导读:本文包含了大鼠气管干细胞论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:骨髓间充质干细胞,成脂肪细胞,成骨细胞,混合淋巴细胞反应
大鼠气管干细胞论文文献综述
汪晶[1]（2017）在《不同年龄段大鼠骨髓间充质干细胞特性及其对气管移植物保护效应与机制的研究》一文中研究指出第一部分大鼠骨髓间充质干细胞提取、扩增及功能鉴定目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞提取、扩增及功能鉴定方法:全骨髓贴壁法从Lewis大鼠骨髓中分离并培养扩增出骨髓间充质干细胞。在细胞培养过程中,观察大鼠BMSCs形态及生长增殖情况变化。流式细胞检测传代至第四代的大鼠BMSCs表面抗原CD29、CD105、CD34、CD45及MHC-Ⅱ的表达;体外诱导骨髓间充质干细胞向成脂、成骨方向分化以鉴定细胞类型;检测骨髓间充质干细胞活力以及生长曲线检测;建立混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)体系,检测骨髓间充质干细胞对T细胞增殖能力的影响。结果:大鼠来源的骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖,干性稳定。原代细胞传代纯化至第四代时,细胞形态均一,排列紧密,呈梭形,类似成纤维细胞且细胞生长旺盛。细胞表型鉴定结果显示:大鼠BMSCs阴性表达CD34、CD45和MHC-Ⅱ,阳性表达CD29和CD105。在特定的诱导下BMSCs可以向成骨、成脂方向分化。MLR显示大鼠BMSCs对DCs诱导的T淋巴细胞增殖有抑制作用。结论:本实验所培养的大鼠BMSCs符合间充质干细胞鉴定标准,且能够在短时间内获得形态、性质稳定且活性高的细胞,并且证实BMSCs具有较强的免疫调节作用,能抑制异体淋巴细胞增殖分裂能力。第二部分不同年龄段Lewis大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性比较目的:探讨不同年龄段大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的改变以及年龄对骨髓间充质干细胞的影响方法:本实验选取幼年(1月龄)、中年(9月龄)、老年(18月龄)叁个年龄段Lewis大鼠,从其骨髓内获取骨髓间充质干细胞。分别取叁个年龄段大鼠骨髓间充质干细胞F4代,观察其细胞形态变化、细胞表面标志及细胞凋亡情况。体外行成骨、成脂诱导分化,比较叁者成骨、成脂诱导分化能力。透射电镜观察叁者形态和结构变化。RT-PCR和Western blot检测叁个年龄段大鼠F4代骨髓间充质干细胞中TERT、β-catenin、P16、P21、PCNAmRNA 和蛋白的表达情况。结果:F4代幼年和中年大鼠BMSCs,细胞形态均一,排列紧密,呈梭形,细胞生长旺盛;而老年大鼠BMSCs为圆形、梭形、多角形混合,细胞生长稀疏。MTT法检测F4代幼年、中年、老年大鼠BMSCs吸光度值并无明显统计学差异;而细胞培养至F9代时,幼年和中年大鼠BMSCs仍然有良好的增殖能力,老年大鼠BMSCs增殖能力明显下降;细胞培养至F15代时,幼年大鼠BMSCs吸光度值也有所下降,老年大鼠BMSCs增殖能力则十分微弱。透射电镜结果显示老年大鼠BMSCs细胞核有固缩、凋亡现象,且胞质内出现较多空泡。成骨、成脂诱导分化结果显示幼年大鼠BMSCs诱导出的脂泡数和钙结节数明显多于中年和老年大鼠BMSCs,老年大鼠BMSCs诱导出的脂泡数和钙结节数明显少于幼年和中年大鼠BMSCs。QT-PCR和Western blot结果显示幼年大鼠BMSCs高表达TERT、β-catenin和PCNA,低表达P16和P21;老年大鼠BMSCs低表达TERT、β-catenin和PCNA,高表达P16和P21。结论:随着鼠龄的增长,BMSCs增殖能力有所下降;且随着培养时间的延长,幼年大鼠BMSCs也会发生衰老,增殖能力也逐渐下降。幼年、中年、老年大鼠BMSCs均有向成骨和成脂分化的潜能,但随着鼠龄的增加,BMSCs诱导成骨和成脂分化能力减弱,即BMSCs多向分化潜能减弱。上调TERT、β-catenin和PCNA以及下调P16和P21的表达可能成为BMSCs发挥抗衰老治疗的重要靶点。第叁部分不同年龄段大鼠骨髓间充质干细胞对同种异体气管移植物保护效应及其对OB治疗效果的研究目的:不同年龄段大鼠骨髓间充质干细胞对同种异体气管移植物保护效应及闭塞性细支气管炎(OB)治疗效果的研究方法:建立同种异体大鼠异位气管移植模型模拟肺移植后OB的病理过程,然后分别给予幼年(1月龄)、中年(9月龄)、老年(18月龄)叁个年龄段大鼠骨髓间充质干细胞局部输注。移植术后第28天,取各组气管移植物行HE染色评估移植气管组织学及形态学差异,免疫组化检测移植气管中E-cadherin、MMP-9和α-SMA的表达情况,TUNEL染色检测细胞凋亡,免疫荧光检测移植气管中TERT、β-catenin定位,Westernblot检测各气管移植物中TERT、β-catenin、P16、P21、PCNA蛋白的表达,EILSA检测血清中炎性因子的表达,以及检测血清中SOD活性和MDA含量结果:在移植后第28天,同种异体移植物气管上皮未能再生,且发生完全性管腔闭塞,最终发展成为OAD。