导读:本文包含了复制抑制剂论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:UL36,抑制剂,马立克氏病毒,去泛素化酶
复制抑制剂论文文献综述
王梦涵[1]（2019）在《去泛素化酶UL36~(USP)抑制剂的筛选及其对MDV复制的抑制作用》一文中研究指出鸡的马立克氏病(Marek’s Disease,MD)是由致病型马立克氏病毒(Marek’s Disease Virus,MDV)引起的淋巴细胞组织增生性传染病,具有高传染性和高致病性,可造成养禽业严重的经济损失。MDV是一种α-疱疹病毒,具有高致病性。MDV分为叁种血清型,致病型MDV属于血清I型,而血型II型和III型可感染鸡但不致病,被作为抗MD疫苗广泛地应用于马立克氏病的防治。随着各种疫苗的使用,出现了更强毒力的MDV(vv)甚至是MDV(vv+),MDV毒力一直呈不断增强的趋势,是否还会出现更强毒力的MDV还无法确定。去泛素化酶是可以将泛素分子从泛素化底物或聚泛素化链上移除的一类异肽酶。细胞中的去泛素化酶通常参与各种细胞进程,例如细胞增殖、凋亡和病毒致病等过程中都发挥着重要作用。因此,一些去泛素化酶已经作为靶点用于抗癌药物的筛选。UL36-480蛋白是由MDV病毒编码的一段具有去泛素化酶活性的被膜蛋白。破坏其去泛素化酶活性可抑制MDV在鸡细胞内的复制、包装,以及MDV的传播,从而阻止MDV所致的鸡的MD肿瘤病。本研究以UL36作为靶点,筛选出有效抗MDV的化合物并在细胞水平上进行了验证。首先通过SDS-PAGE对十种化合物进行筛选,初步筛选出2种有效抑制UL36的化合物,分别为b-AP15和LDN-57444。然后对这两种化合物进行抑制反应动力学分析,拟合动力学曲线并计算Km值和V_(max)。结果表明,b-AP15和LDN-57444这两种抑制剂对UL36蛋白有良好的抑制作用,且均为非竞争性抑制。为了进一步验证这两种抑制剂的抗病毒作用,我们在细胞水平上进行验证。首先利用CCK-8测定抑制剂可作用于抗病毒的最大安全浓度,然后利用蚀斑减少法测定抑制剂对MDV抗病毒作用。结果表明,b-AP15和LDN-57444两种抑制剂可以抑制MDV在细胞内的复制,也可以抑制MDV在细胞内的水平传播。本研究最终确定了b-AP15和LDN-57444对UL36蛋白有抑制作用和抑制类型。并从细胞水平验证了这两种抑制剂对MDV复制的抑制作用。本研究的体外结果为有效抑制MDV病毒在鸡细胞内的复制包装、有效防控MDV病毒的传播、提供了一种新的途径。(本文来源于《吉林大学》期刊2019-06-01）
汪欢[2]（2018）在《Hsp70抑制剂2-苯乙炔磺酰胺对Epstein-Barr病毒的复制和致癌性的影响及分子机制研究》一文中研究指出研究背景及目的:Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus,EBV),也称作人类疱疹病毒4型(humanherpesvirus 4,HHV-4),是疱疹病毒γ亚科的成员之一。EBV在人群中广泛感染,能在体内建立有效的长期的潜伏感染,并难以从体内清除,同时可以引起多种癌症以及其它非恶性肿瘤病毒性疾病,如鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)、胃癌、伯基特淋巴瘤(Burkitt's淋巴瘤)、霍奇金淋巴瘤、传染性单核细胞增多症、淋巴增殖性疾病等。目前临床上所使用的抗EB病毒的主要药物是阿昔洛韦和更昔洛韦,这两者主要作用于病毒DNA聚合酶,但同时也影响着人类正常细胞DNA的复制,毒副作用较大,并且容易使机体细胞产生耐药性突变,临床效果相对并不理想。因此,探索发现新型的、毒副作用小的、具有靶向性的小分子抑制剂有着重要的临床意义。2-苯乙炔磺酰胺(2-phenylethynesulfonamide,PES)是热休克蛋白 70(heat shock protein 70,Hsp70)的小分子抑制剂,它可以与Hsp70相互作用,并破坏Hsp70与其共伴侣蛋白和底物蛋白的结合。近些年的研究表明,PES可以选择性地杀死肿瘤细胞,是一种很有前景的抗癌药物。本研究旨在观察PES对于EBV阳性细胞的影响并对其作用的分子机制进行初步的探索。方法:使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)活性检测试剂盒检测EBV阳性细胞(HONE1/Akata、HK1/Akata和B95-8)经不同浓度的PES处理不同时间后细胞活力的变化;同时,用CCK-8活性检测试剂盒检测Hsp70表达量的改变对EBV阳性细胞活力的改变情况。通过细胞平板克隆形成实验检测PES对EBV阳性细胞(HONE1/Akata和HK1/Akata)长期增殖的影响。通过细胞划痕实验检测PES对EBV阳性细胞的迁移能力是否有影响。通过流式细胞分析仪检测PES诱导EBV阳性细胞周期阻滞以及细胞凋亡的情况。通过蛋白印迹(Western blotting)实验检测EBV阳性细胞经浓度梯度的PES处理或其他各种不同条件处理后,目的蛋白表达水平的变化。通过荧光实时定量PCR技术(quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)检测EBV阳性细胞经PES处理后,目的蛋白mRNA水平的变化,以及PES对EBV阳性细胞中EB病毒基因组DNA复制的影响。