦芽糖底物合成IMO。利用四氧化叁铁的高顺磁性,在四氧化叁铁微球上包裹壳聚糖作为固定毕赤酵母细胞的载体。本文以微波法制备包覆壳聚糖的磁性微球,经戊二醛溶液处理后,用于展示酶毕赤酵母细胞的固定,并对固定化菌的性质及催化效果进行了研究。本课题的研究内容和结果如下:(1)分别以海藻酸钙包埋、戊二醛交联法对表面展示α-葡萄糖苷酶的毕赤酵母菌体(I-Pp-ANGL-GCW61)进行固定化研究,并在固定床中实现IMO的连续化生产。以海藻酸钙包埋法固定毕赤酵母菌体,固定床中,底物停留时间为28.26min时,IMO的转化率为6%(w/w)。以戊二醛交联毕赤酵母菌体,固定床中IMO转化率为21%(w/w),菌体转苷活力降低了70%。(2)以醛基修饰的壳聚糖磁性微球载体固定表面展示α-葡萄糖苷酶的毕赤酵母菌体(I-Pp-ANGL-GCW61),表面展示α-葡萄糖苷酶的毕赤酵母菌体(Pp-ANGL-GCW61)经固定化及冻干后其转苷合成活力为游离菌体转苷合成活力的85%,I-Pp-ANGL-GCW61热稳定性良好,55℃时其转苷合成活力半衰期达36 h。通过优化菌体的固定化量,结果表明单位质量载体Pp-ANGL-GCW61最优固定化量为5.863 g,Pp-ANGL-GCW61固定化效率为51.83%。(3)研究I-Pp-ANGL-GCW61的重复利用次数对菌体活力影响,结果表明,1-5次重复利用中α-葡萄糖苷酶活力维持在80%以上。(4)设计并制作一套固定床反应器,在固定床反应器中填充I-Pp-ANGL-GCW61用以连续催化麦芽糖底物合成低聚异麦芽寡糖(IMO)。固定床中填充30 g固定化菌体,优化底物停留时间,当停留时间为36.42 min时,IMO产率最高为12.12 g/h,底物转化率为36.69%。相较于间歇釜中35.8 g/L/h的IMO生产效率,固定床中的IMO生产效率提高了19.83%,达到42.9 g/L/h。(本文来源于《华南理工大学》期刊2018-01-10）
徐晓敏[5]（2017）在《毕赤酵母表面展示脂肪酶CALB全细胞催化合成肉桂醇酯》一文中研究指出肉桂醇酯是一类非常重要的芳香类化合物,具有令人愉快的果香、花香气息,广泛的被应用于食品、日化以及医药行业。其合成方法受到国内外研究者的广泛关注。目前,市面上的肉桂醇酯大部分是由化学方法合成。在香精香料的生产过程中,化学反应虽然催化效率较高,但存在催化剂制备工艺复杂,反应条件苛刻,生成大量副产物导致目的产物分离困难,有害物质排放量大等问题。这些因素很大程度上影响了产物的纯度以及品质。与传统的化学合成法相比,酶促反应合成香精香料以其催化效率高,反应条件温和,产物纯度高以及环境友好等特点,开始受到人们的青睐。因此,为酶促合成肉桂醇酯找到合适的生物催化剂,实现其绿色酶法制备,并使该方法能在工业上大规模使用,具有广泛的经济效益,成为目前研究的热点。商品脂肪酶酶活较高,能高效催化各种酯化、转酯、水解反应,且便于回收和重复使用,但其价格昂贵,无法大规模的应用于工业上生产。而毕赤酵母能够高效地表达外源蛋白,利用这一特性,通过酵母细胞表面展示系统将脂肪酶CALB锚定在毕赤酵母细胞表面,然后将其进行高密度发酵,得到大量表面展示有CALB脂肪酶的毕赤酵母细胞。再经过低温冷冻干燥即可作为全细胞生物催化剂应用到有机合成反应中。该全细胞生物催化剂不但具有固定化酶的优点,且生产工艺简单,能够有效降低工业生产成本。首先,针对市面上作为香精香料的肉桂醇系列酯,利用本实验室自制毕赤酵母表面展示脂肪酶CALB(Candida antarctica lipase B-displaying Pichia pastoris,Pp-CALB),对其合成的可行性进行了一个初步探索,随后对Pp-CALB合成附加值较高的乙酸肉桂酯的反应条件进行了系统优化。乙酸肉桂酯的合成:在无溶剂体系中,通过全细胞生物催化剂Pp-CALB催化肉桂醇与乙酸乙烯酯发生转酯反应合成乙酸肉桂酯。并对影响反应的因素进行了系统优化,优化后的反应条件为:在10 ml具塞锥形瓶中,加入6 mmol肉桂醇,体系初始水活度0.53,底物摩尔比(乙酸乙烯酯:肉桂醇)2:1,摇床转速120 r/min,反应温度50℃,Pp-CALB 0.05 g,反应3 h,肉桂醇酯化率可达81.34%。