幼年大鼠BMSCs输注后同种异体移植物纤毛黏膜上皮结构完整,假覆层纤毛柱状上皮和粘膜下腺体几乎覆盖了整个管腔,管腔内几乎没有发生闭塞。中年大鼠BMSCs输注后同种异体移植物纤毛黏膜上皮部分脱落缺失,气管黏膜上皮出现不同程度的脱落,上皮层变薄,管腔少量闭塞。老年大鼠BMSCs输注后同种异体移植物纤毛黏膜上皮大部分坏死脱落,粘膜下增厚,管腔发生部分闭塞。幼年、中年、老年大鼠BMSCs输注组,E-cadherin表达依次降低,MMP-9和α-SMA表达则依次升高。幼年大鼠BMSCs抗凋亡作用最强。免疫荧光显示,β-catenin蛋白主要在假复层纤毛柱状上皮层富集,TERT蛋白主要在黏膜上皮层富集。幼年、中年、老年大鼠BMSCs输注组TERT、β-catenin和PCNA蛋白表达量逐渐降低,但都高于同种异体移植气管;而P16和P21蛋白表达量则逐渐升高,但都低于同种异体移植气管。幼年、中年、老年大鼠BMSCs输注后血清中IL-8和TNF-α浓度均降低。与同种异体移植大鼠相比,幼年、中年、老年大鼠BMSCs输注后SOD水平均明显升高,MDA水平均明显下降。结论:成功的建立了大鼠同种异体异位气管移植后慢性排斥反应模型。大鼠BMSCs输注通过抑制移植物气道上皮转间化,抑制移植气管中纤维素形成,减轻细胞凋亡和炎症细胞浸润程度,来促进同种异体移植物上皮修复并预防腔内闭塞,从而减少气道OAD的发生。但随着鼠龄的增加,BMSCs对气管移植物的保护作用逐渐减弱。实验结果表明TERT、β-catenin和PCNA蛋白参与了移植气管的修复与保护,而P16和P21则加重移植气管的损伤。第四部分体外调控不同年龄段大鼠骨髓间充质干细胞及其对气管移植物保护效应与机制的研究目的:探索不同年龄段大鼠骨髓间充质干细胞的调控及其对气管移植物保护效应与机制的研究方法:本实验通过体外分别给予幼年、中年、老年大鼠BMSCs Wnt/β-catenin信号通路激动剂Wnt3a及抑制剂DKK1处理48h,观察叁个年龄段大鼠BMSCs生物学效应的变化。再于体内研究经Wnt3a及DKK1处理的叁个年龄段大鼠BMSCs对同种异体移植气管的作用。结果:经Wnt3a处理后,幼年、中年、老年大鼠BMSCs分裂增殖能力增加,诱导成骨成脂分化能力加强,对同种异体气管移植物保护效应增强。而通过DKK1处理48h后,幼年、中年、老年大鼠BMSCs分裂增殖能力减弱,诱导成骨成脂分化能力减弱,对同种异体气管移植物保护效应减弱。QT-PCR和Western blot结果检测发现,经Wnt3a处理后,幼年、中年、老年大鼠BMSCs高表达TERT、β-catenin和PCNA蛋白,低表达P16和P21蛋白。而经DKK1处理后,幼年、中年、老年大鼠BMSCs表达TERT、β-catenin和PCNA蛋白明显受抑制,而P16和P21蛋白表达增加。结论:Wnt/β-catenin信号通路参与幼年、中年、老年大鼠骨髓间充质干细胞的调控,并影响其体内、体外生物学效应。激活Wnt/β-catenin信号通路,幼年、中年、老年大鼠骨髓间充质干细胞分裂增殖能力增加,诱导成骨成脂分化能力加强,对同种异体气管移植物保护效应增强。而抑制Wnt/β-catenin信号通路,幼年、中年、老年大鼠骨髓间充质干细胞分裂增殖能力减弱,诱导成骨成脂分化能力减弱,对同种异体气管移植物保护效应也随之减弱。且Wnt/β-catenin信号通路可以通过调控TERT、β-catenin、PCNA、P16和P21的表达来调控幼年、中年、老年大鼠BMSCs的生物学特性及其对气管移植物的保护效应。(本文来源于《华中科技大学》期刊2017-05-01）
黄明,周永梅,李斌,吴奇峰,朱玉峰[2]（2015）在《经气管移植骨髓间充质干细胞在染矽尘大鼠体内的归巢》一文中研究指出背景:骨髓间充质干细胞经气管途径注入大鼠体内能减轻染矽尘大鼠的肺部损伤,但其在大鼠体内的分布、迁移情况尚不清楚。目的:观察经气管途径移植的骨髓间充质干细胞在染矽尘大鼠体内的分布和归巢情况。方法:用携带增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒(Lv-e GFP)转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,锥虫蓝染色和CCK-8法检测转染前后细胞的活力及增殖情况。将SPF级SD大鼠随机分为染矽尘组和对照组,染矽尘组大鼠经气管内注入40 g/L无菌矽尘混悬液1 mL,对照组大鼠注入生理盐水1 m L。造模后第2天每只大鼠经气管注入2.5×106个Lv-e GFP转染的骨髓间充质干细胞,分别于移植后的1,2,3,4周处死大鼠,取心、肝、脾、肺、肾、脑组织冰冻切片,荧光显微镜观察各组织荧光表达,图文分析软件计算组织荧光强度。结果与结论:感染复数为50时,转染与未转染Lv-eG FP的骨髓间充质干细胞在活细胞率及增殖力上差异无显着性意义(P>0.05)。注入细胞后两组肺组织切片均可见广泛、强烈的绿色荧光,以支气管、血管周围明显,各时间点染矽尘组的荧光强度均高于对照组(P<0.05),到第4周荧光仍较强。两组其余各脏器在第1周均可见荧光,肝、脾、心脏荧光强、分布广,肾、脑组织荧光相对较弱、分布较少;随时间推移,荧光均逐渐减弱,分布逐渐减少。结果提示骨髓间充质干细胞经气管途径进入染矽尘大鼠体内后可归巢至受损肺部。(本文来源于《中国组织工程研究》期刊2015年23期）