通过流式细胞分析仪检测PES对诱导进入EBV裂解期的HONE1/Akata细胞中GFP荧光强度的影响。通过免疫共沉淀实验(co-immunoprecipitation,IP)以及免疫荧光实验(immunofluorescence,IF)检测Hsp70与EBNA1之间的相互作用,以及PES对这一相互作用的影响。使用HONEl/Akata细胞对裸鼠(BALB/c nude mice)进行致瘤后,用PES对裸鼠进行处理,观察PES对小鼠的体重、肿瘤的重量、肿瘤的体积以及肿瘤中EB病毒核抗原1(EB nuclear antigen 1,EBNA1)表达和EBNA1阳性细胞量的影响。结果:Hsp70功能抑制剂PES能明显降低EBV阳性细胞HONE1/Akata、HK1/Akata和B95-8的细胞活力,而对EBV阴性的正常人肾近曲小管上皮细胞HK2的增殖抑制影响不明显;过表达Hsp70能降低PES对细胞增殖的抑制作用,同时,沉默Hsp70可以加强PES对细胞增殖的抑制作用;PES能抑制EBV阳性细胞HONE1/Akata和HK1/Akata的迁移;PES能诱导EBV阳性细胞HONE1/Akata、HK1/Akata和B95-8周期阻滞在G2期,并通过抑制自噬溶酶体途径来促进细胞凋亡;PES可以明显降低EBV阳性细胞中EBNA1的表达水平,而对其mRNA水平的影响不大;PES对EBNA1的抑制作用并不是通过作用于Gly-Ala重复序列来实现的;PES也不是通过蛋白酶降解途径来诱导EBNA1的下调,同时也不影响其半衰期;PES能抑制诱导EBV进入裂解期后的HONE1/Akata和B95-8细胞内病毒基因组DNA的复制;过表达Hsp70可以增强EBNA1的表达量和细胞内病毒基因组DNA的产量,但是PES能以剂量依赖性的方式抑制这种作用;沉默Hsp70可以降低EBNA1的表达量以及细胞内病毒基因组DNA的产量,同时PES能以剂量依赖性的方式加强这种作用;Hsp70与EBNA1相互作用,但是PES能干扰这种相互作用;PES能明显抑制BALB/c裸鼠体内HONE1/Akata肿瘤的生长以及EB病毒的复制。结论和意义:本课题研究表明PES在体内和体外均能降低EBV阳性细胞中EBNA1的表达,抑制EBV阳性细胞的增殖、迁移,阻滞细胞周期,并通过抑制自噬溶酶体途径来促进细胞凋亡。Hsp70可以增加EB病毒编码蛋白EBNA1的表达,促进病毒基因组DNA的复制。PES可以通过抑制Hsp70的功能,从而抑制EBV阳性细胞中EBNA1的表达,并抑制病毒基因组DNA的复制。Hsp70可以与EBNA1相互作用,而PES可以抑制Hsp70与EBNA1之间的相互作用。通过对PES在EBV阳性细胞中抗肿瘤以及抗病毒作用的研究,为今后PES用于治疗EBV相关恶性肿瘤的研究提供了很好的理论基础和实际应用价值。(本文来源于《武汉大学》期刊2018-10-01）
尹利敏[3]（2018）在《Hsp90抑制剂通过降解乙型肝炎病毒核心蛋白HBc抑制HBV复制》一文中研究指出乙型肝炎病毒(HBV)感染是慢性肝炎、肝硬化、甚至肝癌发病的主要危险因素。热休克蛋白90(Heat shock protein 90,Hsp90)是细胞内重要的分子伴侣,其主要协助新合成的蛋白正确折迭,成功装配,功能稳定以及异常蛋白的降解等过程。有研究表明,Hsp90抑制剂使底物蛋白不能被Hsp90正确折迭,进而促进Hsp90招募E3泛素连接酶泛素化降解Hsp90的底物蛋白。Hsp90抑制剂由于可阻断细胞的生长增殖以及信号传递等功能,已成为癌症药物开发的热点。已有研究表明,Hsp90抑制剂能通过抑制HBV聚合酶与前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)相互作用而减少核糖核蛋白(RNP)复合物的形成,进而抑制病毒RNA包装和DNA复制等过程。然而,此研究仅仅在体外水平证明了Hsp90抑制剂对HBV复制过程的影响,在体内水平的相关研究未见报道。另外,此前有研究表明,HBV核心蛋白HBc也是Hsp90的一种底物蛋白,HBc在病毒复制周期和致病中扮演着重要的作用。Hsp90抑制剂是否能通过HBc进而影响HBV的包装及复制尚不清楚。因此,本课题拟探究Hsp90抑制剂通过HBc影响HBV包装和复制的机制,并进一步在HBV转基因小鼠动物水平予以证明。首先,构建Huh7-HBc稳转细胞株,并通过Western Blot验证其表达;Hsp90抑制剂(17AAG)处理Huh7-HBc,Western Blot检测显示17AAG能下调HBc蛋白的表达量,而Real-time qPCR检测表明17AAG对HBc mRNA水平无影响;另外,转染HBx或HBpol突变的HBV全基因证明17AAG以不依赖HBx或HBpol的方式下调HBc蛋白;随后,以亚胺基环己酮(cycloheximide,CHX)处理Huh7-HBc细胞,Western Blot检测显示17AAG可缩短HBc蛋白的半衰期。其次,为了检测17AAG对HBV复制能力的影响,以17AAG处理HepG2.2.15细胞,分别通过Western Blot、1%的琼脂糖凝胶电泳和Real-time qPCR检测细胞中HBc、衣壳蛋白及HBV DNA水平,结果发现17AAG在细胞水平抑制HBV包装和复制。