导读:本文包含了甲基化特异性定量论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:大肠癌,NDRG4基因,DNA甲基化,核酸侵入反应
甲基化特异性定量论文文献综述
严志进,刘云龙,邹秉杰,宋沁馨,李泰明[1]（2016）在《粪便中大肠癌特异性NDRG4基因甲基化水平的超高灵敏定量检测法》一文中研究指出目的粪便中NDRG4基因的甲基化可作为一种无创检测大肠癌的标志物,但传统DNA甲基化检测方法因灵敏度低、特异性不高难以用于粪便样本的检测。文中旨在建立一种高灵敏、高特异的NDRG4基因甲基化定量检测方法(2-ΔCT法),并用于患者粪便DNA样本的检测。方法选择来自南京军区南京总医院的41例粪便样本,其中12例大肠癌、4例腺瘤、25例正常人样本。将核酸侵入反应与实时荧光PCR技术耦联,采用2-ΔCT法进行相对定量,建立高灵敏高特异的DNA甲基化检测方法,并用于41例粪便样本中NDRG4基因甲基化水平的检测。结果检测了6例大肠癌组织及4例FFPE样本中NDRG4基因甲基化水平,全部样本中均能测出NDRG4基因甲基化,甲基化水平范围为0.01%~6.09%。大肠癌、腺瘤患者及正常人中各有8例、4例、2例检测到甲基化信号,甲基化范围分别为0.06%(0~0.51%)、6.61%(0~23.06%)、6.30%(0~51.01%)。大肠癌、腺瘤患者中甲基化检出率(33.3%、50.0%)较正常人显着升高(4.0%),差异有统计学意义(P<0.05)。结论 2-ΔCT法可用于粪便样本中NDRG4基因甲基化水平的准确测定,为大肠癌的无创检测提供了有力工具。(本文来源于《医学研究生学报》期刊2016年10期）
李甫梧[2]（2016）在《基于DNA甲基化特异性位点区分癌症种类以及同种癌症分型并定量检测血液中的循环肿瘤细胞》一文中研究指出本论文利用肿瘤特异性甲基化位点构建了一种十分简单的方法用于区分前列腺癌(PC-3)、乳腺癌(MCF-7)、宫颈癌(Hela、Hela-S)四种细胞系以及正常人全血样本。实验中,我们一共测试了12个基因启动子区中共50个Cp G位点。发现在所测试位点中,无论是PC-3、MCF-7、Hela、Hela-S以及正常人全血样本,每个样本都具有各个细胞系特异性的DNA甲基化图谱,无论在基因层面还是单个基因不同位点的层面上都具有很强的特异性。测试得到结果发现仅需测试叁个甲基化位点(RA-3、SF-6、GS-5)就可以对实验中设定的5个样本做出鉴定,检出所测样本是以上四种癌细胞系中某种细胞系和正常人全血样本的混合物或单独的正常人全血样本。对未知样本进行该3个位点测试,若RA-3/SF-6/GS-5叁个位点测试得到的信号为+/-/-,则该样本为PC-3和正常人全血的混合物;若RA-3/SF-6/GS-5叁个位点测试得到的信号为+/+/+,则所测的样本为MCF-7和正常人全血的混合物;若RA-3/SF-6/GS-5叁个位点测试得到的信号为-/+/-,则该样本为Hela和正常人全血的混合物;若RA-3/SF-6/GS-5叁个位点测到的信号为-/+/+,则该样本为Hela-S和正常人全血的混合物;若RA-3/SF-6/GS-5叁个位点的信号为-/-/-,则所测的样本为正常人全血样本。另外通过以上实验所测的这些甲基化位点,我们构建了一种全新的循环肿瘤细胞检测方法。观察本实验所得到的结果,我们发现肿瘤细胞和正常人全血样本在所测试的甲基化位点中有大量在正常人全血中甲基化水平表达量极低或不表达但在各个癌细胞系中甲基化表达水平极高的位点。这些具有明显差异的甲基化位点均可以作为各个癌细胞系的在正常人全血中作为循环肿瘤细胞时检测用的标志物。