曲智[3]（2010）在《大鼠气管粘膜上皮细胞损伤修复过程中胚胎干细胞相关基因OCT3/4的表达及其意义》一文中研究指出目的探索OCT3／4在大鼠气管粘膜上皮的损伤修复过程中的表达及意义。方法本研究采用5-FU制成在体大鼠气管上皮损伤修复模型,利用免疫荧光技术观察体内气管干细胞在增殖、分化过程中Oct3／4表达的动态变化,同时应用HE染色及电镜技术观察在该过程中的细胞形态学变化。结果在正常大鼠气管粘膜上皮细胞中,OCT3／4并不表达,而经过5-FU给药后,在完整的基底膜上方散在存留一些GO期细胞,同时在这些细胞中能够检测到OCT3／4阳性细胞,这些阳性细胞开始增殖后能够分化成纤毛细胞、粘液细胞等,在修复后的气管粘膜上皮中,OCT3／4的表达又呈阴性。结论5-FU打击后的GO期细胞中,在修复过程中有细胞有OCT3／4的表达,这些OCT3／4阳性的细胞具有多能分化性,能够完整修复气管粘膜上皮,具有干细胞的特性。(本文来源于《中国医科大学》期刊2010-04-01）
宋楠[4]（2009）在《大鼠气管干细胞增殖分化过程中Oct3/4、Nanog和Sox2的表达及意义》一文中研究指出大鼠气管干细胞增殖分化过程中Oct3/4、Nanog和Sox2的表达及意义前言干细胞是存在于胚胎和成体中的一类特殊细胞,它能长期的自我更新,在特定的条件下具有分化形成多种终末细胞的能力。成体干细胞为存在特定组织中的干细胞,由于无伦理学方面的困扰,成体干细胞的应用越来越受到人们的关注。随之成体干细胞增殖分化调控的机制也成为研究的重点,有学者提出胚胎干细胞相关基因的概念,包括:Oct3/4、Nanog和Sox2等。它们在胚胎干细胞中有表达,而在成熟组织细胞中无表达。这些胚胎干细胞相关基因可以维持胚胎干细胞未分化状态,保持干细胞的多向分化潜能。另外,Oct3/4、Nanog和Sox2的激活能使体细胞发生再编程,表现出未分化细胞特征,使其具有干细胞多潜能分化的能力,为成体干细胞应用提供理论基础。气管上皮在正常情况下更新缓慢,但在损伤修复时能再生以维持其完整性,这说明气管上皮中存在干细胞,只有在损伤的过程中才能激活其潜能。我们实验室已经建立了5-FU引发离体气管损伤修复模型,这一模型成功再现了气管干细胞的增殖分化过程,使气管干细胞增殖分化机制的初步研究成为可能。因5-FU属抗嘧啶类代谢药,经5-FU作用后,气管上皮增殖期细胞脱落,基底膜上残留的细胞为G0期细胞,并出现了干细胞标记物ABCG2的表达,撤除5-FU后气管上皮经扁平细胞、立方细胞,直至48小时恢复到假复层纤毛柱状上皮,证明气管干细胞存在于对5-FU抗性G0期细胞中。但对这一过程的调控机制还所知甚少。本研究利用5-FU引发离体气管损伤修复模型,观察在气管干细胞增殖分化过程中Oct3/4、Nanog和Sox2的动态变化,并探讨其维持气管干细胞未分化状态的分子机制。材料和方法一、离体大鼠气管损伤修复模型的制备及5-azaC处理取约200克左右的Wistar大鼠,雌雄不限,水合氯醛麻醉,无菌条件下取出气管,PBS冲洗,置于DMEM/F12培养液中(含10%胎牛血清)。取正常气管,剪取一气管环固定,留做石蜡切片,灌入蛋白酶ⅩⅣ(0.5mg/ml),结扎另一端,4℃消化过夜,收集消化液,加FBS至终浓度为2.5%终止酶反应收集正常气管上皮细胞于2mlEppendorf管中,-70℃冻存,留做mRNA提取。其余气管组织分为5-FU作用组和5-azaC处理组。5-FU作用组为5-FU作用12小时后,置于DMEM/F12培养液中(含10%胎牛血清),分别于换液后0、3、6、12、24、48小时取出气管组织分别固定,留做石蜡切片;5-azaC处理组在5-FU作用后,当换液后24小时,换为含有1μM 5-azaC DMEM/F12(含10%胎牛血清)继续培养,方法同上,6小时后取出气管组织分别固定,留做石蜡切片;消化,收集细胞于2mlEppendorf管中,-70℃保存,以备DNA,RNA和蛋白提取。二、RT-PCR检测按Trizol~(TM)试剂使用说明提取气管上皮细胞总RNA,检测它的浓度,纯度和完整性。按逆转录试剂盒使用说明操作,选用Oligo-dT做引物合成第一链cDNA,逆转录条件为:30℃10min,40℃40min,99℃5min,5℃5min;PCR反应条件为:94℃变性2min后,94℃30s,退火,72℃1min,进行35个循环,最后于72℃延伸7min。扩增产物使用2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色分析表达结果,测灰度值,统计。相同条件下用β-actin作为内对照。叁、蛋白印迹检测按蛋白抽提试剂盒说明抽提气管上皮细胞总蛋白,SDS-PAGE电泳,50V恒压湿转120mins,BSA室温封闭2hrs,一抗4℃孵育过夜,二抗37℃孵育2hrs,DAB显色。转膜后各步之间均用洗膜液洗膜3次,每次5mins。相同条件下用β-actin作为内对照。