最后,以17AAG处理HBV转基因小鼠,HBV核酸定量检测(PCR-荧光探针法)及HBsAg定量检测表明17AAG能降低转基因小鼠血清中HBV DNA及HBsAg水平;凝胶电泳及免疫组化检测显示17AAG可下调转基因小鼠肝脏中HBc的水平并抑制核衣壳形成;H&E染色发现17AAG对转基因小鼠肝脏的组织形态学无明显影响;Southern Blot检测证明17AAG能抑制转基因小鼠肝脏中HBV复制中间体DNA的合成。通过上述方法本研究发现17AAG在体内可抑制HBV的包装和复制。综上所述,本课题的研究结果证明Hsp90抑制剂17AAG抑制HBc的包装而使平衡趋向于HBc的降解,进而抑制HBV衣壳的形成,从而进一步抑制了HBV的包装及复制等过程。需要提及的是,本研究首次证明了Hsp90抑制剂能抑制HBV转基因小鼠中HBV的包装及复制,为HBV感染的治疗提供了新思路。(本文来源于《福建医科大学》期刊2018-06-01）
黄顺梅,王俊忠,张小勇,李宝林,宋志韬[4]（2018）在《地塞米松、环磷酰胺和他克莫司叁种免疫抑制剂影响HBV复制的体外研究》一文中研究指出目的探讨地塞米松(DEX)、环磷酰胺(CYP)和他克莫司(FK506)在体外对HBV蛋白合成、DNA复制的影响。方法将不同浓度的DEX、CYP和FK506作用于HepG2.2.15细胞系,通过MTT实验确定药物安全浓度范围,通过检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg水平,以及细胞内HBV DNA水平来评价HBV的表达和复制情况。结果DEX、CYP和FK506的药物安全浓度范围分别为0~500、0~1000和0~10μg/mL。与培养基对照处理相比,FK506处理后HBsAg、HBeAg分泌及HBV DNA复制变化差异无统计学意义;CYP处理增加HBsAg分泌,与对照相比差异有统计学意义(P<0.05);但HBeAg分泌及HBV DNA复制变化差异无统计学意义;DEX作用减少HBsAg和HBeAg的分泌,与对照相比差异有统计学意义(P<0.05);但是细胞内HBV DNA复制水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论在药物安全浓度范围内,FK506对HepG2.2.15细胞HBV DNA复制无直接抑制或促进作用。CYP处理后增加HepG2.2.15细胞HBsAg表达,但HBeAg表达及HBV DNA复制变化差异无促进作用;DEX处理抑制HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达,但对HBV DNA复制无抑制作用。(本文来源于《肝脏》期刊2018年05期）
张亚萍[5]（2018）在《泛素化抑制剂PYR41降低EV71复制及其与自噬关系研究》一文中研究指出目的:小儿手足口病(Hand-foot-mouth Disease,HFMD)是一种死亡率高、好发于儿童的且易伴有无菌性脑膜炎和严重的神经系统并发症的感染性疾病。近几年在我国,手足口病在丙类传染病中发病率和死亡人数最高。数据显示,大量已确证的重症病例中,肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)感染是造成小儿手足口病的主要原因。目前,手足口病已成为一种对全球健康有潜在威胁的新兴传染病。众多研究表明,某些宿主因素在EV71发病机制中起关键作用~([1-4])。鉴于泛素蛋白酶体系统在细胞生理代谢、细胞增殖、周期调控、凋亡等方面的广泛作用,因此本实验从细胞泛素化与自噬角度出发,旨在研究泛素化修饰对病毒感染及其诱导的细胞自噬的调控作用。从而为进一步探讨这种调控作用对病毒复制及机体抗病毒等方面的影响奠定基础。方法:1.细胞培养RD-A细胞于含10%的胎牛血清和100U青霉素及100mg/ml链霉素的MEM完全培养基中,在37℃、5%CO_2条件下培养。每隔2日更换新鲜细胞培养液,待细胞长至90%汇合度时,用0.25%胰酶进行消化处理。2.EV71病毒TCID50滴定参照《手足口病预防控制指南(2009版)》接种浓度为5×10~4个/ml的RD-A细胞于96孔板每孔100μl,将收集的染毒细胞培养上清做11次10倍系列稀释,每个稀释度各加入细胞培养板8孔,每孔100μl,同时用稀释液做阴性对照。培养5天后观察并记录全部孔的细胞病变(Cytopathic Effect,CPE),再根据卡波氏公式计算出病毒滴度。3.病毒干预在染毒实验前测定病毒的TCID50,换算成空斑形成单位PFU(P1aque Forming Unit,PFU)。用血细胞计数板计数细胞后,调整细胞浓度并铺板。根据病毒量和细胞数确定感染复数(Multiplicity of Infection,MOI)。以合适的剂量和时间进行染毒实验,将病毒加入细胞培养液中,十字交叉摇动培养板混匀。染毒后合适的时间内,收集培养上清液和细胞进行滴度和VP1检测。4.质粒转染将对数期生长的细胞接种于六孔板中,1×10~5个/ml,次日细胞融合度达到80%左右时,每孔细胞换液成含血清不含抗生素的新鲜培养基,将pPLK/GFP-Atg5-shRNA(2.5μg/孔)和转染试剂lipo6000~(TM)(5μl/孔)分别用无血清无双抗的培养基配置好,静置5min,将准备好的质粒和转染试剂混合,静置20min后,以250μl/孔的体系,分别将其加入相应的孔中,混合均匀,37℃、5%CO_2条件下培养,6h后换液成完全培养基。