何麟蔡洪刘谊陈忠邹昆良邓功建(四川达州市中心医院635000)
【中图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）30-0072-03
【摘要】目的研究应用无血清培养基悬浮法培养U-251胶质瘤细胞系的方法；并分离该细胞系中的脑肿瘤干细胞，鉴定其特异性标志物CD133+的表达并观察其生长和分化特征。方法应用培养大鼠神经干细胞的培养基和培养方法，在无血清培养基中采用悬浮法培养人U-251胶质瘤细胞系；再将分离获得的悬浮生长的脑肿瘤干细胞利用免疫荧光法检测脑肿瘤干细胞特异性标志物CD133+在脑肿瘤干细胞球中的表达。再将脑肿瘤干细胞接种于含血清培养基，观察其分化生长和分化特征。结果U-251胶质瘤细胞系中有约（2.56±0.2）%的肿瘤细胞在无血清培养基中能够存活，增殖，形成自由漂浮的细胞球；其细胞表达CD133+神经干细胞的标志物，并可连续传代，若重新接种于含血清培养基中可重新贴壁分化，贴壁分化后细胞形态与直接在含血清培养基中培养的U-251胶质瘤细胞系无明显差别。结论用悬浮无血清培养法从U-251人胶质瘤细胞系中成功培养出脑肿瘤干细胞，其肿瘤干细胞能够产生为多种细胞形态的分化细胞,脑肿瘤干细胞的分离培养成功对脑肿瘤的基础和临床研究具有重要价值
【关键词】U-251人胶质瘤细胞系脑肿瘤干细胞悬浮法培养无血清培养基
脑肿瘤居成人恶性肿瘤发病率前十位，其发病率和死亡率不断升高，严重地威胁着人类健康和生命。虽然外科手术和其他治疗措施进展很快，但仍很难治愈，经手术(放疗和化疗治疗后，病人几乎无一例外地出现肿瘤复发。在过去的20多年中，脑胶质瘤的治疗一直无明显进展[1]，最近研究发现，脑肿瘤中存在着具有干细胞自我更新特性的细胞亚群即脑肿瘤干细胞(braintumorstemcell，BTSC)，是引发肿瘤并维持脑肿瘤的生长的细胞来源（tumor-initiatingcell，TIC)，在肿瘤的复发过程中起着决定性的作用[2]。肿瘤干细胞（cancerstemcells）是存在于肿瘤中含量较少的具有干细胞性质的细胞群体，它具有自我更新的能力，是形成不同分化程度的肿瘤细胞和肿瘤不断扩大的根源。肿瘤干细胞的消灭就意味着消灭了肿瘤。
本实验中,我们使用成分相对简化成本较低的无血清培养基,应用悬浮培养NSC（Neuralstemcells,NSC）的实验方法,从U-251中成功分离培养出具有增殖形成BTS能力和分化能力的BTSC并连续传代。这种悬浮培养方法简便快捷,能有效地分离和传代BTSC,为BTSC的深入研究提供了材料。
1材料和方法
1.1材料
U-251（人胶质瘤细胞）：由昆明医学院附属第一医院免役治疗中心提供，表皮生长因子（购买于PEPROTECHEC公司），硷性成纤维生长因子（购买于PEPROTECHEC公司），DMEM/F12（购买于GIBCO公司），N2添加剂（购买于GIBCO公司），CD133一抗（购买于SIGMA公司），L-谷氨酰胺（购买于AMRESCO公司），羊抗小鼠IG-FITC二抗（购买于昆明贝吉尔科技有限公司）。
1.2方法
1.2.1细胞培养基
传统含血清培养基（serum-supplementedmedium,SSM）为含10.00%小牛血清的DMEM/F12（1：1）培养基，并添加L-谷氨酰胺（2mmol/L）,胰岛素(4u/L),青霉素G(1×105u/L),链霉素(100mg/L),无血清培养基(serum-freemedium,SFM),为不含胎牛血清的DMEM/F12（1：1）培养基,并添加重组人表皮生长因子(epide-rmalgrowthfactor,EGF,PeproTech)、重组人碱性成纤维生长因(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF,PeproTech)、其它成分同上。
1.2.2U-251中BTSC的分离培养与传代
先将U-251接种于传统SSM中，在培养瓶中传代。待细胞处于对数生长期，用D-Hanks液清洗,胰酶(0.25%)消化,自制巴斯德吸管机械吹打成单细胞悬液,悬于SFM，台盼兰染色并计数，以1×106孔接种于6孔板，在37℃、5.00%，饱和湿度培养箱中培养。待BTSC增殖形成肿瘤干细胞球（braintumorsphere,BTS）3,4d后将其收集并机械吹打成单细胞悬液,重悬于SFM,按1:4的比例传代于6孔板。U-251接种于传统SSM中，连续传代观察作为对照。
