一、人脑胶质瘤nm23-H1蛋白及PCNA的表达（论文文献综述）
王帅[1]（2021）在《CYP46A1在胶质母细胞瘤胆固醇代谢中的作用和机制研究》文中提出研究背景:胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiform,GBM）是成年人中最常见的原发恶性脑肿瘤。GBM患者的标准治疗包括最大限度的手术切除、术后放疗和替莫唑胺（Temzolomide,TMZ）化疗。尽管如此患者在初次确诊后其中位生存期仍然只有14.6个月。因此,亟需探究新的治疗方案来改善GBM患者的预后。越来越多的证据表明胆固醇稳态失调与包括GBM在内的多种肿瘤的发展密切相关。然而流行病学数据分析发现GBM发生风险的高低和血清胆固醇水平并不完全相关,这表明血清胆固醇在GBM发展过程中的作用有限。羟固醇（Oxysterols）是一类胆固醇代谢过程中的氧化衍生物,在人体中羟固醇主要来自于饮食和自身的胆固醇代谢。它包括24-羟化胆固醇（24-Hydroxycholesterol,240HC）,25-羟化胆固醇（25-Hydroxycholesterol,250HC）、27-羟化胆固醇（27-Hydroxycholesterol,270HC）和环状羟固醇（Oxysterols）。这些羟固醇不仅参与胆固醇的代谢过程,也参与调控Hedgehog,Wnt和MAPK信号通路。在神经退行性疾病和肿瘤中,羟固醇可以通过与肝脏X受体（LiverX receptors,LXRs）,羟固醇结合蛋白和胰岛素诱导基因1（Insulin-induced gene 1,INSIG1）等特定的蛋白和转录因子结合之后调控胆固醇代谢和细胞增殖等过程。例如,最近有研究表明270HC可以通过降低胞内胆固醇水平抑制前列腺癌的生长,但在乳腺癌中270HC 却可以诱导上皮间充质转化（Epithelial to mesenchymal transition,EMT）从而促进肿瘤生长。在一种早期肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC）的亚型中,胆固醇稳态的失调则提示患者预后不良。而在GBM中,以下证据支持过量的胆固醇积累可以刺激肿瘤的生长:首先GBM通过上调低密度脂蛋白受体（Low density lipoprotein receptor,LDLR）的表达吞噬低密度脂蛋白（Low density lipoprotein,LDL）从而获取大量胆固醇;其次,GBM中缺少内源性羟固醇,这会导致胆固醇外排降低使GBM细胞积累大量胆固醇。目前为止在GBM中羟固醇减少导致胆固醇稳态失调的机制仍不明确。在哺乳动物中,胆固醇稳态平衡受到以胆固醇调节元件结合蛋白（Sterol regulatory binding proteins,SREBPs）和LXRs两组转录因子为中心的一个复杂蛋白网络的精准调控,它们的下游靶基因参与胆固醇的输入,输出、合成、代谢和酯化。当胞内胆固醇降低时,SREBPs促进参与胆固醇合成和摄取的基因转录,例如 3-羟-3-甲基戊二酰-CoA 还原酶（3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGCR）和LDLR。当细胞内胆固醇含量过高时LXRs开始发挥作用,一方面它可以诱导包括ATP结合盒转运体A1（ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1）和 ATP 结合盒转运体 G1（ATP-binding cassette transporter G1,ABCG1）在内负责胆固醇外排基因的表达;另一方面它还可以通过上调E3泛素连接酶诱导型低密度脂蛋白受体降解器（Inducibledegraderofthe LDLR,IDOL）的表达促进LDLR的降解。研究证明在裸鼠原位成瘤模型中靶向这些信号通路是抑制GBM增殖的有效策略。肿瘤细胞需要摄取大量胆固醇以维持其自身快速增殖,因此阻断细胞获取胆固醇或者增加胆固醇排泄可能是肿瘤治疗过程中的潜在靶点。然而,GBM中导致胆固异常醇积累的关键因素仍不清楚。本研究提取了全转录组数据库中的基因表达信息进行大规模生信分析确定了 GBM中参与胆固醇稳态的差异表达基因。结果显示下调最明显的基因之一是胆固醇24-羟化酶（Cholesterol24-hydroxylase,CYP46A1）,它是一个脑组织特异性酶,其功能是将胆固醇转化为240HC从而将其排出中枢神经系统。在GBM患者中CYP46A1低表达提示患者预后不良,功能研究发现过表达或者药物激活CYP46A1/240HC轴可以在体内外抑制GBM细胞的生长。我们的结果显示CYP46A1是介导GBM中胆固醇稳态失调的一个关键因素,靶向CYP46A1/240HC可能为GBM治疗提供新的策略。第一部分胆固醇在GBM增殖中的作用目的（1）探究GBM和正常脑组织之间的胆固醇代谢是否存在差异。（2）明确胆固醇在GBM细胞增殖中的作用。方法（1）生物信息学分析正常脑组织和胶质瘤组织之间的胆固醇代谢差异。提取Rembrandt数据库中正常脑组织和胶质瘤标本的RNA测序数据进行GSEA,比较胆固醇代谢相关基因基因集在两者之间的表达差异。（2）分别在GBM原代细胞和细胞系中检测胆固醇对细胞增殖的影响。进行挽救实验观察在缺乏胆固醇的培养液中补充外源性胆固醇是否可以部分挽救胆固醇缺乏导致的GBM细胞增殖抑制。结果（1）GBM和正常脑组织之间的胆固醇代谢方式存在明显差异。GSEA显示与正常脑组织相比,GBM组织中胆固醇合成代谢基因集表达较低,提示GBM的增殖可能更加依赖于摄取外源性胆固醇。（2）胆固醇可以促进GBM细胞的增殖。在胆固醇缺乏的培养环境中GBM原代细胞和细胞系增殖均受到抑制,而在培养液中加入富含胆固醇的低密度脂蛋白（Low density lipoprotein,LDL）则可以部分挽救这种胆固醇缺乏导致的增殖抑制。结论正常脑组织和GBM之间的胆固醇代谢存在明显差异,胆固醇是GBM细胞增殖过程中的一种必需物质。第二部分CYP46A1在胶质瘤中的表达及作用机制目的（1）明确CYP46A1在胶质瘤中的表达情况及预后价值。（2）揭示CYP46A1对GBM生长的影响。（3）阐明CYP46A1在GBM恶性进展中发挥作用的机制。方法（1）分别提取Rembrandt和CGGA数据库中的胆固醇代谢相关基因的表达信息和临床病理信息,综合分析确定出差异表达最明显和预后价值最高的基因（CYP46A1）。提取TCGA数据库中的基因表达信息,分析CYP46A1在正常脑组织和不同级别的胶质瘤以及不同GBM亚型中的表达差异,进一步在不同数据库中验证CYP46A1的预后价值。（2）免疫组化分析CYP46A1在不同级别胶质瘤标本中的表达差异。Western blot分析其在正常人星形细胞和不同类型的GBM细胞中的表达差异。（3）构建CYP46A1过表达慢病毒,分别感染GBM细胞系和GBM原代细胞。通过q-RT-PCR和Western blot实验检测CYP46A1过表达效率。细胞计数和克隆形成实验体外观察过表达CYP46A1对细胞增殖的影响。（4）构建GBM细胞系LN229和原代细胞GBM#P3裸鼠颅内成瘤模型,记录CYP46A1对于荷瘤小鼠生存期的影响。处死小鼠后HE染色观察CYP46A1对于肿瘤大小的影响。（5）超高效液相色谱-质谱联用（Ultrahigh-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UHPLC-MS/MS）分析检测 GBM 组织和正常人脑组织中240HC含量的差异。检测过表达CYP46A1后240HC含量的变化。进行细胞活力,细胞凋亡、克隆形成、干细胞成球等实验评估240HC对GBM细胞恶性生物学行为的影响。Western blot检测240HC刺激GBM细胞后相关指标的变化。（6）分别通过试剂盒和菲律平染色检测240HC刺激后胞内胆固醇的变化。进行细胞计数,细胞凋亡和干细胞成球实验观察补充胆固醇是否可以逆转240HC刺激导致的GBM细胞恶性生物学行为的变化。RNA-Seq分析探究240HC对于下游信号通路的影响并进行q-RT-PCR,Western blot等实验验证。结果（1）CYP46A1是GBM中的一个抑癌基因。差异分析显示CYP46A1是正常脑组织和GBM之间表达差异最明显的胆固醇代谢相关基因之一,在胶质瘤患者中,CYP46A1低表达提示患者预后不良。数据库分析显示与正常脑组织相比CYP46A1的表达在GBM和LGG（Low grade glioma,LGG）中均显着降低,免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）分析与上述结果一致。Western blot分析表明与正常人星形胶质细胞（Normal human astrocyte,NHA）相比CYP46A1在GBM细胞中的表达明显降低。对GEO和ENCODE数据库中的染色质免疫沉淀测序（Chromosome immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq）数据分析后我们发现CYP46A1在GBM组织中低表达的原因是组蛋白异常修饰,并且我们用ChIP验证了上述结果。（2）过表达CYP46A1抑制GBM细胞的增殖。q-RT-PCR和Western blot分析显示慢病毒感染GBM细胞可以分别在mRNA和蛋白水平上调CYP46A1的表达。细胞计数、克隆形成和裸鼠颅内原位种瘤实验显示CYP46A1可以抑制GBM增殖。生存分析表明过表达CYP46A1可以显着延长小鼠的生存期。IHC分析表明过表达CYP46A1可以显着降低小鼠颅内GBM标本中的细胞增殖指标PCNA,增加细胞凋亡指标cleaved-caspase 3的蛋白表达。（3）CYP46A1催化产生240HC抑制GBM的增殖和GSC的干性。UHPLC-MS/MS分析显示在GBM细胞中过表达CYP46A1可以显着增加其催化产物240HC的含量;IC50实验观察到240HC在较低浓度下即可对GBM细胞造成显着杀伤。流式细胞术分析发现240HC可以显着增加GBM细胞的凋亡率。GBM细胞系的克隆形成能力和干细胞的成球能力随着240HC浓度的增加而逐渐降低。Western blot分析发现细胞凋亡标志物随着240HC刺激浓度的增加逐渐上调,而细胞增殖标志物逐渐下调。（4）240HC通过降低GBM胞内胆固醇的含量抑制其恶性进展。试剂盒检测和菲律平染色表明240HC刺激可以降低GBM细胞的胆固醇含量。补充外源性胆固醇则可以部分挽救240HC刺激造成的细胞增殖的抑制和凋亡增加。在GBM原代细胞中补充胆固醇则可以挽救240HC刺激导致的细胞成球能力的下降。（5）240HC通过LXR和SREBP1改变GBM中的胆固醇代谢。RNA-Seq表明240HC调控的下游基因与胆固醇代谢信号通路密切相关;这些差异基因包括SREBP1下游靶基因LDLR和LXR的靶基因ABCA1以及胶质瘤干细胞标志物等。q-RT-PCR和Western blot分析验证了上述RNA-Seq的结果。过表达SREBP1可以部分挽救240HC刺激导致的细胞增殖抑制,使用SREBP1抑制剂刺激细胞发现GBM细胞的克隆形成能力明显减弱,胞内胆固醇含量显着降低,这与240HC引起的效应是类似的。结论胶质瘤中CYP46A1表达降低是介导其胆固醇稳态失调的关键因素之一。在GBM细胞中过表达CYP46A1可以抑制GBM细胞的增殖。其分子机制是CYP46A1提高了 240HC的含量,240HC一方面可以激动LXR并增加其下游外排胆固醇相关基因的转录,另一方面240HC还可以抑制SREBP1的激活并降低其下游胆固醇摄取相关基因LDLR的表达。第三部分 依法韦仑通过激活CYP46A1/240HC抑制胶质瘤增殖目的（1）研究CYP46A1激动剂依法韦仑在胶质瘤中的治疗价值。（2）揭示CYP46A1激动剂依法韦仑抑制GBM增殖的机制。方法（1）UHPLC-MS/MS分析检测CYP46A1激动剂依法韦仑刺激胶质瘤原代细胞和胶质瘤细胞系后240HC含量的变化。并通过菲律平染色和试剂盒检测依法韦仑对于胶质瘤原代细胞和细胞系胞内胆固醇含量的影响。（2）IC50实验检测依法韦仑对胶质瘤细胞系和胶质瘤原代细胞的毒性。进行克隆形成实验、细胞凋亡实验、干细胞成球实验等体外评估依法韦仑对GBM细胞增殖,凋亡和干细胞特性的影响。Western blot检测依法韦仑对胆固醇代谢相关指标,细胞凋亡指标、细胞增殖指标和肿瘤干细胞指标的影响。（3）分别构建胶质瘤细胞系LN229和胶质瘤原代细胞GBM#3的裸鼠颅内成瘤模型,记录依法韦仑对小鼠生存期的影响,并通过小动物活体成像系统实时监测肿瘤生长情况。结果（1）依法韦仑可以降低GBM细胞的胞内胆固醇含量。试剂盒检测表明20μM依法韦仑分别刺激LN229和GBM#P3可显着降低细胞内总胆固醇含量。此外,菲律平染色显示10 μM和20 μM依法韦仑刺激可以显着降LN229和GBM#P3的胞内游离胆固醇含量。（2）依法韦仑在体外通过提高240HC含量对胶质瘤细胞有明显杀伤作用。IC50实验显示依法韦仑在较低浓度下即可对LN229（IC50=16.81 μM）和GBM#P3（IC50=24.58 μM）细胞有明显的杀伤效果。20 μM依法韦仑刺激即可显着提高培养液中的240HC浓度。进一步研究表明该药物可以显着抑制GBM细胞的克隆形成能力和干细胞成球能力并增加细胞凋亡,同时可以降低细胞增殖标志物PCNA和干细胞标志物SOX2的表达,并增加凋亡标志物c-PARP的表达。另一方面依法韦仑可以降低胆固醇摄取蛋白LDLR和转录因子SREBP1的蛋白水平,提高胆固醇外排蛋白ABCA1的蛋白含量。（3）依法韦仑可以延长荷瘤小鼠生存期并抑制其肿瘤生长。在LN229和GBM#P3两种GBM颅内原位种瘤模型中,给与小鼠依法韦仑灌胃（0.1 mg/kg/day）可以显着延长荷瘤小鼠生中位存期（LN229:n=5,29天vs 35天,P=0.02;GBM#P3:n=5,27天vs 44天,P=0.007）,并且在GBM#P3模型中,小鼠活体成像分析显示给药组肿瘤荧光信号在21天显着降低（n=5,P=0.005）。同时免疫组化证实给药组细胞增殖标志物PCNA降低而凋亡标志物cleaved caspase-3升高。结论CYP46A1激动剂依法韦仑可以通过激活CYP46A1增加胆固醇代谢产物240HC的含量进而降低GBM细胞胞内胆固醇含量来抑制GBM细胞的增殖。