过滤回收反应后的Pp-CALB,将其洗净喷干,用于下一次反应,连续反应8次,肉桂醇酯化率仍可达到70.00%以上,全细胞生物催化剂Pp-CALB表现出了良好的操作稳定性。在单因素优化基础上,以反应温度,底物摩尔比,Pp-CALB添加量,摇床转速等显着影响因素作为实验因素,采用四因素叁水平的正交实验设计,研究这4个因素及其交互作用对肉桂醇酯化率的影响。经过系统分析,得出最佳反应条件:反应温度50℃,摇床转速120 r/min,Pp-CALB添加量0.06 g,底物摩尔比(乙酸乙烯酯:肉桂醇)1.5,体系初始水活度0.53,反应时间3 h。肉桂醇酯化率接近89.00%,高于单因素条件优化下的肉桂醇酯化率(81.00%)。在摇瓶反应体系的正交实验优化基础上,采用2 L搅拌反应装置,将反应体系放大到2 L。在体系初始水活度0.53,Pp-CALB添加量31.3 g,底物摩尔比1.5,搅拌转速120 r/min,反应温度50℃的条件下,反应3.5 h,肉桂醇酯化率达到88.00%以上,与摇瓶反应水平基本齐平。结果表明,全细胞生物催化剂Pp-CALB在反应放大过程中仍可高效催化合成乙酸肉桂酯,且放大反应重现性较好。最后,利用减压蒸馏法对反应液中的乙酸肉桂酯进行了粗提取,得到的乙酸肉桂酯产品纯度可达87.24%。本研究为毕赤酵母表面展示脂肪酶CALB工业化生产肉桂醇系列酯提供了可靠依据。(本文来源于《华南理工大学》期刊2017-12-28）
余道兵[6]（2017）在《黑曲霉植酸酶基因的定点突变及其在毕赤酵母的表面展示》一文中研究指出黑曲霉植酸酶PHYA目前被公认为最具应用前景的饲用植酸酶之一,但是野生型菌株所产生的植酸酶不能满足工业生产的需求,本研究以Aspergillus niger ZJUY中的植酸酶基因phyA为亲本,借助定点突变的方法,对植酸酶的关键位点的密码子进行优化,并引入氢键(T295S,Q296R和V43N)和对二硫键Cys196-Cys446进行缺失突变,以解决植酸酶在制粒过程中易变性失活的问题。最终将絮凝素Flo1p与改造过的植酸酶以N端融合的方式,展示在Pichia pastoris GS115细胞表面,用1%的甲醇进行诱导表达,通过细胞免疫荧光染色和流式细胞仪检测,证实植酸酶在毕赤酵母细胞表面成功展示。本研究的主要研究结果如下:(1)以黑曲霉基因组为模板,通过叁轮PCR获得去除内含子的植酸酶基因phyA,该法的优势在于在所提取的RNA质量较差的情况下仍可获得完整的去除内含子的植酸酶基因。(2)以野生型的PHYA为亲本,通过PCR最终成功引入R62、H63、G64、R66、P68、R146、H342、D343、S295、R296、N43和S446等12个突变位点,突变效率较高,操作简便易行。(3)借助无缝克隆的方法,成功将锚定片段FS、携带标签Flag的目的片段phyA插入到酵母表达载体pPICZαC中,相比于采用传统的载体构建方法,该法阳性克隆效率较高。(4)采用氯化锂转化的方法,成功将构建的8种表达载体pPICZαC-FS/phyA通过同源重组的方式整合到毕赤酵母GS115基因组上,并通过甲醇的诱导成功展示到GS115细胞表面。(5)通过展示酶特性的研究发现,二硫键Cys196-Cys446的缺失能够使展示酶的内源荧光的发射波长发生红移,改变了酶分子的构象。此外,二硫键Cys196-Cys446的缺失突变能够提高展示酶对底物的亲和力和底物专一性,但会使催化效率下降。(6)展示植酸酶引入氢键和缺失二硫键会导致酶促反应的最适温度和最适pH发生一定程度的改变。(7)通过热稳定性的研究发现,重组菌株A61在90℃水浴处理的过程中,展示酶活丧失比较缓慢,这一特性可以克服制粒过程中(60~90℃)植酸酶变性失活的不足。(8)通过酸碱耐受性研究发现,重组菌株A31、A61、A84在pH 1.6-4.0的范围内,残余酶活均保持在80%以上,可以较好的满足动物饲料用酶的要求。(9)金属离子Na~+、K~+、Fe~(2+)、Zn~(2+)在低浓度时可以激活展示植酸酶的活性,而Cu2+、Mn2+、Co2+对展示植酸酶主要表现为抑制作用。(本文来源于《浙江农林大学》期刊2017-06-18）
