一、乙型肝炎病毒动物模型的研究浅析（论文文献综述）
湛梦茹[1]（2021）在《激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响及相关机制研究》文中指出背景与目的:慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）引起的一种慢性传染性疾病,全球疾病负担重,其中大部分慢性乙肝病毒携带者均在5岁之前被感染。目前没有能够彻底清除HBV的治疗方法。免疫治疗能够实现CHB患者的功能性治愈,是具有前景的乙肝治疗策略之一。慢性HBV感染时免疫系统往往是免疫耐受或衰竭状态。免疫检查点是表达在免疫细胞表面对免疫反应起活化或抑制作用的分子,通过对他们的调节能够打破这种耐受状态。共刺激分子OX40/OX40L、4-1BB是肿瘤坏死因子（受体）超家族（tumor necrosis factor（receptor）superfamily,TNF（R）SF）的成员,在免疫反应的活化尤其是T细胞的活化中起到了重要作用。而程序性死亡受体-1（programmed cell death 1,PD-1）是免疫球蛋白受体CD28亚家族的成员,作为抑制性的信号分子与免疫系统的耐受或衰竭有关。然而目前为止,这些免疫检查点能否作为免疫调节的靶点治疗CHB尚不能明确。相对于婴幼儿,成人对HBV可以产生更强的更有效的免疫反应从而清除病毒,其中发挥年龄依赖性作用的免疫分子尚不清楚。本研究立足于慢性乙型肝炎感染的背景下,通过对OX40/OX40L、PD-1、4-1BB在CHB患者中的表达特点的研究,从而明确其临床意义,及其与年龄的关系。接着我们在rAAV8/1.3HBV小鼠模型中激活免疫检查点OX40,研究其对HBV复制的影响及相关机制,以期为以OX40为靶点治疗CHB的策略提供更多的理论依据。材料与方法:本研究首先收集人的样本用以检测免疫检查点OX40/OX40L、PD-1、4-1BB的表达情况。外周血样本来自我们从2018年9月到2019年6月在吉林大学白求恩第一医院纳入的64名慢性乙肝患者和另外招募的37名健康志愿者。其中慢性乙肝患者包括52名未进行抗病毒治疗的患者和12名应用恩替卡韦（entecavir,ETV）抗病毒治疗的患者,健康志愿者包括24名成人和13名儿童。从外周血中分离出血浆和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。肝脏组织病理标本来自18名进行肝脏穿刺的患者和6名进行肝脏血管瘤手术的成人患者。其中18名慢性乙肝患者包括9名慢性乙型肝炎发作的患者和9名慢性乙型病毒感染未发作的患者。在收集的人的样本中我们先后检测了OX40/OX40L、PD-1、4-1BB的表达情况。为了研究OX40/OX40L在人群中的表达特点,我们应用流式细胞术检测PBMCs中膜形式的OX40和OX40L（membrane-bound OX40,m OX40;membrane-bound OX40L,m OX40L）的表达;应用酶联免疫吸附试验检测血浆中可溶性形式的OX40和OX40L（soluble OX40,s OX40;soluble OX40L,s OX40L）水平;应用免疫组化的方法对肝组织中OX40和OX40L的表达量进行检测。之后为了研究PD-1和4-1BB在CHB患者中表达特点,我们应用前期检测OX40/OX40L的人群样本外加从我院病理科另申请到的6名儿童的肝组织样本,对PD-1和4-1BB在CHB患者中的表达情况进行了检测。我们应用磁珠分选的方法将PBMCs中的CD4+和CD8+T细胞分选出来,应用q RT-PCR的方法检测了各个T细胞亚群PD-1和4-1BB mRNA的水平;应用酶联免疫吸附试验法检测血浆中可溶性的PD-1和4-1BB（soluble PD-1,s PD-1;soluble 4-1BB,s4-1BB）的水平;应用免疫组化的方法检测了肝组织中关于PD-1和4-1BB的表达情况。最后我们将以上检测结果与CHB患者的疾病特点及临床指标进行相关性分析从而探究他们在慢性乙肝感染中的临床意义,及与年龄的关系。基于前期临床样本的结果,我们应用尾静脉注射腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）的方法构建了rAAV/1.3HBV小鼠模型,首次将OX40激动性的单抗应用于该模型以观察其产生的作用。为了明确激活免疫检查点OX40对HBV复制的作用,我们应用全自动电化学发光分析仪检测血清内乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBs Ag）和乙肝e抗原（hepatitis B e antigen,HBe Ag）的水平,用q RT-PCR法检测HBV DNA定量,用免疫组化法检测小鼠肝组织内HBs Ag和乙肝核心抗原（hepatitis B core antigen,HBc Ag）的表达水平。为了明确激活OX40靶点对HBV复制的作用的同时产生的肝脏炎症变化,我们应用微孔板法检测小鼠血清中ALT、AST的水平,应用HE染色的方法观察小鼠肝脏炎症病理变化。为了观察这个过程中伴随的免疫变化,我们分离了小鼠肝脏内浸润的淋巴细胞,应用流式细胞术对其中T细胞亚群的比例进行了检测,同时我们应用流式微球检测法（cytometric bead array,CBA）对该过程中小鼠血清中Th1、Th2、Th17相关的细胞因子进行了评估。期间我们还对小鼠脾脏的长度和重量进行了评估与检测。为了探究上述过程的机制,我们在rAAV8/1.3HBV小鼠模型的基础上将CD4+和CD8+T细胞进行分别剔除,构建了CD4+和CD8+T细胞缺陷的rAAV8/1.3HBV小鼠模型,连同安慰剂组小鼠同时给予OX40激动剂。应用上述检测方法分别对模型中病毒学变化和血清转氨酶变化进行了检测。同时为了进一步从mRNA水平研究激活OX40靶点对HBV复制的作用过程中基因表达的变化,我们分离了小鼠肝内的淋巴细胞对其进行mRNA转录组测序（mRNA sequencing,mRNA-seq）。测序所得的差异表达的mRNAs（differentially expressed mRNAs,DEmRNAs）分别纳入火山图和聚类热图,并分别应用Go功能富集及KEGG、Reactome通路富集的方法对这些DEmRNAs所富集的功能和通路进行初步探索。研究结果:关于OX40/OX40L在人的样本中的表达结果显示在外周血PBMCs中表达OX40+T细胞的百分比在CHB患者中是减少的,其中在高病毒载量组和肝炎发作组中这种减少的趋势尤其明显,且OX40+T细胞的百分比与血清病毒学指标呈负相关。而OX40L+B细胞和单核细胞的百分比在CHB患者的PBMCs中是增多的,同样的这种增多的趋势在高病毒载量组和肝炎发作的组中也比较明显,且他们主要与肝脏炎症指标呈正相关。同时我们还发现慢性乙肝患者外周血中s OX40/OX40L表达明显升高,同样的这种增多的趋势在高病毒载量组和肝炎发作组比较明显,且s OX40/OX40L的水平与病毒复制及肝脏炎症指标均呈正相关。另外ETV治疗前后血浆中s OX40水平没有明显变化。同时我们发现肝组织中OX40/OX40L的表达趋势与血浆中s OX40/OX40L表达趋势相似,即在CHB患者中是表达升高的,且在肝炎发作的患者中升高的趋势更明显。最后我们发现在健康人外周血中总T细胞中OX40+细胞的百分比,CD4+T细胞中的OX40+细胞的百分比,CD14+单核细胞中OX40L+细胞的百分比及血浆中s OX40的水平与年龄呈正相关,具有年龄依赖性。其次关于PD-1和4-1BB在人群中表达的相关研究结果显示在CHB患者中无论是PBMCs中CD4+T细胞还是CD8+T细胞中PD-1 mRNA的水平与健康组相比均是升高的,这与CHB患者肝脏组织中PD-1的表达趋势是一致的。在CHB患者血浆中s PD-1也是升高的,且这种升高的趋势在高病毒载量组和肝炎发作组也比较明显,ETV治疗前后s PD-1水平没有明显变化。另外血浆中s PD-1的水平不仅与HBV的病毒学指标呈正相关还与肝脏炎症指标呈正相关。4-1BB在CHB患者中的表达特点大致与PD-1相似,简单来讲血浆中的s4-1BB的水平在CHB患者中也是异常升高的,且在高病毒载量组和肝炎发作组升高趋势比较明显,ETV治疗前后s4-1BB水平没有明显变化。血浆中s4-1BB水平主要与血清病毒学指标呈正相关。肝组织中4-1BB的表达趋势与血浆中s4-1BB的趋势相似,即与健康对照组相比,CHB患者的肝脏组织中4-1BB的表达水平更高。而在总PBMCs、CD4+T细胞以及CD8+T细胞中4-1BB mRNA的水平在CHB患者中均有升高的趋势但无统计学差异。最后我们观察到在健康人群中无论是PD-1还是4-1BB的表达在不同年龄组均无明显差异。通过对上述免疫检查点的表达特点及临床意义的分析,我们选择将OX40靶点激动剂应用于已经构建成功的rAAV8/1.3HBV小鼠模型中。我们发现小鼠血清中HBs Ag和肝内HBV DNA水平均有所下降,且血清中HBs Ag的水平在第8天达到最低值。同时我们观察到小鼠肝组织内HBs Ag和HBc Ag表达与安慰剂组相比也有减少的趋势。但激活OX40靶点似乎对血清HBV DNA及HBe Ag水平没有影响。在HBV小鼠模型中激活OX40靶点HBV被抑制的同时还伴随着肝脏炎症的产生,表现为血清中ALT和AST不同程度的升高,肝脏组织内炎症细胞的浸润。除此之外,小鼠肝脏内T细胞亚群比例及血清中免疫细胞因子也发生了变化,表现为CD8+T细胞比例的升高及Th1、Th2及Th17相关的细胞因子升高,且相关细胞因子的水平均表现为先升高再下降的趋势,与病毒清除的过程一致。另外我们发现使用OX40激动剂能够引起小鼠脾脏的增大。同时我们还发现在该模型中应用OX40激动剂的效应呈剂量依赖性,主要表现在血清HBs Ag、肝内HBV DNA的下降水平,CD8+T细胞比例升高的水平以及脾脏增大的程度上。在应用OX40激动剂抑制HBV过程相关机制的探索中,我们发现CD4+/CD8+T细胞缺陷和免疫正常的rAAV8/1.3HBV小鼠同时给予OX40激动剂后,在给药第8天和第12天CD4+T和CD8+T细胞缺陷的小鼠血清中HBs Ag水平与免疫正常组HBV小鼠相比均是升高的,其中以CD8+T细胞缺陷的小鼠升高趋势更明显。