在所得到的位点中,可以作为MCF-7细胞系的标志位点有CCN-3、GS-4、GS-5、RA-3、RA-4、RA-5、RA-6、RP-1、RP-4、RP-7、SF-6、TIG-5、TNF-1等13个位点;可以作为PC-3的标志位点有RA-3、RA-4、RA-5、RA-6、RP-1、RA-6、RP-7、TIG-5、TNF-1等9个位点;可以作为Hela的标志位点有RP-1、RP-2、RP-4、RP-6、RP-7、SF-6等六个位点;在Hela-S中有CHF-2、CHF-3、GS-3、GS-4、GS-5、SF-6、TNF-1等7个位点。我们选取了RA-3和RA-5位点作为PC-3和MCF-7的标志位点,另外选取了CHF-3位点作为Hela-S的标志位点,均呈现出较好的结果,仅检测当体系中存在2个癌细胞时,均可以和阴性对照组有明显区分,在体系中有2-2000个癌细胞均呈现出很好的趋势。另外相比目前主流的免疫磁珠捕获的方法来说,该方法仅需200μL去血清血液样本就可以得到相当的阳性率。因该方法在检测循环肿瘤细胞时,所检测到的循环肿瘤细胞不仅包含了具有细胞活性的循环肿瘤细胞,所得到的信号也有部分来自于在血液中已经凋亡的循环肿瘤细胞(由于肿瘤细胞脱离原先的组织到血液中后所处的微环境发生巨大变化,大部分血液中的癌细胞处于凋亡状态)。以及当以DNA作为靶标用于检测时,由于血液中数量最多的血红细胞是没有DNA的,因此也清除了在循环肿瘤细胞检测时最大的障碍。相比以m RNA作为特异性靶标对循环肿瘤进行检测的研究工作,DNA的稳定性是m RNA所无法比拟的。此外,该检测方法对样本的新鲜程度要求也更低,并不要求血样是否溶血。(本文来源于《中国科学院研究生院(上海应用物理研究所)》期刊2016-04-01）
刘洋,钟文雯,王莉莉,于力,朱宏丽[3]（2014）在《甲基化特异性定量PCR技术的应用研究进展》一文中研究指出表观遗传是指DNA序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变,表观遗传改变主要从叁个层面调控基因表达:DNA修饰(DNA甲基化)、蛋白修饰以及非编码RNA的调控(如micro RNA)[1]。DNA甲基化作为研究最为深入的一种,在人类胚胎发育、基因印记、肿瘤发生发挥重要作用[2]。原癌基因和抑癌基因在表观遗传学上的异常改变是肿瘤发生的重要机制之一[3]。1996年Herman等[4]发明(本文来源于《山东医药》期刊2014年19期）
刘洋,康慧媛,王莉莉,卢学春,朱宏丽[4]（2014）在《急性白血病细胞中ID4基因甲基化的PCR定量检测系统的建立及其特异性和敏感性》一文中研究指出ID4基因启动子区甲基化发生率在急性白血病中极高,甲基化程度与急性白血病关系密切。因缺少合适的研究方法,其具体的甲基化量化水平与疾病的关系,人们一直缺乏认识。本研究旨在建立ID4甲基化定量PCR体系,同时验证该方法的特异性及敏感性,并初步尝试在初治急性白血病骨髓样本中评估ID4的甲基化水平。首先构建质粒并建立体系标准曲线,分别使用MSP和定量MSP对细胞系样本进行检测,以传统MSP的结果为对照,验证新方法的特异性;按不同比例将甲基化阴性和阳性细胞混合,用甲基化定量PCR扩增验证新方法敏感性。结果表明,本研究成功建立了符合绝对定量要求的标准曲线;通过细胞系验证,MSP结果与定量MSP结果完全一致;同时在甲基化阴性细胞背景下,定量MSP可以稳定的检测到1∶10-5水平的ID4甲基化阳性细胞。在急性白血病骨髓样本检测中,定量MSP甲基化阳性检出率高于MSP。结论:本研究成功建立了完整的ID4基因甲基化定量PCR体系,该方法特异性好、敏感性高。(本文来源于《中国实验血液学杂志》期刊2014年02期）
