导读:本文包含了表面展示质粒论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:大肠杆菌Nissle,1917,大肠杆菌Nissle,1917无质粒克隆菌株,鞭毛表面展示,λRed重组系统
表面展示质粒论文文献综述
杨颖[1]（2016）在《大肠杆菌Nissle 1917无质粒克隆菌株鞭毛表面展示功能探析》一文中研究指出大肠杆菌Nissle 1917 (Escherichia coli Nissle 1917;EcN)是德国医生Alfred Nissle于1917年从一名抗腹泻士兵粪便中首次分离出的一株益生菌,由于肠道内存在该株“强大效能且具有拮抗活性”的大肠杆菌,该士兵免受肠道传染病流行区疾病的侵扰。随后,在德国和其他一些欧洲国家,EcN作为人用药Mutaflor(?)的活性成分,在治疗各种肠道疾病中扮演着重要角色。近年来,EcN表达外源基因作为疾病诊治载体的研究越来越多,其内含的pMUT2、I型分泌系统以及V型分泌系统等皆用于将外源抗原展呈于EcN表面。鞭毛表面展示属于细菌表面展示技术之一,其基于鞭毛蛋白的高变区可容纳外源多肽且组装成鞭毛丝进而实现外源多肽的表面展示。鞭毛表面展示技术较多在报道沙门氏菌中,而未曾在EcN菌株中探索研究。鉴于EcN是强大效能益生菌,本研究首先构建了EcN无质粒克隆菌株EcNc (EcN cured of its two cryptic plasmids pMUT1 and pMUT2; EcNc),以其鞭毛蛋白高变区为切入点来探讨EcNc鞭毛表面展示。EcN中含有pMUT1、pMUT2两个隐秘大质粒,且2个质粒在传代中很稳定,不易丢失；pMUT1带有ColE1类型复制系统,pMUT2含有类ColE2复制系统,然而对这2个隐秘大质粒的生物学意义了解较少。有研究报道大肠杆菌的致病性受到质粒的调控,且部分大肠杆菌菌株的抗性基因也可能与其隐秘质粒有关。为减少上述隐秘质粒对外源性重组质粒转化和基因组DNA操作带来的不便,同时考虑EcN作为载体菌时其隐秘质粒对人和宿主动物可能产生的副作用,本试验使用限制性内切酶Sph I将携带sacB的自杀性质粒载体pRE112分别与隐秘质粒pMUT1、pMUT2连接,构建重组质粒载体pMUT1-pRE112和pMUT2-pRE112,进一步应用竞争性抑制分别去除EcN自身携带的隐秘质粒,基于自杀性质粒sacB基因的特性,在含10%蔗糖的培养基平板上实施自杀质粒自身消除,最后获得EcN无质粒克隆菌株即EcN△pMUT1△ApMUT2,命名为EcNc (EcN cured of its twocryptic plasmids pMUT1 and pMUT2)对无质粒菌株EcNc生长状况、生化试验、电镜观察以及体外细胞黏附检测,试验结果表明去除两个隐秘大质粒后的EcNc,其生长、生化特性、血清学、形态学特征、体外细胞黏附与原型EcN一致,利用获得的EcNc菌株,将更加方便质粒的转化和遗传相关生物学操作。基于编码EcN菌株鞭毛蛋白的fliC基因序列,利用λ噬菌体Red同源重组系统对EcNc菌株的fliC基因进行敲除。首先纯化回收含有fliC基因同源臂片段和氯霉素抗性基因(cat)表达盒的PCR扩增产物,电转化至已携带pKD46质粒的EcNc菌株中,在Red同源重组酶Gam、Exo、Beta的作用下,PCR回收片段通过两翼同源序列与染色体对应靶基因序列同源重组,在氯霉素抗性平板上筛选到一次同源重组菌株EcNc △fliC::cat。再将质粒pCP20电转化EcNc △fliC::cat菌株,通过其在42℃C表达的Flp重组酶消除PCR片段中FRT位点之间的氯霉素抗性基因。经过PCR鉴定和DNA测序证明二次重组菌,即fliC缺失菌株EcNc △fliC构建成功。将pBR322-fliC电转化EcNc △fliC构建了回补菌株EcNc △fliC/pBR322-fliC。同时,以构建好的pU18-fliC重组质粒为模板,通过反向PCR分别构建了鞭毛蛋白基因859-888位、829-858位缺失的片段fliC1、fliC2,双酶切后连接到自杀载体pRE112中,构建重组自杀载体pRE 112-fliC1、pRE112-fliC2,将其分别导入EcNc菌株中,通过一次重组、二次重组及DNA测序筛选到EcNc鞭毛蛋白基因部分高变区缺失的菌株EcNcfliC1、EcNcfliC2。