与免疫正常组的小鼠相比,CD4+T细胞缺陷小鼠肝内HBV DNA水平没有明显变化,而CD8+T细胞缺陷小鼠则有轻度升高趋势。对于小鼠血清ALT水平,免疫正常的和CD4+T细胞缺陷的HBV小鼠给予OX40激动剂后转氨酶均有所升高,而CD8+T细胞缺陷的HBV小鼠则没有明显升高。关于应用OX40激动剂和安慰剂的HBV小鼠肝内淋巴细胞基于mRNA水平的转录组学测序结果显示,经过OX40激动剂处理后小鼠肝内淋巴细胞表达上调的mRNAs有3008个,下调的有2269个,并可聚类成簇。经Go功能富集分析后,我们发现在生物进程方面这些DEmRNAs主要富集到了白细胞的分化,染色质及组蛋白的修饰调节等过程;在细胞成分方面他们主要富集到了核内的染色质、异染色质及中心体等细胞组成成分上;而在分子功能方面他们主要富集在转录、翻译及小分子GTP酶的结合、Ras GPT酶结合等功能上。经KEGG通路富集分析我们发现这些GEmRNAs主要富集在HBV、人类嗜T淋巴细胞白血病病毒（human T-cell leukemia virus,HTLV）、EB病毒感染相关通路、丝裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）、趋化因子及NF-kapa B等信号通路。而经Reactome分析这些GEmRNAs主要富集在中性粒细胞脱颗粒,细胞因子,白细胞介素,转录调控等相关信号通路。研究结论:免疫检查点OX40/OX40L、PD-1及4-1BB在人的样本中的表达特点向我们提示这几个免疫检查点可能均与慢性HBV感染相关。但其中只有OX40的表达与HBV病毒学指标呈负相关,考虑其与病毒清除密切相关,且只有OX40/OX40L表达呈年龄依赖性。因此我们将OX40激动剂首次应用于rAAV8/1.3HBV小鼠模型,发现激活OX40靶点对HBV复制具有抑制作用,是一个具有前景的治疗CHB的免疫检查点,但激活OX40靶点不能完全清除HBV因此未来可能还需要联合其它治疗方式。对于激活OX40靶点抑制HBV复制的机制显示该过程相对依赖CD4+T细胞似乎更依赖于CD8+T细胞,CD4+T细胞的重要性不可否认,但未来对于HBV的免疫治疗我们也许应该将更多的关注点放在CD8+T细胞上。
余青青[2]（2021）在《肠道菌群失调引起的胆汁酸异常抑制HBeAg阳性CHB患者NK细胞的抗HBV作用》文中提出【背景与目的】慢性HBV持续感染导致肝脏损害,可进展为肝硬化、肝衰竭甚至是肝癌。有报道显示,在肝细胞系中胆汁酸可促进HBV基因的转录和表达;在动物实验中胆汁酸促进HBV的生物合成,这些体内外实验证据提示胆汁酸可影响慢性HBV感染者体内HBV的复制,已知胆汁酸的代谢是通过肠肝循环实现的,肠道菌群与胆汁酸代谢密切相关,但慢性乙型肝炎（CHB）患者肠肝循环的变化尚不清楚。此外,研究表明CHB患者NK细胞的激活及其IFN-γ的分泌受到强烈抑制,但机制未明。为此,本研究旨在探讨肠道菌群与胆汁酸之间的联系以及胆汁酸对慢性HBV感染者的NK细胞的免疫调控机制,为改善患者的疾病转归及其预后提供新的思路。【方法】1.采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）技术定量检测20例健康对照者、20例慢性HBV携带状态和30例HBeAg阳性CHB患者的血清胆汁酸组分,揭示CHB患者的胆汁酸谱特征。2.利用二代测序对另外收集的15例健康对照者、15例慢性HBV携带状态、15例HBeAg阳性CHB患者的粪便标本进行16S V34 Miseq PE300测序分析,揭示CHB患者的肠道菌群分布特点。3.采用流式细胞术（FCM）检测30例血清总胆汁酸（TBA）水平正常、20例血清TBA水平升高的HBeAg阳性慢性HBV感染者NK细胞的百分比、绝对值、表面活化受体NKG2D、CD244以及NK细胞分泌的细胞因子/细胞毒性颗粒的水平;采用FCM技术检测鹅去氧胆酸（CDCA）刺激外周血单个核细胞（PBMC）后NK细胞的百分比及分泌细胞因子/细胞毒性颗粒的水平,以证实CDCA在体外对NK细胞免疫效应功能的影响;采用Transwell实验将HepG2.2.15细胞和胆汁酸刺激后的NK细胞进行共培养,检测HepG2.2.15中HBsAg、HBeAg、HBV DNA的表达水平,以评估胆汁酸对HepG2.2.15细胞中HBV复制的影响;采用FCM技术检测CDCA刺激24 h后NK细胞的凋亡情况;采用FCM技术检测CDCA灌胃C57BL/6小鼠（携带rAAV8-1.3HBV）2周后外周血NK细胞的百分比及其分泌细胞因子/细胞毒性颗粒的水平,以评估CDCA在体内对NK细胞免疫效应功能的影响。【结果】1.肠道菌群失调引起HBeAg阳性CHB患者胆汁酸水平异常肠道菌群中产生7-α脱羟基酶的梭菌属菌群丰度显着降低引起胆汁酸初级和次级胆汁酸的改变。肝脏合成的初级胆汁酸在7-α脱羟基酶的作用下分解为次级胆汁酸。我们的胆汁酸谱分析结果显示HBeAg阳性CHB患者初级胆汁酸水平显着升高,次级胆汁酸虽胆汁酸绝对浓度有所升高,但百分比显着下降,初级胆汁酸/次级胆汁酸的比值也显着升高。2.CDCA抑制NK细胞的抗HBV作用总胆汁酸水平升高的HBeAg阳性慢性HBV感染者,其NK细胞的百分比、表面活化受体NKG2D、CD244以及NK细胞分泌的细胞因子/细胞毒性颗粒的水平显着降低;在体外实验中证实CDCA可损伤NK细胞分泌细胞因子/细胞毒性颗粒的免疫效应功能,促进HepG2.2.15细胞中HBV的复制,在体内实验中证实CDCA可减少小鼠NK细胞的百分比并损伤NK细胞分泌细胞因子/细胞毒性颗粒的免疫效应功能,从而促进HBV的复制。【结论】梭菌属菌群丰度显着降低导致HBeAg阳性CHB患者初级胆汁酸水平升高;在体内外实验中证实,CDCA通过损伤NK细胞的免疫效应功能进而促进HBV的复制。本研究提示调节肠道菌群和胆汁酸有望成为CHB治疗的新靶点。
赵岩[3]（2021）在《慢性乙肝病毒感染患者血浆IL-21和IL-33水平与病毒载量相关性研究》文中进行了进一步梳理背景慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）是全球关注的公共卫生问题,其致病病原体为乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）。机体感染HBV后,可被宿主免疫系统清除,仅表现为急性感染;若HBV经复杂的机制逃避免疫清除,持续阳性超过半年,则造成机体慢性HBV感染。据报道目前全球慢性HBV感染者数量达2.57亿。全球每年死因指向HBV感染或其并发症的患者数量将近90万。如此庞大的感染人群及因病死亡人数足以证明慢性乙型肝炎对人类健康及患者生活质量造成了极大的困扰。我国计划免疫项目包括乙型肝炎病毒疫苗注射,使疾病的发生率在我国得到了有效控制。但因目前世界范围内HBV携带者数量仍十分庞大,我们不能忽略对该病的关注。在慢性感染患者中,持续的HBV感染可导致宿主免疫功能失调,导致CHB患者常伴有CD4+T和CD8+T细胞耗竭。同时,宿主免疫功能的差异也直接影响HBV感染后疾病进展。HBV感染肝细胞后并不直接杀伤肝细胞,但其与抗原提呈细胞等免疫因素相互作用后可激活人体免疫系统,免疫系统的炎性反馈致使炎症反应在肝内发生。又因慢性感染的迁延性,肝脏长期处于非正常生理环境下。因为免疫反应是病毒感染人体后主要的致病机制,因此,免疫学在乙型肝炎研究领域中一直扮演重要角色,研究HBV感染后机体免疫反应的发生发展,也成为人们全面了解乙型肝炎的重要前提。白介素（IL）是人体免疫功能正常行使功能的重要参与因素,其在病程发展中扮演的角色及是长期以来的研究热点。IL-21和IL-33都是免疫细胞所分泌的细胞因子,目前已知它们参与了诸多疾病的发展,如病毒性肝炎等感染性疾病及自身免疫病等。针对IL-21及IL-33在乙肝发病过程中的生理功能,有学者进行了动物模型研究。研究发现在小鼠乙肝模型中IL-21和IL-33的缺失是HBV在小鼠体内的持续存在的必要条件,且向小鼠体内注射IL-21和IL-33表达质粒有助于相关病毒蛋白的清除。结合前人进行的研究,我们推测,IL-21和IL-33在HBV感染后机体免疫反应发生过程中可能发挥了重要作用,其在体内浓度水平随病情发展可能有明显改变,且可能与乙肝相关检查结果如肝功能生物化学检查、乙肝病毒血清学标志物、HBV DNA病毒载量检查在数值上存在相关关系。目的本研究通过比较CHB患者与健康对照者血浆IL-21、IL-33水平差异情况,分析IL-21、IL-33与HBsAg、HBeAg、HBcAb、HBV DNA、及ALT等指标之间的相关性,初步探讨IL-21和IL-33在CHB发展中的作用。方法收集2019年11月10日至2020年11月31日泰州市人民医院感染科59例CHB患者及29例健康体检者外周血。收集患者一般临床资料,包括肝功能（ALT、AST、ALP、GGT）、乙肝病毒血清学标志物（HBsAg、HBeAg、HBcAb）和HBV DNA。将CHB患者分为HBV DNA阳性组（+）、HBV DNA阴性组（-）及健康对照组,比较各组间肝功能、乙肝病毒血清学、HBV DNA指标水平差异情况。采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）检测血浆IL-21、IL-33的水平,比较各组间IL-21、IL-33水平差异情况;另外,分析IL-21、IL-33与肝功能（ALT、AST、ALP、GGT）、乙肝病毒血清学标志物（HBsAg、HBeAg、HBcAb）及HBV DNA指标水平的相关性。结果（1）本研究纳入HBV DNA（+）的CHB患者29例、HBV DNA（-）的CHB患者30例、同期健康体检者29例,三组间年龄、性别构成比均无显着性差异（P>0.05）。HBV DNA（+）组患者ALT、AST水平较HBV DNA（-）组CHB患者及健康对照者（HC）均显着升高,差异有统计学意义（P<0.05）;三组间ALP、GGT水平无显着性差异（P>0.05）。与HBV DNA（-）组相比,HBV DNA（+）组CHB患者HBc Ab水平显着升高,差异有统计学意义（P<0.05）;三组间HBsAg、HBeAg水平无显着性差异（P>0.05）。