一、成人破骨细胞的体外培养（论文文献综述）
周建国[1]（2021）在《microRNA-1286调控BMSCs成骨分化在骨质疏松骨重建作用及机制研究》文中提出目的:骨质疏松（Osteoporosis,OP）是一种全身性代谢性骨病,以骨量减少、骨微结构破坏、骨脆性增加及容易引起脆性骨折为典型特征,预防与治疗一直是临床医师所需解决的问题。骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs）是成骨细胞及脂肪细胞的共同前体,其在骨代谢中发挥了重要作用。miRNAs可通过靶向调控干细胞、成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞中各种转录因子参与骨形成和血管形成。miRNAs作为OP新的潜在治疗靶点或生物标志物,迅速得到了临床关注,越来越多研究表明miRNAs在OP成骨分化起重要作用,如miR-346、miR-20a、miR-29b、miR-433等。目前已有报道发现micro RNA-1286（miR-1286）被证实与癌症及骨关节炎发生与进展有关,但还没有研究探讨其在OP的作用。我们预实验发现OP患者血清过表达miR-1286,在诱导h MSCs成骨分化不同阶段miR-1286的表达逐渐降低,推测miR-1286可能与OP进展有关。相关研究提示miR-1286可能经某些信号通路（如NF-k B、Wnt/β-catenin、氧化应激）参与成骨分化进程,但miR-1286是否参与OP发生发展尚无相关研究证实。卷曲相关蛋白4（Frizzled related protein 4,FZD4）可经不同信号通路（如氧化应激、甲基化、Wnt/β-catenin信号通路）参与细胞的增殖、分化过程,影响BMSCs的细胞分化方向及分化进程。从Starbase3.0网站上查询miR-1286与FZD4存在结合位点,但关于miR-1286与FZD4在BMSCs成骨分化的调控机制是否存在关联尚无相关报道。为此,本研究探讨分析miR-1286与OP的关联性,阐明miR-1286参与BMSCs成骨分化调控OP骨重建作用及相关机制,旨在为OP的防治提供新的治疗思路。方法:第一部分:（1）选取正常健康成人50例,OP患者50例,抽取5m L血液EDTA抗凝处理,采用实时定量聚合酶链反应（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR）检测OP患者血清miR-1286的表达差异。（2）将OP患者的BMSCs细胞体外培养,给予间充质干细胞-成骨分化培养基（Mesenchymal Stem Cell-Osteogenic Differentiation Medium,MODM）培养,观察细胞生长、存活与分化状况,采用碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,ALP）染色及茜素红染色表征OP患者的BMSCs分化过程。（3）采用q RT-PCR检测OP患者的BMSCs细胞分化过程中的miR-1286表达情况。第二部分:（1）将50例OP患者的BMSCs细胞作为研究对象,传代培养至3-4代后经MODM培养基诱导成骨分化,并分为过表达miR-1286组（miR-1286-mimic组）、对照组（miR-NC组）、低表达miR-1286（miR-1286-Inhibitor组）,每例OP患者的BMSCs标本作3个复孔。（2）miR-1286-mimic组转染miR-1286,形成miR-1286过表达的BMSCs细胞分化环境;miR-NC组转染Anti-miR-NC行对照研究;miR-1286-Inhibitor组转染miR-1286抑制,形成miR-1286低表达的BMSCs细胞分化环境,每2-4d更换MODM培养基,培养14d。（3）采用q RT-PCR检测ALP、Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,RUNX2）、骨钙素（Osteocalcin,OCN）、成骨相关转录因子抗体（Osterix）的m RNA表达水平;采用Western blotting法检测RUNX2、OCN、FZD4、Osterix蛋白表达水平;采用q RT-PCR检测卷曲相关蛋白4野生型（Frizzled related protein 4 wild type,FZD4 WT）、卷曲相关蛋白4突变型（Frizzled related protein 4 mutant,FZD4 MUT）、FZD4的m RNA表达水平;荧光素酶报告基因检测miR-1286表达对FZD4的影响;采用ALP染色检测ALP活性和含量;采用茜素红染色评估细胞钙化情况。