徐燕杉[7]（2017）在《黑曲霉α-葡萄糖苷酶在毕赤酵母的表面展示及催化合成低聚异麦芽糖的研究》一文中研究指出低聚异麦芽糖(isomalto-oligosaccharides,IMO)是一种益生元,由于其促进益生菌生长、非发酵性、对人体无害、容易搭配到饮食等优点,在食品工业中需求量巨大。目前,工业上最常采用的是利用α-葡萄糖苷酶的高转苷活力催化合成IMO。低聚异麦芽糖的工业生产最先源于日本,利用黑曲霉α-葡萄糖苷酶将麦芽糖转化成IMO。黑曲霉α-葡萄糖苷酶(ANGL)具有底物浓度要求低、耐高温、转苷活力强的特点。毕赤酵母表面展示体系是一种通过生物细胞固定酶的真核表达体系。诱导表达后,展示外源蛋白的毕赤酵母重组菌株经过冷冻干燥或喷干,制备成为全细胞催化剂参与催化反应。本课题将通过毕赤酵母密码子优化的来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的α-葡萄糖苷酶编码基因全基因合成后,利用实验室保存的展示型毕赤酵母表达载体pKDCBGL-GCWn(12,19,21,49,61),成功将黑曲霉α-葡萄糖苷酶(ANGL)展示在毕赤酵母表面,测定发现其具有高转苷活力,优化其转苷反应条件,同时进行了全细胞催化剂在2 L反应釜中合成低聚异麦芽糖的重复利用性研究。本课题的研究内容和结果如下:(1)黑曲霉α-葡萄糖苷酶在毕赤酵母的表面展示:基于GPI型细胞壁蛋白Gcw12p、Gcw19p、Gcw21p、Gcw49p、Gcw61p构建了展示型表达载体pKANGL-GCWn(n=12,19,21,49,61),得到了展示型重组毕赤酵母菌株GS115/pKANGL-GCWn(n=12,19,21,49,61),生长曲线比对发现外源蛋白的展示没有对重组菌株的正常生长造成明显影响。ANGL水解酶活力及转苷活力的检测结果表明,ANGL经由5种毕赤酵母内源GPI型细胞壁蛋白均成功展示于酵母细胞表面,且具有较高生物活性。摇瓶发酵条件下诱导120h后测定水解酶活,发现以Gcw61p、Gcw19p作为锚定蛋白时,展示型ANGL转苷合成低聚异麦芽糖的酶活力较高,分别为:2.88 U/g、2.51U/g。同时,尝试构建多个锚定蛋白共表达重组毕赤酵母菌株,得到的重组菌株中,水解活力最高的是GS115/ANBGL-GCW(61+19),发酵120h后水解酶活5.16 U/g。(2)基于Pp-ANGL-GCW61的2-mL体系的转苷反应条件优化:将发酵120h的GS115/ANGL-GCW61酵母细胞冷冻干燥,制成全细胞催化剂Pp-ANGL-GCW61,以麦芽糖作为底物,对催化反应的pH、温度、底物浓度以及全细胞催化剂添加量进行优化。优化后的2 m L反应体系:62.5 mg/ml Pp-ANGL-GCW61,300 mg/ml麦芽糖,2 mL 0.04 M Britton Robinson缓冲液(pH 4.0),55?C,200 rpm。反应2 h,麦芽糖生成低聚异麦芽糖的转化率达到约45%。(3)基于Pp-ANGL-GCW61的2-mL、2-L反应体系重复利用:高速离心回收菌体,冷冻干燥后,全细胞催化剂重复利用3次。在2 L反应釜中,利用2-m L体系优化后的反应条件,进行2-L转苷合成低聚异麦芽糖反应体系的重复利用实验。2-m L、2-L体系的重复利用转化率曲线较为一致,随重复利用次数增加,达到最高转化率的时间有所延长,但叁次重复利用的转化率曲线的差异不大,反应5 h时,重复利用第3次的麦芽糖转化率在30%左右。(本文来源于《华南理工大学》期刊2017-06-08）
朱俊[8]（2016）在《毕赤酵母细胞壁多糖合成相关基因GAS1和MNN2对毕赤酵母表面展示效率的影响》一文中研究指出华南理工大学硕士2017Q814毕赤酵母细胞壁多糖合成相关基因GAS1和MNN2对毕赤酵母表面展示效率的影响Cell Wall Polysaccharide Synthesis Related Genes GAS1 and(本文来源于《华南理工大学》期刊2016-12-25）