（2）与健康对照（HC）组相比,HBV DNA（+）组、HBV DNA（-）组患者IL-21、IL-33水平均显着升高,差异有统计学意义（P<0.05）;与HBV DNA（-）组相比,HBV DNA（+）组患者IL-21水平显着升高,差异有统计学意义（P<0.05）;而,HBV DNA（+）组患者血浆IL-33水平与HBV DNA（-）组患者相比无显着性改变,差异无统计学意义（P>0.05）。HBV DNA（+）组患者血浆IL-21水平与HBV DNA水平之间具有显着正相关关系（r=0.475,P<0.01）;而IL-21、IL-33水平与肝功能指标（ALT、AST、ALP、GGT）、乙肝病毒血清学标志（HBsAg、HBeAg、HBcAb）水平间均无显着相关性（P>0.05）;且其血浆IL-33水平各指标间均无显着相关性（P>0.05）。HBV DNA（-）组及所有CHB患者血浆IL-21水平与肝功能指标（ALT、AST、ALP、GGT）、免疫学指标（HBs Ag、HBe Ag、HBc Ab）水平间均无显着相关性（P>0.05）;而血浆IL-33水平与HBc Ab水平之间存在显着正相关关系（r=0.408,P<0.05;r=0.041,P<0.05）,但其与肝功能指标（ALT、AST、ALP、GGT）、乙肝病毒血清学标志（HBsAg、HBeAg）水平之间无显着相关性（P>0.05）。结论CHB患者AST、ALT、IL-21、IL-33水平较健康对照组显着升高,HBcAb HBV DNA（+）组CHB患者HBcAb、IL-21水平较HBcAb HBV DNA（-）组显着升高,IL-21与HBV DNA、IL-33与HBc Ab水平之间呈正相关,提示IL-21、IL-33介导的炎症可能参与了HBV感染后机体的免疫应答,继而促进了CHB病程的进展。
王耀光,万颖颖[4]（2021）在《乙型肝炎病毒相关性肾炎中西医结合研究述评》文中提出乙型肝炎病毒相关性肾炎是感染乙型肝炎病毒后引起免疫复合物沉积在肾脏导致的疾病,是中国常见的继发性肾小球疾病之一,多见于儿童,预后较好。部分发展至晚期会引起肾间质纤维化。由于目前尚未创建可靠的动物模型、传染性大,导致对于乙型肝炎病毒相关性肾炎的研究存在一定困难。分子生物学主要从细胞转染来研究,研究认为乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）与肾小管上皮细胞的凋亡有关。目前研究瓶颈在于缺乏实验研究,临床无统一治疗方案,缺乏大范围、多中心研究。预防乙型肝炎病毒感染最有效的方法是接种乙型肝炎疫苗。目前中西医结合治疗乙型肝炎病毒相关性肾炎取得了一定临床效果,中医从辨证论治、分期论治、中医专方专药等方面治疗乙型肝炎病毒相关性肾炎及防治肾纤维化取得了一定的临床疗效,西医治疗兼顾乙型肝炎及肾小球肾炎两方面。文章将从研究瓶颈、实验研究进展、研究方向、展望等4个部分来论述乙型肝炎病毒相关性肾炎,以期为临床研究乙型肝炎病毒相关性肾炎提供参考。
成茂源[5]（2020）在《基于“主客交”学说研究加减三甲散对肝纤维化大鼠WNT/β-catenin通路和lncRNA及mRNA表达谱的影响》文中研究指明目的:观察加减三甲散干预模型大鼠肝纤维化的效果以及对WNT/β-catenin通路的影响,并从lnc RNA和m RNA角度揭示其作用机制,丰富“主客交”学说的现代生物学内涵。方法:1.实验一:SPF级SD雄性大鼠40只,随机分成空白对照组、模型组、1号方组（加减三甲散1号方组）、2号方组（加减三甲散2号方组）、阳性对照组（秋水仙碱组）。常规喂养7d,模型组、1号方组、2号方组、阳性对照组采用皮下注射四氯化碳油剂的方法制造肝纤维化大鼠模型。造模同时各组均灌胃干预,空白对照组、模型组予以超纯水灌胃,1号方组予以加减三甲散全方灌胃,2号方组以去穿山甲的加减三甲散2号方灌胃,阳性对照组予以秋水仙碱液灌胃。56d后麻醉大鼠,取心尖血和肝脏组织。HE染色观察病理形态,检测血清ALT、AST。Western blot法检测空白对照组、模型组、1号方组、阳性对照组WNT2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量。2.实验二:SPF级SD雄性大鼠40只,随机分成空白对照组、模型组、加减三甲散组、阳性对照组（秋水仙碱组）。常规喂养7d,模型组、加减三甲散组、阳性对照组采用皮下注射四氯化碳油的方式剂制造肝纤维化大鼠模型。造模同时各组均灌胃干预,空白对照组、模型组予以超纯水灌胃,加减三甲散组予以加减三甲散全方灌胃,阳性对照组予以秋水仙碱液灌胃。56d后麻醉大鼠,取心尖血和肝脏组织。HE和MASSON染色观察病理形态,ELISA法检测血清HA、LN、PCⅢ、CIV浓度。高通量二代测序法检测空白对照组、模型组、加减三甲散组大鼠肝组织lnc RNA和m RNA表达谱。结果:1.病理切片:HE染色光镜下观察,实验一中,与空白对照组比较,模型组大鼠、1号方组、2号方组、阳性对照组大鼠肝脏组织纤维化程度明显增大（P﹤0.01）;与模型组比较,1号方组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度减轻,差异显着（P﹤0.01）,2号方组无明显差异（P﹥0.05）;与1号方组比较,2号方组大鼠肝纤维化程度明显加重（P﹤0.01）。实验二中,与空白对照组相比,模型组、加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝脏组织纤维化程度明显增大（P﹤0.01）;与模型组相比,加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度减轻,差异显着（P﹤0.01）;加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度无明显差异,无统计学意义。MASSON染色光镜下观察,实验二中,与空白对照组比较,模型组大鼠肝纤维化程度明显增大（P﹤0.01）,加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝纤维化程度增大（P﹤0.05）;与模型组比较,加减三甲散组、阳性对照组大鼠肝脏组织肝纤维化程度明显减轻（P﹤0.01）;与加减三甲散组比较,阳性对照组大鼠肝脏组织肝纤维化程度相当,无统计学意义（P﹥0.05）。2.肝功能指标:实验一中,与空白对照组相比,模型组、1号方组、2号方组大鼠血清中ALT、AST水平显着升高（P﹤0.01）,阳性对照组大鼠ALT、AST水平相当,无统计学意义（P﹥0.05）;与模型组相比,1号方组、2号方组、阳性对照组大鼠ALT水平显着降低（P﹤0.01）;与模型组相比,1号方组、2号方组大鼠AST水平降低（P﹤0.05）,阳性对照组大鼠AST水平显着降低（P﹤0.01）;与1号方组相比,阳性对照组大鼠血清中AST水平显着降低（P﹤0.01）。3.信号通路指标:实验一中,与空白对照组比较,模型组大鼠肝脏组织WNT2、β-catenin蛋白表达量降低（P﹤0.05）,GSK-3β蛋白表达量显着降低（P﹤0.01）;与模型组比较,1号方组、阳性对照组大鼠肝脏组织WNT2、β-catenin、GSK-3β蛋白含量无明显变化,无统计学意义（P﹥0.05）。4.肝纤维化指标:实验二中,与空白对照组相比,模型组大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ浓度均显着增大（P﹤0.01）。与模型组相比,加减三甲散组大鼠血清中HA浓度增大,差异明显（P﹤0.05）。与模型组相比,加减三甲散组大鼠血清中LN、PCⅢ、CⅣ浓度减小（P﹤0.05）。加减三甲散组与阳性对照组大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ浓度比较,无统计学意义（P﹥0.05）。5.测序结果:实验二中,预测出新的lncRNA1976条。空白对照组与模型组差异Inc RNA基因共340个（187个上调,153个下调）。空白对照组与加减三甲散组差异Inc RNA基因251个（上调139个,下调112个）。模型组与加减三甲散组差异Inc RNA基因93个（上调48个,45下调）。差异lnc RNA靶基因共同功能主要为:自然杀伤细胞介导免疫,自然杀伤细胞介导的细胞毒性调控等。空白对照组与模型组差异m RNA基因1635个（上调1451个,下调184个）,模型组与加减三甲散组得到差异m RNA基因80个（上调39个,下调41个）,空白对照组与加减三甲散组得到差异m RNA基因80个（上调39个,下调41个）。空白对照组、加减三甲散组和模型组m RNA差异基因共同途径为:PPAR信号通路。结论:1.采用四氯化碳诱导法可成功复制大鼠肝纤维化模型。2.加减三甲散1号方减轻模型大鼠肝纤维化程度的效果好于去除穿山甲的加减三甲散2号方。3.加减三甲散（加减三甲散1号方）改善模型大鼠肝纤维化程度不经过WNT/β-catenin通路作用。4.加减三甲散改变肝纤维化模型大鼠lnc RNA和m RNA的表达谱,这可能是加减三甲散改善模型大鼠肝纤维化程度的部分作用机制。