第三部分:（1）将50例OP患者的BMSCs细胞作为样本,将传代至5代的BMSCs细胞经MODM培养诱导成骨分化,并分为过表达FZD4组（pc DNA-FZD4组）、空白对照组（pc DNA-NC组）、对照组（miR-NC组）过表达miR-1286组（miR-1286-mimic组）、过表达miR-1286及FZD4组（miR-1286-mimic+pc DNA-FZD4组）,每例OP患者BMSCs标本作3个复孔。（2）pc DNA-FZD4组转染pc DNA-FZD4模拟FZD4过表达,pc DNA-NC组转染pc DNA-NC行对照组,miR-NC组转染Anti-miR-NC行对照,miR-1286-mimic组转染miR-1286模拟miR-1286过表达,miR-1286-mimic+pc DNA-FZD4组转染pc DNA-FZD4及miR-1286模拟pc DNA-FZD4和miR-1286同时过表达。每2-4d更换MODM培养基,培养14d。（3）采用q RT-PCR检测ALP、RUNX2、OCN、Osterix的m RNA表达水平;采用Western blotting法检测RUNX2、OCN、Osterix蛋白表达水平;采用ALP染色检测ALP活性和含量;采用茜素红染色评估细胞钙化情况。结果:第一部分:（1）OP患者血清中miR-1286的表达明显高于正常健康人群,差异有统计学意义（p<0.01）。（2）OP患者的BMSCs细胞传代4-6h后,贴壁生长,逐渐有伪足伸出,贴壁细胞轮廓清晰,呈现梭形排列;传代培养7d后,细胞数量逐渐增加,细胞出现了进一步的融合生长,形态呈现蝌蚪、草束样,排列紧密,部分区域可见有旋涡样。成骨诱导7d后,ALP阳性细胞染色呈现深蓝色;茜素红染色呈现桔红色,钙化结节明显。（3）诱导BMSCs成骨分化后第3d、第7d及第14d的miR-1286表达水平低于第1d;诱导BMSCs成骨分化后的第7d及第14d的miR-1286表达水平低于第3d;诱导BMSCs成骨分化后的第14d的miR-1286表达水平低于第7d,差异有统计学意义（p<0.01）。第二部分:（1）miR-1286-mimic组的ALP、RUNX2、OCN、Osterix的m RNA表达水平均低于miR-NC组,miR-1286-Inhibitor组ALP、RUNX2、OCN、Osterix的m RNA表达水平均高于miR-NC组,差异有统计学意义（p<0.01）。（2）miR-1286-mimic组的ALP活性低于miR-NC组;miR-1286-Inhibitor组ALP活性高于miR-NC组,差异有统计学意义（p<0.01）。miR-1286-mimic组的ALP染色显示ALP含量较miR-NC组显着降低,茜素红染色显示矿化结节的形成较miR-NC组明显减少;miR-1286-Inhibitor组的ALP染色显示ALP含量较miR-NC组增加,茜素红染色显示矿化结节的形成较miR-NC组明显增加。（3）miR-1286-mimic组的RUNX2、OCN、Osterix蛋白水平低于miR-NC组,miR-1286-Inhibitor组的RUNX2、OCN、Osterix蛋白水平高于miR-NC组,差异有统计学意义（p<0.01）。荧光素酶报告基因实验表明miR-1286的过表达显着猝灭了野生型FZD4（FZD4 WT）的荧光;miR-1286-mimic组的突变型FZD4（FZD4MUT）表达水平与miR-NC组比较无统计学差异（p>0.05）;miR-1286-mimic组的FZD4 WT表达水平低于miR-NC组;miR-1286-Inhibitor组的FZD4 WT表达水平高于miR-NC组,差异有统计学意义（p<0.01）。miR-1286-mimic组的ALP染色显示ALP含量显着降低,茜素红染色显示矿化结节的形成明显减少。第三部分:（1）pc DNA-FZD4组的ALP、RUNX2、OCN及Osterix的m RNA表达水平均高于pc DNA-NC组,差异有统计学意义（p<0.01）。