官黄涛,吕金明,吴春林,李红钢,朱长虹[5]（2013）在《甲基化DNA免疫沉淀-荧光实时定量PCR检测人精浆游离DNA睾丸和附睾特异性甲基化启动子》一文中研究指出目的:建立检测精浆游离DNA(cfsDNA)启动子甲基化水平的甲基化DNA免疫沉淀-荧光实时定量PCR(MeDIP-qPCR)方法。方法:提取精液参数正常(6例)和输精管结扎(6例)男性的cfsDNA,将两组不同个体的cfsDNA分别进行混合,超声处理后形成DNA片段,通过MeDIP分离甲基化DNA片段,然后用qPCR方法检测启动子甲基化水平。结果:精液参数正常组的PRAME、PEG10、MORC1、GML、HOXA5、DNMT3L、SNURF、MSH4、DAZ1和CLPB启动子甲基化水平分别为14.93%、2.64%、0.69%、2.66%、17.50%、21.10%、5.98%、2.28%、13.50%和3.86%,明显低于输精管结扎组的121.25%、73.62%、16.25%、42.90%、76.74%、112.40%、59.79%、25.85%、91.90%和64.53%。其中,PRAME、MORC1、GML、HOXA5、DNMT3L、SNURF、MSH4和DAZ1等8个启动子MeDIP-qPCR的检测结果与启动子甲基化芯片结果一致。结论:通过MeDIP-qPCR方法可以定量检测到cfsDNA中的特异性启动子甲基化,为确定cfsDNA中睾丸和附睾特异性甲基化启动子提供了有效途径。(本文来源于《中华男科学杂志》期刊2013年11期）
徐周敏,秦士新,裴峰,瞿琴[6]（2013）在《PAX1基因甲基化特异性定量PCR检测在宫颈癌筛查中的意义》一文中研究指出目的探讨定量测定配对盒家族基因1(PAX1)甲基化水平在宫颈癌筛查中的意义。方法收集正常宫颈组织20例、宫颈上皮内瘤变Ⅰ(CINⅠ)组织15例、CINⅡ组织16例、CINⅢ组织19例和宫颈癌组织22例。采用甲基化特异性实时定量聚合酶链反应(QMSP)定量检测不同宫颈组织中PAX1甲基化水平,甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测宫颈癌组织PAX1基因区域甲基化情况,并同时行第2代杂交捕获-人乳头瘤病毒-DNA(HC2-HPV-DNA)检测。采用受试者工作特征曲线(ROC)比较两者对宫颈癌的诊断效率。甲基化率通过甲基化指数(PMR)进行指标量化。结果宫颈癌组织的PMR为(75.27±30.61)%,显着高于CINⅢ的(12.90±10.80)%和其他良性病变及正常组织(P<0.001)。QMSP检测PAX1甲基化的ROC曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异度分别为0.98、100.0%和84.3%,优于HC2-HPV-DNA检测的0.82、100.0%和52.5%,差异有统计学意义(P<0.001)。MS-PCR检测结果显示,在癌组织原发灶、转移性癌组织、毗邻原发灶的正常组织和距原发灶边缘>3cm的正常组织中,PAX1的甲基化率分别为95.0%(19/20)、100.0%(4/4)、70.0%(14/20)和35.0%(7/20),组间比较差异有统计学意义(P<0.001)。结论 QMSP方法定量检测PAX1的甲基化具有极高的灵敏度,且其特异度超过目前常用的HC2-HPV-DNA检测方法,在临床筛查和宫颈癌的早期诊断中可能具有潜在的应用价值。(本文来源于《临床肿瘤学杂志》期刊2013年01期）
潘程宇,曹俊,季兴,张丽莉,郭慧敏[7]（2011）在《实时荧光定量PCR和甲基化特异性PCR检测结直肠癌APC、MLH1基因甲基化状态》一文中研究指出背景:启动子区甲基化致肿瘤抑制基因失活在结直肠癌的发生、发展中起重要作用,检测肿瘤相关基因的甲基化状态,可能为寻找新的结直肠癌诊断、预后相关标记物提供依据。目的:比较实时荧光定量PCR(FQ-PCR)与甲基化特异性PCR(MSP)检测基因甲基化状态的差异。方法:以FQ-PCR检测66例结直肠癌组织和20例癌旁组织中与结直肠癌的发生、发展相关的抑癌基因APC和错配修复基因MLH1的甲基化状态,同时以MSP检测结直肠癌组织中APC基因的甲基化状态。结果:根据FQ-PCR结果,结直肠癌组织中APC、MLH1基因甲基化阳性率显着高于癌旁组织(48.5%和54.5%对0%和0%,P=0.000)。FQ-PCR和MSP可检出的甲基化阳性对照DNA最低浓度分别为0.015 ng/μl和1.5 ng/μl,两者对APC基因甲基化状态的检测结果差异有统计学意义(P<0.05)。结论:在DNA甲基化的检测手段中,FQ-PCR的敏感度优于MSP。(本文来源于《胃肠病学》期刊2011年02期）