张瑞[6]（2020）在《忧遁草治疗乙型肝炎的药效学评价及作用机制初探》文中进行了进一步梳理目的:以网络药理学知识为基础,以乙型肝炎模型鼠活体药效学评价为依托,以肠道微生物菌群与肝脏代谢组学的相关分析为手段,探寻忧遁草治疗乙型肝炎的活性成分与作用效果,阐明忧遁草治疗乙型肝炎的药物效果及作用机制。方法:（1）基于传统中草药数据库全面挖掘忧遁草活性成分,利用虚拟对接平台预测筛选各组分靶蛋白,通过化合物-蛋白-疾病互作网络确定忧遁草治疗乙型肝炎的活性成分与重要靶点,GO分析及KEGG富集分析忧遁草治疗乙型肝炎的分子机制;（2）采用尾静脉高压水注法构建乙型肝炎动物模型,灌胃忧遁草水提物（groupYDC）,以灌胃生理盐水组为阴性对照（groupMod）,以灌胃恩替卡韦溶液为阳性对照（groupETC）,以未建模组为健康对照（groupNor）,灌胃10d,ELISA检测血清HBs Ag、IL-1β、TNF-α水平,SYBR-q RT-PCR检测肝组织HBV-ccc DNA含量,HE染色观察小鼠肝脏病理切片的炎性改变;（3）采用Illumina-Mi Seq平台检测肠道菌群;（4）LC-MS/MS法检测肝组织代谢产物;（5）使用R程序进行16S与非靶代谢的多组学联合分析。结果:（1）网络药理学筛选出叶绿醇、异牡荆素及β-谷甾醇为忧遁草关键类药化合物,CAS3、CAS9、PIK3CA、AKT1、TNF为关键靶基因,NF-κB转录因子信号通路、蛋白激酶B（AKT）信号通路、外源性凋亡信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路为重要调控途径;（2）药效学分析发现,与模型组相比,忧遁草水提物可显着降低小鼠血清HBs Ag、IL-1β、TNF-α（P<0.05）和肝组织中HBV ccc DNA的表达量（P<0.05）,并改善肝组织毛玻璃样变及炎性水平;（3）16Sr DNA结果显示,忧遁草水提物治疗恢复HBV模型小鼠肠道微生物平衡,显着降低厚壁菌门和拟杆菌门的比率（P<0.05）,显着降低肠道乳杆菌科和乳杆菌属细菌的比例（P<0.05）,显着增加理研菌科和另枝菌属细菌的丰度（P<0.05）和梭菌目、毛螺旋菌科、瘤胃菌科微生物的丰富度（P<0.05）;（4）LC-MS分析结果显示,忧遁草水提物显着上调肝脏马尿酸、L-组氨酸、谷胱甘肽、二十碳五烯酸、海藻糖、D-苏氨酸、水苏糖的代谢水平（P<0.05）;显着下调尿苷5’-二磷酸、胆酸、氧化三甲胺、CDP乙醇胺,磷酰胆碱的代谢水平（P<0.05）。（5）肠道菌群-代谢组学联合分析发现忧遁草通过对另枝菌属的调节从而影响与其显着相关的代谢物马尿酸、胆酸水平（P<0.05）。结论:忧遁草是经网络药理学分析出的可靠的乙型肝炎治疗药物;忧遁草具有显着改善小鼠模型乙型肝炎进展的药物效果;忧遁草具有重塑小鼠肠道菌群平衡,调节肝脏代谢物水平发挥广泛治疗乙型肝炎的作用;忧遁草具有调节另枝菌属进而调控生物靶标马尿酸、胆酸,发挥特异性治疗乙型肝炎的效果。
袁正宏课题组,岳蕾,唐怡洁,丁家惠,徐通,李畅,徐明珠,叶建宇,李雨檬,胡孔颖,王洋,宰文静,刘江霞,张小楠,陈捷亮,袁正宏[7]（2020）在《实现慢性乙型肝炎治愈的战略计划及路径研究（美国国立卫生研究院2019年11月）》文中进行了进一步梳理尽管高效的乙型肝炎预防性疫苗已经普及了30多年,但HBV感染仍在继续蔓延。每年约有90万人死于暴发性肝炎（急性肝功能衰竭）和慢性HBV感染导致的肝硬化（肝脏瘢痕形成）、肝功能衰竭和肝细胞癌（HCC）等。HCC作为一种主要由HBV慢性感染所导致的癌症,其发病率在世界范围内也在逐步上升。目前,每年死于病毒性肝炎的人数高于死于艾滋病毒感染、结核病或疟疾的人数,这表明我们迫切需要更好的方法来治疗及治愈些HBV感染者。在感染率较高的地区,例如东亚和非洲,超过6%的成年人受到过感染。其最常见的感染方式是通过母婴垂直传播,或者在幼年期间暴露于感染者的血液或者其他体液。性接触、共用针头,或者其他会导致暴露于
席婷[8]（2019）在《慢性乙型肝炎肝胆湿热与无证可辨型差异表达蛋白研究》文中研究说明目的基于课题组前期应用蛋白芯片技术和iTRAQ结合LC-MS/MS技术研究慢性乙型肝炎不同中医证型的差异表达蛋白质,本研究采用ELISA方法检测慢性乙型肝炎肝胆湿热证相关蛋白1-309、MCP-1、SDF-1、FAP、M-CSF、IGF-1、VCAM-1、ApoM在该证型及无证可辨型的表达水平,以期获得与慢性乙型肝炎肝胆湿热证相关的蛋白质物质基础。方法纳入慢性乙型肝炎肝胆湿热型样本30例、慢性乙型肝炎无证可辨型样本15例,健康对照样本15例。取各组样本外周静脉全血,采用ELISA方法检测目标蛋白质在各组的表达水平。利用STRING数据库对差异蛋白进行GO富集分析和KEGG信号通路富集分析。本研究中所有资料均采用SPSS 22软件进行统计学分析,绘制ROC曲线时采用MedCalc 19.0.3软件。结果1.与健康对照组比较,慢性乙型肝炎肝胆湿热组、无证可辨组I-309、MCP-1、SDF-1、FAP、M-CSF、IGF-1、VCAM-1蛋白表达均上调,差异有统计学意义（P<0.05）;ApoM蛋白表达均下调,差异有统计学意义（P<0.05）。2.与慢性乙型肝炎无证可辨组比较,慢性乙型肝炎肝胆湿热组TBIL水平升高,差异无统计学意义（P>0.05）;ALT、AST、HBV DNA水平下降,差异无统计学意义（P>0.05）;1-309、MCP-1、SDF-1、FAP、M-CSF、IGF-1、VCAM-1蛋白表达下调,差异有统计学意义（P<0.05）;ApoM蛋白表达上调,差异无统计学意义（P>0.05）。3.1-309、MCP-1、SDF-1、FAP、M-CSF、IGF-1、VCAM-1 蛋白的 GO 富集分析以及KEGG信号通路富集分析显示,在生物过程中主要参与免疫系统过程中的正向调节,白细胞趋化、T细胞活化的正向调节,细胞黏附、迁移、增殖的正向调节,对刺激的应答、炎症反应、信号受体活性的调节等;在分子功能中,主要参与信号受体结合,整合素结合,受体配体活性,细胞因子活性,趋化因子活性等;在细胞位置中,主要位于细胞外间隙、细胞外区等;主要富集在细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路、类风湿性关节炎信号通路、TNF信号通路、趋化因子信号通路等。4.R OC 曲线分析显示,I-309、MCP-1、SDF-1、FAP、M-CSF、IGF-1、VCAM-1蛋白组合鉴别诊断慢性乙型肝炎肝胆湿热型与慢性乙型肝炎无证可辨型的灵敏度、特异度、曲线下面积分别为96.67%、93.33%、0.960。结论1.1-309、MCP-1、SDF-1、FAP、M-CSF、IGF-1、VCAM-1、ApoM 蛋白表达水平变化与慢性乙型肝炎有关。2.1-309、MCP-1、SDF-1、FAP、M-CSF、IGF-1、VCAM-1 蛋白表达水平变化与慢性乙型肝炎肝胆湿热证证候特征有关,差异表达蛋白功能主要涉及对T淋巴细胞、单核细胞的调节作用,为开展证候发生的生物学调控机制研究提供了方向。
陈雪梅[9]（2019）在《顺铂通过激活ROS/JNK和抑制Akt/mTOR通路诱导乙型肝炎病毒再激活的分子机制研究》文中指出目的:乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个严重的全球性公共卫生问题。据世界卫生组织报道,全世界约有3.5亿人患有慢性HBV感染,慢性HBV感染是肝细胞癌（HCC）发生的主要原因。一般情况下,慢性HBV感染者和无症状HBV携带者极少发生HBV再激活现象,但患者若接受化疗或免疫抑制治疗肿瘤时,则很可能使肝细胞内静息状态或是低复制状态的HBV大量活化,HBV病毒的大量复制引起肝功能损伤,甚至导致急性肝炎、急性重症肝炎、急性肝衰竭等严重的临床问题。临床上大量数据表明,在化疗药物的使用过程中出现HBV再激活现象,但是化疗药物诱导HBV再激活的具体分子机制至今仍不清楚,因此需要进一步研究。细胞自噬（autophagy）是通过依赖溶酶体去除受损细胞器和长寿命蛋白质一种分解代谢过程,以维持细胞稳态。自噬在许多生理和病理生理过程中起着至关重要的作用。自噬在病毒复制的过程中发挥着“双刃剑”的作用,一方面,自噬可以响应细胞压力,如营养物质剥夺,未折叠的蛋白质反应（UPR）,危险相关分子模式（DAMP）,缺氧,氧化还原应激和线粒体损伤。病毒可以在复制周期的不同阶段触发许多这些刺激诱导自噬,自噬可能作为抗病毒途径发挥作用。另一方面,自噬在病毒复制生命周期中发挥的有益作用,病毒可以逃避抗病毒先天免疫,从而增强其复制。研究表明,病毒感染可能与自噬过程有着复杂的相互联系,主要有以下三个主要结果:（1）自噬被用作促进病毒复制的支架;（2）病毒破坏或抑制自噬过程以促进病毒复制;（3）自噬抑制病毒复制。顺铂是一种有效的化疗药物,常用于治疗各种类型的癌症,包括淋巴瘤,肉瘤,卵巢癌,宫颈癌,小细胞肺癌和膀胱癌等。已有临床报道HBV再激活是使用顺铂等化疗药物严重的并发症之一。病毒复制后宿主免疫功能受损被认为是导致化疗相关HBV再激活的首要因素,但是研究报道HBV再激活发生在化疗早期,表明除了扰乱免疫和病毒复制之间的平衡机制,化疗药物可能直接刺激HBV再激活。因此,化疗药物或免疫抑制剂相关的HBV再激活的潜在的机制需要进一步研究,将为HBV再激活的预防和治疗提供新思路和理论依据。课题组前期实验中,已经在HBV稳定表达的细胞模型和HBV转基因小鼠模型中证实了顺铂可以促进HBV复制和HBV病毒蛋白的合成,因此本实验主要研究顺铂诱导HBV再激活的具体分子机制。实验方法:1、在HepAD38和HepG2-HBV1.3细胞中,采用ELISA、RealTime PCR、Southern blot、Western blot方法检测顺铂作用后HBV病毒复制水平。2、在HepAD38和HepG2-HBV1.3细胞中,采用Western blot、激光共聚焦的方法检测自噬蛋白和HBV病毒蛋白的表达水平,进一步联合使用自噬抑制剂氯喹（Chloroquine diphosphate salt,CQ）、3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）和siATG5阻断自噬后检测HBV复制水平,分析顺铂、自噬和HBV复制的关系。3、采用激光共聚焦显微镜检测顺铂处理细胞后细胞内ROS水平,进一步顺铂联合氧化应激抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）,采用ELISA、Real-Time PCR、Southern blot、Western blot等实验,检测自噬水平和HBV病毒复制水平。4、运用Western blot实验及查阅文献,筛选了MAPKs通路相关的信号分子,联合使用shJNK、NAC、SC79和MK2206探索顺铂促进HBV复制的具体分子机制。5、HBV转基因小鼠模型实验验证顺铂促进HBV复制。腹腔注射氯喹或者饮水喂N-乙酰半胱氨酸处理小鼠两天,再联合顺铂连续注射五天,48小时后收集血清和肝组织采用ELISA、Real-Time PCR、激光共聚焦显微镜、Western blot、Southern blot以及IHC等实验方法检测。