本文主要研究内容
作者于观留（2019）在《坦布苏病毒感染对鸭胚成纤维细胞生物学功能的影响及其机制研究》一文中研究指出：坦布苏病毒（Tembusu virus,TMUV）感染,是于2010年4月份发生在我国江浙地区的一种新发病毒性传染病,其主要引起产蛋鸭体温升高、食欲下降、卵泡变性出血、卵黄性腹膜炎、产蛋大幅下降以及雏鸭头颈震颤、共济失调和四肢麻痹等典型症状。该传染病具有传播范围广、传播速度快以及感染率高等特点。至今,已造成我国大多数省份的养鸭场发生感染,严重影响着我国水禽养殖业的健康发展。深入探究病毒感染所诱导宿主细胞的生物学功能改变及有关信号通路网络的调控机制,不仅有助于理解病毒在细胞内、外的信号传递,以及转录后的调节过程,自身与其他信号分子之间的关系及相互作用,还可对宿主细胞代谢及相关疫病的发生发展过程有较为全面的认识。然而,目前对于TMUV与其宿主细胞互作机制的研究甚少,对于该病毒所诱导宿主细胞生物学功能影响机制更是缺乏了解。为解决上述问题,本研究以鸭胚成纤维细胞（DEF）为研究对象,利用在流行病学调查中所分离的蚊源TMUV（TMUV-SDMS）作为国内该病毒优势株的代表株,运用转录组测序技术（RNA-Seq）、qRT-PCR和RNAi等分子生物学技术,在细胞及分子水平上深入探究TMUV感染对DEF细胞生物学功能的影响,筛选并验证该病毒感染与宿主细胞互作的关键基因或蛋白,探讨了TMUV-SDMS所诱导DEF凋亡与坏死的致死机理,为阐明该病毒逃逸宿主防御机制、探寻抗病毒新靶点等提供数据支持。研究内容主要分为以下五个方面:一、TMUV遗传演化分析本项研究在流行病学调查中所分离到的11株TMUV分离株（包括鸭源、鸡源、鹅源、麻雀源和蚊源）的基础上,对NCBI数据库67株TMUV代表株的同源性比对、进化树分析、蛋白质三级结构和糖基化位点进行了分析。结果表明:当前我国已有17个省份出现了TMUV的感染,且该传染病的爆发具有秋季高发的季节性特点;由以上78株病毒代表株的同源性比对和进化树分析可知,该病毒NS1基因的核酸和氨基酸的同源性均明显低于其E基因、NS3基因和NS5基因的核酸和氨基酸的同源性,TMUV主要演化为马来西亚（1955）、马来西亚（2012）、泰国（2013）和中国分离株I和中国分类株II（TMUV优势株）五大分支;根据以上病毒代表株蛋白质高级结构和糖基化位点分析,该病毒E蛋白在148151处氨基酸位点存在着由无规则卷曲到α螺旋的变异,在380381处和393397处存在着β折叠片段的延长的变异,在154处氨基酸糖基化位点存在着由NYSA到NYPV、NYSV和NYPA的突变;此外,该病毒NS1蛋白在180182处氨基酸位点存在着由无规则卷曲到α螺旋的结构变异,在175处氨基酸糖基化位点存在由NTTD到NITD的突变。以上结果表明,当前我国TMUV优势株为中国分离株II,且总体变异程度较小;蚊源TMUV（TMUV-SDMS）可作为国内TMUV优势株的代表株。二、TMUV-SDMS在DEF中的感染及样品RNA-Seq分析本研究选用最早感染TMUV蚊源细胞（C6/36）对TMUV-SDMS进行增殖培养,随后将增殖培养后的TMUV-SDMS接种至生长密度为70%80%的原代DEF中。将感染该病毒的DEF细胞和未感染该病毒的DEF细胞分别设为试验组和对照组,于感染后的12 h和24 h时分别提取总RNA,并对其进行质检（A260/A280>1.5,A260/A230>1.0,RIN>7）。运用Illumina HiSeq 2000TM平台对以上样品进行转录组测序（RNA-Seq）,采用RPKM（Reads Per Kilobase of exon model per million mapped sequence reads）方法对Unigene进行计算,按照表达量倍数变化（Fold Change）和表达量变化显著性（P value）筛选Unique（差异基因的筛选标准为差异倍数Fold change>2且P<0.05）。最后,在全基因组背景下,运用超几何运算将筛选出差异表达基因分别向GO功能分类和KEGG信号通路富集分析。结果显示,经过质控后的各组样品得到的clean data,Q20和Q30质控率均在94.0%以上,由此表明本研究中所获得的转录组测序数据质量较高。在病毒感染12 h时,共筛选出911个差异基因,其中83.96%（764/911）的差异基因上调表达,16.04%的差异基因下调表达（147/911）;在病毒感染24 h时,共筛选出3008个差异基因,其中59.54%（1791/3008）的差异基因上调表达,40.46%的差异基因下调表达（1217/3008）。通过对以上差异基因进行GO功能分类和KEGG信号通路富集分析可知,这些差异基因行使的生物学功能主要为免疫系统、细胞生长与坏死、信号转导和信号分子与交互等方面。以上结果表明,TMUV-SDMS可诱导DEF免疫系统、细胞生长与坏死、信号转导和信号分子与交互等生物学功能的改变。三、TMUV-SDMS感染对DEF免疫系统的影响在本研究中,由RNA-Seq所提示的信息可知,免疫相关的差异基因主要富集在Toll样受体信号通路、RIG-I-样受体信号通路、趋化因子信号通路、NOD样受体信号通路、造血细胞系、细胞质DNA识别信号通路等。通过对以上信号通路中的差异基因按照表达量的高低进行进一步分类汇总可知,在TMUV-SDMS感染DEF早期和中期时,宿主细胞内与免疫相关信号通路中的模式识别受体（如RIG-I、MDA5和TMEM173）被激活,导致细胞因子（如IFNα、IL-6、IL-12、CCL19和CCL20）,转录因子和信号分子（如IRF7、NF-kB和STAT1）和抗原呈递蛋白（如CD44和CD70）的大量产生,由此初步揭示了宿主细胞应对该病毒感染的天然免疫转录谱。四、TMUV-SDMS感染对DEF细胞凋亡与坏死影响结合RNA-Seq所提供的信息,本研究运用激光共聚焦显微镜、流式细胞术和JC-1探针等技术定性和定量检测了TMUV-SDMS感染对DEF细胞生长与坏死的影响。