四、间接免疫荧光检测气管上皮Oct3/4,Nanog和Sox2的表达石蜡切片脱蜡至水,抗原修复,非免疫动物血清封闭,一抗分别为山羊抗Oct3/4,兔抗Nanog和山羊抗Sox2;二抗分别TRITC标记兔抗羊IgG和FITC标记羊抗兔IgG。DAPI复染细胞核。50%缓冲甘油封片,荧光显微镜OlympasBX51下观察并照相。阴性对照实验:用等量的0.01mol/L PBS代替一抗,其余步骤同前。五、免疫组化检测气管上皮CK14和P63的表达石蜡切片脱蜡至水,高温高压抗原修复,非免疫动物血清封闭,一抗分别为山羊抗CK14和山羊抗P63,4℃孵育过夜;二抗37℃孵育30min。DAB显色。显微镜下观察并照相。阴性对照实验:用等量的0.01mol/L PBS代替一抗,其余步骤同前。六、甲基化特异性PCR检测以酚-氯仿抽提法提取气管上皮细胞DNA,参见试剂盒说明进行甲基化修饰,然后进行甲基化特异性PCR(MSPCR)反应,MSPCR反应条件为:95℃变性3min后,98℃10s,退火,72℃1min,进行40个循环,最后于72℃延伸7min。扩增产物使用2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色分析表达结果,测灰度值,统计。七、统计分析所有的RT-PCR实验和蛋白印迹实验均独立重复叁次,所得数据的值用均数(means)±标准偏差(SD)来表示。用SPSS 11.5软件对所得数据进行单因素方差分析,当P＜0.05认为有统计学意义。结果1、5-FU诱导损伤修复过程中CK14、P63和Oct3/4的表达变化正常气管上皮几乎没有Oct3/4的表达,去除5-FU作用后0h,Oct3/4少量表达,随后表达量逐渐增高,至6h达到峰值,随后逐渐降低,至48小时几乎恢复至正常水平;正常气管上皮CK14和P63高表达,去除5-FU作用后0h,CK14和P63几乎不表达,之后表达逐渐增加,至48h几乎恢复正常水平。2、间接免疫荧光检测5-FU作用后大鼠气管上皮Oct3/4、Nanog和Sox2的表达正常气管上皮几乎没有Oct3/4、Nanog和Sox2的表达,5-FU打击后0h,出现Oct3/4、Nanog和Sox2阳性细胞,随后逐渐增多,至6h达到高峰,随后逐渐降低,至48h几乎恢复至正常水平。Oct3/4、Nanog和Sox2的定位相同,均位于相同的细胞中。3、5-FU诱导损伤修复过程中Oct3/4、Nanog和Sox2的表达变化蛋白印迹检测大鼠气管上皮损伤修复过程中Oct3/4、Nanog和Sox2的蛋白水平发现,正常气管上皮没有Oct3/4、Nanog和Sox2表达。5-FU打击后0h,出现Oct3/4、Nanog和Sox2的表达,并随着气管上皮的修复逐渐增加,在6h达到高峰,随后逐渐降低,至48h降至正常水平。RT-PCR的结果与蛋白印迹的结果相同。4、MSPCR检测5-FU作用后大鼠气管上皮Oct3/4、Nanog和Sox2的启动子甲基化状态选取几个有代表性的时间点,分别选取正常气管上皮细胞、5-FU作用后0h的细胞、5-FU作用后恢复6h的细胞和恢复48h的气管上皮细胞进行检测。结果显示在正常气管上皮细胞中仅存在叁种基因的甲基化条带,而5-FU作用后0h和6h出现了这叁种基因的甲基化和未甲基化条带,48h也只有叁种基因的甲基化条带。5、5-azaC处理对大鼠气管上皮损伤修复的影响HE染色显示,5-FU诱导损伤后,气管上皮细胞恢复24h出现分化时用5-azaC作用,与单纯5-FU作用对照组相比,气管上皮的形态出现差异。单纯5-FU作用对照组,气管上皮于30h后出现双层,而5-azaC作用组,气管上皮呈现扁平细胞。免疫荧光结果检测Oct3/4、Nanog和Sox2的表达,5-azaC作用组Oct3/4、Nanog和Sox2阳性的细胞数明显高于单纯5-FU作用组。RT-PCR与荧光结果相同。结论1、5-FU作用后,经48小时气管上皮可基本恢复正常形态。2、Oct3/4可作为气管干细胞标志物,此细胞CK14阴性、P63阴性,可向基底细胞、纤毛细胞、粘液细胞分化。3、Oct3/4、Nanog和Sox2在气管干细胞增殖分化的过程中发挥了重要的作用。4、在气管干细胞的增殖分化过程中,Oct3/4、Nanog和Sox2表达的动态变化与其启动子甲基化调控有关。(本文来源于《中国医科大学》期刊2009-04-01）
吕威力,邢雪松[5]（2008）在《大鼠气管干细胞增殖分化过程中Wnt/β-Catenin信号分子的表达》一文中研究指出背景:干细胞和细胞外基质的互相作用需要Wnt信号途径的参与。在气管损伤后的修复过程中,不同的分子信号级联控制干细胞的迁移、增生与分化,Wnt信号途径是否参与其中?目的:检测并验证Wnt/β-Catenin信号途径在气管干细胞增殖分化中的作用。设计、时间及地点:单一样本观察实验,于2004-05/2006-07在沈阳医学院完成。材料:2周龄Wistar大鼠,雌雄不拘,作为离体气管来源。方法:实验组以含氟尿嘧啶的HamsF12培养液作用离体大鼠气管,作用12h后换成单纯Hams F12液,对照组只用Hams F12液培养。主要观察指标:去除氟尿嘧啶后于0,6,12,24,48h采用免疫组织化学SP染色及蛋白印迹法检测气管上皮中Wnt-1和β-Catenin的表达。结果:氟尿嘧啶作用12h后,大鼠气管上皮细胞绝大部分脱落,暴露出基底膜,仅剩余少数较分散的间隔分布的近于裸核的细胞,呈钉状位于基底膜上。氟尿嘧啶去除6h后,气管基底膜上可见少量扁平样细胞。24h后基底膜上细胞数目增加,并逐渐分化呈立方状,连接成片。48h后气管上皮中出现假复层柱状上皮,并可见纤毛细胞。免疫组织化学及蛋白定量结果显示:正常及损伤后0h气管上皮极少量表达Wnt-1及β-Catenin,损伤后6hWnt-1及β-Catenin表达最强,其后随时间延长,表达逐渐减少。结论:Wnt-1时间依赖性表达与气管上皮损伤修复进程相吻合,胞浆中游离状态的β-Catenin表达可能产生了促进气管干细胞的增殖并抑制其分化的作用。(本文来源于《中国组织工程研究与临床康复》期刊2008年25期）