刘晓宁[2]（2021）在《新型NFAT信号通路抑制剂及其抗神经胶质母细胞瘤活性研究》文中指出多形性神经胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）是中枢神经系统中最常见的原发性肿瘤,约占神经胶质瘤的50%,占脑部肿瘤的15%。GBM肿瘤的恶性程度高、预后差,导致95%的GBM患者生存期不超过两年。而且由于其高度侵袭性,在不影响大脑正常功能的情况下很难将肿瘤切除干净,导致其术后极易复发,且手术后病人生存质量受到很大的影响。因此,药物治疗在改善病人生存期及提高患者生存质量方面发挥着重要作用。目前,临床上用于GBM肿瘤治疗的一线药物为替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）等烷化剂,但这类药物长期应用极易产生耐药性。另外人们也积极开发作用其他靶点的药物,以及将免疫治疗、靶向治疗应用于GBM肿瘤治疗,尽管有些治疗方案取得了显着的治疗效果,但患者的生存期仍没有实质性的提高。因此,临床上仍迫切需要开发新的治疗药物或方法用于GBM治疗。活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells,NFAT）是一类重要的核转录因子,在多种细胞过程以及胚胎发育、器官再生中发挥着关键作用。值得注意的是,近年来越来越多的研究发现,NFAT在包括GBM肿瘤在内的多种肿瘤组织中表达上调或过活化,且与不良预后密切相关。NFAT调控的MMPs、VEGFR等下游基因,与肿瘤的发生与发展密切相关,因此,NFAT信号通路是一潜在的抗肿瘤药物靶点,可以为GBM治疗提供新的策略。已上市的药物化合物库是人类宝贵的财富,其药理学性质及安全性都得到了很好的评价,因此从老药中寻找新药可以加快药物研发进程。基于此,本课题首先采用老药新用的策略寻找结构新颖的NFAT信号通路抑制剂。同时,采用传统药物化学的方法及现代合理药物设计相结合的方法,对前期发现的先导化合物YZ85进行结构改造,以探索有效的、结构新颖的、具有自主知识产权的抗GBM肿瘤候选药物分子。具体结果如下:1.基于老药新用的药物研发策略筛选出NFAT信号通路抑制剂用于GBM肿瘤治疗。首先从已上市的药物化合物库中,筛选出了93种结构简单且易于衍生的化合物构建筛选化合物库。初筛结果显示,8种化合物有较高的NFAT信号通路抑制活性,其中匹莫范色林酒石酸盐（PIM）的活性最高,IC50值为6.47μM。随后的作用机理研究发现PIM通过抑制CRAC通道中的STIM1的寡聚,而抑制NFAT信号通路的激活。实验结果显示PIM在细胞水平上可引起细胞周期G1/S期的停滞、促进细胞凋亡,从而显着抑制GBM肿瘤细胞U87的增殖、迁移、运动等。在体内,PIM能显着抑制皮下及原位GBM肿瘤的生长。最值得注意的是,PIM的给药方式为灌胃给药,表明其可以穿越血脑屏障,从而保证了未来临床试验中的治疗效果。组学研究进一步揭示,除了NFAT信号通路,PIM对ATR/RB/E2F、MYC及Aurora A/B信号通路也有较强的抑制作用,进而损害细胞周期进程、DNA复制和碱基代谢,有望产生较强的抗肿瘤作用。2.基于先导化合物结构改造的策略探索高活性磺酰胺类NFAT信号通路抑制剂。本部分内容以前期发现的高活性磺酰胺类NFAT信号通路抑制剂YZ85为先导化合物,设计合成了19种YZ85衍生物并进行了初步的抗肿瘤活性评价。结果显示,YZ85衍生物具有良好的抗GBM活性,有望发展成有效的抗肿瘤药物。通过本课题的研究,揭示了NFAT信号通路是非常有潜力的GBM肿瘤治疗靶点。PIM于2016年刚刚获准上市,其抗肿瘤活性研究较少,本研究首次报道了其对GBM肿瘤治疗潜力的新的抗肿瘤机制,即抑制NFAT信号通路、ATR/RB/E2F信号通路等。在接下来的研究中,将考虑PIM与GBM肿瘤的临床一线药物TMZ或者m TORC1抑制剂联合用药,并积极推动PIM的临床试验。YZ85衍生物其抗肿瘤活性还有待进一步提高,因此将对其结构继续衍生化。
蔡鲁[3]（2020）在《中药威灵仙基原品种之一棉团铁线莲的化学成分研究》文中认为棉团铁线莲（Clematis hexapetala Pall.）为毛茛科（Ranunculaceae）铁线莲属植物,其干燥根和根茎是中药威灵仙（Clematidis Radix Et Rhizoma）三种基原品种之一。威灵仙味辛、咸,性温,归膀胱经,具有祛风湿,通经络之功效,用于治疗风湿痹痛、肢体麻木、筋脉拘挛和屈伸不利等症。本文利用HP-20大孔树脂、硅胶、ODS和Sephadex LH-20等多种色谱分离纯化技术,从棉团铁线莲根和根茎60%乙醇提取物的大孔树脂50%乙醇洗脱部位中分离得到了 66个化合物,并通过UV、IR、MS、NMR等波谱技术、化学方法和计算ECD技术确定了其化学结构,包括愈创木烷型倍半萜类6个（1-3,13-15）,异戊烯基取代的酚苷3个（4-5,8）或苄醇苷2个（6-7）,木脂素类41个（9-10,22-60）,简单苯丙素类8个（11,17-18,61-65）,没食子酸酚苷类2个（12,16）,茋类2个（20-21）和酚类2个（19,66）,其中新化合物12个（1-12）,首次从该属植物中分离得到的已知化合物14个（13-17,20,22,35,44-47,65-66）,除化合物22,30,31外均为首次从本种植物中分离得到。化合物1-3为愈创木烷型倍半萜类化合物,该类化合物在铁线莲属植物中尚属首次发现;在NOESY谱确定其相对构型的基础上,采用改良Mosher酯化方法确定了其绝对构型。化合物4-8为少见的异戊烯基化1,2,3,4-四取代酚苷或苄醇苷类化合物,其中异戊烯基的烯碳或甲基与邻位酚羟基形成六元环或七元环,以酚苷或苄醇苷的方式存在;并推测了其苷元可能的生源途径。化合物9-10为骈双四氢呋喃类木脂素的双糖苷类化合物。在10μM浓度下,以脂多糖（LPS）诱导的小鼠腹腔巨噬细胞（RAW264.7）为模型,检测对细胞分泌TNF-α和NO的抑制作用,评价化合物的抗炎活性,结果显示15和20显示TNF-α抑制作用,抑制率分别为49.46%和62.50%,而所测化合物未显示明显NO抑制活性;以对PTP1B酶的抑制作用评价降糖活性,结果显示20的抑制率为86.0%;以MTT法评价细胞毒活性,结果显示化合物对人结肠癌细胞（HCT-116）、人肝癌细胞（HepG2）、人胃癌细胞（BGC-823）、人肺癌细胞（A549）和人脑胶质瘤细胞（U251）等均未见明显细胞毒作用;以体外钙蛋白酶抑制活性评价降血脂作用,在1mM～10μM浓度下,结果未见明显抑制作用。以上研究结果丰富了棉团铁线莲植物的化学成分研究内容,为其进一步深入研究和应用奠定了基础,对其活性物质的阐明以及作为中药威灵仙的药用提供了参考。
刘亦晨[4]（2020）在《肿瘤同源外泌体纳米声敏剂EXO-DVDMS的构建及其声动力杀伤乳腺癌的实验研究》文中进行了进一步梳理研究背景及目的癌症诊疗是全球范围的重大公共卫生问题之一。根据《Cancer Statistics,2019》的统计数据显示,乳腺癌高居全球女性常见癌症的首位,致死率位列前茅。目前以手术治疗、化学治疗、放射治疗、内分泌治疗、靶向治疗及中药治疗为主的乳腺癌治疗体系虽取得一定疗效,但仍面临治疗毒副作用大,肿瘤转移及复发率高等亟待解决的难题。研究靶向、低毒、微创的乳腺癌治疗方式,是生物医学领域面临的重大课题。声动力学疗法（Sonodynamictherapy,SDT）是近年来逐渐发展起来的一种肿瘤治疗新方法。SDT利用超声波固有的组织穿透性强,能量衰减小的特点,将能量有效的聚焦于深部病灶部位,激活富集于肿瘤组织中的声敏剂,并通过超声空化效应、自由基产生、降低耐药性、介导细胞凋亡以及免疫调节等多种机制发挥抗肿瘤作用。该疗法将本身低毒/无毒的声敏剂在病灶组织的选择性富集和超声的精准聚焦相结合,可实现组织靶向性的肿瘤组织杀伤,从而最大程度上降低对周围正常组织的影响。因此SDT对于手术治疗困难,不同癌症患者个性化无创或微创治疗,改善愈后生存质量具有重要意义。声敏剂在SDT治疗中起着至关重要的作用。理想的声敏剂应具有良好声敏性,且能够在病灶组织内特异性滞留,从而实现高效、安全的声动力治疗。传统声敏剂使用存在着生物利用度较低,肿瘤部位累积浓度不佳,药物稳定性易受体内环境影响等局限性。因此探索新型高效声敏剂,克服当前声敏剂存在的缺陷,同时提升声敏剂向肿瘤组织的递送效率是当前SDT领域迫切需要探索的科学问题。纳米技术的快速发展和广泛应用为声敏剂的高效递送及SDT治疗效果的提升提供了新的机遇。相较于小分子药物,纳米级声敏剂更易通过实体瘤的高通透性和滞留效应（Enhanced permeability and retention effect,EPR）特性,促使敏化剂被动靶向富集于肿瘤组织,可减少在非肿瘤组织的蓄积。通过纳米材料携载传统声敏剂或直接采用具有声敏特性的纳米材料作为声敏剂,可以有效改善声敏剂的理化特性或直接参与提升SDT疗效。然而,外源性的纳米声敏剂在临床应用方面仍然面临着许多困难。例如,纳米材料及其降解产物存在潜在的免疫原性和积累毒性,且易被网状内皮系统（Reticuloendothelial system,RES）识别清除。此外,由于肿瘤组织的高度异质性以及体内各种生理病理屏障的存在,在一定程度上削弱了 EPR效应,进一步提升了药物精准递送的难度。近年来,越来越多的研究开始关注来源于细胞自身或亚细胞结构的内源性载体。外泌体（Exosome）是细胞自身分泌的纳米级（30-150nm）囊泡,可携带亲本细胞的信息,广泛参与细胞间的通讯,已被开发应用于疾病的诊断和治疗。由于外泌体的内生性特点,以其作为载体的敏化剂递药系统具有生物相容性好、免疫原性低、具备潜在靶向性等特点,可有效规避外源性材料在治疗中的问题。为了强化敏化剂在肿瘤组织的靶向富集,在多种促进EPR效应的尝试中,发现超声靶向微泡爆破（Ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD）技术在促进药物递送和渗透方面有独特的应用优势。本论文选用在前期研究中表现出良好声活性兼具治疗与成像功能的卟啉二聚体钠盐华卟啉钠（Sinoporphyrin sodium,DVDMS）作为声敏剂,采用同源肿瘤外泌体包装策略,构建了内源性的华卟啉钠外泌体纳米声敏剂（EXO-DVDMS）。通过引入引导超声（US1）促进EXO-DVDMS在肿瘤部位的蓄积和渗透,随后采用治疗超声（US2）触发SDT作用,论文系统研究了 EXO-DVDMS在生理条件下的药物保护作用,超声介导下的药物释放和胞内转运特征,以及同源肿瘤靶向性;并以离体培养的小鼠乳腺癌4T1细胞和小鼠乳腺癌荷瘤模型为实验对象,开展引导超声作用下EXO-DVDMS增效SDT抗肿瘤作用的初步分析,旨在为探索运用天然外泌体构建声响应性纳米递送平台,提升SDT抗乳腺癌的疗效提供有价值的理论依据和实验基础。研究方法及结果:1.华卟啉钠外泌体纳米声敏剂（EXO-DVDMS）的制备及其鉴定:实验首先通过筛选PEG分子量及浓度,增加提取前和提取后处理步骤,对文献已报道的PEG沉降分离法进行改良,并将该改良后方法（PEG-8K改良法）提取外泌体与超速离心和商品试剂盒分离的外泌体进行比较,以评估PEG-8K改良方案的适用性;利用荧光酶标仪测定EXO-DVDMS包封率和载药效率;透射电镜（TEM）观察颗粒形貌;NTA和DLS测定颗粒粒径、Zeta电位、粒径稳定性;Western blot检测外泌体标志性蛋白;流式细胞仪（FCM）和高分辨率激光共聚焦（CLSM）共同验证所制备EXO-DVDMS的纯度,以排除未载药外泌体干扰。结果显示:①PEG-8K改良法所提外泌体量为超速离心法10倍以上,粒径适中,稳定性良好,外泌体粒径和蛋白量均与商品化试剂盒提取样品相似,且该步骤可扩展用于多种细胞来源及血液来源外泌体的分离;②药质比为1:15.5,孵育温度为28℃,孵育时间为30分钟为制备EXO-DVDMS的最佳载药条件;所制备EXO-DVDMS呈圆形囊泡结构,颗粒均一,平均粒径为（126.71±3.86）nm,Zeta电位为（-10.67±0.52）mV,单分散性优良,粒径稳定性良好,外泌体标志性蛋白CD9和CD63呈阳性,包封率（EE%）约为84.57%,载药率（DL%）约为5.18%;③EXO-DVDMS颗粒中具有DVDMS荧光信号的阳性颗粒比率高于98.5%,提示EXO-DVDMS具有较高纯度。2.模拟生理条件下外泌体对华卟啉钠的药物保护作用研究:利用DLS测定EXO-DVDMS在模拟体内生理条件（血清、pH、温度）中的颗粒稳定性;采用全波长荧光酶标仪研究不同条件下游离DVDMS（Free-DVDMS）以及EXO-DVDMS的光谱性质;单线态氧探针（SOSG）联合荧光分光光度计检测EXO-DVDMS在正常/模拟生理条件下经超声刺激后的单线态氧产量。