结果显示,TMUV-SDMS感染不仅可以导致DEF细胞在感染12 h和24 h后的细胞活性显著降低（P<0.01）,还可以诱导DEF细胞显著的凋亡与坏死、S+G2M期的停滞以及线粒体膜电位的降低（P<0.05或P<0.01）。通过对本研究中细胞凋亡与坏死相关差异基因的汇总分析可知,这些差异基因主要定位于内源性的线粒体途径和外源性的死亡受体途径。以上结果表明,TMUV-SDMS感染可诱导DEF细胞S+G2/M期停滞,这可能是因CDC20B过表达所致;且该病毒感染主要是通过内源性的线粒体途径和外源性的死亡受体途径诱导DEF凋亡与坏死。五、DEF细胞生长与坏死关键基因的筛选与验证为了进一步确定TMUV-SDMS与DEF互作的关键基因,阐明其在调节该病毒感染所诱导DEF细胞生长与坏死过程中所行使生物学功能。本项研究根据RNA-Seq所提供的信息,选择在细胞凋亡信号通路中表达量最高且具有调节线粒体膜通透性、控制CytC和凋亡因子释放等作用的B淋巴细胞瘤2A1抗凋亡基因（BCL2A1）作为目的基因,运用RNAi等分子生物学技术探究其在调节细胞周期、细胞凋亡与坏死等细胞生长与坏死过程中的调节作用。研究结果表明,BCL2A1具有调控宿主细胞G2M期以及细胞凋亡和坏死作用;且该靶基因与BCL2、CDC20B和MCL1等还具有密切关系（即:与BCL2有拮抗作用,与CDC20B、CytC和MCL1等有协同关系）,但具体作用机制还需今后进一步探究。本研究从分子水平探讨了TMUV感染对DEF细胞生物学功能的影响,深入揭示了该病毒所诱导DEF凋亡与坏死的具体机制,研究结果对于丰富TMUV感染宿主转录谱、阐明该病毒逃逸宿主防御机制和探寻靶向线粒体抗病毒药物研发等均具有重要意义。
Abstract
tan bu su bing du （Tembusu virus,TMUV）gan ran ,shi yu 2010nian 4yue fen fa sheng zai wo guo jiang zhe de ou de yi chong xin fa bing du xing chuan ran bing ,ji zhu yao yin qi chan dan ya ti wen sheng gao 、shi yu xia jiang 、luan pao bian xing chu xie 、luan huang xing fu mo yan 、chan dan da fu xia jiang yi ji chu ya tou geng zhen chan 、gong ji shi diao he si zhi ma bi deng dian xing zheng zhuang 。gai chuan ran bing ju you chuan bo fan wei an 、chuan bo su du kuai yi ji gan ran lv gao deng te dian 。zhi jin ,yi zao cheng wo guo da duo shu sheng fen de yang ya chang fa sheng gan ran ,yan chong ying xiang zhao wo guo shui qin yang shi ye de jian kang fa zhan 。shen ru tan jiu bing du gan ran suo you dao su zhu xi bao de sheng wu xue gong neng gai bian ji you guan xin hao tong lu wang lao de diao kong ji zhi ,bu jin you zhu yu li jie bing du zai xi bao nei 、wai de xin hao chuan di ,yi ji zhuai lu hou de diao jie guo cheng ,zi shen yu ji ta xin hao fen zi zhi jian de guan ji ji xiang hu zuo yong ,hai ke dui su zhu xi bao dai xie ji xiang guan yi bing de fa sheng fa zhan guo cheng you jiao wei quan mian de ren shi 。ran er ,mu qian dui yu TMUVyu ji su zhu xi bao hu zuo ji zhi de yan jiu shen shao ,dui yu gai bing du suo you dao su zhu xi bao sheng wu xue gong neng ying xiang ji zhi geng shi que fa le jie 。wei jie jue shang shu wen ti ,ben yan jiu yi ya pei cheng qian wei xi bao （DEF）wei yan jiu dui xiang ,li yong zai liu hang bing xue diao cha zhong suo fen li de wen yuan TMUV（TMUV-SDMS）zuo wei guo nei gai bing du you shi zhu de dai biao zhu ,yun yong zhuai lu zu ce xu ji shu （RNA-Seq）、qRT-PCRhe RNAideng fen zi sheng wu xue ji shu ,zai xi bao ji fen zi shui ping shang shen ru tan jiu TMUVgan ran dui DEFxi bao sheng wu xue gong neng de ying xiang ,shai shua bing yan zheng gai bing du gan ran yu su zhu xi bao hu zuo de guan jian ji yin huo dan bai ,tan tao le TMUV-SDMSsuo you dao DEFdiao wang yu huai si de zhi si ji li ,wei chan ming gai bing du tao yi su zhu fang yu ji zhi 、tan xun kang bing du xin ba dian deng di gong shu ju zhi chi 。