吕威力,邢雪松[6]（2008）在《Wnt信号通路在大鼠气管干细胞增殖分化过程中的时空表达》一文中研究指出背景:实验前期项目已协同有关人员创立了体外观察气管干细胞的模型,并解决了气管干细胞的定位、分离及性状分析。但在气管干细胞的增殖分化过程中,究竟有哪些基因参与及其各自作用、气管干细胞可产生功能细胞的分化程序至今仍不清楚。目的:利用氟尿嘧啶诱发离体气管上皮损伤,检测气管干细胞增殖分化损伤重建过程中Wnt信号途径成员的时空表达变化。设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-06/2007-06在沈阳医学院中心实验室完成。材料:清洁级2周龄Wistar大鼠18只,用于制备离体气管环。氟尿嘧啶由天津人民制药厂生产。方法:将镜下观察纤毛摆动情况良好的气管环分为两组:损伤组将气管环置于含12.5mg/L氟尿嘧啶的HamsF-12液中,作用12h后去除氟尿嘧啶,换成新鲜的HamsF-12液继续培养,分别于3,6,12,24,48h取部分等量组织块。对照组用等体积HamsF-12液代替氟尿嘧啶,其余培养条件及取材时间同损伤组。主要观察指标:RT-PCR法检测气管上皮中Wnt-1、β-连环蛋白、T细胞因子、c-myc基因表达的变化。结果:氟尿嘧啶作用12h后,光镜下可见少数间隔分布、近于裸核的细胞,呈钉状位于基底膜上,前期实验已证明其为气管干细胞。RT-PCR结果显示,对照组气管上皮无Wnt-1和T细胞因子mRNA的表达,β-连环蛋白与c-myc mRNA轻度表达。损伤组经氟尿嘧啶作用后,可检测到Wnt-1 mRNA的表达,β-连环蛋白mRNA一时性轻度下降;Wnt-1、β-连环蛋白、T细胞因子、c-myc mRNA分别于去除氟尿嘧啶后3,6,12h达到高峰;24h后叁者mRNA表达水平均下调;至48hWnt-1 mRNA无表达,后叁者mRNA少量表达。结论:在整个气管上皮重建过程中,Wnt1、β-连环蛋白、T细胞因子和c-myc mRNA的表达变化基本遵循相似的规律,提示Wnt信号通路作为一个整体参与气管干细胞增殖分化过程的调控。(本文来源于《中国组织工程研究与临床康复》期刊2008年21期）
丁强,杨扬,贾心善,孙善亮,马小波[7]（2008）在《ABCG2/Bcrp1可能是大鼠气管上皮干细胞的标记物》一文中研究指出目的:探索气管上皮干细胞的表面标记物。方法:取2周龄的Wistar大鼠,取出气管环,5-FU损伤12h后,取气管上皮涂片进行增殖细胞核抗原、ABCG2/Bcrp1抗原染色、RT-PCR检测ABCG2/Bcrp1基因表达。结果:5-FU损伤后大鼠气管上皮气管环的上皮全部脱落,残留间隔分布的裸核样细胞,基底膜完整。气管上皮涂片免疫组织化学染色可见PCNA染色阳性的细胞与阴性细胞间隔分布,间接免疫荧光染色可见ABCG2/Bcrp1阳性细胞;RT-PCR检测ABCG2/Bcrp1阳性反应产物与预计长度符合。结论:ABCG2/Bcrp1可以作为气管上皮干细胞的标记,为进一步分离纯化扩增奠定基础。(本文来源于《中国病理生理杂志》期刊2008年05期）
马小波[8]（2008）在《大鼠气管干细胞增殖分化过程中Notch信号分子的表达及意义》一文中研究指出前言成体干细胞数量稀少但对机体却至关重要,它们是生后机体损伤修复、自我更新的重要来源。气管上皮存在着气管干细胞,它对气管上皮的损伤修复和自我更新及多种呼吸系统疾病具有重要意义,但由于气管上皮结构的复杂性及所处微环境的特殊性,气管干细胞的研究进展极为缓慢。利用经典的5-FU打击的方法,我们在体外建立了气管上皮再生修复的模型,这一模型成功再现了气管干细胞的增殖分化过程,使气管干细胞增殖分化机制的初步研究成为可能。离体气管在5-FU的作用下,增殖期细胞脱落,基底膜上仅残余散在分布的GO期细胞;去除5-FU作用后,气管上皮经裸核样细胞、扁平细胞、立方细胞,至48-72h时,基本恢复气管上皮的假复层纤毛上皮正常结构。可见,5-FU作用后的GO期细胞中含有气管干细胞,气管上皮的修复过程正是通过气管干细胞的增殖分化完成的,先前的研究已经证实了这一点。但我们对这一过程的调控机制还所知甚少。Notch是脊椎动物和无脊椎动物发育过程中一类十分重要的信号受体蛋白家族,它通过与邻近细胞间的相互作用来精确调控各谱系细胞的分化、增殖和凋亡,进而决定细胞命运和发育过程,其表达与功能具有组织特异性。近年来研究报道,Notch信号通路在干细胞增殖分化过程中起着重要的作用,Notch信号对气管干细胞增殖分化的作用尚未阐明。