结果显示:①24小时内,EXO-DVDMS在模拟生理条件下粒径稳定性良好;②与Free-DVDMS相比,EXO-DVDMS吸收光谱在保留原有369 nm索瑞带的同时,在430 nm处产生了新的吸收峰,其位于516-631 nm之间的4个Q带的峰值均高于Free-DVDMS,而EXO-DVDMS的荧光发射峰峰位与Free-DVDMS相同（640 nm左右）,峰值显着提升。在不同pH、温度及不同存储时间条件下,EXO-DVDMS均显着提升了游离DVDMS的光谱稳定性,避免模拟生理条件下低pH和非特异性蛋白结合对DVDMS理化性质的影响;③在中性条件和酸性条件存放24小时后,EXO-DVDMS经超声刺激下单线态氧产量分别是Free-DVDMS的4.74倍和14.4倍,提示EXO-DVDMS有希望显着提升Free-DVDMS的SDT作用。3.EXO-DVDMS的释药行为分析:采用透析法分析EXO-DVDMS中DVDMS在不同血清浓度、不同pH、不同参数超声刺激下的释药行为;对苯二甲酸（TA）法检测超声处理后EXO-DVDMS溶液中羟自由基的生成;TEM观察超声处理对EXO-DVDMS形态的影响:CLSM观察EXO-DVDMS经超声处理后细胞水平的药物释放行为。结果显示:①低pH及超声可以触发EXO-DVDMS中DVDMS的药物释放;②EXO-DVDMS的加入可在一定范围内以浓度依赖的方式提升体系内羟自由基的产量,说明EXO-DVDMS增强了超声空化作用;③超声处理对空白外泌体没有显着影响,但会造成EXO-DVDMS膜结构变化;④超声刺激可从细胞层面时空可控性触发EXO-DVDMS的胞内释药。4.EXO-DVDMS的细胞摄取和体外同源靶向性研究:通过FCM和CLSM检测EXO-DVDMS的细胞摄取情况。结果显示:①EXO-DVDMS与4T1细胞共孵育3小时即可在胞内观测到对EXO-DVDMS的摄取,共同孵育12小时后,高达98%左右的细胞均对药物进行了内化;②在血清存在条件下,相较于游离药物Free-DVDMS和脂质体药物Lipo-DVDMS,外泌体包装的EXO-DVDMS更容易被其同源肿瘤细胞摄取,其胞内荧光强度分别是Free-DVDMS及Lipo-DVDMS的1.62倍和1.44倍;③EXO-DVDMS在同源4T1细胞中的富集量是非同源细胞的1.81-2.35倍,初步从细胞水平证实EXO-DVDMS的具有同源肿瘤靶向性;④超声刺激可进一步提升细胞对于EXO-DVDMS的摄取,相较于Free-DVDMS,EXO-DVDMS联合超声处理对4T1细胞膜通透性的提升更为显着。5.EXO-DVDMS介导的SDT对乳腺癌细胞的体外杀伤效应:通过MTT,钙黄绿素/PI双染实验研究EXO-DVDMS介导的SDT对小鼠乳腺癌4T1细胞的存活率的影响;DCF及DHE探针联合荧光显微镜和FCM对EXO-DVDMS介导的SDT处理后胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）和超氧阴离子的产生进行定性及定量分析;CLSM观察超声处理对EXO-DVDMS的亚细胞定位的影响。结果显示:①相较于Free-DVDMS,EXO-DVDMS在相同参数下表现出更强的体外抗肿瘤作用,且EXO-DVDMS联合超声处理对肿瘤细胞的声动力杀伤效应具有明显的剂量依赖性;②EXO-DVDMS联合超声处理后,包括超氧阴离子在内的胞内ROS水平显着高于Free-DVDMS-SDT组;③EXO-DVDMS在被细胞摄取初期首先定位于溶酶体,随后在超声刺激下其细胞定位发生了一定程度的改变,与溶酶体共定位现象减弱,而与线粒体共定位现象增强。表明外加超声作用联合溶酶体低pH条件共同刺激DVDMS从外泌体膜上及腔内分离释放和胞内转运。6.引导超声作用下EXO-DVDMS的体内代谢及同源肿瘤靶向性研究:尾静脉注射EXO-DVDMS和Free-DVDMS后,利用全波长荧光酶标仪测定EXO-DVDMS和Free-DVDMS在小鼠体内的长循环性能;建立小鼠背部单侧、双侧同种、双侧异种荷瘤模型,采用小动物活体成像系统研究EXO-DVDMS的体内富集代谢规律及同源肿瘤靶向能力;采用小鼠背部双侧肿瘤模型,尾静脉给药后,对一侧移植瘤进行超声处理,小动物活体成像系统观察引导超声（1.0 MHz,2W,3 min超声处理+MBs,US1）处理对EXO-DVDMS在肿瘤中富集量的影响;对引导超声处理后肿瘤进行连续冰冻切片,荧光体视显微镜观察肿瘤组织中EXO-DVDMS的分布情况。结果显示:①EXO-DVDMS有效提升了 DVDMS在体内的长循环性能;②EXO-DVDMS在4T1肿瘤的富集量分别是非同源CT26肿瘤中的2.17倍以及非同源B-EXO-DVDMS的2.04倍,初步在在体水平证实EXO-DVDMS具有同源肿瘤靶向性;③超声侧肿瘤中DVDMS的平均光量子强度约为未超声侧肿瘤的2.05倍,同时,US1处理后,肿瘤组织中EXO-DVDMS的渗透深度和分布均匀性都有显着提升;④EXO-DVDMS给药组肿瘤组织中DVDMS平均光量子强度约为Free-DVDMS组的3.22倍。以上结果表明,EXO-DVDMS联合US1处理显着改善了 DVDMS的生物分布、肿瘤积累和体内成像能力。7.多级超声联合EXO-DVDMS-SDT对乳腺癌杀伤作用的在体研究:实验利用4T1移植瘤模型,从在体水平通过对肿瘤生长情况,肿瘤转移情况的研究,分析引导超声协同治疗超声作用下EXO-DVDMS声动力抗肿瘤效果,并对整个治疗的安全性进行了初步评估。结果显示:①EXO-DVDMS联合US1+US2能够显着增效DVDMS-SDT对小鼠乳腺癌4T1移植瘤的治疗效果,H&E染色结果显示出EXO-DVDMS联合US1+US2可以造成肿瘤组织更大程度的损伤,肿瘤组织内TUNEL染色阳性率显着升高,PCNA表达量显着降低,说明该处理模式可显着诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖;②EXO-DVDMS联合US1+US2处理组小鼠肺结节显着减少,肺部H&E染色显示肺组织结构趋于正常,肿瘤组织内MMP-9显着下调,说明该处理可显着降低肿瘤肺转移情况;③EXO-DVDMS联合多级超声处理对小鼠体重和主要脏器无明显影响,初步证实这一治疗模式具有较高的安全性。研究结论:本研究通过将天然纳米囊泡引入SDT治疗领域,创新性的采用肿瘤同源外泌体装载兼具成像与治疗功能的卟啉二聚体钠盐DVDMS,构建了具有同源肿瘤寻靶能力的新型内源性纳米声敏剂（EXO-DVDMS）。外泌体的包装成为DVDMS进入生物体的“隐形衣”和“保护伞”,有效避免了模拟生理条件下低pH和非特异性蛋白结合对DVDMS理化性质的影响,极大提升了 DVDMS的光谱稳定性和ROS产量。EXO-DVDMS在超声刺激下可以实现时空性的响应性药物释放,可作为新型超声响应型递药系统。论文所探索的外源超声引导结合内源外泌体同源靶向的双重靶向模式,有效改善了因肿瘤异质性及生理病理屏障带来的EPR作用效果不足的问题,提升了 DVDMS的生物分布、肿瘤积累和体内成像能力。在多级超声治疗与EXO-DVDMS的联合作用下,有效抑制了同源肿瘤的生长和转移,实现了高效、安全性、个性化的SDT治疗。
杨安强[5]（2019）在《长链非编码RNA PVT1通过EZH2调节胶质瘤细胞的增殖和迁移机制研究》文中研究指明一、研究背景和目的胶质瘤是成人最常见的脑内原发性肿瘤,约占中枢神经系统肿瘤的50%左右,目前手术、放疗、化疗是脑胶质瘤治疗的主要途径,但接受治疗的病人预后较差。长链非编码RNA（long non-coding RNA,LncRNA）,顾名思义就是不能编码蛋白质的一类RNA,其转录副本超过200个核苷酸长度。研究表明LncRNA在人类多种肿瘤性疾病中起着至关重要的作用。有证据表明LncRNA的表达与神经发育、神经退行性和免疫性疾病,精神疾病、原发性脑肿瘤、神经肿瘤等存在密切的联系。在成人原发性脑肿瘤中恶性程度最高、预后最差的胶质瘤,已有大量研究揭示LncRNA与其发病机制、转移、侵袭及其预后情况等均存在一定的关系,已然成为近年来胶质瘤研究的热点和难点。在研究中,可以通过多种途径研究LncRNA对组织和细胞的进行调节,比如使用siRNA沉默LncRNA;反义序列降解LncRNA;相应的酶直接裂解LncRNA等。Liang Ying等人通过siRNA转染实验,下调LncRNA-PVT1表达水平,发现膀胱癌细胞的增殖能力降低。通过siRNA下调胃癌细胞LncRNA-PVT1表达水平可使细胞增殖能力下降,过表达LncRNA-PVT13会升高细胞的增殖能力。我们课题组前期研究结合前人的研究发现,临床胶质瘤组织样本和多种胶质瘤细胞系中,LncRNA-PVT1呈现高表达,且其表达水平与胶质瘤细胞的严重程度具有一定的正相关性。基于此,本研究从体内和体外水平上,通过PVT1沉默和过表达转染,人为调节PVT1表达,研究胶质瘤细胞的增殖和迁移变化,并深入了解PVT1和EZH2两者之间的相互关系,为胶质瘤的治疗奠定实验室基础。二、方法PVT1/EZH2与胶质瘤预后相关性研究:1、临床样本取材和细胞培养标本取自东部战区总医院神经外科,2001年1月至2009年6月,共80例,经过病理证实的原发性胶质瘤标本。临床标本采集后,立即放于液氮中速冻,然后转移至-80℃冰箱贮存。按照WHO（2000年）胶质瘤分级标准,胶质瘤分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级,每级20例。通过颅脑外伤后脑肿胀致脑疝形成后进行的颅内减压手术等获得正常脑组织标本,共10例,作为正常对照组。正常脑组织HEB细胞、HS683细胞、T98MG细胞、U373细胞、SHG44细胞、A172细胞、U251细胞和U87MG细胞购于上海细胞库,使用10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养,37℃ 5%CO2培养箱中。2、qRT-PCR检测PVT1和EZH2基因的表达水平分别对正常脑组织、WHOⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级、正常脑组织、HEB细胞、HS683细胞（相当于WHOⅡ级）,T98MG细胞（相当于WHO Ⅱ级）,U373细胞（相当于WHO Ⅲ级）,SHG44细胞、A172细胞、U251细胞和U87MG细胞（四者属于胶质母细胞瘤,相当于WHO Ⅳ级）,进行qRT-PCR,检测Lnc PVT1和EZH2基因的表达水平。3、Log-rang（Mantel-Cox）法绘制生存曲线对纳入研究的80例临床人脑胶质瘤患者进行了后续随访,随访共80个月,观察生存期,计算总体生存率,并绘制Log-rang（Mantel-Cox）生存曲线。4、Western blot检测EZH2蛋白的表达水平分别取8例正常脑组织、WHOⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤组织、正常脑组织、HEB细胞、HS683细胞（相当于WHO Ⅱ级）,T98MG细胞（相当于WHO Ⅱ级）,U373细胞（相当于WHO Ⅲ级）,SHG44细胞、A172细胞、U251细胞和U87MG细胞（四者属于胶质母细胞瘤,相当于WHO Ⅳ级）,进行Western blot分析,检测EZH2蛋白的表达水平。5、免疫荧光检测胶质瘤组织中EZH2蛋白的表达水平分别取8例正常脑组织、WHO Ⅰ级、WHOⅡ级、WHO Ⅲ级、WHO Ⅳ级胶质瘤组织,进行EZH2蛋白的免疫荧光检测,计算EZH2阳性细胞所占的比例。6、免疫荧光检测胶质瘤细胞系中EZH2蛋白的表达水平分别培养HEB细胞、HS683细胞、T98MG细胞、U251细胞和U87MG细胞,制备细胞爬片,进行EZH2蛋白的免疫荧光检测,计算EZH2阳性细胞所占的比例。体外研究实验:1、选择胶质母细胞瘤细胞系U87MG和U251进行体外实验2、分别合成siRNA-PVT1和过表达OEPVT1质粒,采用Lipofectamine2000,进行U87MG和U251细胞转染,设置沉默阴性对照组（Silence-NC组）和过表达阴性对照组（Over-NC组）。3、qRT-PCR和Western blot检测转染效率转染48h后,胰酶消化收集细胞,qRT-PCR检测Lnc PVT1和EZH2基因的表达水平,判定转染效率;Western blot检测EZH2蛋白的表达变化。4、MTT法检测细胞增殖活性分别于0h、24h、48h和72h时间点测定各组细胞吸光度值,绘制吸光度值曲线,比较各组细胞的增殖活性。5、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡转染48h后,胰酶消化收集细胞。进行Annexin V-FITC/PI双染,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率变化。6、PI单染流式细胞术检测细胞周期转染48h后,胰酶消化收集细胞。75%酒精固定过夜,进行PI染色,流式细胞仪检测各组细胞周期的变化,按照公式PI=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）,计算细胞增殖指数。7、Transwell法检测细胞迁移能力转染48h后,胰酶消化收集细胞。采用Transwell小室进行迁移能力的检测。