转染至合适时间,加入合适剂量的EV71病毒处理。分组情况:空白对照组(未感染组、染毒12h)、阴性对照组pPLK/GFP-shRNA(未感染组、染毒12h);干扰组pPLK/GFP-Atg5-shRNA(未感染组、染毒12h)。作用至染毒处理后12h时,分别收集各组细胞及上清液。5.CCK-8法进行药物PYR41的细胞活性检测取对数期细胞,计数,将其密度调至1×10~5个/ml,100μL/孔接种于96孔板;待细胞贴壁后,分别以0.0、0.1、1.0、5.0、10.0μmol/L PYR41处理RD-A细胞,各设5个复孔。培养至12h时,用CCK-8法检测细胞活性。终止培养前2 h,加入10μL CCK-8溶液(剂量为5.0 mg/ml);在450 nm测各孔的吸光度(OD)值,计算各孔平均OD值,以对照组细胞活性为100%,计算各孔的细胞活力=(OD处理/OD对照)×100%。6.免疫印迹法检测自噬相关蛋白及病毒蛋白VP1表达将对数期生长的细胞接种于六孔板中,1×10~5个/ml,次日细胞融合度达到80%左右时,加入PYR41(5μM)预处理12h,再感染EV71(MOI=1),并设置不加药物处理的未染毒组和染毒组,于染毒后6h、12h,离心收集各组细胞,加入细胞总蛋白提取试剂和蛋白酶抑制剂PMSF,冰上裂解细胞后,4℃,13800rpm,离心15 min取上清,经BCA法定量并调整蛋白浓度,加入4×loading buffer经加热变性得到蛋白质样品。细胞总蛋白质经12%SDS-PAGE电泳,转移到NC膜上,5%脱脂奶粉室温封闭2 h后,分别用抗LC3-I/II(1:1000)、P62(1:2000)、VP1(1:1000)、β-actin(1:2000)于4°C孵育过夜,TBST洗涤3次,每次5min,再加入HRP标记的抗兔和抗鼠二抗(1:5000)室温孵育2 h,TBST洗3次,每次5min,ECL化学发光,底物显色,于凝胶成像仪曝光后分析结果。7.荧光定量PCR法检测病毒蛋白VP1 mRNA表达依照方法6分组情况,RD-A细胞经PYR41(5μM)处理12h,再染毒,于染毒后6h、12h,分别收集各组细胞,TRIzol法提取各组细胞总RNA;按照快速cDNA第一链生成试剂盒说明书的方法进行反转录;再以生成的cDNA为模板,进行荧光定量PCR扩增。设计并合成各个qRT-PCR引物。所有引物均由上海生工有限公司合成。PCR反应条件:95℃预变性60s;95℃15s,60℃15s,72℃60s,共40个循环。Bio-Rad荧光定量PCR仪,测定各组Cq值,叁次独立重复实验,经Prism 5软件统计分析,得出目的基因与内参基因的相对比值。8.免疫荧光法检测细胞内EV71病毒数量取对数期细胞,接种于24孔板中,1×10~5个/ml/孔,次日细胞融合度达到80%左右时,加入PYR41(5μM)预处理12h,再染毒,于染毒后3h、6h、12h,PBS洗涤叁次,各组细胞分别用4%多聚甲醛,固定10 min(便于EV71染色),PBS洗涤叁次,加入0.3%TritonX-100通透10 min,PBS洗涤叁次,免疫荧光封闭液(5%BSA)室温封闭30 min;吸弃封闭液,加入抗EV71(1:200)一抗,4℃,过夜,PBS洗涤3次;加入FITC标记的抗兔二抗(1:200)室温孵育30 min,PBS洗涤3次;DAPI进行核染色,PBS洗涤叁次,每次5分钟,在荧光显微镜下观察并拍照,分析比较各组病毒数量的变化。9.统计学分析数据以(?)±s表示,用SPSS19.0和Sigmaplot 12.3软件进行统计分析,组间均数比较用t检验,百分比和率的比较用χ~2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.EV71感染RD-A细胞,增加了细胞泛素化水平:免疫印迹结果显示随着病毒感染时间的增加,细胞内泛素化蛋白(Ub)s明显增加,且在12h后达较高水平(P<0.05);同时随着EV71感染剂量的增加,细胞内泛素化蛋白(Ub)s含量逐渐增加,并在MOI=5时达较高水平(P<0.05)。2.抑制泛素化减少细胞内病毒数量:RD-A细胞预先用PYR41处理再染EV71,染毒12h时PYR41+EV71组与无药物仅EV71组比,病毒蛋白VP1含量明显减低(P<0.01),同时荧光定量PCR分析也发现,12h时,PYR41+EV71组病毒VP1 mRNA水平与仅EV71组比较明显减低(P<0.01)。免疫荧光法通过荧光显微镜观察FITC(绿色)标记的EV71分布,也发现12h时PYR41组比仅EV71组荧光斑点数明显减少(P<0.05)。3.抑制泛素化,导致EV71诱导的自噬进程受抑:我们的前期研究发现EV71可诱导细胞自噬,且随感染时间和感染剂量增加而自噬增强。本结果显示PYR41处理RD-A细胞,发生LC3-I向LC3-II转换,尤其在12h时转换明显(P<0.01)。且PYR41加药组比单独EV71组LC3-II也明显增加(P<0.01)。为进一步验证PYR41对自噬的作用使得LC3-II累加是否由于抑制自噬晚期阶段。我们检测P62的变化,结果发现染毒后诱导P62降低;而PYR41作用后,P62降解的趋势受抑(P<0.05)。即PYR41导致自噬进程受抑,抑制溶酶体内容物的降解。4.EV71感染RD-A细胞后,自噬分子Atg5发生泛素化降解:EV71感染RD-A后,细胞内Atg5降低,12h显着降低(P<0.01)。