yan jiu nei rong zhu yao fen wei yi xia wu ge fang mian :yi 、TMUVwei chuan yan hua fen xi ben xiang yan jiu zai liu hang bing xue diao cha zhong suo fen li dao de 11zhu TMUVfen li zhu （bao gua ya yuan 、ji yuan 、e yuan 、ma qiao yuan he wen yuan ）de ji chu shang ,dui NCBIshu ju ku 67zhu TMUVdai biao zhu de tong yuan xing bi dui 、jin hua shu fen xi 、dan bai zhi san ji jie gou he tang ji hua wei dian jin hang le fen xi 。jie guo biao ming :dang qian wo guo yi you 17ge sheng fen chu xian le TMUVde gan ran ,ju gai chuan ran bing de bao fa ju you qiu ji gao fa de ji jie xing te dian ;you yi shang 78zhu bing du dai biao zhu de tong yuan xing bi dui he jin hua shu fen xi ke zhi ,gai bing du NS1ji yin de he suan he an ji suan de tong yuan xing jun ming xian di yu ji Eji yin 、NS3ji yin he NS5ji yin de he suan he an ji suan de tong yuan xing ,TMUVzhu yao yan hua wei ma lai xi ya （1955）、ma lai xi ya （2012）、tai guo （2013）he zhong guo fen li zhu Ihe zhong guo fen lei zhu II（TMUVyou shi zhu ）wu da fen zhi ;gen ju yi shang bing du dai biao zhu dan bai zhi gao ji jie gou he tang ji hua wei dian fen xi ,gai bing du Edan bai zai 148151chu an ji suan wei dian cun zai zhao you mo gui ze juan qu dao αluo xuan de bian yi ,zai 380381chu he 393397chu cun zai zhao βshe die pian duan de yan chang de bian yi ,zai 154chu an ji suan tang ji hua wei dian cun zai zhao you NYSAdao NYPV、NYSVhe NYPAde tu bian ;ci wai ,gai bing du NS1dan bai zai 180182chu an ji suan wei dian cun zai zhao you mo gui ze juan qu dao αluo xuan de jie gou bian yi ,zai 175chu an ji suan tang ji hua wei dian cun zai you NTTDdao NITDde tu bian 。yi shang jie guo biao ming ,dang qian wo guo TMUVyou shi zhu wei zhong guo fen li zhu II,ju zong ti bian yi cheng du jiao xiao ;wen yuan TMUV（TMUV-SDMS）ke zuo wei guo nei TMUVyou shi zhu de dai biao zhu 。er 、TMUV-SDMSzai DEFzhong de gan ran ji yang pin RNA-Seqfen xi ben yan jiu shua yong zui zao gan ran TMUVwen yuan xi bao （C6/36）dui TMUV-SDMSjin hang zeng shi pei yang ,sui hou jiang zeng shi pei yang hou de TMUV-SDMSjie chong zhi sheng chang mi du wei 70%80%de yuan dai DEFzhong 。jiang gan ran gai bing du de DEFxi bao he wei gan ran gai bing du de DEFxi bao fen bie she wei shi yan zu he dui zhao zu ,yu gan ran hou de 12 hhe 24 hshi fen bie di qu zong RNA,bing dui ji jin hang zhi jian （A260/A280>1.5,A260/A230>1.0,RIN>7）。