8、Transwell法检测细胞侵袭能力转染48h后,胰酶消化收集细胞。采用Transwell小室进行迁移侵袭的检测。9、RNA免疫共沉淀检测PVT1与EZH2关系。体内研究实验:1、分别稳定转染U251细胞,筛选沉默和过表达的稳转细胞株。2、裸鼠成瘤实验取稳定转染的U251细胞株,选择6-8周龄BALB/c裸鼠,右侧近腋窝处皮下注射稳转细胞株,建立移植瘤模型。3、移植瘤生长速度测量每4天用游标卡尺测量肿瘤大小,并记录,按照公式:肿瘤体积（V）=（L×S2）/2,其中L为肿瘤最长径,S为肿瘤最短径,计算肿瘤体积。4、移植瘤重量称量当肿瘤生长至最长的直径为1.5厘米时,安乐处死裸鼠,切取肿瘤。分离黏连组织,称量肿瘤组织的重量,并记录。5、qRT-PCR检测移植瘤中凋亡相关蛋白表达提取各组移植瘤组织的RNA,进行qRT-PCR实验,分别检测PVT1,EZH2,Caspase3,Bax 和Bcl-2 mRNA表达水平。6、Western blot检测移植瘤中凋亡相关蛋白表达提取各组移植瘤组织的总蛋白,进行Western blot实验,分别检测PVT1,EZH2,Caspase3,Bax和Bcl-2蛋白表达水平。7、TUNEL检测移植瘤组织凋亡取各组移植瘤组织,进行TUNEL实验,分析各组移植瘤的总体凋亡情况。8、免疫组化检测移植瘤PCNA蛋白表达取各组移植瘤组织,进行PCNA的免疫组化实验,分析各组移植瘤的PCNA蛋白阳性表达率。统计学方法使用SPSS17.0软件统计学处理,正常脑组织与胶质瘤组织中Lnc PVT1和EZH2表达水平的比较利用Paired Wilcoxon test。用Log-rang（Mantel-Cox）法绘制两组病人生存曲线,两组曲线的比较利用log-rank方法检验差异有无统计学意义。所有数据均以均数±标准差（x±s）表示,多组间比较采用单因素方差分析（One Way ANOVA）,两两比较采用Dunnett-t法或S-N-K法,以P<0.05表示差异有统计学意义。三、结果胶质瘤临床样本1、qRT-PCR实验结果表明,与正常组脑组织比较,随着胶质瘤级别的增加,PVT1表达水平呈现升高的趋势,与胶质瘤恶性程度呈现正相关性。与正常脑细胞HEB细胞相比,HS683,T98MG,U373,SHG44、A172、U251 和U87MG,PVT1基因表达均有显着性差异,PVT1蛋白表达水平与胶质瘤恶性程度也呈现正相关性。2、qRT-PCR和Western blot实验结果表明,与正常脑组织比较,随着胶质瘤级别的增加,EZH2表达水平呈现升高的趋势,与胶质瘤恶性程度呈现正相关性。在胶质瘤细胞系中,与正常HEB细胞相比,HS683,T98MG,U373,SHG44、A172、U251和U87MG,EZH2基因表达均有显着性差异,与胶质瘤恶性程度也呈现正相关性。3、根据PVT1 mRNA表达水平（低:<3,n= 18;中:3-6,n= 19;高:>6,n= 34）将胶质瘤患者分成三组,然后进行Log-rang（Mantel-Cox）分析。结果显示高PVT1表达的中位生存时间为9.5个月,而中等PVT1表达的中位生存时间为25个月,而低PVT1表达的中位生存时间为58个月。根据EZH2 mRNA表达水平（低:<2,n=16;中等:2-4,n= 17;高:>4,n=38）将患者分成三组,然后进行Log-rang（Mantel-Cox）分析。结果显示高EZH2表达的中位生存时间为10.4个月,而中等EZH2表达的中位生存时间为28个月,而低EZH2表达的中位生存时间为57.6个月。临床结果说明Lnc PVT1和EZH2表达水平与胶质瘤患者的生存结果具有一定的相关性,Lnc PVT1和EZH2表达水平越高,胶质瘤患者的生存时间越短。4、免疫荧光染色结果显示,胶质瘤组织中,EZH2蛋白表达于细胞核上。与正常脑组织相比,胶质瘤中EZH2蛋白表达水平明显上调;随着胶质瘤恶性程度的增加,EZH2阳性表达率显着性升高,即EZH2表达水平与胶质瘤恶性程度呈现正相关性,恶性程度越高,EZH2表达水平越高。5、免疫荧光染色结果显示,胶质瘤细胞系中,EZH2蛋白表达于细胞核上。与正常脑细胞HEB细胞相比,胶质瘤细胞系中EZH2蛋白表达水平明显上调;随着胶质瘤恶性程度的增加,EZH2阳性表达率显着性升高,即EZH2表达水平与胶质瘤恶性程度呈现正相关性,恶性程度越高,EZH2表达水平越高。体外研究结果:1、qRT-PCR和Western blot实验结果显示,与NC阴性组比较,转染PVT1-siRNA可显着降低PVT1的表达（P<0.05）,转染OEPVT1可显着升高PVT1表达（P<0.05）,表明PVT1-siRNA和OEPVT1转染效率较高,可用于后续实验。2、MTT法检测各组细胞活性与对照组比较,转染PVT1-siRNA组细胞的增殖活性显着下降,过表达OEPVT1组与其对照组比较,细胞活性显着性升高,数据具有统计学意义（P<0.05）。3、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞凋亡U87MG细胞沉默组凋亡率为（38.26±1.53）%,对照组为（1.53±0.63）%,U251细胞沉默组凋亡率为（31.46±2.15）,对照组为（1.97±0.68）%。;与对照组比较,沉默组U87MG和U251细胞凋亡率显着性下降（P<0.05）,而过表达组未观察到明显的细胞凋亡率变化(图2-4,P>0.05。4、PI流式细胞周期与Silence-NC对照组相比,U87MG沉默组细胞G0/G1期百分比增加,S+G2/M期百分比降低,表现为细胞增殖指数PI由对照组的0.40±0.08下降为沉默组的0.27±0.07（P<0.05）。U251细胞也表现G0/G1期百分比增加,S+G2/M期百分比降低,细胞增殖指数PI下降。与Over-NC对照组相比,U87MG过表达组细胞G0/G1期百分比下降,S+G2/M期百分比升高,表现为细胞增殖指数PI由对照组的0.41 ± 0.09升高为过表达组的0.58± 0.10（P<0.05）。U251细胞也表现G0/G1期百分比降低,S+G2/M期百分比升高,细胞增殖指数PI升高（P<0.05）。5、Transwell侵袭能力对3个视野观察并计数的结果显示,沉默PVT1组U87MG和U251细胞中发生侵袭的细胞数量分别为41.23±4.06和31.33±4.28,过表达组分别为175.00±8.52和184.67±7.77,与对照组相比,沉默PVT1组细胞的侵袭数量明显降低,过表达PVT1组细胞的侵袭数量明显升高,差异均有统计学意义（P<0.05）6、Transwell迁移能力对3个视野观察并计数的结果显示,沉默PVT1组U87MG和U251细胞中发生迁移的细胞数量分别为101.23±4.25和91.33±4.08,过表达组分别为195.00±9.52和204.67±9.87,与对照组相比,沉默PVT1组细胞的迁移数量明显降低,过表达PVT1组细胞的迁移数量明显升高,差异均有统计学意义（P<0.05）。7、PVT1与EZH2的调控关系RNA免疫共沉淀（RIP）表明,与IgG组比较,anti-EZH2组PVT1 的表达量超过total RNA组50%,anti-EZH2组PVT1 表达量显着高于IgG组,说明PVT1可与EZH2蛋白特异并紧密结合。RIP实验表明PVT1通过绑定并结合EZH2,发挥其生物学功能。体内研究结果:1、移植瘤体积变化Silence及其Silence-NC组U251细胞注射进入裸鼠体内,待成瘤后（8天）,每四天用游标卡尺测定一次肿瘤的长度和宽度。与Silence-NC组相比,Silence组移植瘤体积显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）;Over及其Over-NC组U251细胞注射进入裸鼠体内,待成瘤后（4天）,每四天用游标卡尺测定一次肿瘤的长度和宽度。与Over-NC组相比,Over组移植瘤体积显着升高,差异有统计学意义（P<0.05）。2、移植瘤重量Silence及其Silence-NC组U251细胞注射进入裸鼠体内28天后,分离肿瘤组织;Over及其Over-NC组U251细胞注射进入裸鼠体内20天后,分离肿瘤组织。与Silence-NC（1.03±0.095）组相比,Silence组（0.664± 0.148）移植瘤重量显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）;与Over-NC组（1.024±0.113）相比,Over组（1.71±0.269）移植瘤重量显着升高,差异有统计学意义（P<0.05）。3、qRT-PCR 实验分析U251 移植瘤样本中EZH2,Caspase3,Bax 和Bcl-2的基因表达与Silence-NC组比较,沉默PVT1基因后,伴随着EZH2基因表达量的降低;引起促凋亡蛋白caspase3和Bax mRNA表达水平的显着性升高（P<0.05）,抑凋亡蛋白Bcl-2 mRNA表达水平的显着性降低（P<0.05）。与Over-NC组比较,过表达PVT1基因后,伴随着EZH2基因表达量的升高;引起促凋亡蛋白caspase3和Bax mRNA表达水平的显着性降低（P<0.05）,抑凋亡蛋白Bcl-2 mRNA表达水平的显着性升高（P<0.05）。差异具有统计学意义。4、Western blot实验分析U251移植瘤样本中EZH2,Caspase3,Bax和Bcl-2的蛋白表达与Silence-NC组比较,沉默PVT1基因后,伴随着EZH2蛋白表达量的降低;引起促凋亡蛋白caspase3和Bax蛋白表达水平的显着性升高（P<0.05）,抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达水平的显着性降低（P<0.05）。与Over-NC组比较,过表达PVT1基因后,伴随着EZH2蛋白表达量的升高;引起促凋亡蛋白caspase3和Bax蛋白表达水平的显着性降低（P<0.05）,抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达水平的显着性升高（P<0.05）。差异具有统计学意义。5、TUNEL实验分析移植瘤总体凋亡情况TUNEL结果显示,与Silence-NC对照组（1.23±0.21%）相比,Silence组（12.64±1.24%）移植瘤的凋亡指数明显升高,差异具有显着性差异（P<0.05）;与Over-NC对照组（1.33±0.25%）相比,Over组（1.26±0.24%）移植瘤的凋亡指数没有明显变化,没有显着性差异（P>0.05）。6、免疫组化实验分析PCNA蛋白表达结果显示,PCVA蛋白表达与细胞核上,呈现弥散状或颗粒状表达。与Silence-NC对照组（30.2 ± 2.6%）相比,Silence组（12.6±2.24%）移植瘤的PCNA阳性率明显降低,差异具有显着性差异（P<0.05）;与Over-NC对照组（32.5±4.6%）相比,Over组（62.5±5.4%）移植瘤的PCNA阳性率明显升高,具有显着性差异（P<0.05）。四、结论1.在胶质瘤组织及其细胞系中,长链非编码RNAPVT1和EZH2均高表达,其表达水平与胶质瘤恶性程度呈现正相关性。2.长链非编码RNA PVT1通过靶向调节EZH2蛋白的表达调节胶质瘤细胞的增殖和迁移。
王海英[6]（2019）在《Kpnβ1在非小细胞肺癌中的表达及其作用机制研究》文中指出第一部分 Kpnβ1在非小细胞肺癌中的表达及临床意义目的:研究Kpnβ1在非小细胞肺癌中的表达及与预后的关系,探索Kpnβ1作为潜在靶点在非小细胞肺癌检测中应用的可能性。方法:收集154例组织标本,其中包括8例新鲜NSCLC患者的癌组织及癌旁组织和146例NSCLC蜡块组织及相对应癌旁组织。运用Western Blot方法检测新鲜NSCLC及癌旁组织中Kpnβ1及PCNA蛋白的表达。将146蜡块组织及相对应的癌旁组织进行免疫组化染色,检测石蜡组织切片中Kpnβ1蛋白的表达情况,并统计学分析Kpnβ1的表达与146例NSCLC患者临床病理参数之间的关系,分别使用COX多因素分析及Kaplan-Meier生存曲线分析Kpnβ1蛋白的表达与患者预后之间的关系。结果:（1）Kpnβ31蛋白在新鲜NSCLC组织中的表达较癌旁组织明显增高,差异有统计学意义（P<0.05）;同时Western Blot结果还提示新鲜NSCLC中PCNA蛋白的表达较癌旁组织中也明显增高,与Kpnβ1蛋白表达趋势一致。（2）免疫组化结果显示:Kpnβ1及Ki-67蛋白主要表达于细胞核,阳性表达呈黄色或者棕黄色。Kpnβ1及Ki-67在NSCLC组织中的阳性表达均明显高于正常肺组织,且与NSCLC的分化程度有关,分化程度越低标本中Kpnβ1及Ki-67蛋白的表达较多。（3）统计学分析结果显示:Kpnβ1高表达与患者年龄（p=0.038<0.05）、临床分期（p<0.001）、组织分化程度（p=0.017<0.05）、肿瘤大小（p=0.028<0.05）、淋巴结是否转移（p<0.001）,以及Ki-67的表达高低（p=0.013<0.05）相关,差异有统计学意义。而与患者的性别、组织学分型与吸烟状况无明显关系（P>0.05）。在多因素分析中,Kpnβ1 蛋白的高表达（HR,1.911,95%CI.1.015-3.598;P=0.045）和组织分化程度（HR,3.226,95%CI,2.026-5.136;P<0.001）是影响 NSCLC 预后的独立因素,Kaplan-Meier生存曲线提示Kpnβ1高表达组较Kpnβ1低表达组生存率差,差异有统计学意义（P<0.001）。