pc DNA-FZD4组的ALP活性高于pc DNA-NC组,差异有统计学意义（p<0.01）。此外,Western blotting分析还显示pc DNA-FZD4组的RUNX2、OCN、Osterix蛋白水平均高于pc DNA-NC组,差异有统计学意义（p<0.01）。ALP染色显示pc DNA-NC组的ALP含量显着增加,茜素红染色显示矿化结节形成明显增加。（2）miR-1286-mimic+pc DNA-FZD4与miR-1286-mimic组的ALP、RUNX2、OCN及Osterix m RNA表达水平均低于miR-NC组;且miR-1286-mimic组的ALP、RUNX2、OCN及Osterix m RNA表达水平低于miR-1286-mimic+pc DNA-FZD4组,差异有统计学意义（p<0.01）;在对成果分化相关的ALP活性及成骨相关蛋白水平检测后发现,ALP活性、RUNX2蛋白、OCN蛋白、Osterix蛋白亦呈现了相同变化。结论:（1）OP患者血浆中的miR-1286的表达明显高于健康正常人群,且在诱导BMSCs成骨分化1d、3d、7d、14d后,miR-1286的表达逐渐降低,这提示miR-1286与OP成骨分化负性相关,可能与OP的发生发展有关。（2）本研究从OP患者提取的BMSCs经细胞培养后发现,传代效果良好,细胞生长能力旺盛,功能状态良好,可满足细胞形态学观察研究,可作为后续体外实验成骨分化的实验标的。（3）miR-1286的过表达抑制了OP患者BMSCs的成骨分化能力,引起了成骨分化下游的关键酶及蛋白表达下调;而miR-1286低表达,促进了OP患者BMSCs的成骨分化能力,引起了成骨分化下游的关键酶基因与蛋白表达的上调,这说明miR-1286可能介导参与了OP成骨分化相关过程。（4）miR-1286可直接与FZD4 m RNA靶向结合,进而影响了FZD4的表达,FZD4的过表达促进了OP患者的BMSCs成骨分化作用,加速了OP骨的生成;miR-1286能够通过与FZD4相互作用而调控抑制h BMSCs的成骨分化,这表明miR-1286与FZD4存在靶向结合特性,能靶向结合FZD4,经Wnt/FZD4途径介导参与OP的BMSCs成骨分化过程,从而调控影响OP的发生发展。
杨依林[2]（2020）在《青少年特发性脊柱侧凸单细胞转录组病因学分析及脊柱畸形相关临床研究》文中研究指明第一章青少年特发性脊柱侧凸脊柱松质骨组织高通量单细胞转录组学测序分析目的:青少年特发性脊柱侧凸（adolescent idiopathic scoliosis,AIS）是最常见的脊柱畸形之一,但至今为止其病因仍不清晰。此前大量的研究发现AIS患者存在骨代谢和骨骼生长发育异常,提示骨骼细胞异常的增殖、分化在AIS的发病过程中发挥了重要作用。本研究通过对AIS脊柱松质骨组织的单细胞转录组学测序从单细胞层面构建AIS骨骼细胞分化发育图谱,并通过对比分析AIS患者与对照组之间细胞分化发育过程的差异,以期探索AIS发生发展过程中潜在的致病机制,为实现AIS的早期分子诊断和病因学治疗提供理论基础。方法:选取合适的AIS和对照组手术患者,术中取适量脊柱松质骨组织。分离消化组织、筛选细胞、构建单细胞悬液,通过t-SNE算法结合标记基因和基因本体功能识别细胞群体、鉴别细胞类型。拟时序分析构建骨骼细胞（成骨细胞、软骨细胞、破骨细胞）的分化发育轨迹,对比分析AIS组和对照组骨骼细胞分化发育的差异,并通过细胞间通讯分析和细胞内信号通路分析探索与骨骼细胞异常分化发育相关的细胞间互相作用及其可能的下游目标信号通路,系统探索AIS骨骼细胞异常发育的病因学基础。结果:在脊柱松质骨组织内共发现19类不同类型的细胞。对比分析AIS和对照组间骨骼细胞的分化轨迹和细胞间通讯及下游信号通路,相应地提出了AIS的潜在病因有:（1）AIS间充质干细胞MSC-IGFBP5亚群向成骨细胞分化障碍,导致AIS成骨细胞数量减少和骨骼矿化异常,细胞间通讯分析提示MSC-IGFBP亚群细胞与淋巴细胞的互相作用介导间充质干细胞的炎症爆发、增殖分化障碍和免疫逃逸,构成了免疫因素参与AIS成骨细胞分化障碍的病因学基础。（2）AIS软骨祖细胞向软骨细胞的分化障碍,可能源于其与免疫细胞互相作用后HIF-1信号通路异常激活引起细胞能量代谢障碍,因此导致软骨细胞减少并影响脊柱的软骨内成骨。