黄奎[9]（2016）在《疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在毕赤酵母表面展示》一文中研究指出疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)是一种耐热性好、位置特异性和区域选择性较强的脂肪酶,在洗涤剂、化妆品、生物化工等领域有良好的应用前景。但目前商品化的TLL多是固定化酶,在经分离纯化获得游离酶蛋白后还需要固定化,因而价格偏高,限制了广泛应用。酵母表面展示技术是近年研究热点之一,借助基因工程方法将细胞壁蛋白与酶蛋白的融合,从而实现在标准发酵过程中,将外源蛋白固定于酵母细胞表面,类似于酶的固定化。毕赤酵母表面展示系统是发展迅速且应用前景广阔的真核表达系统,它不仅具有分子遗传操作简单的优点,同时能够在强诱导性启动子AOX1的作用下实现高密度表达。因此,将TLL展示在毕赤酵母表面为寻求性价比更高的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶催化剂提供了良好的思路。目前对疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的研究相比其它脂肪酶而言比较少,在TLL1(GenBank:ABV69591.1)和TLL2(NCBI Accession:O59952)这两个基因上也只有少数研究报道。本课题首先将TLL1优化后的基因,分别以带自身信号肽序列片段和不带自身信号肽序列片段的形式,与毕赤酵母内源壁蛋白Gcw51p、Gcw61p的基因串联,构建了pPIC9k-sTLL1-GCW61、pPIC9k-TLL1(Δsig)-GCW61、pPIC9k-sTLL1-GCW51和pPIC9k-TLL1(Δsig)-GCW51四种展示表达质粒。然后将这四种质粒转入毕赤酵母GS115,从而构建出四种相应的高水解酶活的重组表面展示菌株。然后将所得四种菌株进行摇瓶水平发酵,并对脂肪酶表达情况进行了研究。结果表明,疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶成功在毕赤酵母表面展示,并表现出一定水解活力,具体为GS115/pPIC9k-s TLL1-GCW61,205.24U/g;GS115/pPIC9k-TLL1(Δsig)-GCW61,118.69U/g;GS115/pPIC9k-sTLL1-GCW51,97.33U/g;GS115/pPIC9k-TLL1(Δsig)-GCW51,26.50U/g。初步得出结论:(1)该展示系统有效,(2)对于TLL,锚定蛋白Gcw61p展示效果好于锚定蛋白Gcw51p,(3)对于TLL,带目的基因自身信号肽的酶活高于不带目的基因自身信号肽的。其次将TLL2做目的基因,构建了GS115/pPIC9k-TLL2-GCW61和GS115/pPIC9k-TLL2-GCW51展示表达菌株,其酶活为172.34U/g和84.19U/g。由于酶活未有提高,故改用本实验室构建并改造后的PHKA-AOX高分泌表达质粒作展示表达质粒,并通过叁丁酸甘油酯平板初筛和摇瓶水平复筛,筛选出GS115/PHKA-AOX-TLL2-GCW61展示表达菌株,其摇瓶发酵144h后,菌体酶活最高可达1964.76U/g。然后对GS115/PHKA-AOX-TLL2-GCW61进行了免疫荧光标记,进一步确证脂肪酶被展示在细胞表面。其发酶液经真空冷冻干燥后,用于该脂肪酶酶学性质的研究。其最适底物为对硝基苯酚己酸酯,最适作用温度为55℃,最适作用pH为9.0,在70℃中保存90min,酶活力仍保存70%以上,具有较高耐热的特性。Ca~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)对酶有强烈的激活作用,Cu~(2+)、Fe~(2+)、Fe~(3+)、K~+、Li~+、Na~+、Co~(2+)对酶有强烈抑制作用,Ba~(2+)、Mg~(2+)、Ni~(2+)对酶影响不大。本课题所构建的展示TLL2全细胞催化剂,具高酶活、耐碱性和热稳定高等特点,这为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在工业上广泛应用奠定一定基础,也为其他脂肪酶的工业化应用提供解决思路。(本文来源于《华南理工大学》期刊2016-12-25）