结论:Kpnβ1蛋白在NSCLC组织中呈高表达,并与患者年龄、临床分期、组织分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、以及Ki-67的表达密切相关;Kpnβ1高表达较低表达的患者预后差,是影响NSCLC预后的独立因素。第二部分 Kpnβ1通过PI3K/AKT通路对非小细胞肺癌增殖能力的影响目的:通过运用分子生物学方法检测沉默Kpnβ1基因后肺癌细胞增殖能力和对顺铂敏感性的变化情况,及对PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响。探讨Kpnβ1通过PI3K/AKT信号通路影响NSCLC生物学特性的可能机制。方法:Western blot方法检测Kpnβ1蛋白在NSCLC细胞株（A549,H1299与SPCA-1）中的表达,Kpnβ1蛋白在A549细胞株表达最高,然后用流式细胞仪检测细胞的周期变化;同时,使用Western Blot方法检测Kpnβ1、PCNA和Cyclin D1蛋白在细胞不同周期时相的表达情况。用Kpnβ1的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）敲低A549细胞内的Kpnβ1表达,随后用CCK-8、平板克隆形成试验与5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷试剂盒（5’ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU）检测下调Kpnβ1基因后A549细胞增殖能力的改变;流式细胞仪检测下调Kpnβ1基因对A549细胞周期进程的影响。此外,本研究通过CCK-8方法检测了 Kpnβ1基因沉默后A549细胞对CDDP敏感性的改变。并通过Western Blot方法进一步验证Kpnβ1沉默及顺铂处理后Kpnβ1蛋白、PI3K,p-AKT（Ser473）和p-AKT（Thr308）蛋白的表达以及细胞凋亡指标cleaved-parp表达情况。结果:（1）Kpnβ1蛋白在A549、H1299及SPCA-1中均有表达,而在A549中的表达高于另外两株细胞系,因此,我们选取A549细胞用于后续实验。（2）对A549细胞进行流式细胞仪检测发现,A549细胞在血清饥饿培养时,细胞增殖能力明显受到抑制,细胞周期被阻滞在G0/G1期;恢复血清供应培养后,细胞增殖能力恢复,由G0/G1期进入S期,G0/G1期比例由72.32%下降至35.08%,S期细胞由22.55%增加至56.62%;同时,血清饥饿后,Kpnβ1表达水平明显降低,恢复血清供应培养后,Kpnβ1的表达随细胞增殖力升高也逐渐升高,在48h达到高峰;Kpnβ1的表达与Cyclin D1及PCNA的趋势一致;而干扰Kpnβ1基因后,Cyclin A2、Cyclin D1以及PCNA的表达较对照组则明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）CCK8方法、平板克隆实验及EdU试剂盒检测均发现Kpnβ1表达下调后,与对照组相比,干扰组细胞增殖能力明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）流式细胞检测发现Kpnβ1基因沉默后A549细胞G0/G1期细胞增加（从65.31%至77.77%）,S期细胞减少（从25.99%至17.94%）,差异有统计学意义（P<0.05）。（5）顺铂敏感性检测结果发现,经不同浓度顺铂处理后,Kpnβ1基因干扰组和对照组细胞增殖力均有下降,以Kpnβ1干扰组下降最明显,且与CDDP剂量呈正相关,在CDDP20 μmol/L浓度时最明显,差异有统计学意义（P<0.05）。（6）Kpnβ1沉默后 PI3K/AKT通路相关蛋白 PI3K,p-AKT（Ser473）,p-AKT（Thr308）和PCNA的表达水平较对照组均明显降低。（7）为进一步探讨Kpnβ1基因与顺铂的协调作用,用Western Blot检测用Kpnβ1干扰与顺铂处理后,PI3K,p-AKT（Ser473）and p-AKT（Thr308）蛋白的表达变化,结果显示:Kpnβ1基因沉默组、顺铂处理组及Kpnβ1基因沉默联合顺铂处理组的PI3K,p-AKT（Ser473）和p-AKT（Thr308）蛋白表达与对照组相比均明显降低,其中以Kpnβ1-shRNA联合CDDP处理组各蛋白表达降低最明显。此外,与对照组相比其他三组细胞凋亡指标cleaved-parp表达均增高,以两者联合组cleaved-parp表达增高最明显。结论:沉默Kpnβ1基因能够抑制NSCLC细胞增殖,增加NSCLC细胞对CDDP的敏感性;Kpnβ1可能通过调控PI3K/AKT信号通路发挥其作用。本研究探讨了 Kpnβ1在非小细胞肺癌中的表达及其可能的作用机制,为进一步应用于临床提供实验室基础及理论依据。
王栋良[7]（2017）在《鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤细胞生长的实验研究及机制探讨》文中进行了进一步梳理第一部分鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤U87和U118细胞生长的现象观察目的:探讨鞣花酸（Ellagic acid,EA）对人脑胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme,GBM）细胞U87、U118细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。方法:应用CCK-8法检测EA对U87、U118细胞活性的影响;应用克隆形成实验、EdU实验检测EA对U87、U118细胞增殖能力的影响;应用流式细胞术检测EA对U87、U118细胞周期的影响;应用流式细胞术、Hoechst33342/PI双染法检测EA对U87、U118细胞凋亡的影响;应用细胞划痕实验观察EA对U87、U118细胞迁移能力的影响;应用Transwell assay实验观察EA对U87、U118细胞侵袭能力的影响;结果:EA可以抑制人脑GBM细胞U87、U118的细胞活性,其抑制作用呈浓度、时间依赖性,EA处理瘤细胞48h后,U87、U118细胞的IC50分别为91.2μM、98.6μM。克隆形成实验中,经EA处理的瘤细胞克隆形成数明显低于对照组（P<0.05）,说明EA能有效抑制U87、U118细胞的增殖。EdU实验中,经EA处理的U87、U118细胞的增殖能力大大减弱。流式细胞术检测细胞周期发现,经100μM的EA处理48h后,U87细胞和U118细胞处于细胞周期S期的细胞数分别增加10.89%、11.54%,而处于G1期、G2/M期的细胞数明显减少,差异显着（P<0.05）,说明EA干扰U87、U118细胞的细胞周期进程,使细胞周期阻滞在S期。流式细胞术凋亡检测表明,经100μM的EA处理瘤细胞48h后,U87、U118 细胞的凋亡率分别从（7.58±1.13）%、（9.33±0.27）%上升到（23.49±0.64）%、（19.84±1.06）%,说明 EA 诱导 GBMU87、U118 细胞凋亡。Hoechst33342/PI双染实验发现,EA处理组出现大量呈凋亡形态的细胞。细胞划痕实验中,U87细胞的对照组、50μM的EA处理组划痕的愈合率分别为（51.69±0.29）%,（31.82±0.44）%;U118细胞的对照组、50μM的EA处理组划痕的愈合率分别为（49.75±0.64）%,（29.82±0.69）%;差异显着（p<0.05）,说明 EA 能有效抑制GBMU87、U118细胞的迁移。Transwell侵袭实验中,U87细胞的对照组、l00μM的EA处理组透膜细胞数分别为（82±3）个、（31±1）个;U118细胞的对照组、100μM的EA处理组透膜细胞数分别为（97±6）个、（50±4）个;说明EA能有效抑制GBMU87、U118细胞的侵袭。结论:EA能抑制GBMU87、U118细胞的增殖,促进其凋亡,抑制其侵袭。第二部分鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤U87和U118细胞生长的机制初探目的:探讨鞣花酸（Ellagic acid,EA）抑制胶质母细胞瘤（Glioblastomamultifore,GBM）U87、U118细胞增殖,促进其凋亡,抑制其侵袭的分子机制。方法:应用免疫荧光化学检测对照组和实验组细胞的DNA双链断裂情况;应用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒检测EA对GBMU87、U118细胞线粒体膜电位的影响;应用明胶酶谱实验检测EA对GBMU87、U118细胞中MMP-9、MMP-2活性的影响;应用Western blot检测EA对GBMU87、U118细胞增殖、凋亡、侵袭等相关基因表达水平的影响。结果:EA通过损伤GBM U87、U118细胞的DNA引起细胞周期阻滞,进而抑制细胞增殖。EA能引起GBMU87、U118细胞的线粒体膜电位下降,导致细胞凋亡。明胶酶谱实验中,100μM的EA处理瘤细胞24h后,U87细胞MMP-9、MMP-2 的活性水平分别下降（78.31±2.53）%、（32.48±1..37）%;U118 细胞 MMP-9、MMP-2 的活性水平分别下降（60.94±4.47）%、（8.99±1.02）%;差异显着（p<0.05）,说明EA能抑制GBMU87、U118细胞MMP-9、MMP-2的活性。增殖相关基因Western blot 结果显示,实验组细胞中 PCNA、Ki67、CyclinA2、Cyclin D1、CDK-2、CDK-6的表达下调;凋亡相关基因Western blot结果显示,实验组细胞中Bcl-2的表达下调,而 Cleaved PARP、Bax、Active Caspase-3、DR4、DR5 的表达上调;侵袭相关基因Western blot结果显示,实验组细胞E-Cadherin的表达上调,而Snail、MMP-2、MMP-9的表达下调。而且实验组细胞Akt、p-Akt、Notch1、Notch3的表达下调。结论:EA抑制GBMU87、U118细胞的生长,其可能的分子机制是EA通过调控Akt、Notch信号通路而调节细胞的增殖、凋亡、侵袭等相关基因的表达。第三部分 鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤细胞生长的体内实验研究目的:观察鞣花酸（Ellagic acid,EA）抑制胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme,GBM）U87细胞异体移植瘤生长的现象,探讨其机制,并评估EA的不良反应。方法:将GBMU87细胞悬液接种在Balb/c裸鼠皮下成瘤,约2周后取出,切碎后二次接种成瘤,造模成功后随机分组,实验组进行EA灌胃,对照组用生理盐水灌胃。观察EA对移植瘤、小鼠体重的影响;对移植瘤行HE染色、免疫组化染色等病理学分析,检测增殖、凋亡、侵袭相关基因的表达水平;同时解剖荷瘤小鼠观察其内脏情况,并进行血常规、肝肾功、心肌酶等血液学分析。结果:EA能明显抑制移植瘤的生长,平均抑制率为37.40%,与对照组相比,差异显着（P<0.05）。HE染色发现实验组肿瘤组织中出现坏死灶、炎性反应减轻、病理性核分裂减少等现象。免疫组化染色发现,实验组肿瘤组织中增殖相关基因PCNA、Ki67、CyclinA2、CyclinD1、CDK-2、CDK-6 的表达下调;凋亡相关基因 Cleaved PARP、Bax、Active Caspase-3、DR4、DR5 的表达上调,而 Bcl-2 的表达下调;侵袭相关基因E-Cadherin的表达上调,而Snail、MMP-2、MMP-9的表达下调。同时实验组肿瘤组织中Akt、p-Akt、Notch1、Notch3的表达下调。实验组和对照组荷瘤小鼠的体重无明显差异;实验组荷瘤小鼠的内脏形态及血液学指标无明显异常。结论:EA通过调节Akt、Notch信号通路抑制U87细胞异体移植瘤的生长,未出现明显的不良反应。