加上泛素活化酶抑制剂PYR41后,与原未加PYR41仅EV71时相比,Atg5降低被明显抑制(P<0.05)。说明Atg5发生了泛素化降解,这一降解能被PYR41抑制。说明EV71感染后依赖于泛素化降解Atg5。5.PYR41降低细胞内病毒数量与其自噬效应有关:免疫印迹显示PYR41引起的VP1改变随着3-MA或CQ的作用发生相应增加或减低(P<0.01),故PYR41抗病毒的作用与自噬效应有关,可以通过改变自噬而改变;同时由该结果及结果3推测PYR41对自噬及病毒的作用可能与CQ类似:抑制自噬晚期,增加病毒释放,使细胞内病毒数量减低。为证实此,我们进一步通过TCID50法检测PYR41对胞外病毒滴度的影响。发现PYR41预处理再染毒12h胞外病毒滴度明显升高(P<0.05)。6.自噬关键蛋白Atg5的减少利于增加病毒数量:EV71感染增强泛素化降解Atg5而影响自噬水平,增加了胞内病毒数量。转染质粒pPLK/GFP-Atg5-shRNA后,细胞内病毒蛋白VP1增加(P<0.05)。表明Atg5的减低可能有利于病毒复制或减少其释放。即PYR41也可通过抑制Atg5的降解而启动增强自噬早期阶段,降低细胞内病毒数量。再次验证了前期的结果。结论:泛素活化酶抑制剂PYR41抑制泛素化后,可减少细胞内病毒数量。且这种抗病毒作用与其自噬效应有关:通过抑制自噬晚期,增加了病毒的胞外释放,导致胞内病毒数量减低。同时,PYR41通过对自噬分子Atg5的泛素化降解的抑制,促进自噬早期启动,也会降低胞内病毒量。由此得出:EV71感染引起的泛素化有利于病毒复制,而这一原因可能与EV71增强自噬关键蛋白Atg5的泛素化降解而影响自噬水平有关。这些结果为我们更好地理解EV71的致病机制提供实验基础,也从泛素化的角度为预防和治疗EV71感染提供一种新的策略和思路。(本文来源于《山西医科大学》期刊2018-05-29）
郭颂欣,何士俊,黄翠红,姚新刚,刘叔文[6]（2018）在《新型登革病毒RNA聚合酶小分子抑制剂Z1降低登革病毒复制和感染的研究》一文中研究指出目的 筛选新型的登革病毒RNA聚合酶抑制剂。方法 大肠杆菌原核表达DENV2 RNA聚合酶蛋白NS5RdRp。SPR高通量筛选小分子化合物库,寻找与NS5 RdRp蛋白结合的小分子化合物;CPE、LDH和空斑实验在细胞水平上验证化合物的抗病毒效果;实时荧光定量PCR法检测化合物对病毒RNA合成的影响;免疫荧光法检测病毒复制中间体dsRNA以及病毒蛋白合成;蛋白免疫印迹法检测化合物对病毒蛋白合成量的影响;时间点处理实验判断抗病毒作用阶段。结果 2,5-二氢-1,2-二苯基-4-环己氨基-5-氧代-1H-吡咯-3-甲酸乙酯(Z1)与NS5 RdRp具有结合活性,在细胞水平上具有抗DENV2活性,半数有效浓度(EC50)为4.75μmol·L-1。Z1抑制DENV2 RNA合成,抑制病毒dsRNA的合成,并抑制病毒蛋白的合成,其抑制作用发生在病毒进入后阶段。结论 Z1是新型的登革病毒NS5 RdRp抑制剂,其明显抑制登革病毒RNA的合成,并进一步抑制病毒蛋白的翻译合成,从而抑制子代病毒的复制和释放,其可作为新型的抗登革病毒先导化合物用于进一步的开发。(本文来源于《中国药理学通报》期刊2018年06期）
Pan,JQ,潘佳倩,童双梅,汤静[7]（2018）在《La蛋白新型抑制剂H11调控HBV复制过程中LncRNA表达谱变化》一文中研究指出【据《J Viral Hepatitis》2018年4月】题:La蛋白新型抑制剂H11调控HBV复制过程中LncRNA表达谱变化(作者Pan JQ等)在HBV发展过程中,我们发现La蛋白新型抑制剂H11能够通过抑制人La蛋白与HBV RNA的结合进而抑制HBV的复制,但是具体作用机制并不明确。Pan等分别用化合物H11和DMEM处理能够稳定表达HBV的肝癌细胞Hep G2.2.15作为实验组和对照组(本文来源于《临床肝胆病杂志》期刊2018年05期）
郭家梅[8]（2018）在《RNase H活性升高对HIV-1复制和聚合酶抑制剂的影响及NPB524抗HIV-1作用机制研究》一文中研究指出HIV-1逆转录酶(Reverse Transcriptase,RT)是抗艾滋病药物研发的经典靶点,该酶具有叁种酶活性:RNA依赖的DNA聚合酶(RNADependentDNAPolymerase,RDDP)活性,DNA 依赖的 DNA 聚合酶(DNA Dependent DNA Polymerase,DDDP)活性和核糖核酸酶H(RNase H)活性,这叁种酶活性协调催化逆转录过程。虽然逆转录过程中RT的聚合酶活性(包括RDDP和DDDP活性)和RNase H活性均必不可少,但目前上市的12个逆转录酶抑制剂均为聚合酶活性抑制剂,包括核苷类逆转录酶抑制剂(Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors,NRTIs)和非核苷类逆转录酶抑制(non-Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors,NNRTIs)。目前尚无以RNase H活性为靶点的药物上市,相对其他艾滋病药物靶点,针对RNase H的研究空间相对较大。HIV-1逆转录过程由RT聚合酶活性和RNase H活性协调催化。而聚合酶抑制剂NRTIs和NNRTIs是WHO推荐的一线艾滋病治疗药物,即抑制RT聚合酶活性是必须的。