上述EcNc、EcNc △fliC、EcNc △fliC/pBR322-fliC、EcNc fliC1、EcNc fliC2的成功构建,旨在进一步探索鞭毛蛋白高变区序列改变对EcNc性状的影响。测试EcNc、EcNc △fliC、EcNc △fliC/pBR322-fliC、EcNc fliC1、EcNcfliC2的生长性能、运动性、鞭毛的抗原性、鞭毛形成以及体外细胞黏附、体内肠道定植能力。结果显示,各株细菌生化特性一致,生长性能没有差异变化；EcNc △fliC在半固体培养基上无运动性能,Western blot检测不到鞭毛蛋白的表达,且电镜下观察不到鞭毛形态,其对IPEC-J2的黏附能力相对于EcNc则下降64%(p=0.002)、相对于EcNc fliC1下降52%(p=0.018)、相对于EcNc fliC2下降50%(p=0.01)。EcNc △fliC回补菌株EcNc △filC/pBR322-fliC与EcNc的特性相一致,对IPEC-J2的黏附能力恢复到EcNc的黏附水平；用Western blot能检测到EcNc fliC1、EcNc fliC2鞭毛蛋白的表达,电镜下亦能观察到鞭毛丝,但它们在半固体培养基上几乎不能运动,EcNc fliC1、EcNc fliC2对IPEC-J2的黏附能力相对于EcNc则分别下降26%(p=0.124),29%(p=0.586),差异不显着；但EcNc fliC1对IPEC-J2的黏附能力比EcNc △fliC高52%(p=0.018),EcNc fliC2对IPEC-J2的黏附能力比EcNc △fliC高50%(p=0.01)。在体内肠道定植试验中,接种后第1 d、第3 d、第7d取样检测,各组细菌在同一肠段(回肠、盲肠或结肠)的定植能力无显着差异；但各组细菌在盲肠的定植数量高于各自在回肠和结肠的定植,尤其是接种后第1 d, EcNc/pBR322、EcNc △fliC/pBR322-fliC、EcNc fliC1/pBR322、EcNc filC2/pBR322在盲肠的定植显着高于其各自在回肠的定植数量。EcNc还具有F1A、F1C和卷曲菌毛等黏附因子,他们也共同介导和促进细菌在动物体内的定植,使得EcNc △filC/pBR322也能在小鼠肠道有效定植。EcNc鞭毛蛋白高变区分别缺失287-296位或者277-286位10个氨基酸后亦能表达鞭毛蛋白并形成鞭毛丝,且不影响重组菌在小鼠体内的定植能力,说明EcNc鞭毛蛋白高变区能容许部分氨基酸的缺失。随后本研究尝试以鞭毛基因高变区表面展示外源基因。以重组质粒pUC18-fliC为模板,设计两对含六聚组氨酸肽(6His)基因的反向PCR引物,反向PCR产物经Dpn I、 Exnase TM Ⅱ重组环化,分别获得含有嵌合鞭毛基因片段(fliC01、fliC02)的重组质粒pUC18-fliC01、pUC18-fliC02, fliC01、fliC02这两个片段为将六聚组氨酸肽(6His)基因分别插入EcNc fliC高变区774-775位和792-811位碱基之间的序列。将fliC01、fliC02片段分别插入自杀性载体pRE1 12,获得重组质粒pRE112-fliC01、pRE112-fliC02,再将其分别转化EcNc。通过一次重组和二次重组将嵌合鞭毛基因整合入EcNc基因组中,最终获得无抗性筛选盒的重组菌株EcNc fliC01、EcNc fliC02。对重组菌株生长状况、鞭毛形成以及体外细胞黏附试验和小鼠体内定植试验分析,结果表明EcNc fliC01、EcNc fliC02的生长未受影响,表达的嵌合鞭毛蛋白能被H1多抗或His-Tag单抗识别并且能组装形成鞭毛丝；EcNc fliC01、EcNc fliC02对IPEC-J2细胞的黏附能力及小鼠肠道定植能力与EcNc相比无显着性差异。EcNc鞭毛蛋白插入6His后能将其展呈于菌体表面。在利用EcNc鞭毛成功展示6His后,本研究以重组质粒pUC18-fliC为模板,设计两对分别含有BVDV (Bovine viral diarrhea virus) NADL毒株E2蛋白B、T细胞表位基因的反向PCR引物,反向PCR产物经Dpn Ⅰ、ExnaseTM Ⅱ重组环化,分别获得含有嵌合鞭毛基因片段(fliCB、fliCT)的重组质粒pUC18-fliCB、pUC18-fliCT, fliCB、fliCT片段为将B细胞表位、T细胞表位基因分别插入fliC基因792-811位碱基之间构建的嵌合鞭毛基因片段。