张建东[8]（2016）在《NME4、Bnip3L、HKDC1在新诊断幕上胶质母细胞瘤中的表达及其与预后的关系》文中认为第一部分:NME4在新诊断幕上胶质母细胞瘤中的表达及其与预后的关系肿瘤转移抑制蛋白4（Non-metastatic cells 4 protein,NME4）在胶质母细胞瘤（GB）的发生与发展过程中起着关键作用。然而,NME4蛋白在胶质母细胞瘤肿瘤细胞中的表达方式及情况以及其是否与肿瘤患者的临床预后有关现今仍有争议。因此,通过检测NME4蛋白在胶质母细胞瘤肿瘤组织细胞中的表达情况及模式,讨论NME4蛋白与胶质母细胞瘤肿瘤患者预后之间的关系。搜集70例新近诊断的幕上脑胶质母细胞瘤肿瘤患者的肿瘤组织标本,然后,通过使用免疫组化技术来检测肿瘤组织标本中NME4蛋白的表达情况及模式,通过K-M曲线以及COX比例风险回归模型来评价肿瘤组织标本中NME4蛋白表达情况对肿瘤患者无进展生存期（PFS）和总体生存期（OS）的影响。相对于无NME4蛋白表达的胶质母细胞瘤患者正常脑组织,实验结果显示胶质母细胞瘤肿瘤组织提高了NME4的表达。NME4蛋白的表达情况与肿瘤患者的年龄（P=0.467）、性别（P=0.206）以及患者术前Karnofsky功能评分（KPS）（P=0.131）并无很大的关系。而单因素分析则表明NME4蛋白高表达和肿瘤患者短的PFS（P<0.001）以及OS（P<0.001）有较大的关系;多因素分析确认NME4蛋白高表达与短的PFS和OS有关,并与患者KPS、年龄和放化疗无关。胶质母细胞瘤肿瘤细胞中高表达的NME4蛋白是导致胶质母细胞瘤患者预后较差的一个独立因素,说明NME4蛋白可能成为胶质母细胞瘤肿瘤患者的一个有希望的治疗靶点。第二部分:Bnip3L在新诊断幕上胶质母细胞瘤中的表达及其与预后的关系类Bcl-2/E1B19k Da交互作用蛋白3样蛋白（Bcl-2/E1B19k Da-inteareting Protein 3-like,Bnip3L）在胶质母细胞瘤（GBM）的发生与进展过程中起重要作用。但是,胶质母细胞瘤肿瘤组织细胞中Bnip3L蛋白的表达情况以及其与患者预后的关系现今仍未知。本实验通过检测Bnip3L蛋白在胶质母细胞瘤肿瘤组织中的表达情况及模式,判断Bnip3L和胶质母细胞瘤患者预后之间的关系。搜集70例胶质母细胞瘤肿瘤患者的肿瘤及正常脑组织标本,通过使用免疫组化方法分析Bnip3L蛋白的表达情况及模式,使用统计学方法分析Bnip3L蛋白与患者无进展生存期（PFS）及总体生存期（OS）之间的关系。相比于无Bnip3L蛋白表达的胶质母细胞瘤正常脑细胞,实验结果表明,胶质母细胞瘤肿瘤组织提高了Bnip3L的表达。Bnip3L蛋白的表达情况与肿瘤患者的年龄（P=0.257）、性别（P=0.314）和术前Karnofsky功能评分（KPS）（P=0.158）无较大关系。而单因素分析则表明高表达的Bnip3L蛋白与患者短的PFS（P<0.001）以及OS（P<0.001）有较大相关;且多因素分析确认高表达Bnip3L是导致患者出现短的PFS和OS的一个预后因素,和患者KPS、年龄和放化疗无关。Bnip3L蛋白高表达是影响胶质母细胞瘤患者预后的一个独立因素,显示Bnip3L蛋白可能是肿瘤细胞中的一个非常有意义的治疗靶点。第三部分:HKDC1在新诊断幕上胶质母细胞瘤中的表达及其与预后的关系己糖激酶结构域蛋白1（Hexokinase domain-containing protein 1,HKDC1）在胶质母细胞瘤（WHOIV,GBM）的肿瘤发生与肿瘤进展中起重要作用。然而,HKDC1蛋白在肿瘤细胞中的表达情况及模式以及其与肿瘤预后的关系现今仍未明晰。因此,通过分析胶质母细胞瘤肿瘤组织中HKDC1蛋白的表达情况及模式,研究HKDC1蛋白与肿瘤患者预后之间的关系。搜集70例胶质母细胞瘤肿瘤标本,通过免疫组化方法分析HKDC1蛋白的表达模式及情况,使用统计学方法分析HKDC1蛋白和患者无进展生存期（PFS）以及总体生存期（OS）之间的关系。相比于无HKDC1蛋白表达的正常脑组织,结果显示,胶质母细胞瘤肿瘤组织提高了HKDC1的表达。肿瘤组织细胞中HKDC1蛋白的表达情况和患者的年龄（P=0.332）、性别（P=0.417）以及术前Karnofsky功能评分（KPS）（P=0.321）无较大的关系。而单因素分析则显示高表达的HKDC1蛋白与肿瘤患者较短的PFS（P=0.021）以及OS（P=0.002）有较大关系;且多因素分析确认高表达HKDC1是导致肿瘤患者较短的PFS和OS的一个预后因素,并与患者KPS、年龄和放化疗无关。表明肿瘤细胞中高表达的HKDC1蛋白作为影响胶质母细胞瘤患者预后的一个独立因素,可能成为胶质母细胞瘤患者的一个非常有意义的治疗靶点。
李小宇[9]（2012）在《人鼻咽癌放射抗拒移植瘤模型的建立及放射抗拒相关蛋白的研究》文中研究表明【研究背景和目的】鼻咽癌是我国常见的恶性肿瘤之一，尤以华南地区发病率最高。由于鼻咽部解剖位置的特殊性以及鼻咽癌细胞对射线较敏感的特点，放射治疗是未转移鼻咽癌患者的首选治疗方式。同步放化疗提高了局部晚期鼻咽癌患者的生存时间，已经成为局部晚期鼻咽癌患者的标准治疗模式[1-2]。临床工作中，一些患者接受了足量的放化疗也出现复发，这通常是由于存在对放疗抗拒的细胞有关[5]。目前放射抗拒机理研究热点在于：对比亲本细胞及其诱导出来的放射抗拒细胞，以高通量实验方法筛选出差异表达基因或者蛋白，经过体外实验进一步验证。但相应的体内实验很少报道。目前已有报道诱导出人鼻咽癌放射抗拒细胞系CNE2R)，本课题组前期也已建立了人鼻咽癌放射抗拒细胞系CNE-2R)，但相应的动物实验模型尚未建立。肿瘤动物模型是研究肿瘤机理和肿瘤防治研究最有用的工具之一。BALB/c-nu裸小鼠先天性胸腺缺乏，适合移植瘤生长，因此裸鼠异种移植瘤模型是肿瘤研究中常用的模型。本研究将诱导出来的放射抗拒细胞移植到动物体内，建立裸鼠移植瘤模型，并用χ射线分次照射移植瘤以检验放射抗拒细胞在体内的放射抗拒性，为解决鼻咽癌放射抗拒问题提供较好的动物模型。本研究进一步探讨前期研究筛选出的几个差异表达蛋白（DEPs）：NPM1蛋白、Annexin A3蛋白和nm23-H1蛋白在不同放射敏感移植瘤组织中的表达，为解决鼻咽癌放射抗拒提供新的标志物，这对于临床上采取更有效的手段以提高鼻咽癌的治疗效果很有必要。【研究方法】1.将鼻咽癌放射抗拒细胞CNE-2R和人鼻咽癌亲本细胞CNE-2注射入裸鼠皮下，建立人鼻咽癌放射抗拒移植瘤模型和人鼻咽癌放射敏感移植瘤模型这一对比模型。2.观察移植瘤生长特性，以χ射线分次照射移植瘤，观察不同放射敏感性移植瘤受照射后生长情况。3.取出移植瘤进行病理学检测，光镜下观察移植瘤细胞形态。4.免疫组化法检测NPM1蛋白、Annexin A3蛋白和nm23-H1蛋白在不同放射敏感性移植瘤组织中的表达，比较其差异。【研究结果】1.建立了人鼻咽癌放射抗拒移植瘤模型（CNE-2R移植瘤）和人鼻咽癌放射敏感移植瘤模型（CNE-2移植瘤）。2.未受照射CNE-2R移植瘤生长速度慢于未受照射CNE-2移植瘤（P<0.01），移植瘤体积倍增时间分别为4.8天、3.9天；CNE-2R移植瘤生长受照射抑制不明显（P>0.05），而CNE-2移植瘤受照射生长明显受抑（P<0.05），移植瘤积倍倍增时间分别为6.2天、17.1天；CNE-2R移植瘤受照射后体积增长率大于CNE-2移植瘤（P<0.01）。3.移植瘤形态大体形态及病理学检查：肉眼见移植瘤呈卵圆形或不规则球形，有薄层假包膜，切面呈鱼肉状。光镜下可见未受照射CNE-2R移植瘤及未受照射CNE-2移植瘤大量坏死灶，受照射CNE-2R移植瘤细胞较少坏死。未坏死的CNE-2移植瘤细胞与CNE-2R移植瘤细胞形态光镜下无明显差别。移植瘤细胞呈巢状分布，呈多角形或卵圆形。核大深染，核圆形、卵圆形，胞浆丰富，可见病理核分裂。移植瘤细胞与人鼻咽低分化鳞癌细胞来源形态学特征一致。4. NPM1蛋白、Annexin A3蛋白在未受照射CNE-2R移植瘤中较在未受照射CNE-2移植瘤中明显低表达，P<0.01；nm23-H1蛋白则明显高表达，P<0.05。AnnexinA3蛋白在受照射CNE-2R移植瘤中较在受照射CNE-2移植瘤中表达明显下调，P<0.01；nm23-H1蛋白表达则明显上调，P<0.01；NPM1蛋白在受照射CNE-2R中较在受照射CNE-2移植瘤中表达稍上调，差异无明显统计学意义，P>0.05。【研究结论】1.成功建立了人鼻咽癌放射抗拒移植瘤模型。2.人鼻咽癌放射抗拒移植瘤生长速度较人鼻咽癌放射敏感移植瘤慢，生长受照射抑制不明显，提示鼻咽癌放射抗拒移植瘤可能通过减慢生长速度获得放射抗拒性。3. NPM1蛋白、Annexin A3蛋白在未受照射CNE-2R移植瘤中较在未受照射CNE-2移植瘤中明显低表达，nm23-H1蛋白明显高表达，与前期体外试验结论一致。提示NPM1蛋白、Annexin A3蛋白和nm23-H1蛋白与鼻咽癌放射抗拒有关，可能作为鼻咽癌放射抗拒新的标志物，但需要临床进一步验证。4. NPM1蛋白、nm23-H1蛋白在受照射CNE-2R移植瘤中较在受照射CNE-2移植瘤中表达上调，可能与照射后细胞DNA损伤修复能力增强有关。
韩磊[10]（2008）在《复合功能基因投递系统的构建和体内外研究》文中认为细菌磁小体（BMPs）是趋磁性细菌体内依靠生物矿化法合成的磁性纳米颗粒,主要由磁核和包被磁核的脂质膜两部分组成。磁小体本身所具有的独特性质,使其在许多领域得到了广泛的应用,但作为基因载体的应用研究还很少。本文通过对磁小体的修饰和改性,将其构建成具有磁靶向和跨膜复合功能的基因投递系统,并在此基础上使用该基因投递系统对人脑胶质瘤进行体内外基因治疗实验,并探讨治疗效果。本文通过FTIR、XPS、TEM和HRTEM对磁小体脂质膜的组分、官能团和微观形貌进行观察和分析,发现磁小体具有独特的微观排列形貌和粒径分布,平均粒径为45nm,饱和磁化强度为74.33emu/g,并采用荧光胺的方法对磁小体脂质膜上氨基含量进行了定量分析,发现每毫克磁小体的脂质膜上含有58.58 nmol的氨基基团;通过XRD、SQUID和紫外-可见分光光度计对磁小体磁核的组分和磁性能进行分析,发现磁小体的磁核由四氧化三铁晶体组成,具有较强的磁响应性和分散稳定性,并通过ICP-MS分析了磁小体中铁元素的含量为每毫克磁小体含有0.605mg的铁元素,含有约3.3549×1012个磁小体颗粒;细胞毒性实验的结果证实了磁小体具有很好的生物相容性。通过碳二亚胺（EDC·HCl）偶合法,制备出具有磁靶向的基因投递系统（BMPs-PAMAM）,并优化了制备条件,在此基础上将跨膜多肽（Tat）借助偶联剂（Sulfo-LC-SPDP）连接到BMPs-PAMAM磁性粒子表面,制备出具有磁靶向和跨膜复合功能的基因投递系统（Tat-BMPs-PAMAM）。通过FTIR、XPS、Zeta Potential Analyzer、TEM、SQUID和紫外-可见分光光度计对复合功能基因投递系统的结构、组成、微观形貌和磁性能进行了分析表征。定量了每毫克BMPs表面接枝有0.056mg的PAMAM大分子和0.027mg的Tat多肽,大约每个BMPs上接枝了1472个PAMAM大分子和3190个Tat多肽分子。该投递系统粒径均匀,约为50nm;具有较强的磁响应性和分散稳定性,其饱和磁化强度为62.46emu/g。凝胶电泳阻滞实验证明了两种基因投递系统（BMPs-PAMAM和Tat-BMPs- PAMAM）均能够与报告质粒（pEGFP与pGL-3）形成非常稳定的复合物,并且对报告质粒具有很好的酶切保护作用;细胞毒性实验证实了两种投递系统具有较好的生物相容性。使用两种基因投递系统将两种报告质粒转染U251细胞,结果显示,当BMPs-PAMAM与报告质粒的质量比为20:1、Tat-BMPs-PAMAM与报告质粒的质量比为12.5:1时,均具有最高的转染效率,分别为16.65%和20.56%,并且外加磁场的靶向性作用能够使两种基因投递系统的转染效率提高25%。体外磁靶向跨膜定位实验证明所制备的两种复合功能基因投递系统（BMPs-PAMAM和Tat-BMPs- PAMAM）具有较好的磁靶向和跨膜复合功能,其转染效率分别为为11.56%,13.28%,高于商用转染试剂Lipofectamine 2000的转染效率9.86%。对两种基因投递系统进行放射性元素99mTc标记,用SPECT考察了两种投递系统荷载pGL-3质粒的复合物在正常SD大鼠体内分布情况,并详细考察了注射方式、Tat多肽和外加磁场对复合物在各脏器中分布和跨血脑屏障能力的影响,显示其磁靶向和跨膜的复合功能。使用U251胶质瘤细胞模型研究了两种基因投递系统的体外基因转染对肿瘤的抑制效果,并与Lipofectamine 2000进行了对比。通过细胞免疫荧光、细胞免疫组化和Western blot检测相关靶蛋白的表达,证明了Tat-BMPs-PAMAM与Lipofectamine 2000对靶蛋白具有相似的治疗效果。体外细胞生物学特性实验证明,经两种基因投递系统基因治疗后的U251细胞的增殖活性和侵袭能力均显着降低,凋亡细胞数显着上升,并且Tat-BMPs-PAMAM/psiRNA比BMPs-PAMAM /psiRNA具有更好的体外抑制效果,与Lipofectamine 2000/psiRNA组相比没有显着性的差异。以荷U251胶质瘤裸鼠为动物模型研究了两种基因投递系统的体内基因转染对肿瘤的抑制效果。裸鼠体内肿瘤生长速率曲线、肿瘤组织标本的免疫组化和原位凋亡检测（TUNEL法）的结果与体外实验结果相一致:经体内基因治疗后,Tat-BMPs-PAMAM/psiRNA比BMPs-PAMAM/psiRNA具有更好的体内治疗效果,与Lipofectamine 2000/psiRNA组相比没有显着性的差异。综上所述,本文将纳米生物技术与肿瘤分子生物学技术相结合,将制备的BMPs-PAMAM和Tat-BMPs-PAMAM作为非病毒基因投递系统进行基因治疗的研究,充分利用磁小体的磁靶向性和Tat多肽的跨膜功能构建出具有复合功能的非病毒基因投递系统,为疾病的基因治疗尤其是中枢神经系统疾病的基因治疗奠定了基础。
二、人脑胶质瘤nm23-H1蛋白及PCNA的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人脑胶质瘤nm23-H1蛋白及PCNA的表达（论文提纲范文）
（1）CYP46A1在胶质母细胞瘤胆固醇代谢中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 胆固醇在GBM增殖中的作用 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 附图表 |