1.2.3有限稀释、单克隆形成实验
将贴壁生长于SSM中的U-251细胞经胰酶消化,吹打成单细胞悬液,以每孔100μl无血清培养基中含10个细胞的浓度接种于96孔板,以后每日每孔添加20μl新鲜无血清培养基,5天后记录所有孔中BTS的总数,计算具有单细胞克隆形成能力的BTSC占全部肿瘤细胞的百分率。此实验重复5次。
收集第二次传代后第4天的BTS,机械吹打成单细胞悬液,离心后重悬于无血清培养基,计数并调整细胞密度,采用有限稀释法,梯度稀释成每100μl含1、5、10、20个活细胞的细胞悬液,分别以每孔100μl接种至96孔板,标记只有一个BTS的孔,连续观察单细胞克隆的形成。
1.2.4U-251交替在含血清和无血清两种培养基中培养
按1.2.2的方法,待细胞系在SFM中形成原代肿瘤干细胞球2d后,将BTS或吹散后的单细胞用D-Hank液清洗,重悬于SSM。BTS按1：3的比例，单细胞按1×106/孔接种于12孔板。接种2d后再按2.2的方法将消化的U-251细胞接种于SFM如此重复3遍。
1.2.5U-251中脑肿瘤干细胞的分化
取第四次传代后4d的BTS,离心后弃上清,用含10%小牛血清、未添加EGF和bFGF的DMEM/F12培养基重悬,接种于放置有预先包被左旋多聚赖氨酸的盖玻片的6孔板,每孔2ml,动态观察BTSC分化。并在接种后第8天取盖玻片行苏木精-伊红染色,显微镜下观察细胞形态。
1.2.6脑肿瘤干细胞特异性标志物CD133的免疫荧光染色
在原12孔培养板中，取生长状况良好的原代或次代的脑肿瘤干细胞球，用PBS液在摇床上漂洗，5min,2次后，加入少量含10%血清、无生长因子的DMEM/F12培养基,置人37℃、5.00%，饱和湿度培养箱中温浴2小时让BTS贴壁，用PBS液在摇床上漂洗,5min,3次，把细胞片浸入95％乙醇或丙酮中固定5min,用PBS液在摇床上漂洗,5min,抗CD133-抗4℃孵育过夜,在原培养板中用PBS液在摇床上洗，5min,3次后，FITC标记二抗37℃孵育90min,用PBS液在摇床上漂洗，5min,3次。荧光显微镜下观察。
1.2.7免疫组化阳性结果判定
CD133为跨膜蛋白,定位于细胞膜及细胞质。以细胞膜和细胞质出现棕黄色高出背景色为阳性细胞。
1.2.8统计学方法
应用SPSS11.0统计软件,统计具有单细胞克隆形成能力的BTSC占全部肿瘤细胞的百分率。每次实验均用方差分析作拟和优度检验。
2结果
2.1U-251接种于SFM后形成可连续传代的肿瘤干细胞球
当把U-251接种到SFM中4h后,相差显微镜下观察,其中少量细胞发生贴壁并长出突起,其它大部分细胞悬浮于培养基中,呈圆形,互相之间部分粘连,见图1A。接种24～48h后显微镜下即可见到有克隆样细胞球形成,悬浮于培养基中,晃动培养瓶时可见细胞球滚动;细胞球由几个至几十个细胞组成,小的形状不规则,较大的多为卵球形或圆球形,类似神经干细胞球;细胞呈圆形,无突起,大小不一,折光性较强，见图1B。接种7d后形成了体积较大的细胞团,多为圆球形或卵圆形;晃动培养瓶时可见细胞球滚动;细胞球由上百个细胞构成,球内细胞呈圆形,大小不一,相差显微镜下透亮,折光性较强,此时形成的细胞球可称为脑肿瘤干细胞球(BTSs);同时培养基中仍存在大量悬浮的单细胞和一些形状不规则的非特异性聚集细胞,但较接种明显减少。而大部分细胞则贴壁生长,不能形成细胞球，见图1C。对照组中未见典型BTS形成。
ABC
图1原代U-251细胞接种于无血清培养基后形成的脑肿瘤干细胞球
A：原代细胞在无血清培养基培养4h后（×40)
B：原代细胞在无血清培养基培养48h后（×40)
C：原代细胞在无血清培养基培养7d后（×40)
Figure1PrimaryU-251spheresgeneratedinserum-freemedium
A:4hafterseedingprimarytumorcellsintoserum-freemedium(×40);
B:48hafterseeding(×40);C:7daysafterseeding(×40).