刘洋,康慧媛,王新荣,王畅,王莉莉[8]（2009）在《ID4基因甲基化特异性定量PCR方法的建立及其在急性白血病微小残存病检测中的意义》一文中研究指出背景:抑癌基因和原癌基因通过表观遗传学和遗传学机制上的异常导致了急性白血病的发生。多种抑癌基因启动子区CpG岛高甲基化导致的相应基因沉默,在急性白血病发生发展中起了重要的作用,并成为急性白血病细胞的特征之一。DNA结合抑制因子4(Inhibitor of DNA binding(本文来源于《第12届全国实验血液学会议论文摘要》期刊2009-11-05）
刘洋[9]（2009）在《ID4基因甲基化特异性定量PCR方法的建立及其在急性白血病微小残存病检测中的意义》一文中研究指出抑癌基因和原癌基因通过表观遗传学和遗传学机制上的异常导致了急性白血病的发生。多种抑癌基因启动子区CpG岛高甲基化导致的相应基因沉默,在急性白血病发生发展中起了重要的作用,并成为急性白血病细胞的特征之一。DNA结合抑制因子4(Inhibitor of DNA binding 4,ID4)属于螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)蛋白家族,导师于力教授通过甲基化敏感性限制性路标基因组扫描技术(Restriction Landmark Genomic Scanning,RLGS)筛选出ID4基因,并首次发现它是一个受甲基化调控的抑癌基因。进一步通过甲基化特异性PCR(MS-PCR)技术研究发现,ID4甲基化的发生与急性白血病病情的发展密切相关。这些研究结果提示:ID4基因启动子区甲基化可能成为急性白血病的一种新的生物标记。目前针对ID4甲基化的研究仍然停留在定性水平,将实时定量PCR技术与MSP技术结合,分析急性白血病病情的发展与ID4基因甲基化量化水平之间的关系,这一课题在国内外尚属于研究空白。ID4甲基化特异性定量PCR方法的建立从理论上可以提高甲基化检测水平的特异性和敏感性,在微小残留病变检测、复发风险评估、治疗策略选择等方面具有重要的临床意义。本研究建立了ID4甲基化特异性定量PCR方法,并通过对急性白血病患者肿瘤负荷与甲基化水平之间的变化趋势分析探讨该方法在在微小残留病变检测、复发风险评估中的意义。首先实验通过MSP和定量MSP的方法在细胞系中证明:1、HL-60、U937、MOLT4、NK-92血液肿瘤细胞系为ID4基因高甲基化细胞系。K562甲基化阳性,甲基化程度低于前四种细胞系。293-t、293细胞系的ID4基因启动子区呈非甲基化状态。2、在ID4基因启动子区在急性白血病淋系和髓系细胞系中甲基化均为阳性,提示可能在急性白血病亚型中ID4甲基化覆盖率较广。3、定量MS-PCR结果与MS-PCR结果一致,证明在定量MS-PCR体系的可靠性。第二,建立完整的ID4甲基化定量PCR体系,包括设计ID4甲基化特性探针、引物;选择内参体系、阳性、阴性以及空白对照;成功构建了目标片段和内参扩增片段的质粒;制作目标片段和内参的标准曲线;选择适合的定量分析方法。并验证该方法的特异性和敏感性,结果证明:1、17例正常骨髓ID4甲基化均为阴性,45例初治急性白血病骨髓样本甲基化阳性率为77.8%,其中AML为72.7%,ALL为79.2%,方法具有良好的特异性。2、将甲基化阴性和阳性细胞系按不同比例混合,该方法最低可以检测到1:10~(-5)中的ID4甲基化阳性细胞,证明敏感性高。第叁,在方法建立的基础上,初步尝试检测急性白血病骨髓样本:1、甲基化阳性率中,正常骨髓标本均为0,初治组为75%,复发、未缓解组为100%。