| 第二部分 CYP46A1在胶质瘤中的表达及作用机制 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 附图表 |
| 第三部分 依法韦仑通过激活CYP46A1/240HC抑制胶质瘤增殖 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 附图表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 胆固醇代谢在胶质瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章一 |
| 英文文章二 |
（2）新型NFAT信号通路抑制剂及其抗神经胶质母细胞瘤活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 多形性神经胶质母细胞瘤的研究现状 |
| 1.2 NFAT信号通路与肿瘤 |
| 1.2.1 NFAT及其信号通路的调节机制 |
| 1.2.2 NFAT信号通路与肿瘤的关系 |
| 1.2.3 NFAT信号通路抑制剂 |
| 1.3 老药新用与神经胶质瘤 |
| 1.3.1 老药新用的优势 |
| 1.3.2 老药新用在神经胶质瘤中的应用现状 |
| 1.4 选题的背景和意义 |
| 第二章 基于老药新用的NFAT信号通路抑制剂及其抗GBM肿瘤活性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 主要材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 PIM作为一种有效的NFAT信号通路抑制剂的鉴定 |
| 2.3.2 PIM抑制TG诱导的NFAT核易位分子机制的探究 |
| 2.3.3 PIM的体外抗GBM活性评价 |
| 2.3.4 PIM的体内抗GBM活性评价 |
| 2.3.5 PIM抗GBM肿瘤的分子机理研究 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 磺酰胺类NFAT信号通路抑制剂及其抗GBM肿瘤活性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 仪器和试剂 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 YZ85衍生物的表征及抗GBM增殖活性测定 |
| 3.3.2 构效关系分析 |
| 3.4 小结及下一步工作计划 |
| 第四章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 相关化合物的图表 |
| 附录二 相关化合物的表征图 |
| 作者在硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）中药威灵仙基原品种之一棉团铁线莲的化学成分研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 铁线莲属植物化学成分及其药理活性研究进展 |
| 第一节 铁线莲属植物化学成分的研究进展 |
| 第二节 铁线莲属植物药理活性的研究进展 |
| 第二章 棉团铁线莲根和根茎的化学成分研究 |
| 第一节 研究背景 |
| 第二节 研究结果 |
| 第三节 新化合物的结构解析 |
| 第四节 已知化合物的结构鉴定 |
| 第五节 实验部分 |
| 第三章 药理活性筛选 |
| 第一节 提取物的体内药理活性筛选 |
| 第二节 化合物的体外药理活性筛选 |
| 第四章 结果与讨论 |
| 参考文献 |
| 发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附录 |
（4）肿瘤同源外泌体纳米声敏剂EXO-DVDMS的构建及其声动力杀伤乳腺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乳腺癌发展趋势及治疗现状概述 |
| 1.2 声动力疗法与声敏剂研究进展 |
| 1.2.1 超声在生物医学领域应用的概述 |
| 1.2.2 声动力学疗法抗肿瘤机制 |
| 1.2.3 声敏剂 |
| 1.3 外泌体作为药物递送系统的研究进展 |
| 1.3.1 外泌体的生物发生和基本特性 |
| 1.3.2 外泌体的细胞摄取 |
| 1.3.3 外泌体的分离纯化 |
| 1.3.4 外泌体的功能化修饰与药物装载 |
| 1.3.5 基于外泌体的治疗平台 |
| 1.4 本研究的立论依据、研究内容、目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 华卟啉钠外泌体纳米声敏剂的构筑及其鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 仪器与设备 |
| 2.2.2 试剂与配制 |
| 2.2.3 细胞及动物来源 |
| 2.2.4 无外泌体血清的制备 |
| 2.2.5 外泌体提取试剂配制条件的筛选及外泌体分离纯化方法的建立 |
| 2.2.6 华卟啉钠外泌体的制备 |
| 2.2.7 华卟啉钠外泌体荧光测定 |
| 2.2.8 华卟啉钠外泌体包封率及载药率测定 |
| 2.2.9 外泌体粒径、分散性、蛋白浓度测定 |
| 2.2.10 NTA测定EXO-DVDMS粒径及Zeta电位 |
| 2.2.11 TEM观察EXO-DVDMS形貌 |
| 2.2.12 细胞、外泌体中蛋白的提取和定量 |
| 2.2.13 Western blot检测EXO-DVDMS的外泌体标志性蛋白 |
| 2.2.14 EXO-DVDMS样品中载华卟啉钠外泌体的比率测定 |
| 2.2.15 数据分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 PEG-8K改良法提取纯化细胞外泌体及血液外泌体 |
| 2.3.2 DVDMS荧光测定及标准曲线的绘制 |
| 2.3.3 影响直接孵育法制备EXO-DVDMS的因素 |
| 2.3.4 不同载药方式制备的EXO-DVDMS |
| 2.3.5 EXO-DVDMS的表征 |
| 2.3.6 EXO-DVDMS样品载华卟啉钠外泌体的比率测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 模拟生理条件下外泌体对华卟啉钠的药物保护作用及EXO-DVDMS释药特性研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 仪器与设备 |
| 3.2.2 试剂与配制 |
| 3.2.3 细胞来源培养 |
| 3.2.4 超声装置 |
| 3.2.5 EXO-DVDMS的制备 |
| 3.2.6 EXO-DVDMS在模拟生理条件下粒径稳定性 |
| 3.2.7 EXO-DVDMS在模拟生理条件下光谱性质稳定性 |
| 3.2.8 超声联合EXO-DVDMS模拟生理条件下的单线态氧产率 |
| 3.2.9 不同条件下EXO-DVDMS中DVDMS释放规律 |
| 3.2.10 TA法检测超声空化效应 |
| 3.2.11 超声对EXO-DVDMS形态的影响 |
| 3.2.12 超声对EXO-DVDMS胞内释放的影响 |
| 3.2.13 数据分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 不同浓度血清溶液中Blank-EXO和EXO-DVDMS的粒径变化 |
| 3.3.2 Free-DVDMS和EXO-DVDMS光谱性质研究 |
| 3.3.3 模拟生理条件下超声联合EXO-DVDMS的单线态氧产率测定 |
| 3.3.4 不同条件下EXO-DVDMS中DVDMS释放规律 |
| 3.3.5 超声联合EXO-DVDMS的空化效应测定 |
| 3.3.6 超声对EXO-DVDMS形态的影响 |
| 3.3.7 超声对EXO-DVDMS胞内释放的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 超声联合华卟啉钠外泌体对乳腺癌细胞的体外杀伤效应研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 仪器与设备 |
| 4.2.2 试剂与配制 |
| 4.2.3 细胞来源及培养 |
| 4.2.4 超声装置 |
| 4.2.5 EXO-DVDMS的制备 |
| 4.2.6 Lipo-DVDMS的制备 |
| 4.2.7 EXO-DVDMS在4T1细胞中的摄取规律分析 |
| 4.2.8 EXO-DVDMS细胞水平的同源靶向性评估 |
| 4.2.9 超声作用下4T1细胞对Free-DVDMS和EXO-DVDMS的摄取 |
| 4.2.10 FD500摄取法检测超声联合EXO-DVDMS对4T1细胞膜通透性的影响 |
| 4.2.11 MTT法检测不同处理后4T1细胞存活率 |
| 4.2.12 CalceinAM/PI双染检测细胞存活情况 |
| 4.2.13 超声联合EXO-DVDMS在4T1细胞内的活性氧产率测定 |
| 4.2.14 超声对EXO-DVDMS胞内定位及胞内转运的影响 |
| 4.2.15 数据分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 EXO-DVDMS在4T1细胞中的摄取规律 |
| 4.3.2 4T1细胞对不同形式DVDMS的摄取 |
| 4.3.3 EXO-DVDMS细胞水平的同源靶向性评估 |
| 4.3.4 超声联合EXO-DVDMS对4T1细胞摄取DVDMS的影响 |
| 4.3.5 超声联合EXO-DVDMS对4T1细胞膜通透性的影响 |
| 4.3.6 超声联合EXO-DVDMS对4T1细胞的体外杀伤效应 |
| 4.3.7 超声联合EXO-DVDMS在4T1细胞内的活性氧产率测定 |
| 4.3.8 超声对EXO-DVDMS胞内定位及胞内转运的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 引导超声作用下华卟啉钠外泌体的体内代谢及同源肿瘤富集研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 仪器与设备 |
| 5.2.2 试剂与配制 |
| 5.2.3 细胞来源、细胞培养及动物模型 |
| 5.2.4 超声装置与处理模式 |
| 5.2.5 DiR-EXO和EXO-DVDMS的制备 |
| 5.2.6 微泡的制备 |
| 5.2.7 游离DVDMS及EXO-DVDMS的血液长循性能测定 |
| 5.2.8 EXO-DVDMS在4T1荷瘤小鼠肿瘤组织的富集规律 |
| 5.2.9 EXO-DVDMS的体内同源肿瘤寻靶能力研究 |
| 5.2.10 引导超声联合EXO-DVDMS处理后4T1荷瘤小鼠肿瘤组织中EXO-DVDMS富集量测定 |
| 5.2.11 引导超声联合EXO-DVDMS处理后EXO-DVDMS在4T1荷瘤小鼠肿瘤组织分布及渗透性研究 |
| 5.2.12 数据分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 EXO-DVDMS血液长循性能测定 |
| 5.3.2 同源外泌体在4T1荷瘤小鼠肿瘤组织的富集 |
| 5.3.3 EXO-DVDMS在体水平同源肿瘤靶向性研究 |
| 5.3.4 引导超声联合EXO-DVDMS作用后4T1荷瘤小鼠肿瘤组织中EXO-DVDMS代谢及富集研究 |
| 5.3.5 引导超声联合EXO-DVDMS处理后EXO-DVDMS在4T1荷瘤小鼠肿瘤组织分布及渗透性研究 |
| 5.3.6 引导超声联合Free-DVDMS/EXO-DVDMS处理后DVDMS在4T1荷瘤小鼠肿瘤组织分布及代谢规律 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 多级超声联合华卟啉钠外泌体纳米声敏剂对乳腺癌杀伤作用的在体研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 仪器与设备 |
| 6.2.2 试剂与配制 |
| 6.2.3 细胞来源、细胞培养及动物模型 |
| 6.2.4 超声装置与处理模式 |
| 6.2.5 EXO-DVDMS的制备 |
| 6.2.6 微泡的制备 |
| 6.2.7 多级超声联合EXO-DVDMS对小鼠4T1肿瘤生长抑制效应研究 |
| 6.2.8 肿瘤组织与各器官形态学观察 |
| 6.2.9 肿瘤组织TUNEL染色分析 |
| 6.2.10 免疫组织化学法检测肿瘤组织增殖细胞核抗原PCNA及基质金属蛋白酶MMP-9的表达变化 |
| 6.2.11 小鼠肝肾生化指标检测 |
| 6.2.12 数据分析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 多级超声联合EXO-DVDMS对小鼠4T1肿瘤生长的影响 |
| 6.3.2 不同处理后肿瘤组织PCNA表达变化 |
| 6.3.3 不同处理后TUNEL染色观察肿瘤组织的细胞凋亡情况 |
| 6.3.4 多级超声联合EXO-DVDMS对小鼠4T1肿瘤肺转移的影响 |