李梦悦[10]（2016）在《毕赤酵母表面展示海藻糖合酶技术的研究》一文中研究指出海藻糖合酶是一种能够一步法转化麦芽糖生成海藻糖的酶制剂,其底物专一性较高,使用该酶生产海藻糖工艺简单,不受底物麦芽糖浓度的影响,是工业生产海藻糖的首选。为获得具有生产海藻唐合酶能力的毕赤酵母表面展示载体,以实验室筛选的恶臭假单胞杆菌Pseudomonas putide P06海藻糖合酶基因为模板,PCR扩增得到海澡糖合酶基因(tres,2064 bp),连接至pPICZαA质粒中,获得重组质粒pPICZαA-tres。以来自pEGFP-N1质粒的增强型绿色荧光蛋白的基因(egfp,720bp)为外源展示蛋白编码基因,以来源于酿酒酵母的共价连接酵母细胞壁的Pir系列蛋白的Pir1p成熟肽作为毕赤酵母表面展示的锚定蛋白,利用PCR技术扩增得到pir1p(847 bp),连接至重组质粒pPICZαA-tres中,构建成pPICZαA–tresegfp-pir1p重组质粒。将重组质粒pPICZαA–tres-egfp-pir1p利用电转技术转化进毕赤酵母GS115中,外源蛋白在α-factor信号肽的引导下分泌表达并锚定到细胞壁上,展示在细胞壁表面。经流式细胞仪检测到荧光强度,说明外源蛋白成功展示到毕赤酵母,并以此为判断依据优化出外源蛋白表达量较高的发酵条件。继续将pir1p(847 bp)连接至重组质粒pPICZαA-tres中,重新构建重组质粒pPICZαA–tres-pir1p,转化至毕赤酵母GS115,筛选出阳性克隆子,进行发酵试验。发酵产物经离心、破碎并使用昆布多糖酶水解、洗脱,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析可见明显融合蛋白条带,说明海藻糖合酶已成功锚定在毕赤酵母表面。将重组毕赤酵母使用pH 7.5的缓冲液清洗并重悬,与底物浓度为300g/L的麦芽糖在30℃-60℃水浴条件下作用2 h,反应产物藻利用HPLC检测,能够检测到海藻糖合酶学活性300.65 U/g。在优化后的酶促反应条件pH 7.5,50℃表面展示海藻糖合酶的酶活达到600.65 U/g。40℃-50℃之间酶活较稳定,保温60 min后残留酶活的相对活力达75%以上;最适的反应pH值为7.5,并在偏碱性环境下稳定。(本文来源于《齐鲁工业大学》期刊2016-05-28）
毕赤酵母表面展示论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
利用表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)的毕赤酵母细胞(Pp-CALB)为全细胞催化剂,以不同脂肪酸作为酰基供体,在无溶剂体系中和肉桂醇发生酯化反应合成肉桂醇酯。探究了Pp-CALB对于不同酰基供体的选择性,并且对反应温度、摇床转速、酶加量、底物摩尔比、酶的水活度和反应体系等一系列影响酶催化反应的因素进行了优化,建立了无溶剂体系中肉桂醇酯的酶法合成工艺。结果表明,在底物摩尔比为2:1,摇床转速为120 r/min,反应温度为50℃的条件下,添加初始水活度为0.53的Pp-CALB 0.05 g,反应3h,肉桂醇的酯化率可达81.34%,在最适反应条件下,使用Pp-CALB连续反应8次后,肉桂醇的酯化率仍然能达到70.00%以上,具有较好的操作稳定性。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
毕赤酵母表面展示论文参考文献
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标签：毕赤酵母表面展示; 非水相酶催化; 南极假丝酵母脂肪酶B; 南极假丝酵母脂肪酶A;