将fliCB、fliCT片段分别插入自杀性载体pRE112,获得重组质粒pRE112-fliCB、 pRE112-fliCT,再将其分别转化EcNc。通过一次重组和二次重组将嵌合鞭毛基因整合入EcNc基因组中,筛选获得无抗性筛选盒的重组菌株EcNc fliCB、EcNc fliCT。两株重组菌株生长、鞭毛形成以及体外细胞黏附试验与EcNc无显着差异；在半固体平板上,EcNc fliCB无运动性,而EcNc fliCT具有运动性。将EcNc、EcNc fliCB、EcNc fliCT灌胃免疫SPF BALB/c小鼠,二免后一周收集血液和肠道,检测小鼠体内产生抗B、T细胞表位的特异性抗体IgA、IgG,结果表明,免疫重组菌株EcNc fliCB能够刺激机体产生抗B细胞表位的IgG抗体(0.552±0.027),免疫EcNc fliCT同样能够刺激机体产生抗T细胞表位IgG抗体(0.515±0.049),空白对照组(免疫EcN)未检测出针对相应包被蛋白的IgG抗体。免疫EcNc fliCB小鼠肠道能检测出针对B细胞表位的IgA抗体(0.367±0.030),与空白对照组差异显着(0.040±0.017；p=0.040)；免疫EcNc fliCT小鼠肠道能检测出针对T细胞表位的IgA抗体(0.371±0.034),与空白对照组差异显着(0.024±0.010;p=0.025)。EcNc fliCB、EcNc fliCT能诱导B、T细胞表位抗原特异的体液及黏膜免疫应答。上述试验结果证明EcNc鞭毛蛋白不同高变区能携带一定大小的外源抗原并较好展呈于菌体表面,为优质益生菌EcN更好的潜在应用研究奠定了基础。(本文来源于《扬州大学》期刊2016-05-01）
韩林臻,李宏梅,王方昆,赵孝民[2]（2015）在《鸡柔嫩艾美耳球虫不同抗原蛋白部分基因真核表达质粒的构建及其酵母表面展示》一文中研究指出(目的)鸡球虫生活史复杂,分为有性生殖阶段和无性生殖阶段,生活周期中蛋白表达谱有较大差异,其单一蛋白的基因工程疫苗仅具有部分保护力。因此本研究旨在构建鸡柔嫩艾美耳球虫不同抗原蛋白部分基因真核表达质粒以期为鸡球虫串联多表位活载体疫苗的研究奠定基础。(方法)利用基因功能预测软件,对已报道的具有较好免疫原性的Et MIC 2、Et MIC 3、EtAMA 1进行抗原表位的预测,截选抗原表位集中的基因片段;以本实验室柔嫩艾美耳球虫分离株SD-01株孢子化卵囊cDNA为模板扩增这些片段,分段克隆获得串联多表位融合基因,其大小为939 bp,然后定向克隆到真核表达载体pCTCON 2,构建获得pCT-EtC2A1C3质粒。将该串联表达质粒转染到酵母细胞EBY 100中进行诱导表达。分别用叁种蛋白的单因子血清,通过Western-Blot和间接免疫荧光鉴定串联蛋白表达情况。(结果)结果显示,经Western-Blot检测,可见大小约为33 KDa的阳性反应条带:间接免疫荧光可以检测到特异性绿色荧光,表明成功构建了表达质粒pCT-EtC2A1C3,并能在酵母细胞EBY 100中表达。(本文来源于《中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十叁次学术研讨会论文集》期刊2015-07-25）
岳礼溪[3]（2009）在《解脂耶罗威亚酵母菌表面展示质粒的构建及应用的初步研究》一文中研究指出以分泌型表达载体pINA1317为基础,分别借助解脂耶罗威亚酵母菌(Yarrowia lipolytica)细胞壁蛋白YlCwp1 C端的131个氨基酸和C端的110个氨基酸,构建了Y. lipolytica表面展示质粒,我们将其分别命名为pINA1317-ylcwp131和pINA1317-ylcwp110。利用新构建的表面展示质粒成功展示了报告蛋白——增强型绿色荧光蛋白(EGFP),展示EGFP的细胞占到观察的细胞总数的100%。用本研究构建的质粒展示外源蛋白不需特殊物质诱导,宿主菌进入生长的稳定期后开始表达。利用pINA1317-ylcwp110分别成功展示了来源于真菌奥默柯达酵母菌(Kodamaea ohmeri)BG3的植酸酶和来自细菌哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)SF-1的溶血素蛋白,得到了具有相应活性的菌株,免疫荧光实验结果证明目的蛋白已经展示在Y. lipolytica表面。为了比较表面展示植酸酶与游离植酸酶的异同,利用pINA1317表达载体将K. ohmeri BG3的植酸酶在Y. lipolytica中进行了表达,得到了分泌游离植酸酶的菌株,并利用Ni2+亲和层析对重组酶进行了纯化。