结果提示:在急性白血病细胞中耐药、难治的克隆甲基化阳性率高;易复发、难治的亚型甲基化阳性率呈增高的趋势。2、PMR(percentage of methylatedreference)值代表甲基化定量水平,正常组均为0与患病组有显着差异(p＜0.00);在不同疾病状态下(初治、完全缓解、复发、未缓解)初治组与完全缓解组PMR值有统计学差异(p=0.031＜0.05)。PMR值似乎与肿瘤在体内的负荷有关。初治时个体间PMR值差异较大。3、系列样本的研究发现:持续缓解状态时,PMR值一直保持在极低的水平;复发时PMR伴随肿瘤细胞数量增加而增加,PMR值与急性白血病肿瘤负荷有显着的相关性;有提前预测形态学复发的可能;与其他遗传学微残指标变化趋势相同,可检测到急性白血病分子复发。总之,本研究成功建立了ID4甲基化特异性定量PCR的体系和方法。同时通过临床样本证明:ID4基因启动子区的甲基化在各急性白血病亚型中具有覆盖率广;该方法特异性好,敏感性高;甲基化水平的量化指标PMR值,可以反映急性白血病患者肿瘤细胞负荷变化;不同克隆的白血病细胞间存在差异;动态监测具有提示复发的作用,具备成为新的MRD检测标志的潜质。本研究为其在MRD检测中的应用奠定了初步的实验基础。(本文来源于《中国人民解放军军医进修学院》期刊2009-05-20）
王先良[10]（2006）在《基于甲基化特异性引物和SAGE的高通量DNA甲基化定量检测方法研究》一文中研究指出遗传与变异是生物界普遍存在的一种生命现象。经典遗传学告诉我们若生物遗传物质相同,生物性状也应该一样,但是事实往往并非如此!没有遗传物质的变化,生物性状却可以在亲代和子代间传递,涉及的内在机制就是在经典遗传本质之外的表观遗传(Epigenetics)。所谓表观遗传,是指当DNA序列没有任何改变时,基因的功能或者生物性状的变化却可以通过有丝分裂和/或减数分裂进行传递。表观遗传的本质与基因组DNA甲基化和组蛋白的修饰(甲基化和乙酰化)存在密切关系。现有研究表明DNA甲基化状态改变是比基因突变更早的生物事件。真核生物基因组DNA甲基化与基因表达、肿瘤发生、基因印迹、X染色体失活和染色体结构维持有密切关系。核心机制在于基因表达调节位点的高甲基化可以抑制基因的表达或者使基因失活,因此开展真核生物基因组甲基化研究具有重要意义!真核生物基因组DNA甲基化主要发生在CG二核苷酸(CpG)的胞嘧啶碱基5位碳环上,简称为5’-mC。目前发现真核生物基因组内每个CpG位点的甲基化不是完全甲基化和无甲基化这两种简单的情况,不同生物、不同组织、不同器官的基因组DNA每个甲基化潜在位点都有其固有的或者说是相对正常的甲基化水平,每个位点甲基化水平可以用百分比来表示。而这种相对正常的甲基化水平对于维护这些细胞群相对正常的生理和生化功能具有非常重要的意义。了解真核生物体内不同生物、不同组织、不同器官的基因组DNA每个CpG位点甲基化固有水平,是开展各种病理状态和机体稳态失衡的表遗传相关机制的前提。开展DNA甲基化研究的关键是了解目标CpG甲基化水平变异位点(methylation variation positions)与各种生理和病理事件的相互关系。就我们人类来说,如果能够建立某种正常组织基因组所有CpG位点固有甲基化水平的图谱,那么对于目前的各种肿瘤等的表观遗传机制研究来说将是根本性的进步。目前一项针对绘制人类所有不同组织、不同器官的基因组每个CpG位点甲基化固有水平图谱的计划即人类表观遗传研究计划(Human Epigenetic Project, HEP)已经于2003年开始启动。HEP的主要目的是绘制出与目前人类基因组图谱相似的“甲基化变异图谱”,即甲基化变异位点(methylation variable positions, MVPs)图谱,MVPs对阐明一些重要疾病的发病机理和疾病诊断具有重要意义。正如人类基因组计划的完成依赖于高效技术的开发一样, HEP计划能否实现的关键就在于高通量DNA甲基化定量检测方法的使用与否。