yun yong Illumina HiSeq 2000TMping tai dui yi shang yang pin jin hang zhuai lu zu ce xu （RNA-Seq）,cai yong RPKM（Reads Per Kilobase of exon model per million mapped sequence reads）fang fa dui Unigenejin hang ji suan ,an zhao biao da liang bei shu bian hua （Fold Change）he biao da liang bian hua xian zhe xing （P value）shai shua Unique（cha yi ji yin de shai shua biao zhun wei cha yi bei shu Fold change>2ju P<0.05）。zui hou ,zai quan ji yin zu bei jing xia ,yun yong chao ji he yun suan jiang shai shua chu cha yi biao da ji yin fen bie xiang GOgong neng fen lei he KEGGxin hao tong lu fu ji fen xi 。jie guo xian shi ,jing guo zhi kong hou de ge zu yang pin de dao de clean data,Q20he Q30zhi kong lv jun zai 94.0%yi shang ,you ci biao ming ben yan jiu zhong suo huo de de zhuai lu zu ce xu shu ju zhi liang jiao gao 。zai bing du gan ran 12 hshi ,gong shai shua chu 911ge cha yi ji yin ,ji zhong 83.96%（764/911）de cha yi ji yin shang diao biao da ,16.04%de cha yi ji yin xia diao biao da （147/911）;zai bing du gan ran 24 hshi ,gong shai shua chu 3008ge cha yi ji yin ,ji zhong 59.54%（1791/3008）de cha yi ji yin shang diao biao da ,40.46%de cha yi ji yin xia diao biao da （1217/3008）。tong guo dui yi shang cha yi ji yin jin hang GOgong neng fen lei he KEGGxin hao tong lu fu ji fen xi ke zhi ,zhe xie cha yi ji yin hang shi de sheng wu xue gong neng zhu yao wei mian yi ji tong 、xi bao sheng chang yu huai si 、xin hao zhuai dao he xin hao fen zi yu jiao hu deng fang mian 。yi shang jie guo biao ming ,TMUV-SDMSke you dao DEFmian yi ji tong 、xi bao sheng chang yu huai si 、xin hao zhuai dao he xin hao fen zi yu jiao hu deng sheng wu xue gong neng de gai bian 。san 、TMUV-SDMSgan ran dui DEFmian yi ji tong de ying xiang zai ben yan jiu zhong ,you RNA-Seqsuo di shi de xin xi ke zhi ,mian yi xiang guan de cha yi ji yin zhu yao fu ji zai Tollyang shou ti xin hao tong lu 、RIG-I-yang shou ti xin hao tong lu 、qu hua yin zi xin hao tong lu 、NODyang shou ti xin hao tong lu 、zao xie xi bao ji 、xi bao zhi DNAshi bie xin hao tong lu deng 。tong guo dui yi shang xin hao tong lu zhong de cha yi ji yin an zhao biao da liang de gao di jin hang jin yi bu fen lei hui zong ke zhi ,zai TMUV-SDMSgan ran DEFzao ji he zhong ji shi ,su zhu xi bao nei yu mian yi xiang guan xin hao tong lu zhong de mo shi shi bie shou ti （ru RIG-I、MDA5he TMEM173）bei ji huo ,dao zhi xi bao yin zi （ru IFNα、IL-6、IL-12、CCL19he CCL20）,zhuai lu yin zi he xin hao fen zi （ru IRF7、NF-kBhe STAT1）he kang yuan cheng di dan bai （ru CD44he CD70）de da liang chan sheng ,you ci chu bu jie shi le su zhu xi bao ying dui gai bing du gan ran de tian ran mian yi zhuai lu pu 。