2.2脑肿瘤干细胞单克隆形成过程的观察
收集第二次传代后第4天的BTS,经胰酶消化,吹打成单细胞悬液,计数后重悬于SFM，接种12～24h后即可见2至十几个细胞的单克隆形成,48h后可见十几至数十个细胞的单克隆BTS,4～5d后可见数十至上百个细胞的单克隆BTS(图2)。这表明单个BTSC可增殖形成BTS。
ABC
EFG
图2单个脑肿瘤干细胞增殖形成脑肿瘤干细胞球的过程
A：培养2h的BTSC(×100)B：培养12h的BTSC(×100)
C：培养24h的BTSC(×400)D：培养48h的BTSC(×100)
E：培养3d的BTSC(×100)E：培养5d的BTSC(×400)
Figure2OneBTSresultedfromtheproliferationofasinglebraintumorstemcell(BTSC)
A:2hafterseedingBTSC(×100)B:12hafterseedingBTSC(×100)
C:24hafterseedingBTSC(×400)D:48hafterseedingBTSC(×100)
E:3dayafterseedingBTSC(×100)F:5dayafterseedingBTSC(×400)
2.3U-251中存在少量的脑肿瘤干细胞，具有形成脑肿瘤干细胞球的能力
以每孔100μl无血清培养基中含10个细胞的浓度接种于96孔板,5天后记录所有孔中BTS的总数,计算具有单细胞克隆形成能力的BTSC占全部肿瘤细胞(2.56±0.20)%(表1)。
表1U-251中BTSC的比例
每次实验均用方差分析作拟和优度检验,P<0.05。
2.4U-251能在含血清和无血清两种培养基中交替转换生长方式
U-251在SSM中呈贴壁生长，而在SFM中呈悬浮的BTS样生长；并都能在相应的培养基中连续传代更换培养基后，U-251的生长方式很快发生转换，重复几次后这种转换能力并不减弱。
2.5脑肿瘤干细胞的分化
绝大部分BTS在接种于含血清培养基4h后已经贴壁,并开始有细胞从BTS中迁移出来;24h后BTS球体变扁,形状不规则,迁移出来的细胞增多;4～6d时贴壁细胞数量明显增加,铺满盖玻片;迁移出的细胞贴壁生长,胞体和突起扁平,相差显微镜下难以分辨形态(图3A,B,C)。诱导分化8d后可发现BTS内部细胞呈未分化状态,细胞排列很紧密并相互堆叠,细胞核小均一,胞浆很少,核浆比例高;而迁移出的细胞形成单细胞层,呈分化的神经元或胶质细胞样,但形态不典型,突起短小,细胞核大小不一,异质性明显(图3D)。这表明BTS是由BTSC(而非NSC)增殖而成;BTS中的BTSC可在含血清培养基中分化,产生具有多种形态的子代肿瘤细胞。
ABCD
图3脑肿瘤干细胞在含血清培养基中分化
A：BTS接种于含血清培养基4h后已经分化(×400)
B：BTS接种于含血清培养基24h后分化更多(×400)
C：BTS接种于含血清培养基6d后分化细胞形成多层(×400)
D：诱导分化8d后(×100)
Figure4BTSCsdifferentiatedinmediumcontainingserum
A:DifferentiatedcellsmigratedoutofBTS4haftertheBTSadheredtothecoverslip(×400).