结果:1、顺铂处理HepAD38和HepG2-HBV1.3细胞后,实验结果显示,与对照组相比,Cisplatin组细胞上清中HBsAg和HBeAg水平、3.5kb mRNA水平、HBV DNA水平、HBV复制中间体以及细胞内HBsAg和HBcAg蛋白含量均明显升高。说明顺铂在体外促进HBV复制。2、采用Western blot和激光共聚焦检测顺铂作用后自噬水平变化,Western blot结果显示:与对照组相比,顺铂作用后LC3I/II蛋白水平呈浓度依赖方式增加,p62呈时间依赖方式降低;激光共聚焦实验显示:与对照组相比,RFP-LC3 puncta和GFP-LC3 puncta均明显增加,但是RFP-LC3 puncta较GFP-LC3 puncta增加更加明显。说明顺铂在体外可以促进完整自噬。采用顺铂进一步联合使用自噬抑制剂CQ、3-MA和siATG5抑制自噬后,Western blot结果显示:自噬水平降低和HBV复制水平均降低。3、顺铂处理HepAD38和HepG2-HBV1.3细胞后,采用激光共聚焦显微镜检测ROS水平,结果显示顺铂明显增强了细胞内ROS水平。进一步采用氧化应激抑制剂NAC,Western blot结果显示:与Cisplatin组相比,Cisplatin+NAC组发现LC3、HBsAg和HBcAg蛋白水平降低;ELISA结果显示,与Cisplatin组相比,Cisplatin+NAC组细胞上清中HBsAg和HBeAg水平降低;Real-Time PCR结果显示:与Cisplatin组相比,Cisplatin+NAC组3.5kb mRNA和HBV DNA水平降低;Southern blot结果显示:与Cisplatin组相比,Cisplatin+NAC组HBV复制中间体水平降低。以上结果说明顺铂通过ROS诱导自噬,抑制ROS会降低顺铂诱导HBV再激活的作用。4、采用Western blot方法筛选了MAPKs通路相关的信号分子,结果显示:Cisplatin作用后,p-JNK表达增加,p-mTOR和p-AKT表达降低,p-p38无明显变化。采用NAC与Cisplatin联合处理,与Cisplatin组相比,p-JNK蛋白水平表达降低,p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR无明显变化。进一步使用shJNK或SC79（AKT诱导剂）与Cisplatin联合处理均可部分逆转Cisplatin诱导的自噬和HBV复制水平,而ROS水平无变化;使用MK2206（AKT抑制剂）与Cisplatin联合处理可促进Cisplatin诱导的自噬蛋白和HBV病毒蛋白,而ROS水平无变化。以上结果说明说明顺铂通过ROS上调JNK和抑制AKT/mTOR信号激活自噬并诱导HBV再激活。5、在HBV转基因小鼠模型中,顺铂促进HBV复制、HBV病毒蛋白合成和诱导炎症,同时顺铂促进ROS水平、MDA水平和自噬水平增加。用ROS抑制剂NAC或自噬抑制剂CQ预处理可以逆转顺铂诱导自噬增强HBV复制,而CQ不影响顺铂诱导的ROS水平增加。结论:在本课题中,我们在HBV复制细胞模型和HBV小鼠模型中证实顺铂促进HBV再激活,从分子水平解析了顺铂通过ROS上调JNK/p-38、抑制AKT/mTOR信号诱导自噬促进HBV复制,为探索HBV再激活的分子机制提供了新的思路。
汪静雯[10]（2019）在《乙型肝炎病毒通过miR-192-3p-XIAP轴调控NF-κB信号通路诱导自噬以促进病毒自身复制》文中提出乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）慢性感染是肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）发生和发展的主要诱导因素之一。虽然乙肝疫苗的普及大大减少了新感染的数量,而核苷类似物和干扰素等抗病毒药物的治疗也极大地降低了感染患者的死亡率。但由于现有的药物不能完全清除HBV感染过程中产生的共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）,导致目前全世界仍有超过3.5亿慢性乙肝病毒感染者,每年约88.7万人死于HBV引起的肝硬化、肝癌及其并发症。故为探索乙型肝炎和肝癌的新的治疗靶点和开发新的治疗药物提供理论依据,需要进一步研究HBV的持续性复制和致病机制。越来越多的证据表明微小RNA（microRNAs,miRNAs）参与HBV复制和HBV相关肝癌的发生。miRNA是一类短的、内源性的非编码RNA,可通过与靶基因mRNA的3’-非翻译区（3’-Untranslated regions,3’-UTR）上的种子序列互补配对结合,调控靶基因的转录后水平。有研究表明,HBV可上调或下调胞内多种miRNAs的表达,而多种miRNAs在HBV感染过程中也发挥了重要的作用,如miRNA可通过影响病毒复制等过程来清除宿主细胞中的病毒感染。自噬是被真核细胞用来降解和回收未折叠或错误折叠的蛋白、受损的细胞器,以及入侵的病原体等,以维持细胞内环境稳态的一种分解代谢过程。HBV感染可诱导宿主细胞的自噬,其中HBV的S和X蛋白是其诱导自噬的关键调控因子,而自噬反应对细胞中HBV的复制也至关重要。已有许多自噬相关基因,如Atg5、Beclin-1和LC3等被证明是miRNAs的靶基因,能够被miRNAs所调控。近年来,miRNA所介导的自噬反应在病毒学研究领域中得到广泛关注。然而,miRNA如何调控HBV诱导的自噬与HBV复制,仍然知之甚少。前期工作中,我们从文献报道的正常和HBV感染病人样本的miRNA表达谱中挑选了差异表达的11个miRNA,即miR-340-5p、miR-192-3p等进行验证,根据我们的实验结果及在已有的相关文献研究的基础上,确定miR-192-3p作为我们的研究对象。在本研究中,我们发现miR-192-3p表达水平随HBV患者血清中HBV DNA水平的升高逐渐降低。随后,分子机制研究结果显示:HBV感染是通过HBx蛋白与c-Myc相互作用抑制miR-192-3p的表达。为了探索HBV抑制miR-192-3p的功能,我们鉴定出了miR-192-3p的一个新的靶基因,X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP）,同时证明miR-192-3p是一个自噬抑制因子,其在体外和小鼠模型中受到HBV感染的抑制,导致细胞自噬。重要的是,我们发现HBV通过miR-192-3p-XIAP轴促进自噬,这一过程在体内和体外对HBV复制是重要的。我们紧接着证明miR-192-3p通过核因子κB信号通路抑制自噬,从而减少HBV复制。最后我们揭示HBV通过miR-192-3p靶向XIAP来激活核因子κB（Nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号通路,上调Beclin-1的表达,促进自噬,增加HBV复制。综上所述,我们的研究发现了HBV通过HBx调控miR-192-3p-XIAP-NF-κB轴诱导自噬而促进HBV复制这一信号通路,该信号通路的关键点将可能成为未来HBV相关疾病药物研制的新靶点。此外,我们的研究结果也表明miR-192-3p是一种新的HBV感染调节因子,暗示它可能在肝癌的发生发展中发挥重要的作用,它将可能作为HBV患者的新的生物标志物或治疗靶标。
二、乙型肝炎病毒动物模型的研究浅析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乙型肝炎病毒动物模型的研究浅析（论文提纲范文）
（1）激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 慢性HBV感染的自然史 |
| 1.2 慢性HBV感染的免疫应答 |
| 1.2.1 慢性HBV感染中固有免疫反应 |
| 1.2.2 慢性HBV感染中适应性免疫反应 |
| 1.3 慢性乙型肝炎免疫治疗进展 |
| 1.3.1 靶向固有免疫的治疗策略 |
| 1.3.2 靶向适应性免疫的治疗策略 |
| 1.3.3 其它免疫治疗策略 |
| 1.4 免疫检查点OX40/OX40L、PD-1、4-1BB研究现状 |
| 1.4.1 OX40/OX40L相关研究进展 |
| 1.4.2 PD-1 相关研究进展 |
| 1.4.3 4-1BB相关研究进展 |
| 第2章 OX40/OX40L及其可溶性分子在慢性乙肝患者中的表达及临床意义 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 人的样本来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血采集及血浆分离与保存 |
| 2.2.2 外周血单个核细胞提取 |
| 2.2.3 流式细胞术检测PBMCs中OX40/OX40L的表达 |
| 2.2.4 免疫组化检测肝组织内OX40/OX40L的表达 |
| 2.2.5 酶联免疫吸附试验检测血浆中sOX40/OX40L水平 |
| 2.2.6 统计处理方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 研究对象人口学资料及临床特征 |
| 2.3.2 慢性乙肝患者中OX40/OX40L及其可溶性分子的表达 |
| 2.3.3 慢性乙肝患者中OX40/OX40L及其可溶性分子的水平与临床的相关性研究 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 PD-1、4-1BB分子及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达及临床意义 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 人的样本来源 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 复苏外周血单个核细胞和准备血浆 |
| 3.2.2 磁珠分选人外周血T细胞亚群 |
| 3.2.3 PBMCs中总RNA的提取 |
| 3.2.4 qRT-PCR检测PBMCs中PD-1和4-1BB mRNA水平 |
