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【摘要】目的：按照《中华人民共和国药典》2015版的要求，对复方薄荷脑软膏微生物限度检查方法进行研究和方法验证，建立复方薄荷脑软膏的微生物限度检查法。方法：按照《中华人民共和国药典》2015版（四部）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、控制菌检查法，采用常规法进行研究验证。结果：采用常规法做出各菌的回收比值均在0.5～2.0范围内，金黄色葡萄球菌生产良好可检出、铜绿假单胞菌生产良好可检出，该法符合《中华人民共和国药典》2015版的要求。结论：经过需氧菌、霉菌和酵母菌；金黄色葡萄球菌；铜绿假单胞菌的研究试验，复方薄荷脑软膏微生物限度（需氧菌、霉菌和酵母菌；金黄色葡萄球菌；铜绿假单胞菌）可采用常规法检查。
【关键词】微生物限度检查；复方薄荷脑软膏；方法验证
【中图分类号】R927.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）19-0358-02
复方薄荷脑软膏主要成分为樟脑、薄荷脑、水杨酸甲酯等，用于伤风感冒所致的鼻塞、昆虫叮咬、皮肤开裂、轻度烧烫伤、擦伤、晒伤及皮肤瘙痒等症的对症治疗。《中华人民共和国药典》2015年版对非无菌产品微生物限度检查法在培养基种类、适用性试验菌种、回收率范围等方面进行了较大修订，本研究是按照《中华人民共和国药典》2015年版（四部）非无菌产品微生物限度检查的方法对复方薄荷脑软膏微生物限度检查方法的验证。
1.需氧菌、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证
1.1验证菌种
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]
铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]
白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]
黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]
1.2验证方法
1.2.1菌液制备接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成适宜浓度的菌悬液，备用。
接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天，培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成适宜浓度的菌悬液，备用。
接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，20～25℃培养5～7天，加入5mL含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释成适宜浓度的孢子悬液，备用。
1.2.2稀释液的选用采用含吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释剂。
1.2.3需氧菌、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证
1.2.3.1供试液的制备取复方薄荷脑软膏10g，加含5%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL中，混合均匀，制成1：10供试液。
1.2.3.2回收比值测定试验组：取1：10的供试液1mL注入平皿，同时加入试验菌，接种量不大于100CFU，注皿，培养，计数。
菌液组：取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液。
供试品对照组：取供试液1mL注入平皿，以稀释液代替菌液，按试验组操作。
1.2.4回收比值计算公式（要求：回收率比值应在0.5～2范围内）
试验组菌落数-供试品对照组菌落数
试验组回收比值=--------------------------------×100%菌液组菌落数
1.3细菌数、霉菌及酵母菌数计数验证结果
1.3.1试验
1.3.1.1方法：常规法
1.3.1.2培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基，沙氏葡萄糖琼脂培养基
1.3.1.3培养条件：
生化培养箱LRH－250培养温度：35℃培养天数：3天
霉菌培养箱SPX－270培养温度：25℃培养天数：5天
1.3.1.4结果
结果：供试品的金黄色葡萄球菌检查可采用常规法检验。
2.2铜绿假单胞菌
2.2.1菌种编号铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]
2.2.2培养基胰酪大豆胨液体培养基，溴化十六烷基三甲铵琼脂
2.2.3培养条件生化培养箱LRH－250培养温度：35℃培养时间：1天。
2.2.4验证方法常规法
取1:10的供试液10mL，加入到100mL胰酪大豆胨液体培养基中，摇匀，加入铜绿假单胞菌，接菌量不大于100CFU，按照《中华人民共和国药典》2015版（四部）1106非无菌产品微生物限度检查中的铜绿假单胞菌检查方法检查。
结果：供试品的铜绿假单胞菌检查可采用常规法检验。
3.结论
3.1经过上述需氧菌、霉菌和酵母菌
金黄色葡萄球菌；铜绿假单胞菌的研究试验，复方薄荷脑软膏微生物限度（需氧菌、霉菌和酵母菌；金黄色葡萄球菌；铜绿假单胞菌）可采用常规法检查。
3.2复方薄荷脑软膏微生物限度检验方法
3.2.1取复方薄荷脑软膏10g，加含吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，混匀，作为1：10供试液。
3.2.2需氧菌、霉菌和酵母菌计数采用常规法进行微生物限度检查。
3.2.3控制菌中的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌采用常规方法进行检查。
【参考文献】
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版：四部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：140-151.
[2]中国药品生物制品检定所，中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范[M].北京:中国医药科技出版社，2010:351.