si 、TMUV-SDMSgan ran dui DEFxi bao diao wang yu huai si ying xiang jie ge RNA-Seqsuo di gong de xin xi ,ben yan jiu yun yong ji guang gong ju jiao xian wei jing 、liu shi xi bao shu he JC-1tan zhen deng ji shu ding xing he ding liang jian ce le TMUV-SDMSgan ran dui DEFxi bao sheng chang yu huai si de ying xiang 。jie guo xian shi ,TMUV-SDMSgan ran bu jin ke yi dao zhi DEFxi bao zai gan ran 12 hhe 24 hhou de xi bao huo xing xian zhe jiang di （P<0.01）,hai ke yi you dao DEFxi bao xian zhe de diao wang yu huai si 、S+G2Mji de ting zhi yi ji xian li ti mo dian wei de jiang di （P<0.05huo P<0.01）。tong guo dui ben yan jiu zhong xi bao diao wang yu huai si xiang guan cha yi ji yin de hui zong fen xi ke zhi ,zhe xie cha yi ji yin zhu yao ding wei yu nei yuan xing de xian li ti tu jing he wai yuan xing de si wang shou ti tu jing 。yi shang jie guo biao ming ,TMUV-SDMSgan ran ke you dao DEFxi bao S+G2/Mji ting zhi ,zhe ke neng shi yin CDC20Bguo biao da suo zhi ;ju gai bing du gan ran zhu yao shi tong guo nei yuan xing de xian li ti tu jing he wai yuan xing de si wang shou ti tu jing you dao DEFdiao wang yu huai si 。wu 、DEFxi bao sheng chang yu huai si guan jian ji yin de shai shua yu yan zheng wei le jin yi bu que ding TMUV-SDMSyu DEFhu zuo de guan jian ji yin ,chan ming ji zai diao jie gai bing du gan ran suo you dao DEFxi bao sheng chang yu huai si guo cheng zhong suo hang shi sheng wu xue gong neng 。ben xiang yan jiu gen ju RNA-Seqsuo di gong de xin xi ,shua ze zai xi bao diao wang xin hao tong lu zhong biao da liang zui gao ju ju you diao jie xian li ti mo tong tou xing 、kong zhi CytChe diao wang yin zi shi fang deng zuo yong de Blin ba xi bao liu 2A1kang diao wang ji yin （BCL2A1）zuo wei mu de ji yin ,yun yong RNAideng fen zi sheng wu xue ji shu tan jiu ji zai diao jie xi bao zhou ji 、xi bao diao wang yu huai si deng xi bao sheng chang yu huai si guo cheng zhong de diao jie zuo yong 。yan jiu jie guo biao ming ,BCL2A1ju you diao kong su zhu xi 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论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自山东农业大学的于观留，发表于刊物山东农业大学2019-07-08论文，是一篇关于坦布苏病毒论文,鸭胚成纤维细胞论文,生物学功能论文,细胞凋亡与坏死论文,细胞周期论文,山东农业大学2019-07-08论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自山东农业大学2019-07-08论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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