| 3.2.5 酶联免疫吸附试验检测血浆sPD-1和s4-1BB |
| 3.2.6 免疫组化检测肝脏内PD-1和4-1BB的表达 |
| 3.2.7 统计处理方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 研究对象人口学资料及临床特征 |
| 3.3.2 慢性乙肝患者中PD-1及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达与临床相关性研究 |
| 3.3.3 慢性乙肝患者中4-1BB及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达与临床相关性研究 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 rAAV8/1.3HBV小鼠模型的构建及在HBV小鼠模型中激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响的相关研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物和r AAV8/1.3HBV病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 建立经尾静脉注射腺相关病毒的HBV模型 |
| 4.2.2 检测小鼠血清内HBsAg、HBe Ag水平 |
| 4.2.3 小鼠肝脏灌流分离肝内浸润淋巴细胞 |
| 4.2.4 小鼠肝脏组织全基因组DNA提取 |
| 4.2.5 qRT-PCR法检测小鼠HBV DNA定量 |
| 4.2.6 流式细胞术检测小鼠肝内T细胞亚群比例 |
| 4.2.7 CBA法检测小鼠血清内细胞因子 |
| 4.2.8 检测小鼠血清ALT,AST水平 |
| 4.2.9 处理小鼠肝脏组织和制备切片 |
| 4.2.10 小鼠肝脏组织HE染色 |
| 4.2.11 免疫组化检测小鼠肝组织内HBsAg和HBcAg |
| 4.2.12 数据统计处理 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 rAAV8/1.3 HBV小鼠模型的构建 |
| 4.3.2 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制同时伴随着肝脏炎症的产生 |
| 4.3.3 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制的同时伴随着T细胞亚群比例及免疫细胞因子的变化 |
| 4.3.4 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制具有药物剂量依赖性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制相关机制的初步研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠体内CD4~+和CD8~+T细胞的剔除 |
| 5.2.2 流式细胞术检测小鼠外周血的T细胞 |
| 5.2.3 小鼠血清HBsAg和肝脏组织内HBV DNA的检测 |
| 5.2.4 小鼠血清ALT水平检测 |
| 5.2.5 小鼠肝脏灌流分离肝内浸润淋巴细胞 |
| 5.2.6 小鼠肝脏内淋巴细胞mRNA的提取及文库构建测序 |
| 5.2.7 数据统计处理 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 CD4~+T和CD8~+T 细胞缺陷的rAAV8/1.3HBV小鼠模型的构建 |
| 5.3.2 激活OX40靶点抑制HBV复制的过程相对于CD4~+ T细胞似乎更依赖于CD8~+ T细胞的作用 |
| 5.3.3 激活OX40靶点抑制HBV复制的过程中基于mRNA测序的小鼠肝内浸润淋巴细胞的转录组学研究 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（2）肠道菌群失调引起的胆汁酸异常抑制HBeAg阳性CHB患者NK细胞的抗HBV作用（论文提纲范文）
| 英汉缩略词名词对照 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 肠道菌群失调引起HBeAg阳性CHB患者胆汁酸水平升高 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 胆汁酸抑制NK细胞的抗HBV作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述:HBV相关动物模型研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）慢性乙肝病毒感染患者血浆IL-21和IL-33水平与病毒载量相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| (一)前言 |
| (二)材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 样本采集 |
| 1.3 临床资料采集 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 实验原理 |
| 2.2 操作步骤 |
| 2.3 统计分析 |
| (三)结果 |
| 1.CHB患者与HC健康对照基本信息 |
| 1.1 CHB患者与HC健康对照一般临床资料 |
| 1.2 CHB患者与健康对照者一般临床资料比较 |
| 2.CHB患者与健康对照者肝功能指标水平比较 |
| 2.1 CHB患者与健康对照者ALT、AST、ALP及 GGT水平 |
| 2.2 CHB患者与健康对照者肝功能指标水平比较 |
| 3.CHB患者HBs Ag、HBe Ag及 HBc Ab水平比较 |
| 3.1 CHB患者HBs Ag、HBe Ag及 HBc Ab水平 |
| 3.2 CHB患者HBs Ag、HBe Ag及 HBc Ab水平比较 |
| 4.CHB患者和健康对照者血浆IL-21、IL-33 水平比较 |
| 4.1 CHB患者和健康对照者血浆IL-21、IL-33 水平 |
| 4.2 CHB患者和健康对照者血浆IL-21、IL-33 水平比较 |
| 5.血浆IL-21、IL-33 水平与肝功能指标、乙肝病毒血清学标志及HBV DNA水平的相关性分析 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| 参考文献 |
| 综述 HBV免疫逃避机制研究现状 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）乙型肝炎病毒相关性肾炎中西医结合研究述评（论文提纲范文）
| 1 研究瓶颈 |
| 1.1 缺乏实验研究 |
| 1.2 临床无统一治疗方案，中西医无统一的标准 |
| 1.3 缺乏大范围、多中心研究 |
| 2 实验研究进展 |
| 2.1 动物模型 |
| 2.2 分子生物学 |
| 3 研究方向 |
| 3.1 综合治疗 |
| 3.2 儿科 |
| 3.3 HBV-GN抗肾纤维化 |
| 3.3.1 肾纤维化 |
| 3.3.2 中西医抗肾纤维化治疗 |
| 4 展望 |
（5）基于“主客交”学说研究加减三甲散对肝纤维化大鼠WNT/β-catenin通路和lncRNA及mRNA表达谱的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 祖国医学对肝纤维化的认识 |
| 1.1 病名探讨 |
| 1.2 病因病机探究 |
| 1.3 治法探讨 |
| 2 现代医学对肝纤维化的认识 |
| 2.1 肝纤维化的病因 |
| 2.2 肝纤维化的诊断 |
| 2.3 肝纤维化的治疗 |
| 3 本研究的理论基础 |
| 3.1 “主客交”学说 |
| 3.1.1 “主客交”学说的创立 |
| 3.1.2 “主客交”含义 |
| 3.1.3 “主客交”学说的发展 |
| 3.1.4 “主客交”学说的特点 |
| 3.2 “主客交”与肝纤维化 |
| 3.3 “主客交”之治疗——三甲散及加减运用 |
| 3.4 加减三甲散及其运用 |
| 4 肝纤维化与Wnt/β-catenin信号转导通路 |
| 4.1 肝星状细胞与肝纤维化 |
| 4.2 Wnt信号转导通路 |
| 4.3 Wnt/β-catenin与肝纤维化 |
| 5 LncRNA与肝纤维化 |
| 5.1 LncRNA概况 |
| 5.2 LncRNA在肝纤维化中的研究 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 实验一 加减三甲散功效对比及wnt信号通路研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验主要试剂 |
| 1.1.3 实验主要仪器和设备 |
| 1.1.4 实验药物 |
| 1.1.5 实验场地 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 实验动物分组 |
| 1.2.2 干预用药的用法用量及制备方法 |
| 1.2.3 造模方法 |
| 1.2.4 药物干预方法 |
| 1.2.5 血清标本采集与处理 |
| 1.3 观察指标及方法 |
| 1.3.1 大鼠肉眼下观察 |
| 1.3.2 大鼠肝脏组织形态 |
| 1.3.3 血清肝功能指标观察 |
| 1.4 肝组织wnt2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量观测 |
| 1.5 统计学处理方法 |
| 1.6 实验结果 |
| 1.6.1 大鼠一般情况变化 |
| 1.6.2 大鼠肝脏组织形态变化 |
| 1.6.3 血清肝功能指标观察 |
| 1.6.4 肝组织wnt2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量变化 |