目前开展DNA甲基化研究困难较大,主要的原因就在于DNA甲基化的检测比较困难。到目前为止,虽然有很多方法报道,但是一般还只限于定性检测(如甲基化特异性PCR法),一个或数个位点的定量检测等(MALDI质谱定量检测技术)。所以开展DNA甲基化研究真正的限制在于检测方法的局限。目前可使用的甲基化检测技术虽然很多,但是这些方法一般来说都有一些固有的缺陷如单次检测位点有限,需要使用位点特异性引物,需要较高的硬件支持等。因此,相对于比HGP大数倍的工作量,建立新的高通量的甲基化CpG位点定量检测方法对人类表观遗传研究特别是HEP来说是一个亟待解决的难题。SAGE能以远高于DNA芯片的精确度和重复性来检测在病理条件下基因表达谱的改变。基于SAGE技术的启发,我们将亚硫酸氢钠处理和甲基化特异性引物延伸结合起来,创立了一种全新的基于甲基化特异性引物(methylation-specific primers, MSP)和SAGE技术的高通量DNA甲基化定量检测方法,简称为MSP-SAGE,以应用于基因组甲基化定量分析。MSP-SAGE的原理如下:首先利用亚硫酸氢钠对基因组DNA进行处理,使未甲基化的胞嘧啶转变为U,而甲基化的CpG不变。将处理和未处理的DNA变性成单链,用随机引物PNNNNCG对存在含有CG的单链进行特异延伸,而无甲基化CG的单链处则不能延伸;再次变性后利用随机引物将延伸所得的单链产物补成带有一个磷酸基团的平末端双链;再将其与一个带有平端的人工接头Linker1(含Mme I限制性内切酶识别位点TCCPuAC(N)20/18)进行连接,用Mme I酶切后再与连接子Linker2连接起来,从而构建成两端具有已知引物序列和中间带有未知序列的双链模板并进行随后的PCR扩增;对PCR产物进行酶切,分离纯化对应的17bp的未知标签片断Tags;将这些Tags串联起来形成串联子,将串联子克隆测序,一次即可得到许多Tag的序列信息和数量信息。根据两组Tags的序列信息可以对甲基化CpG进行定位,根据两组Tags的数量信息可以计算出该位点的甲基化定量信息(%)。本研究分为叁个部分:第一部分、DNA甲基化标准品的研制目的:制备DNA定量甲基化标准系列应用于研制DNA甲基化定量检测新方法和DNA甲基化样本的实际检测。方法:通过BLAST搜索,确定人工合成特异的DNA单链序列并将其杂交成双链DNA标准序列,然后用DNA甲基化酶M.SssⅠ将标准DNA序列完全甲基化,对未甲基化DNA序列进行降解后,回收完全甲基化序列并利用亚硫酸氢钠(HSO3-)基因组测序法检测其甲基化的效果,最后配制不同甲基化水平的DNA甲基化标准品。结论:HpaⅡ酶切结果显示DNA序列甲基化处理效果较好。亚硫酸氢钠基因组测序法克隆测序结果也证明回收的DNA甲基化双链处于完全甲基化状态。结果: DNA甲基化系列标准品研制成功,并可应用于下一步的DNA甲基化方法学研究。第二部分、基于甲基化特异性引物和SAGE的DNA甲基化高通量检测方法目的:创立一种全新的基于甲基化特异性引物和SAGE技术的高通量DNA甲基化定量检测方法(MSP-SAGE),以应用于高通量DNA甲基化的定量检测。方法:MSP-SAGE的设计综合利用了SAGE技术、甲基化特异性引物、核酸内切酶MmeⅠ、生物素磁珠和亚硫酸氢钠处理技术的优点。首先利用亚硫酸氢钠对基因组DNA进行处理,使未甲基化的胞嘧啶转变为U,而甲基化的CpG不变。将处理和未处理的DNA变性成单链,用随机引物PNNNNCG对存在含有CG的单链进行特异延伸,而无甲基化CG的单链处则不能延伸;再次变性后利用随机引物将延伸所得的单链产物补成带有一个磷酸基团的平末端双链;再将其与一个带有平端的人工接头Linker1 (含Mme I限制性内切酶识别位点TCCPuAC(N)20/18)进行连接,用Mme I酶切后再与连接子Linker2连接起来,从而构建成两端具有已知引物序列和中间带有未知序列的双链模板并进行随后的PCR扩增;对PCR产物进行酶切,分离纯化对应的17bp的未知标签片断Tags;将这些Tags串联起来形成串联子并进行克隆测序,一次即可得到许多Tag的序列信息和数量信息。