本研究利用5-FU介导的大鼠气管上皮损伤修复模型,检测了大鼠气管干细胞增殖分化过程中Notch信号分子的表达及意义。材料和方法1、离体大鼠气管损伤修复模型的制备及DAPT和Jag-1处理取约200克左右的Wistar大鼠,雌雄不限,水合氯醛麻醉,无菌条件下取出气管,PBS冲洗,置于DMEM/F12培养液中(含10%胎牛血清)。取正常气管,剪取一气管环固定,留做石蜡切片,灌入蛋白酶ⅩⅣ(0.5mg/ml),结扎另一端,4℃消化过夜,收集消化液,加FCS至终浓度为2.5%终止酶反应收集正,常气管上皮细胞于2mlEppendorf管中,-70℃冻存,留做mRNA。其余气管组织分为DAPT预处理组、Jag-1预处理组、对照组、DAPT处理组和Jag-1处理组。DAPT及Jag-1预处理组先在培养液中加入5μM DAPT或40μM Jag-1,37℃,5%CO_2孵育12小时,弃去上述培养液,于DMEM/F12(含10%胎牛血清)培养液中加入终浓度为120mg/ml的5-FU,37℃,5%CO_2孵育12小时,弃去上述培养液,换成新鲜DMEM/F12液(含10%胎牛血清);对照组单纯5-FU作用;DAPT处理组和Jag-1处理组在5-FU作用后换为含有5μM DAPT或40μM Jag-1的DMEM/F12(含10%胎牛血清)继续培养,方法同上,分别于换液后0、3、6、12、24、48小时取出气管组织分别固定,留做石蜡切片;消化,收集细胞于2mlEppendorf管中,—70℃保存,以备RNA和蛋白提取。2、RT-PCR检测按Trizol~(TM)试剂使用说明提取气管上皮细胞总RNA,检测它的浓度,纯度和完整性。按逆转录试剂盒使用说明操作,选用Oligo—dT做引物合成第一链cDNA,逆转录条件为:30℃10min,40℃40min,99℃5min,5℃5min;PCR反应条件为:94℃变性2min后,94℃30s,退火,72℃1min,进行30个循环,最后于72℃延伸7min。扩增产物使用2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色分析表达结果,测灰度值,统计。相同条件下用β-actin作为内对照。3、蛋白印迹检测按蛋白抽提试剂盒说明抽提气管上皮细胞总蛋白,SDS-PAGE电泳,50V恒压湿转120mins,BSA室温封闭2hrs,一抗4℃孵育过夜,二抗37℃孵育2hrs,DAB显色。转膜后各步之间均用洗膜液洗膜3次,每次5mins。相同条件下用β-actin作为内对照。4、间接免疫荧光检测气管上皮ABCG2,CK19,Notch3和Jagged1的表达连续切片,石蜡切片脱蜡至水,抗原修复,非免疫动物血清封闭,一抗分别为Goat anti-ABCG2,Rabbit anti-CK19,Rabbit anti-Notch3和Goat anti-Jagged1;二抗分别TRITC标记Rabbit anti Goat IgG和FITC标记Goat anti Rabbit IgG。DAPI复染细胞核。50%缓冲甘油封片,荧光显微镜OlympasBX51下观察并照相。阴性对照实验:用等量的0.01mol/L PBS代替一抗,其余步骤同前。5、统计分析所有的RT-PCR实验和蛋白印迹实验均独立重复叁次,所得数据的值用均数(means)±标准偏差(SD)来表示。用SPSS 11.5软件对所得数据进行单因素方差分析,当P＜0.05认为有统计学意义。结果1、5-FU诱导损伤修复过程中ABCG2、CK19和PCNA的表达变化正常气管上皮几乎没有ABCG2表达,去除5-FU作用后Oh,ABCG2少量表达,随后表达量逐渐增高,至6h达到峰值,随后逐渐降低,至48h几乎恢复正常水平;正常气管上皮CK19高表达,去除5-FU作用后Oh,CK19表达极微量,之后表达逐渐增加,至12h后CK19表达量迅速上升,至48h几乎恢复正常水平;正常气管上皮PCNA微量表达,去除5-FU作用后Oh表达量仍然很低。3h后PCNA开始表达并逐渐增高,至6h达到峰值,随后下降,至48h时,基本恢复正常水平。2、Notch信号分子在大鼠气管上皮的表达RT-PCR结果显示,正常大鼠气管上皮中Notch-1、Notch-3、Jagged-1、Hes1、Hey1和Hey2均有表达;Notch-2、Jagged-2、Hes3和Hes5在正常气管上皮及去除5-FU作用后气管干细胞增殖分化过程中均没有明显表达。Notch-3、Jagged-1和Hey1在5-FU打击修复过程中表达量有显着差异。3、5-FU诱导损伤修复过程中N3ICD,Jagged1及Hey1的表达变化蛋白印迹检测大鼠气管上皮损伤修复过程中N3ICD,Jagged1及Hey1的蛋白水平发现,正常气管上皮N3ICD、Jagged-1和Heyl仅有微量表达。5-FU打击后Oh,其表达增高,并随着气管上皮的修复逐渐增加,分别在6h、6h和12h达到高峰,随后逐渐降低,至48-72h降至正常水平。4、间接免疫荧光检测5-FU作用后大鼠气管上皮和Jagged1、Notch3、ABCG2和CK19的表达Jagged1为膜表达,多表达于上皮基底侧。打击后Oh,气管上皮可见少量Jagged1阳性细胞,随气管上皮的修复逐渐增多,至6h Jagged1阳性细胞最多,随后Jagged1蛋白表达逐渐减少,至48h,接近恢复正常水平。