| 1.7 讨论 |
| 1.7.1 加减三甲散2号方的由来 |
| 1.7.2 对肝纤维大鼠模型的评价 |
| 1.7.3 对大鼠一般情况的影响 |
| 1.7.4 对大鼠肝脏病理形态的影响 |
| 1.7.5 对大鼠血清肝功能指标的影响 |
| 1.7.6 对肝组织wnt2、β-catenin、GSK-3β蛋白表达量的影响 |
| 2 实验二加减三甲散干预肝纤维化大鼠lnc RNA和 m RNA表达谱的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验主要试剂 |
| 2.1.3 实验仪器和设备 |
| 2.1.4 实验药物 |
| 2.1.5 实验场地 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物分组 |
| 2.2.2 造模方法 |
| 2.2.3 干预用药的制备及用法用量 |
| 2.2.4 药物干预方法 |
| 2.2.5 标本采集与处理 |
| 2.3 观察指标及方法 |
| 2.3.1 大鼠肉眼下形态观察 |
| 2.3.2 小鼠肝脏组织形态 |
| 2.3.3 血清肝纤维化指标观察 |
| 2.4 高通量测序肝脏组织m RMA和 lnc RNA |
| 2.4.1 RNA抽提和质检 |
| 2.4.2 文库构建 |
| 2.4.3 上机测序 |
| 2.4.3.1 获得reads |
| 2.4.3.2 数据预处理 |
| 2.4.3.3 基因组比对(Mapping genome) |
| 2.4.4.4 基因饱和度分析 |
| 2.4.4.5 mRNA和lncRNA差异基因筛选 |
| 2.4.4.6 GO 富集分析和 KEGG pathway 富集分析 |
| 2.5 统计学处理方法 |
| 2.6 实验结果和分析 |
| 2.6.1 大鼠一般情况变化 |
| 2.6.2 大鼠肝脏组织形态变化 |
| 2.6.3 血清肝纤维化指标观察 |
| 2.6.4 大鼠肝脏组织mRNA表达谱的变化 |
| 2.6.5 大鼠肝脏组织lnc RNA表达谱的变化 |
| 2.7 讨论 |
| 2.7.1 对大鼠一般情况的影响 |
| 2.7.2 对大鼠肝脏病理形态的影响 |
| 2.7.3 对大鼠血清肝纤维化指标的影响 |
| 2.7.4 对大鼠肝脏组织lncRNA和mRNA的影响及与“主客交”的联系 |
| 结论 |
| 特色与创新 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件 1:附图 部分原始图片 |
| 附件 2:文献综述 中成药治疗肝纤维化的临床研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件 3:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（6）忧遁草治疗乙型肝炎的药效学评价及作用机制初探（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 一、忧遁草治疗乙型肝炎的网络药理学分析 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 平台及软件 |
| 1.1.2 数据准备 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 乙型肝炎相关基因挖掘 |
| 1.2.2 忧遁草组分及靶点预测筛选 |
| 1.2.3 网络构建分析 |
| 1.2.4 基因富集分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、忧遁草治疗乙型肝炎模型鼠的药效学评价 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 质粒鉴定结果 |
| 2.2.2 动物造模鉴定结果 |
| 2.2.3 忧遁草对乙型肝炎相关指标的影响 |
| 2.2.4 忧遁草对小鼠肝脏病理的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、忧遁草对乙型肝炎模型小鼠的粪便肠道菌群的影响 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验对象 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 肠道菌群微生物群组成与多样性分析 |
| 3.2.2 门水平差异 |
| 3.2.3 科水平差异 |
| 3.2.4 属水平差异 |
| 3.2.5 进化分枝结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、忧遁草对乙型肝炎模型小鼠的肝脏代谢组学的影响 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验对象 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 PCA、OPLS-DA分析与正负离子差异代谢物火山图 |
| 4.2.2 忧遁草vs模型组显着差异代谢物 |
| 4.2.3 差异代谢物聚类分析 |
| 4.2.4 差异代谢物关联与KEGG富集分析 |
| 4.2.5 差异代谢物维恩分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 五、忧遁草干预的小鼠16S与非靶向代谢物联合分析 |
| 5.1 对象与方法 |
| 5.1.1 实验流程 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.1.3 数据关联分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 相关系数矩阵热图 |
| 5.2.2 网络图 |
| 5.2.3 层次聚类热图 |
| 5.2.4 相关关系散点图 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 肠道微生物菌群概述及其在肝脏疾病中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 附录 |
| 作者在校学习期间参加科研与发表论文情况 |
| 致谢 |
（7）实现慢性乙型肝炎治愈的战略计划及路径研究（美国国立卫生研究院2019年11月）（论文提纲范文）
| 一、战略优先事项1：乙型肝炎病毒生物学 |
| （一）明确控制感染和疾病进展的病毒学因素 |
| （二）了解HBV感染中的免疫和其他宿主因素 |
| （三）不同亚群和年龄组的疾病进展和防控的临床病理学和相关因素研究 |
| 二、战略优先事项2：工具和资源 |
| （一）试剂、流程和测定的标准化与共享 |
| （二）改良细胞培养方法和无细胞系统，以促进基础研究和产品研发 |
| （三）研发可以反映人类肝病进程的新动物模型 |
| （四）确立疾病进程和治疗应答的生物标志物 |
| （五）开发用于疾病诊断、监测和治疗评估的手段 |
| （六）拓展临床研究 |
| 三、战略优先事项3：乙型肝炎治愈和防范策略 |
| （一）制定抑制病毒复制和/或刺激机体免疫应答的治疗策略 |
| （二）考虑人群亚群和并存病的治疗方法评估 |
| （三）制定有效的策略筛查并接种高危人群及医疗服务不足的人群，同时保障其后续护理及持续治疗 |
| 四、结论 |
（8）慢性乙型肝炎肝胆湿热与无证可辨型差异表达蛋白研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词对照表 |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 慢性乙型肝炎免疫调节治疗研究概况 |
| 2 肝胆湿热证的研究概况 |
| 2.1 肝胆湿热证的历史沿革 |
| 2.2 肝胆湿热证的生物学基础研究概况 |
| 2.2.1 肝胆湿热证与实验室指标相关性研究概况 |
| 2.2.2 肝胆湿热证的组学研究概况 |
| 2.2.3 肝胆湿热证相关信号通路研究概况 |
| 3 慢性乙型肝炎无证可辨型的研究概况 |
| 3.1 慢性乙型肝炎无证可辨型中医研究概况 |
| 3.1.1 慢性乙型肝炎无证可辨型的研究意义 |
| 3.1.2 慢性乙型肝炎无证可辨型的内涵及诊治 |
| 3.1.3 慢性乙型肝炎无证可辨型与伏邪理论 |
| 3.2 慢性乙型肝炎无证可辨型的现代研究概况 |
| 第二部分 慢性乙型肝炎肝胆湿热型与无证可辨型差异表达蛋白研究 |
| 1 研究目的 |
| 2 研究对象 |
| 2.1 研究对象来源 |
| 2.2 诊断标准 |
| 2.2.1 西医诊断标准 |
| 2.2.2 中医诊断标准 |
| 2.3 纳入标准 |
| 2.4 排除标准 |
| 3 研究方法 |
| 4 实验材料 |
| 4.1 实验所用仪器与试剂 |
| 4.1.1 实验主要仪器 |
| 4.1.2 实验主要试剂 |
| 5 实验方法 |
| 5.1 样品的采集及血清的制备 |
| 5.2 样本的运输 |
| 5.3 检测方法 |
| 5.3.1 ELISA检测原理 |
| 5.3.2 ELISA操作步骤 |
| 5.4 统计学分析 |
| 6 实验结果 |
| 6.1 一般资料 |
| 6.1.1 性别构成 |
| 6.1.2 年龄构成 |
| 6.1.3 肝功能和病毒学指标 |
| 6.2 目标蛋白质的分析结果 |
| 6.2.1 ELISA检测目标蛋白质结果分析 |
| 6.2.2 差异蛋白质的功能富集和信号通路富集分析 |
| 6.2.3 ROC曲线分析 |
| 7 讨论 |
| 7.1 慢性乙型肝炎肝胆湿热型、无证可辨型与健康对照差异表达蛋白讨论 |