| 6.3.5 不同处理后肿瘤组织MMP-9的表达变化 |
| 6.3.6 多级超声联合EXO-DVDMS对荷瘤小鼠体重及主要脏器的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
（5）长链非编码RNA PVT1通过EZH2调节胶质瘤细胞的增殖和迁移机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 PVT1和EZH2在人脑胶质瘤和正常脑组织中的表达研究及在胶质瘤细胞系中的表达 |
| 前言 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 体外实验观察PVT1调控EZH2作用及对胶质瘤细胞系功能学影响 |
| 前言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 体内实验观察PVT1调控EZH2作用及对鼠胶质瘤移植瘤的影响 |
| 前言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（6）Kpnβ1在非小细胞肺癌中的表达及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 KPNB1在非小细胞肺癌中的表达及临床意义 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第二部分 KPNB1通过PI3K/AKT通路对非小细胞肺癌增殖能力的影响 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 在攻读博士学位期间公开发表的论文与参加的项目 |
| 致谢 |
（7）鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤细胞生长的实验研究及机制探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤U87和U118细胞生长的现象观察 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图 |
| 第二部分 鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤U87和U118细胞生长的机制初探 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图 |
| 第三部分 鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤细胞生长的体内实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述(一) 人脑胶质母细胞瘤侵袭性及其机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述(二) 凝花酸的生物学功能及其抗癌作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间科研成果 |
| 致谢 |
（8）NME4、Bnip3L、HKDC1在新诊断幕上胶质母细胞瘤中的表达及其与预后的关系（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分：NME4在新诊断幕上胶质母细胞瘤中的表达及其与预后的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分：Bnip3L在新诊断幕上胶质母细胞瘤中的表达及其与预后的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分：HKDC1在新诊断幕上胶质母细胞瘤中的表达及 其与预后的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 本课题获得科研资助项目 |
| 致谢 |
（9）人鼻咽癌放射抗拒移植瘤模型的建立及放射抗拒相关蛋白的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 人鼻咽癌放射抗拒移植瘤模型的建立 |
| 引言 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.3 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二部分 NPM1 蛋白、nm23-H1 蛋白和 annexin A3 蛋白在不同放射敏感性鼻咽癌移植瘤中的表达及意义 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 核磷蛋白、膜连蛋白、转移抑制蛋白与肿瘤治疗抗拒研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）复合功能基因投递系统的构建和体内外研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 脑胶质瘤 |
| 1.2.1 脑胶质瘤与基因治疗 |
| 1.2.2 RNAi 技术 |
| 1.2.3 EGFR-P13K-AKT 信号通路 |
| 1.3 基因载体 |
| 1.3.1 病毒性基因载体 |
| 1.3.2 非病毒类基因载体 |
| 1.3.3 聚阳离子基因载体介导的基因转染的一般过程 |
| 1.3.4 Starburst PAMAM dendrimers 树枝状聚合物基因载体 |
| 1.4 具有跨膜和磁靶向复合功能的基因投递系统的构建 |
| 1.4.1 趋磁性细菌与磁小体 |
| 1.4.2 跨膜多肽TAT 概述 |
| 1.5 本文的研究内容及意义 |
| 第二章 磁小体理化性质的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂与仪器 |
| 2.2.2 磁小体的纯化 |
| 2.2.3 磁小体理化性质的研究 |
| 2.2.4 磁小体细胞毒性的研究 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 磁小体的清洗提纯 |
| 2.3.2 磁小体脂质膜理化性质的研究 |
| 2.3.3 磁小体磁核理化性质的研究 |
| 2.3.4 磁小体理化性质的研究 |
| 2.3.5 磁小体细胞毒性的研究 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 具有复合功能基因投递系统的构建与表征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂与仪器 |
| 3.2.2 BMPs-PAMAM 基因投递系统的构建 |
| 3.2.3 Tat-BMPs-PAMAM 复合功能基因投递系统的构建 |
| 3.2.4 具有复合功能基因投递系统的表征 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 构建BMPs-PAMAM 基因投递系统反应条件的优化 |
| 3.3.2 具有复合功能基因投递系统的表征 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 复合功能基因投递系统体外报告基因转染效率的评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂与仪器 |
| 4.2.2 报告质粒的提取 |
| 4.2.3 凝胶阻滞实验 |
| 4.2.4 复合物稳定性实验 |
| 4.2.5 Dnase I 酶切保护实验 |
| 4.2.6 基因载体细胞毒性实验 |
| 4.2.7 报告质粒的转染实验 |
| 4.2.8 体外磁靶向跨膜定位实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 报告质粒的提取与鉴定 |
| 4.3.2 DNA 结合实验 |
| 4.3.3 聚合物稳定性实验 |
| 4.3.4 DNA 酶切保护实验 |
| 4.3.5 载体的细胞毒性实验 |
| 4.3.6 体外转染实验 |
| 4.3.7 体外磁靶向跨膜定位实验结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 复合功能基因投递系统体内分布和跨血脑屏障功能研究- |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验试剂与仪器表 |
| 5.2.2 磁性复合功能载体的放射性标记[188] |
| 5.2.3 磁性复合功能载体载基因体内分布 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 放射性元素~(99m)Tc 跨血脑屏障（BBB）功能检测 |
| 5.3.2 ~(99m)Tc-复合功能基因投递系统的体内分布和跨BBB 功能检测- |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 载psiRNA 复合功能基因投递系统抑制 U251 人脑恶性胶质瘤的细胞实验研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 实验试剂与仪器 |
| 6.2.2 细胞培养 |
| 6.2.3 治疗质粒的提取 |
| 6.2.4 基因转染 |
| 6.2.5 Western blot 检测相关蛋白的表达 |
| 6.2.6 相关抗原免疫组化染色(ABC 法) |
| 6.2.7 相关抗原免疫荧光染色 |
| 6.2.8 流式细胞仪分析细胞周期 |
| 6.2.9 Annexin V-FITC 检测细胞凋亡 |
| 6.2.10 细胞增殖活性的分析 |
| 6.2.11 U251 胶质瘤细胞侵袭能力的体外实验 |
| 6.2.12 统计学方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 治疗质粒的提取与鉴定 |
| 6.3.2 Western blot 检测相关蛋白的表达 |
| 6.3.3 细胞免疫组化与免疫荧光检测 |
| 6.3.4 细胞周期分析 |
| 6.3.5 细胞凋亡分析 |
| 6.3.6 MTT 实验 |
| 6.3.7 细胞侵袭能力的研究 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 载psiRNA 复合功能基因投递系统抑制 U251 人脑恶性胶质瘤的动物实验研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验部分 |
| 7.2.1 实验试剂与仪器 |
| 7.2.2 动物模型的建立 |
| 7.2.3 治疗基因的提取 |
| 7.2.4 体内基因治疗 |
| 7.2.5 肿瘤生长情况观察 |
| 7.2.6 组织标本的常规HE 染色 |
| 7.2.7 免疫组织化学检测 |
| 7.2.8 原位细胞凋亡的检测 |
| 7.2.9 统计学处理 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 治疗质粒的大量提取 |
| 7.3.2 肿瘤生长曲线 |
| 7.3.3.H E 染色 |
| 7.3.4 治疗后肿瘤相关指标变化情况 |
| 7.3.5.T UNEL 原位凋亡检测 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 本章小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表论文和科研情况 |
四、人脑胶质瘤nm23-H1蛋白及PCNA的表达（论文参考文献）
- [1]CYP46A1在胶质母细胞瘤胆固醇代谢中的作用和机制研究[D]. 王帅. 山东大学, 2021(11)
- [2]新型NFAT信号通路抑制剂及其抗神经胶质母细胞瘤活性研究[D]. 刘晓宁. 山东师范大学, 2021(12)
- [3]中药威灵仙基原品种之一棉团铁线莲的化学成分研究[D]. 蔡鲁. 北京协和医学院, 2020(05)
- [4]肿瘤同源外泌体纳米声敏剂EXO-DVDMS的构建及其声动力杀伤乳腺癌的实验研究[D]. 刘亦晨. 陕西师范大学, 2020(02)
- [5]长链非编码RNA PVT1通过EZH2调节胶质瘤细胞的增殖和迁移机制研究[D]. 杨安强. 南方医科大学, 2019(09)
- [6]Kpnβ1在非小细胞肺癌中的表达及其作用机制研究[D]. 王海英. 苏州大学, 2019(04)
- [7]鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤细胞生长的实验研究及机制探讨[D]. 王栋良. 武汉大学, 2017(06)
- [8]NME4、Bnip3L、HKDC1在新诊断幕上胶质母细胞瘤中的表达及其与预后的关系[D]. 张建东. 福建医科大学, 2016(07)
- [9]人鼻咽癌放射抗拒移植瘤模型的建立及放射抗拒相关蛋白的研究[D]. 李小宇. 广西医科大学, 2012(09)
- [10]复合功能基因投递系统的构建和体内外研究[D]. 韩磊. 天津大学, 2008(08)