B:Moredifferentiatedcellsmigratedout24hlater(×400).C:Differentiatedcellsformed
monolayeraroundtheBTS6dayslater(×400).D:Differentiatedcellsscatteredaroundthe
BTSandundifferentiatedBTSCsassembledintheBTS8dayslater(×100)
2.6肿瘤干细胞球的免疫荧光
BTSCs表达NSCs的特异性标志物CD133。对在SFM中培养的第二代BTSC5d后的BTSs直接进行CD133免疫荧光检测。结果表明BTSs均呈CD133强阳性表达。这表明BTSs内存在大量CD133阳性BTSCs,呈细胞膜和细胞质染色模式（见图4）
AB
图4免疫荧光法检测脑肿瘤干细胞球中存在CD133阳性肿瘤干细胞
A：CD133阳性的BTSs（×100)B：在白光下的BTSs
Figure4TheexpressionofCD133inBTSCsinundifferentiatedBTSsobservedwithimmunofluorescencestaining
A：CD133-positiveBTSs(green,FITC-conjugatedsecondantibody,×100).
B：BTSsinthelight
3讨论
本实验中,我们使用成分相对简化、成本较低的无血清培养基,应用悬浮培养NSC的实验方法,从U-251中成功分离培养出具有增殖形成BTS能力和分化能力的BTSC并连续传代，此方法国内尚未见报道。这种悬浮培养方法简便快捷,能有效地分离和传代BTSC,为BTSC的深入研究提供了材料。
本研究从U-251中分离出的BTSC和从人脑肿瘤中分离出的BTS具有以下共同特征：它们在SFM中能形成克隆性的细胞球——脑肿瘤干细胞球，并能连续传代；在单克隆实验中都可以观察到单个BTSC增殖形成BTS的过程，随着接种时间的延长BTS体积都迅速变大，细胞数量增加，体现了BTSC的快速增殖性；U-251的BTSC比例为(2.18±0.10)﹪，在培养环境更换为SSM后，它们都被诱导贴壁分化，并继续增殖，产生大量子代细胞[3]，这些共同特征证明从U-251中分离出的BTSC与从人脑肿瘤中分离出的BTSC具有相近的性质。本实验证明，因U-251中BTSC在体外悬浮培养中具有快速增殖、稳定均一、容易取材的特性，并且能够在SSM中分化并快速转化为贴壁生长，所以在某些特定研究中它可以作为人脑肿瘤中BTSC的替代研究材料，成为研究BTSC的有用工具。
U-251中的BTS在去除生长因子的含血清培养基中很快发生贴壁分化,随即有大量分化细胞从中迁出。迁移出来的肿瘤细胞具有多种形态,异质性明显,不具有典型的神经元和胶质细胞的形态特征。有研究表明BTSC具有多向分化的能力,并且其分化细胞的种类和比例与其来源的肿瘤组织具有明显的相似性[4,5,6]。所以,U-251中的BTSC的分化具有肿瘤特异性,这是BTSC和正常NSC的重要区之一。
干细胞标记物技术曾经是实体TSC分离、纯化的一大障碍,NSC的特征性标记物Nestin的出现使NSC的分离、纯化成为可能。CD133是新近发现的一个新抗原,表达在干细胞及前体细胞上,包括NSC及神经前体细胞,而在成熟细胞包括比较成熟的前体细胞上表达阴性[7,8]。本研究证实,从U-251中培养分离出的神经球样的克隆同时表达CD133这表明在这些神经球样的克隆中存在着干细胞,BTSCs。标志物CD133的出现,有利于对BTSCs进行鉴定和筛选。本试验利用免疫荧光组化的方法,证实了在U-251中存在一定比例的CD133阳性细胞,说明了U-251中含有一定比例的脑肿瘤干细胞。有文献报道CD133用于鉴定BTSC细胞较为理想[9]。
总之,BTSC的分离培养成功对脑肿瘤的基础和临床研究具有重要价值。首先,第一、BTSC的存在本身就是对现有脑肿瘤发生、发展理论的重要补充。第二、为脑肿瘤治疗方法的改进和创新提供新的启示;产生直接针对BTSC的异、高效、个体化的治疗方法,有效地抑制肿瘤生长,防治肿瘤的迁移和复发。第三、BTSC的研究可以和NSC的研究相互促进,揭示二者的关系,明确BTSC的来源。
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