| 7.2 慢性乙型肝炎肝胆湿热型与无证可辨型差异表达蛋白讨论 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 中医证候的蛋白质组学研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录1: 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（9）顺铂通过激活ROS/JNK和抑制Akt/mTOR通路诱导乙型肝炎病毒再激活的分子机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 顺铂促进HBV复制的体外实验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 顺铂通过自噬促进HBV复制的体外实验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 顺铂通过ROS诱导自噬促进HBV复制的体外实验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四部分 体内验证顺铂诱导HBV再激活的分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文和参加的会议 |
（10）乙型肝炎病毒通过miR-192-3p-XIAP轴调控NF-κB信号通路诱导自噬以促进病毒自身复制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 乙型肝炎病毒(HBV)研究现状概述 |
| 1.1.1 HBV的发现 |
| 1.1.2 HBV的基因组结构和编码的蛋白 |
| 1.1.3 HBV的感染周期 |
| 1.1.4 HBx的功能研究 |
| 1.2 HBV利用自噬反应促进自身复制 |
| 1.2.1 自噬的发现 |
| 1.2.2 自噬的分类 |
| 1.2.3 自噬反应发生的过程 |
| 1.2.4 HBV利用自噬促进自身复制 |
| 1.3 miRNA在 HBV诱导自噬反应中的研究进展 |
| 1.3.1 miRNA的发现 |
| 1.3.2 miRNA的产生和功能 |
| 1.3.3 miRNA与自噬 |
| 1.3.4 miRNA与 HBV |
| 1.3.5 miRNA在 HBV诱导自噬反应中的调控作用 |
| 1.4 NF-κB信号通路的研究进展 |
| 1.4.1 NF-κB信号通路的组成 |
| 1.4.2 NF-κB信号通路的类别 |
| 1.4.3 HBV/HBx调控NF-κB信号通路的活性 |
| 1.4.4 NF-κB信号通路与自噬 |
| 1.5 XIAP的研究进展 |
| 1.6 本章小结 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验相关仪器设备 |
| 2.2 实验材料与试剂 |
| 2.2.1 细胞,细胞培养与细胞转染 |
| 2.2.2 表达质粒的构建 |
| 2.2.3 化学药品,抗体和其他试剂 |
| 2.2.4 细胞/组织/血清中的RNA提取 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂 |
| 2.2.6 免疫印迹(western blot)所用试剂 |
| 2.2.7 双荧光素酶报告基因实验所用材料 |
| 2.2.8 共聚焦和透射电镜观察自噬体所用材料 |
| 2.2.9 酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒 |
| 2.2.10 Southern blot and Northern blot所用试剂 |
| 2.2.11 免疫共沉淀实验(Co-IP) |
| 2.2.12 染色质免疫共沉淀(ChIP)实验所用试剂 |
| 2.2.13 小鼠尾静脉高压注射相关材料 |
| 2.2.14 本研究所用引物列表 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 细胞相关实验 |
| 2.3.2 质粒的构建与扩增 |
| 2.3.3 RNA的提取 |
| 2.3.4 qRT-PCR实验 |
| 2.3.5 免疫印迹(western blot) |
| 2.3.6 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.3.7 激光共聚焦显微镜观察自噬体 |
| 2.3.8 ELISA检测HBV抗原分泌 |
| 2.3.9 Southern blot 和 Northern blot 实验 |
| 2.3.10 Co-IP 实验 |
| 2.3.11 CHIP 实验 |
| 2.3.12 Balb/C小鼠尾静脉高压注射 |
| 2.3.13 HBV病毒的浓缩与定量 |
| 2.3.14 HBV病毒感染人原代肝细胞 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 HBV感染抑制miR-192-3p的表达 |
| 3.1.1 研究背景 |
| 3.1.2 HBV浓度梯度抑制miR-192-3p的分泌 |
| 3.1.3 HBV浓度梯度抑制miR-192-3p的胞内表达 |
| 3.1.4 HBV通过HBx抑制miR-192-3p转录 |
| 3.1.5 c-Myc显着抑制miR-192-3p的水平 |
| 3.1.6 HBx通过稳定c-Myc表达而抑制miR-192-3p的水平 |
| 3.1.7 HBx与c-Myc共同结合miR-192 的启动子 |
| 3.2 HBV抑制miR-192-3p而上调XIAP的表达 |
| 3.2.1 研究背景 |
| 3.2.2 筛选miR-192-3p的靶基因 |
| 3.2.3 确证XIAP作为miR-192-3p的靶基因 |
| 3.2.4 HBV抑制miR-192-3p而上调XIAP的表达 |
| 3.3 HBV通过miR-192-3p-XIAP轴诱导自噬 |
| 3.3.1 研究背景 |
| 3.3.2 HBV诱导自噬发生 |
| 3.3.3 miR-192-3p抑制自噬反应但不影响自噬流 |
| 3.3.4 miR-192-3p抑制HBV诱导的自噬反应 |
| 3.3.5 XIAP诱导自噬 |
| 3.3.6 Anti-miR-192-3p通过上调XIAP而促进自噬 |
| 3.3.7 HBV调控miR-192-3p-XIAP轴诱导自噬 |
| 3.4 HBV通过miR-192-3p-XIAP诱导自噬而促进HBV复制 |
| 3.4.1 研究背景 |
| 3.4.2 miR-192-3p抑制HBV壳体化DNA的水平和抗原分泌 |
| 3.4.3 XIAP促进HBV复制 |
| 3.4.4 Anti-miR-192-3p通过上调XIAP而促进病毒复制 |
| 3.4.5 HBV调控miR-192-3p-XIAP轴诱导HBV自身复制 |
| 3.5 HBV通过miR-192-3p-XIAP轴调控NF-ΚB通路诱导自噬而促进HBV复制 |
| 3.5.1 研究背景 |
| 3.5.2 miR-192-3p靶向XIAP抑制NF-κB信号通路 |
| 3.5.3 HBV通过miR-192-3p上调XIAP激活NF-κB信号通路 |
| 3.5.4 SC-514 抑制NF-κB信号通路减弱了HBV诱导的自噬和HBV病毒复制 |
| 3.5.5 SN50 抑制NF-κB信号通路减弱了HBV诱导的自噬和HBV病毒复制 |
| 3.6 体内实验证实HBV通过miR-192- 3p-XIAP轴诱导自噬并且促进其自身的复制 |
| 3.6.1 研究背景 |
| 3.6.2 在小鼠体内HBV急性感染抑制miR-192-3p的表达 |
| 3.6.3 在小鼠体内HBV-miR-192-3p-XIAP轴诱导自噬 |
| 3.6.4 在小鼠体内HBV通过miR-192-3p-XIAP轴促进自身复制 |
| 3.7 HBV病毒感染人的原代肝细胞后抑制miR-192-3p而上调XIAP水平进而诱导自噬并且促进其自身的复制 |
| 3.7.1 研究背景 |
| 3.7.2 HBV感染原代肝细胞抑制miR-192-3p的表达 |
| 3.7.3 HBV感染原代肝细胞促进XIAP的转录 |
| 3.7.4 miR-192-3p抑制HBV感染原代肝细胞诱导的自噬 |
| 第四章 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果 |
| 致谢 |
四、乙型肝炎病毒动物模型的研究浅析（论文参考文献）
- [1]激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响及相关机制研究[D]. 湛梦茹. 吉林大学, 2021(01)
- [2]肠道菌群失调引起的胆汁酸异常抑制HBeAg阳性CHB患者NK细胞的抗HBV作用[D]. 余青青. 福建医科大学, 2021(02)
- [3]慢性乙肝病毒感染患者血浆IL-21和IL-33水平与病毒载量相关性研究[D]. 赵岩. 大连医科大学, 2021(01)
- [4]乙型肝炎病毒相关性肾炎中西医结合研究述评[J]. 王耀光,万颖颖. 天津中医药, 2021(01)
- [5]基于“主客交”学说研究加减三甲散对肝纤维化大鼠WNT/β-catenin通路和lncRNA及mRNA表达谱的影响[D]. 成茂源. 成都中医药大学, 2020(01)
- [6]忧遁草治疗乙型肝炎的药效学评价及作用机制初探[D]. 张瑞. 海南医学院, 2020(01)
- [7]实现慢性乙型肝炎治愈的战略计划及路径研究（美国国立卫生研究院2019年11月）[J]. 袁正宏课题组,岳蕾,唐怡洁,丁家惠,徐通,李畅,徐明珠,叶建宇,李雨檬,胡孔颖,王洋,宰文静,刘江霞,张小楠,陈捷亮,袁正宏. 肝脏, 2020(03)
- [8]慢性乙型肝炎肝胆湿热与无证可辨型差异表达蛋白研究[D]. 席婷. 成都中医药大学, 2019(04)
- [9]顺铂通过激活ROS/JNK和抑制Akt/mTOR通路诱导乙型肝炎病毒再激活的分子机制研究[D]. 陈雪梅. 重庆医科大学, 2019(01)
- [10]乙型肝炎病毒通过miR-192-3p-XIAP轴调控NF-κB信号通路诱导自噬以促进病毒自身复制[D]. 汪静雯. 武汉大学, 2019(08)