正常气管上皮Notch3绝大部分为膜阳性,5-FU打击后Oh,Notch3核阳性细胞增多,至6h达到高峰,随后降低,至48h仅见极少的核阳性细胞。大部分Jagged-1阳性细胞与Notch3核阳性细胞相邻,并分布与气管上皮的相似区域。ABCG2和CK19均为膜表达,表达于气管上皮不同的细胞,变化规律与Western blot结果一致,绝大部分ABCG2阳性细胞为Notch3核阳性细胞。5、DAPT阻断和Jag-1持续激活Notch信号通路对大鼠气管上皮损伤修复的影响免疫印迹结果显示,DAPT处理后6小时Notch通路活性明显低于对照组,24h时Notch通路几乎完全失活。DAPT阻断后,ABCG2增高幅度下降,并于6h后显着低于对照组;K19表达持续增高,并于6h后显着高于对照组,至24h时基本达到正常水平,并持续高表达;PCNA增高幅度下降,6h后显着低于对照组,至24h时已几乎检测不多PCNA的表达。Jag-1持续激活Notch通路,ABCG2增高幅度升高,并于6h后显着高于对照组;CK19表达降低,并于6h后显着低于对照组;PCNA增高幅度上升,6h后显着高于对照组。HE染色显示,5-FU诱导损伤后,用DAPT阻断Notch通路,与单纯5-FU作用的对照组相比,气管上皮的形态于6h开始出现差异。此时,大部分气管上皮细胞已呈立方状;12h,可见纤毛出现在气管上皮;12h—48h细胞没有明显增加,气管上皮呈单层立法上皮,被覆纤毛。用Jag-1持续激活Ntoch通路的情况下,细胞增加迅速,但始终未见纤毛出现,48h后,气管上皮没有恢复假覆层纤毛柱状上皮的结构。6、DAPT及Jag-1预处理对大鼠气管上皮损伤修复的影响正常气管上皮经DAPT预处理后,细胞数量明显减少。再经5-FU作用后,气管上皮细胞几乎全部脱落,没有细胞残留。经48h后,气管上皮仍没有修复的迹象。正常大鼠气管上皮经Jag-1预处理后,纤毛细胞明显减少。再经5-FU作用后,气管基底膜上残留细胞数量增加,并于24h时基本恢复了假覆层纤毛柱状上皮的结构。免疫荧光显示,正常气管上皮ABCG2(+)细胞数量稀少;经DAPT预处理后,气管上皮未见ABCG2阳性细胞。经Jag-1预处理后,气管上皮ABCG2阳性细胞数量增加。结论1、5-FU作用后48h,气管上皮形态及增殖分化状态基本恢复正常水平;2、Notch-1、Notch-3、Jagged-1、Hes1、Hey1和Hey2可能参与了正常大鼠气管上皮稳态的维持;3、Notch-3、Jagged-1和Hey1可能在气管干细胞增殖分化的过程中发挥了作用;4、Notch信号对气管干细胞未分化状态的维持及增殖起着重要的作用,是气管上皮损伤修复所不可缺少的。(本文来源于《中国医科大学》期刊2008-04-01）
孙善亮[9]（2008）在《曲古抑菌素A对大鼠气管干细胞增殖分化的影响》一文中研究指出目的目前,在气管干细胞研究中,我们建立了氟脲嘧啶(Fluorouracil,5-Fu)引发离体气管损伤修复模型,论证了气管干细胞位于具有5-FU抗性的G0期细胞中。为阐明气管干细胞增殖分化的调控机制,我们已检测了wnt信号中的wnt1,β-catenin,cyclinD1等成员在气管干细胞增殖分化过程中的时空变化情况,证明了Wnt/β-catenin信号传导途径参与调控气管干细胞增殖分化全过程。另外,我们还观察到了HDAC1在气管干细胞增殖分化过程中的动态表达情况。本文结合前段我研究组工作基础,利用TSA抑制HDAC1的作用,采用形态学、免疫组化及western blotting方珐观察其在5-Fu模型中对气管干细胞增殖分化的影响。方法1、制备气管损伤模型及剥离上皮取约200克左右的Wistar大鼠,雌雄不限(中国医科大学实验动物中心提供),腹腔注射10%水合氯醛0.4ml/100g,无菌条件下取出气管,无菌PBS反复冲洗,洗净血液和粘液,置于DMEM/F12培养液中(含10%胎牛血清),于培养液中加入终浓度为100mg/ml的5-Fu,37℃,5%CO2孵育12小时,弃去上述培养液,换成新鲜DMEM/F12液(含10%胎牛血清),同时加入终浓度为200nM的TSA继续培养,于换液后3、6、12、24、48小时分别10%中性福尔马林固定,石蜡包埋,制成4μm厚的组织切片。同时各时间点取气管组织,放于Eppendorf管中,-70℃保存。2、HE染色动态观察各时间点气管粘膜上皮组织学形态改变。3、利用免疫组织化学染色观察没有TSA作用时HDAC1在5-Fu模型中的表达。4、Western blotting检测TSA对各时间点HDAC1的表达量变化的影响。结果1、HE:在没有TSA作用情况下,去除5-Fu作用后0h,大部分气管上皮脱落,残留间隔分布的裸核样细胞(即G0期细胞);去除5—FU后恢复3h,裸核细胞消失,细胞呈扁平状,细胞核变长,细胞浆伸展几乎可以将基底膜覆盖;6h,细胞核变圆,有处可见变为立方上皮,细胞数增多;12小时,上皮完全变为立方上皮,胞核增大,胞浆增多,上皮细胞数目继续增多;恢复至24小时,细胞表面出现多量纤毛;恢复48h,气管上皮接近恢复假复层结构。在有TSA作用情况下,去除5-Fu作用后0-12小时,基底膜上残留裸核细胞基本没有变化,但是数量稍有增加;24-48小时,裸核细胞消失,细胞成扁平状,细胞核变长,细胞浆伸展覆盖基底膜。