将来自于未处理组的某一CpG位点的序列出现的次数定义为[Tags]A,其相应的处理组的该CpG位点的序列出现的次数定义为[Tags]B,将标准系列的实际甲基化水平和[Tags]B/[Tags]A之间建立线性回归方程,得出回归系数k。根据测序结果计算出每一位点的[Tags]B/[Tags]A比值,依据公式:ML(%)=[Tags]B/[Tags]A×1/k×100,就可以计算出该位点的甲基化定量信息。结果:MSP-SAGE具有良好的线性,基于标准系列的[Tags]B/[Tags]A与其实际甲基化水平的标准曲线方程为Y=1.455x(R2=0.984,P<0.01)。甲基化水平为80%的DNA甲基化标准样品,其对应的[Tags]B/[Tags]A为137/119,计算所得的甲基化水平为79.1%。MSP-SAGE的回收率在95%到110%之间,精确度位于4.2%和10.5%,检测限在3%左右。另外还对MSP-SAGE的实验条件进行了优化。DNA的适宜起始模板量应该不低于6×107个DNA分子,MSP-SAGE的单次检测通量至少可以达到24个CpG位点,产生MSP-SAGE稳定检测结果所需克隆数目至少为被检测CpG位点的两倍。结论:相对于目前的检测方法,MSP-SAGE具有很多优点,是一种很有应用前途的高通量DNA甲基化定量检测方法。第叁部分、利用MSP-SAGE检测p16基因CpG岛人工样品目的:检验MSP-SAGE用于高通量甲基化定量检测的实际效果。方法:以人类p16基因CpG岛区域为目标,人工扩增构建出甲基化水平已知的人类基因组人工样品作为检测对象,同时利用MSP-SAGE和基因组测序法对人工样品的DNA甲基化进行定量检测,并对结果进行横向比较。结果:各次检测均具有良好的线性,DNA甲基化人工样品MSP-SAGE和亚硫酸氢钠测序法检测结果差异无统计学意义,两种方法的总体一致性可以达到98.51%。结论:MSP-SAGE是一种高效实用的高通量DNA甲基化定量检测方法,可以应用于真核生物基因组DNA甲基化的高通量检测。(本文来源于《华中科技大学》期刊2006-05-01）
甲基化特异性定量论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本论文利用肿瘤特异性甲基化位点构建了一种十分简单的方法用于区分前列腺癌(PC-3)、乳腺癌(MCF-7)、宫颈癌(Hela、Hela-S)四种细胞系以及正常人全血样本。实验中,我们一共测试了12个基因启动子区中共50个Cp G位点。发现在所测试位点中,无论是PC-3、MCF-7、Hela、Hela-S以及正常人全血样本,每个样本都具有各个细胞系特异性的DNA甲基化图谱,无论在基因层面还是单个基因不同位点的层面上都具有很强的特异性。测试得到结果发现仅需测试叁个甲基化位点(RA-3、SF-6、GS-5)就可以对实验中设定的5个样本做出鉴定,检出所测样本是以上四种癌细胞系中某种细胞系和正常人全血样本的混合物或单独的正常人全血样本。对未知样本进行该3个位点测试,若RA-3/SF-6/GS-5叁个位点测试得到的信号为+/-/-,则该样本为PC-3和正常人全血的混合物;若RA-3/SF-6/GS-5叁个位点测试得到的信号为+/+/+,则所测的样本为MCF-7和正常人全血的混合物;若RA-3/SF-6/GS-5叁个位点测试得到的信号为-/+/-,则该样本为Hela和正常人全血的混合物;若RA-3/SF-6/GS-5叁个位点测到的信号为-/+/+,则该样本为Hela-S和正常人全血的混合物;若RA-3/SF-6/GS-5叁个位点的信号为-/-/-,则所测的样本为正常人全血样本。