本论文提出并试图证实如下两个假设:①当聚合酶抑制剂与RNase H抑制剂联合使用时,由于聚合酶活性和RNase H活性同时被抑制,可能使这两种酶活性重新达到平衡,由此导致治疗效果不及单独使用聚合酶抑制剂。②若在应用聚合酶抑制剂抑制聚合酶活性的同时升高RNase H活性,将加剧两种酶活性的失衡,可能达到更优的抗HIV-1效果。本论文构建并应用表型混合(Phenotypic Mixing)病毒模型提高HIV-1病毒颗粒中的相对RNase H活性,考察了 RNase H活性升高对HIV-1复制和聚合酶抑制剂NRTIs及NNRTIs药效的影响。结果显示,RNase H活性升高抑制HIV-1的复制;RNase H 活性升高可提升 HIV-IRT-K10N 和 HIV-1RT-Y181c 对 NVP 的敏感性;RNase H活性升高可提升HIV-lRT-D67N/K70R/T215F对AZT的敏感性。本研究还发现当向HIV-1RT-M184V病毒颗粒引入50%的野生型RT时,HIV-1RT-M184V对3TC的敏感性与野生型HIV-1 一致,即不再产生耐药。该结果与K.Van Laethem等人的临床研究结果一致,提示表型混合病毒模型可用于研究突变病毒比例与耐药出现的相关性。我们还应用该结果验证了胞浆中的RT进入病毒衣壳结构调节逆转录过程的可能性。结果显示,胞浆中的野生型RT并未提升HIV-1RT-M184V对3TC的敏感性,提示胞浆中的RT无法进入病毒衣壳结构调节逆转录过程。本部分内容的研究结果提示,HIV-1逆转录过程中RT聚合酶活性和RNase H活性的平衡十分重要。①RNase H活性升高导致两种酶活性失衡,从而抑制HIV-1复制。②RNase H活性升高有利于聚合酶抑制剂的抗突变HIV-1药效。③通过向细胞浆提供外源性RNase H无法达到升高RNase H活性的目的,继续寻找RNase H激活剂是直接有效的方法。药用植物来源的天然产物是抗病毒药物的重要来源。本课题组前期研究发现从丹参细胞培养物的脂溶性成分中分离得到的化合物NPB524具有良好的抗HIV-1活性,半数抑制浓度为30 nM。本论文研究了该化合物的抗HIV-1作用机制,发现NPB524为HIV-1转录抑制剂。综上所述,本论文包含两部分内容:第一部分研究了逆转录过程中RT聚合酶活性与RNase H活性的失衡对HIV-1复制和聚合酶抑制剂药效的影响,证实了RNase H活性升高抑制HIV-1的复制,并有助于提升部分耐药病毒对聚合酶抑制剂的敏感性,期望拓宽以RNase H为靶点的抗HIV-1药物研发思路。第二部分确认了天然产物NPB524具有抗HIV-1活性,机制研究显示NPB524为HIV-1转录抑制剂,期望能为该类药物的研究提供物质基础。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2018-05-01）
任科[9]（2017）在《BRD4溴结构域抑制剂促进人单纯疱疹病毒复制及其机理研究》一文中研究指出人单纯疱疹病毒(human herpes simplex virus,HSV)是一类具有囊膜结构的线性双链DNA病毒,是引起人类皮肤性疾病最常见的病原体。根据血清型不同,该病毒可分为Ⅰ型和Ⅱ型(HSV-1和HSV-2)。HSV-1主要感染面部的皮肤和黏膜,引起口龈炎、疱疹性角膜炎、皮肤疱疹性湿疹。HSV-2主要感染生殖器部位的皮肤和黏膜,导致生殖器疱疹,是性传播疾病(STD)的主要病原体,还能显着增加HIV(human immunodeficiency virus)感染的风险。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)统计发现,截至2012年,全球50岁以下人口中,约有2/3人数感染过HSV-1,而在15-49岁人群中,有超过5.5亿人有生殖器疱疹病毒感染。HSV感染具有溶细胞感染(lyticinfection)和潜伏感染(latentinfection)两种形式。溶细胞感染,也称裂解性感染,是指HSV感染上皮细胞后,进行复制,引起细胞发生病变(cytopathiceffect,CPE)直至裂解死亡。与此同时,部分病毒沿轴突上行至神经节潜伏,在神经元细胞中建立潜伏感染。潜伏期的HSV在宿主细胞中不进行复制,但过度劳累或免疫力下降等因素可以将潜伏的HSV病毒激活,导致病毒迁移至上皮细胞造成再次感染,这是造成HSV反复感染的主要原因。HSV如何建立和维持潜伏感染,以及再激活的机制都尚不清楚。HSV感染必须借助宿主细胞的转录系统以实现自身基因的表达,而这一过程自然会受到宿主转录系统的调控。文献中对于宿主转录系统调控病毒基因表达的作用机制虽然有比较细致的描述,但是对于HSV感染以及潜伏—再激活转换的分子机理缺乏了解。在溶细胞感染过程中,病毒非核小体DNA被注入细胞核,并快速环化成有组蛋白修饰的染色质,主要表现为基因组的甲基化和乙酰化,并且与病毒溶细胞感染过程中的复制以及病毒潜伏状态的维持密切相关。因此组蛋白乙酰化或者甲基化因素可以显着影响HSV复制和感染。为探究表观遗传调控对HSV感染的影响,本课题选择筛选表观遗传学小分子化合物库这一策略来寻找能够对溶细胞感染过程中病毒感染复制产生影响的表观遗传调控因素。我们发现两类结构互异的小分子化合物可以显着促进HSV复制。