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明重组酶的分子量约为65.1 kDa;小于天然酶的分子量(98.2 kDa)而大于在大肠杆菌中表达的重组酶分子量(51.0 kDa)。重组酶基本保持了天然酶的性质。表面展示的植酸酶在60.0℃,pH 5.0时酶活是114.7 mU/mg菌体干重。表面展示的植酸酶与天然酶和Y. lipolytica中表达的游离酶相比,最适作用温度由65.0℃降低至60.0℃。与天然植酸酶相比,表面展示酶对温度更为敏感,但与Y. lipolytica中表达的游离酶相比,温度稳定性提高。表面展示植酸酶与另外两者相比,pH稳定范围缩小,在pH3.0～8.0能够保持稳定;最适作用pH范围拓宽,在pH4.0～6.0之间酶活力较高且酶活力相差不大。金属离子对表面展示植酸酶的激活或抑制作用与天然酶及游离重组酶一致,但是作用效果减弱。毒性实验结果表明,表面展示有哈维氏弧菌溶血素蛋白的活的Y. lipolytica对大西洋牙鲆幼鱼是安全的。将该菌株作为活疫苗以5.0×108 cells/ml的浓度免疫大西洋牙鲆幼鱼,每尾0.2ml,并于初次免疫后第7 d和第21 d分别加强免疫;最后一次免疫后第7 d取血,间接ELISA检测到了大西洋牙鲆血清中溶血素特异抗体的产生。由于间接ELISA检测的需要,本研究采用Ni2+亲和层析纯化了在大肠杆菌中表达的重组V. harveyi溶血素,纯化的溶血素具有溶血活性,分子量大小约为45.0kDa;HiTrap rProteinA Sepharose亲和层析纯化了大西洋牙鲆免疫球蛋白IgM,SDS-PAGE结果表明纯化的IgM重链和轻链的大小分别是74.5 kDa和26.3 kDa,这是关于大西洋牙鲆免疫球蛋白IgM的首次报道。利用本研究纯化的IgM制备了小鼠抗大西洋牙鲆IgM多克隆抗体,免疫斑点法测定抗体效价达到1:3200以上。如果进一步改造菌株,增加目的蛋白质在Y. lipolytica表面的表达量,同时减少酵母菌表面其他蛋白质的量,那么该表面展示质粒可以应用于固定化酶、生物转化、生物修复、活疫苗和超高通量筛选等方面。(本文来源于《中国海洋大学》期刊2009-05-01）
表面展示质粒论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
(目的)鸡球虫生活史复杂,分为有性生殖阶段和无性生殖阶段,生活周期中蛋白表达谱有较大差异,其单一蛋白的基因工程疫苗仅具有部分保护力。因此本研究旨在构建鸡柔嫩艾美耳球虫不同抗原蛋白部分基因真核表达质粒以期为鸡球虫串联多表位活载体疫苗的研究奠定基础。(方法)利用基因功能预测软件,对已报道的具有较好免疫原性的Et MIC 2、Et MIC 3、EtAMA 1进行抗原表位的预测,截选抗原表位集中的基因片段;以本实验室柔嫩艾美耳球虫分离株SD-01株孢子化卵囊cDNA为模板扩增这些片段,分段克隆获得串联多表位融合基因,其大小为939 bp,然后定向克隆到真核表达载体pCTCON 2,构建获得pCT-EtC2A1C3质粒。将该串联表达质粒转染到酵母细胞EBY 100中进行诱导表达。分别用叁种蛋白的单因子血清,通过Western-Blot和间接免疫荧光鉴定串联蛋白表达情况。(结果)结果显示,经Western-Blot检测,可见大小约为33 KDa的阳性反应条带:间接免疫荧光可以检测到特异性绿色荧光,表明成功构建了表达质粒pCT-EtC2A1C3,并能在酵母细胞EBY 100中表达。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
表面展示质粒论文参考文献
[1].杨颖.大肠杆菌Nissle1917无质粒克隆菌株鞭毛表面展示功能探析[D].扬州大学.2016
[2].韩林臻,李宏梅,王方昆,赵孝民.鸡柔嫩艾美耳球虫不同抗原蛋白部分基因真核表达质粒的构建及其酵母表面展示[C].中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十叁次学术研讨会论文集.2015
[3].岳礼溪.解脂耶罗威亚酵母菌表面展示质粒的构建及应用的初步研究[D].中国海洋大学.2009
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