另外通过以上实验所测的这些甲基化位点,我们构建了一种全新的循环肿瘤细胞检测方法。观察本实验所得到的结果,我们发现肿瘤细胞和正常人全血样本在所测试的甲基化位点中有大量在正常人全血中甲基化水平表达量极低或不表达但在各个癌细胞系中甲基化表达水平极高的位点。这些具有明显差异的甲基化位点均可以作为各个癌细胞系的在正常人全血中作为循环肿瘤细胞时检测用的标志物。在所得到的位点中,可以作为MCF-7细胞系的标志位点有CCN-3、GS-4、GS-5、RA-3、RA-4、RA-5、RA-6、RP-1、RP-4、RP-7、SF-6、TIG-5、TNF-1等13个位点;可以作为PC-3的标志位点有RA-3、RA-4、RA-5、RA-6、RP-1、RA-6、RP-7、TIG-5、TNF-1等9个位点;可以作为Hela的标志位点有RP-1、RP-2、RP-4、RP-6、RP-7、SF-6等六个位点;在Hela-S中有CHF-2、CHF-3、GS-3、GS-4、GS-5、SF-6、TNF-1等7个位点。我们选取了RA-3和RA-5位点作为PC-3和MCF-7的标志位点,另外选取了CHF-3位点作为Hela-S的标志位点,均呈现出较好的结果,仅检测当体系中存在2个癌细胞时,均可以和阴性对照组有明显区分,在体系中有2-2000个癌细胞均呈现出很好的趋势。另外相比目前主流的免疫磁珠捕获的方法来说,该方法仅需200μL去血清血液样本就可以得到相当的阳性率。因该方法在检测循环肿瘤细胞时,所检测到的循环肿瘤细胞不仅包含了具有细胞活性的循环肿瘤细胞,所得到的信号也有部分来自于在血液中已经凋亡的循环肿瘤细胞(由于肿瘤细胞脱离原先的组织到血液中后所处的微环境发生巨大变化,大部分血液中的癌细胞处于凋亡状态)。以及当以DNA作为靶标用于检测时,由于血液中数量最多的血红细胞是没有DNA的,因此也清除了在循环肿瘤细胞检测时最大的障碍。相比以m RNA作为特异性靶标对循环肿瘤进行检测的研究工作,DNA的稳定性是m RNA所无法比拟的。此外,该检测方法对样本的新鲜程度要求也更低,并不要求血样是否溶血。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
甲基化特异性定量论文参考文献
[1].严志进,刘云龙,邹秉杰,宋沁馨,李泰明.粪便中大肠癌特异性NDRG4基因甲基化水平的超高灵敏定量检测法[J].医学研究生学报.2016
[2].李甫梧.基于DNA甲基化特异性位点区分癌症种类以及同种癌症分型并定量检测血液中的循环肿瘤细胞[D].中国科学院研究生院(上海应用物理研究所).2016
[3].刘洋,钟文雯,王莉莉,于力,朱宏丽.甲基化特异性定量PCR技术的应用研究进展[J].山东医药.2014
[4].刘洋,康慧媛,王莉莉,卢学春,朱宏丽.急性白血病细胞中ID4基因甲基化的PCR定量检测系统的建立及其特异性和敏感性[J].中国实验血液学杂志.2014
[5].官黄涛,吕金明,吴春林,李红钢,朱长虹.甲基化DNA免疫沉淀-荧光实时定量PCR检测人精浆游离DNA睾丸和附睾特异性甲基化启动子[J].中华男科学杂志.2013
[6].徐周敏,秦士新,裴峰,瞿琴.PAX1基因甲基化特异性定量PCR检测在宫颈癌筛查中的意义[J].临床肿瘤学杂志.2013
[7].潘程宇,曹俊,季兴,张丽莉,郭慧敏.实时荧光定量PCR和甲基化特异性PCR检测结直肠癌APC、MLH1基因甲基化状态[J].胃肠病学.2011
[8].刘洋,康慧媛,王新荣,王畅,王莉莉.ID4基因甲基化特异性定量PCR方法的建立及其在急性白血病微小残存病检测中的意义[C].第12届全国实验血液学会议论文摘要.2009
[9].刘洋.ID4基因甲基化特异性定量PCR方法的建立及其在急性白血病微小残存病检测中的意义[D].中国人民解放军军医进修学院.2009
[10].王先良.基于甲基化特异性引物和SAGE的高通量DNA甲基化定量检测方法研究[D].华中科技大学.2006