除已经报道的组蛋白去乙酰化酶抑制剂HDACi(Histone deacetylases inhibitor,HDACi)外,我们还发现 BET 家族蛋白溴结构域(bromodomain,BD)抑制剂,包括 PFI-1,(+)-JQ1,I-BET-762 等能够显着促进 HSV-1 和 HSV-2 溶细胞感染。JQ-1 是BRD4(Bromdomain-containing protein4,BRD4)选择性抑制剂,其通过与BRD4的BD区(bromodomain,BD)结合,阻断BRD4与乙酰化赖氨酸结合,从而抑制宿主细胞基因转录。作为一个多结构域蛋白,BRD4的C末端结构域能够与正性转录延伸因子(Positive transcription elongation factor,P-TEFb)结合形成具有转录活性的复合物。为了进一步研究BRD4溴结构域抑制剂促HSV复制的机制,我们首先研究了 BRD4在HSV溶细胞感染中的作用。用siRNA抑制细胞BRD4蛋白表达,我们发现抑制BRD4表达能够明显抑制病毒复制,提示BRD4是HSV溶细胞感染所需要的宿主因子;通过免疫共沉淀以及免疫荧光染色方法,我们发现HSV感染诱导BRD4与P-TEFb亚单元CDK9结合,并且与DNA依赖性RNA聚合酶(RNAPII)形成复合物,JQ-1处理可以增加这些复合物的形成,表明JQ-1可能通过BRD4及蛋白复合物形成而加速病毒mRNA延伸过程;最后,通过染色质免疫沉淀(ChIP)实验我们发现该转录复合物能够定位于病毒基因启动子区,与之相对应的是JQ1处理能够增加该复合物在HSV基因启动子区富集。由于JQ-1是作用机制相对清楚的小分子探针,其主要通过阻断BD域与乙酰化赖氨酸结合,影响组蛋白乙酰化修饰及宿主细胞基因转录过程,因此我们研究了过表达BRD4结构域在HSV感染中的作用,发现过表达BD1(aa1-196),BD1/2(aa 1-640)以及C端结构域(aa 197-1362)能不同程度地促进HSV感染。这些结果表明BRD4在基因转录方面调控HSV溶细胞感染过程。化学生物学是90年代新兴的一门学科,其特点之一是将小分子作为工具发现生命过程中的复杂生物学问题。小分子化合物探针具有作用靶点专一、作用机制相对清楚的特点,因此可以用于发现调控生命过程的重要分子靶点、构建蛋白作用网络。本研究通过筛选表观遗传学小分子化合物库发现BRD4蛋白溴结构域抑制剂能够促进人单纯疱疹病毒的溶细胞感染,并以小分子抑制剂JQ1为工具,同时结合病毒学、细胞分子生物学以及化学生物学的研究方法,首次发现并证明了在HSV溶细胞感染过程中,BRD4蛋白参与了病毒基因的转录调控,并初步探明了 JQ1能够促进HSV溶细胞感染复制的作用机制。这些工作为今后深入地理解和研究细胞对HSV基因表达的调控机制提供了新的思路和实验基础。(本文来源于《南京大学》期刊2017-05-01）
焦洋,李书明,马丽英[10]（2016）在《HIV-1逆转录酶抑制剂耐药相关突变位点及其复制适应性研究》一文中研究指出逆转录酶抑制剂是高效抗逆转录病毒治疗的主要药物,广泛应用于艾滋病治疗中。治疗过程中出现的耐药相关突变位点除了影响抗病毒治疗效果,还可能影响病毒的复制适应性。本综述介绍了逆转录酶抑制剂的耐药相关突变位点,并阐述了常见位点对病毒复制适应性的影响。提出研究耐药相关突变位点的适应性可为临床治疗提供重要的基础数据。(本文来源于《第七届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛论文汇编》期刊2016-09-09）
复制抑制剂论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
研究背景及目的:Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus,EBV),也称作人类疱疹病毒4型(humanherpesvirus 4,HHV-4),是疱疹病毒γ亚科的成员之一。EBV在人群中广泛感染,能在体内建立有效的长期的潜伏感染,并难以从体内清除,同时可以引起多种癌症以及其它非恶性肿瘤病毒性疾病,如鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)、胃癌、伯基特淋巴瘤(Burkitt's淋巴瘤)、霍奇金淋巴瘤、传染性单核细胞增多症、淋巴增殖性疾病等。目前临床上所使用的抗EB病毒的主要药物是阿昔洛韦和更昔洛韦,这两者主要作用于病毒DNA聚合酶,但同时也影响着人类正常细胞DNA的复制,毒副作用较大,并且容易使机体细胞产生耐药性突变,临床效果相对并不理想。因此,探索发现新型的、毒副作用小的、具有靶向性的小分子抑制剂有着重要的临床意义。2-苯乙炔磺酰胺(2-phenylethynesulfonamide,PES)是热休克蛋白 70(heat shock protein 70,Hsp70)的小分子抑制剂,它可以与Hsp70相互作用,并破坏Hsp70与其共伴侣蛋白和底物蛋白的结合。近些年的研究表明,PES可以选择性地杀死肿瘤细胞,是一种很有前景的抗癌药物。本研究旨在观察PES对于EBV阳性细胞的影响并对其作用的分子机制进行初步的探索。方法:使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)活性检测试剂盒检测EBV阳性细胞(HONE1/Akata、HK1/Akata和B95-8)经不同浓度的PES处理不同时间后细胞活力的变化;同时,用CCK-8活性检测试剂盒检测Hsp70表达量的改变对EBV阳性细胞活力的改变情况。