2、免疫组化检测结果:HDAC1呈胞核阳性。无TSA作用时经5-Fu作用后0小时,未见HDAC1阳性细胞;去除5-Fu后3—6小时,仍未见明显HDAC1阳性细胞;12小时,HDAC1阳性细胞数明显增多,并可见几个HDAC1阳性细胞围绕着底部一个HDAC1阴性细胞和多个HDAC1阳性细胞间夹着几个HDAC1阴性细胞分布的现象;24小时,HDAC1阳性细胞数最多,累及全层。48小时,HDAC1阳性细胞数略减少,阳性细胞分布集中于假复层结构顶部即靠近管腔侧。TSA作用后,基本没有HDAC1阳性细胞出现。3、Western blotting检测结果:无TSA作用时,HDAC1正常无表达,去除5—FU后0小时无表达,3、6、24小时表达量依次递增,24小时达高峰,48小时表达量略减少。TSA作用时,HDAC1表达明显受到抑制。结论1、TSA可以阻断经过5-Fu处理后的气管上皮损伤修复过程,抑制气管干细胞的分化,造成气管干细胞的增殖堆积。2、本研究有可能为解决干细胞供体不足,提供一种新的方法,可能将对干细胞的来源和实际应用带来巨大优势。(本文来源于《中国医科大学》期刊2008-03-01）
王琳琳,贾心善,马小波[10]（2006）在《Wnt／B-catenin信号途径在大鼠气管干细胞增殖分化过程中的时空表达及机制研究》一文中研究指出目的研究大鼠气管干细胞增殖分化中Wnt信号分子调控机制。方法应用氟尿嘧啶 (5-FU)诱发大鼠气管损伤,光镜动态观察修复过程,蛋白印迹法和免疫组化(SP)法检测Wnt-Ⅰ及β-Catenin的表达,RT-PCR法检测TCF-4及c-Myc mRNA的表达。结果 1、5-FU作用12小时大鼠气管上皮细胞绝大部分脱落,可见少量间隔分布的类似裸核的气管干细胞位于基底膜上,去除5-FU后, 细胞形态逐渐由扁平、立方,到48小时出现假复层柱状上皮。2、正常及损伤后0小时气管上皮极少量表达Wnt-1,损伤后6小时Wnt-1表达最强,其后随时间延长,Wnt-1表达逐渐减少。3、正常及损伤后 0小时气管上皮极少量表达β-Catenin,恢复12小时后β-Catenin蛋白表达最强,而后其水平呈递减趋势。4、5-FU作用后6小时气管上皮较正常组Tcf-4 mRNA的表达显着增加,之后随着修复的进行,其表达逐渐减少。5、5-FU作用后12小时气管上皮较正常组c-Myc mRNA的表达显着增加,之后随着修复的进行,其表达逐渐减少。结论 Wnt信号分子时间依赖性表达与气管上皮损伤修复进程相吻合,说明其在气管干细胞增殖分化中起重要调控作用。(本文来源于《中华医学会病理学分会2006年学术年会论文汇编》期刊2006-06-01）
大鼠气管干细胞论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
背景:骨髓间充质干细胞经气管途径注入大鼠体内能减轻染矽尘大鼠的肺部损伤,但其在大鼠体内的分布、迁移情况尚不清楚。目的:观察经气管途径移植的骨髓间充质干细胞在染矽尘大鼠体内的分布和归巢情况。方法:用携带增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒(Lv-e GFP)转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,锥虫蓝染色和CCK-8法检测转染前后细胞的活力及增殖情况。将SPF级SD大鼠随机分为染矽尘组和对照组,染矽尘组大鼠经气管内注入40 g/L无菌矽尘混悬液1 mL,对照组大鼠注入生理盐水1 m L。造模后第2天每只大鼠经气管注入2.5×106个Lv-e GFP转染的骨髓间充质干细胞,分别于移植后的1,2,3,4周处死大鼠,取心、肝、脾、肺、肾、脑组织冰冻切片,荧光显微镜观察各组织荧光表达,图文分析软件计算组织荧光强度。结果与结论:感染复数为50时,转染与未转染Lv-eG FP的骨髓间充质干细胞在活细胞率及增殖力上差异无显着性意义(P>0.05)。注入细胞后两组肺组织切片均可见广泛、强烈的绿色荧光,以支气管、血管周围明显,各时间点染矽尘组的荧光强度均高于对照组(P<0.05),到第4周荧光仍较强。两组其余各脏器在第1周均可见荧光,肝、脾、心脏荧光强、分布广,肾、脑组织荧光相对较弱、分布较少;随时间推移,荧光均逐渐减弱,分布逐渐减少。结果提示骨髓间充质干细胞经气管途径进入染矽尘大鼠体内后可归巢至受损肺部。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
大鼠气管干细胞论文参考文献
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[7].丁强,杨扬,贾心善,孙善亮,马小波.ABCG2/Bcrp1可能是大鼠气管上皮干细胞的标记物[J].中国病理生理杂志.2008
[8].马小波.大鼠气管干细胞增殖分化过程中Notch信号分子的表达及意义[D].中国医科大学.2008
[9].孙善亮.曲古抑菌素A对大鼠气管干细胞增殖分化的影响[D].中国医科大学.2008
[10].王琳琳,贾心善,马小波.Wnt／B-catenin信号途径在大鼠气管干细胞增殖分化过程中的时空表达及机制研究[C].中华医学会病理学分会2006年学术年会论文汇编.2006