通过细胞平板克隆形成实验检测PES对EBV阳性细胞(HONE1/Akata和HK1/Akata)长期增殖的影响。通过细胞划痕实验检测PES对EBV阳性细胞的迁移能力是否有影响。通过流式细胞分析仪检测PES诱导EBV阳性细胞周期阻滞以及细胞凋亡的情况。通过蛋白印迹(Western blotting)实验检测EBV阳性细胞经浓度梯度的PES处理或其他各种不同条件处理后,目的蛋白表达水平的变化。通过荧光实时定量PCR技术(quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)检测EBV阳性细胞经PES处理后,目的蛋白mRNA水平的变化,以及PES对EBV阳性细胞中EB病毒基因组DNA复制的影响。通过流式细胞分析仪检测PES对诱导进入EBV裂解期的HONE1/Akata细胞中GFP荧光强度的影响。通过免疫共沉淀实验(co-immunoprecipitation,IP)以及免疫荧光实验(immunofluorescence,IF)检测Hsp70与EBNA1之间的相互作用,以及PES对这一相互作用的影响。使用HONEl/Akata细胞对裸鼠(BALB/c nude mice)进行致瘤后,用PES对裸鼠进行处理,观察PES对小鼠的体重、肿瘤的重量、肿瘤的体积以及肿瘤中EB病毒核抗原1(EB nuclear antigen 1,EBNA1)表达和EBNA1阳性细胞量的影响。结果:Hsp70功能抑制剂PES能明显降低EBV阳性细胞HONE1/Akata、HK1/Akata和B95-8的细胞活力,而对EBV阴性的正常人肾近曲小管上皮细胞HK2的增殖抑制影响不明显;过表达Hsp70能降低PES对细胞增殖的抑制作用,同时,沉默Hsp70可以加强PES对细胞增殖的抑制作用;PES能抑制EBV阳性细胞HONE1/Akata和HK1/Akata的迁移;PES能诱导EBV阳性细胞HONE1/Akata、HK1/Akata和B95-8周期阻滞在G2期,并通过抑制自噬溶酶体途径来促进细胞凋亡;PES可以明显降低EBV阳性细胞中EBNA1的表达水平,而对其mRNA水平的影响不大;PES对EBNA1的抑制作用并不是通过作用于Gly-Ala重复序列来实现的;PES也不是通过蛋白酶降解途径来诱导EBNA1的下调,同时也不影响其半衰期;PES能抑制诱导EBV进入裂解期后的HONE1/Akata和B95-8细胞内病毒基因组DNA的复制;过表达Hsp70可以增强EBNA1的表达量和细胞内病毒基因组DNA的产量,但是PES能以剂量依赖性的方式抑制这种作用;沉默Hsp70可以降低EBNA1的表达量以及细胞内病毒基因组DNA的产量,同时PES能以剂量依赖性的方式加强这种作用;Hsp70与EBNA1相互作用,但是PES能干扰这种相互作用;PES能明显抑制BALB/c裸鼠体内HONE1/Akata肿瘤的生长以及EB病毒的复制。结论和意义:本课题研究表明PES在体内和体外均能降低EBV阳性细胞中EBNA1的表达,抑制EBV阳性细胞的增殖、迁移,阻滞细胞周期,并通过抑制自噬溶酶体途径来促进细胞凋亡。Hsp70可以增加EB病毒编码蛋白EBNA1的表达,促进病毒基因组DNA的复制。PES可以通过抑制Hsp70的功能,从而抑制EBV阳性细胞中EBNA1的表达,并抑制病毒基因组DNA的复制。Hsp70可以与EBNA1相互作用,而PES可以抑制Hsp70与EBNA1之间的相互作用。通过对PES在EBV阳性细胞中抗肿瘤以及抗病毒作用的研究,为今后PES用于治疗EBV相关恶性肿瘤的研究提供了很好的理论基础和实际应用价值。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
复制抑制剂论文参考文献
[1].王梦涵.去泛素化酶UL36~(USP)抑制剂的筛选及其对MDV复制的抑制作用[D].吉林大学.2019
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[3].尹利敏.Hsp90抑制剂通过降解乙型肝炎病毒核心蛋白HBc抑制HBV复制[D].福建医科大学.2018
[4].黄顺梅,王俊忠,张小勇,李宝林,宋志韬.地塞米松、环磷酰胺和他克莫司叁种免疫抑制剂影响HBV复制的体外研究[J].肝脏.2018
[5].张亚萍.泛素化抑制剂PYR41降低EV71复制及其与自噬关系研究[D].山西医科大学.2018
[6].郭颂欣,何士俊,黄翠红,姚新刚,刘叔文.新型登革病毒RNA聚合酶小分子抑制剂Z1降低登革病毒复制和感染的研究[J].中国药理学通报.2018
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[8].郭家梅.RNaseH活性升高对HIV-1复制和聚合酶抑制剂的影响及NPB524抗HIV-1作用机制研究[D].北京协和医学院.2018
[9].任科.BRD4溴结构域抑制剂促进人单纯疱疹病毒复制及其机理研究[D].南京大学.2017
[10].焦洋,李书明,马丽英.HIV-1逆转录酶抑制剂耐药相关突变位点及其复制适应性研究[C].第七届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛论文汇编.2016