结论:本研究的单细胞转录组学测序分析首次对比分析了AIS与对照组骨骼细胞分化发育谱系的差异,并根据细胞间通讯和下游信号通路分析提出了AIS成骨细胞和软骨细胞分化障碍的潜在免疫学疾病机制,可以为实现AIS的早期分子诊断和病因学治疗提供新的思路。第二章Rho A/ROCK信号通路异常对青少年特发性脊柱侧凸间充质干细胞向软骨细胞分化的影响及其机制研究目的:青少年特发性脊柱侧凸是最常见的脊柱畸形之一,但其致病机制尚不明确。骨骼细胞异常的生长发育在AIS的病因研究中一直备受关注,我们前期研究也发现AIS患者特定的间充质干细胞群体向软骨细胞分化障碍,且细胞内信号通路的对比分析提示AIS患者间充质干细胞内Rho A/ROCK信号通路异常活跃。但目前针对AIS间充质干细胞内Rho A/ROCK通路异常介导软骨细胞分化障碍的研究较少,本研究拟从基因、蛋白、细胞层面系统研究Rho A/ROCK信号通路异常对在AIS间充质干细胞向软骨细胞分化过程中的调控作用及其分子机制。方法:选取2016年1月至2017年6月在我院手术治疗的30例Lenke 1女性AIS患者（AIS组）和年龄、性别相匹配的30例非脊柱侧凸手术患者（对照组）,术中取适量脊柱松质骨行间充质干细胞体外培养并向软骨细胞诱导分化。单细胞转录组测序构建软骨细胞的分化轨迹图谱,比较分析软骨分化障碍AIS间充质干细胞群体与对照组之间细胞内信号通路的差异。蛋白印记检测AIS组与对照组之间Rho A/ROCK通路关键蛋白的表达,综合利用Si RNA干扰、腺病毒转染、应用抑制剂等方法改变间充质干细胞内Rho A/ROCK信号通路活性,体外向软骨细胞诱导培养中在不同时间节点与AIS组和对照组细胞比较分析软骨细胞细胞增殖、免疫荧光染色、分化标志物表达、下游信号通路关键蛋白表达及其磷酸化水平变化。结果:单细胞转录组测序分析发现AIS间充质干细胞内Rho A/ROCK信号通路异常活跃,蛋白印记检测验证有近50%AIS患者Rho A蛋白表达增强,阿尔新兰染色结果提示其软骨细胞分化能力下降。间充质干细胞体外成软骨细胞诱导培养并在不同时间节点对比分析AIS H-Rho A组、对照组、Rho A干扰表达组、Rho A过表达组、应用ROCK蛋白抑制剂组细胞,发现AIS H-Rho A组细胞内Rho A/ROCK信号通路LIMK、cofilin和MLC蛋白磷酸化水平高于对照组,提示AIS间充质干细胞Rho A/ROCK信号通路的异常活跃,软骨细胞甲苯胺蓝染色、CollagenⅡ和F-actin免疫荧光染色强度弱于对照组,提示其向软骨细胞分化水平降低;干扰Rho A表达或者应用ROCK蛋白抑制剂能够部分降低LIMK、cofilin和MLC的磷酸化水平,并提高甲苯胺蓝染色、CollagenⅡ和F-actin免疫荧光染色强度;在对照组干细胞过表达Rho A蛋白可以提高间充质干细胞内LIMK、cofilin和MLC的磷酸化水平的同时降低向软骨细胞分化的能力。结论:AIS间充质干细胞内高表达的Rho A蛋白可能是Rho A/ROCK信号通路过度激活的启动因素,通过增加下游LIMK、cofilin和MLC蛋白磷酸化水平促进肌动蛋白聚合和细胞骨架重组,间充质干细胞内过度激活的Rho A/ROCK信号通路过度激活在软骨细胞分化过程中发挥抑制作用,并可能因此构成AIS间充质干细胞软骨分化障碍的病因,进一步导致脊柱骨骼生长发育异常参与AIS致病过程。第三章青少年特性脊柱侧凸相关脊柱畸形临床研究第一节青少年特发性脊柱侧凸术后双肩失平衡现象:是否可以预测?目的:术后双肩失平衡是青少年特发性脊柱侧凸手术常见的并发症,能够显着影响患者术后形象和手术的满意度,然而目前针对AIS术后双肩失平衡的研究结果互相矛盾,也并未达成共识。本节研究的目的是探索AIS发生术后双肩失平衡的危险因素,并尝试建立一个全新的AIS术后双肩失平衡的预测公式。方法:选取2012年1月-2015年1月在我院行手术治疗的青少年特发性脊柱侧凸患者进行回顾性分析。测量术前、术后以及末次随访时全脊柱正侧位平片和侧屈位平片。根据末次随访双肩影像学高度（RSH）将患者分为双肩失平衡组和双肩平衡组,进行单因素分析（独立样本t检验）和二元Logistic回归分析术后双肩失平衡的危险因素,建立AIS患者术后双肩失平衡预测公式PSI指数,绘制ROC曲线并计算预测阈值。结果:总共114例AIS患者纳入研究,分为双肩失平衡组（RSH≧10mm）60人和双肩平衡组（RSH<10mm）54人。单因素分析发现两组间术前近胸弯Cobb角（P=0.002）、术前近胸弯Cobb角/术前主胸弯Cobb角比值（P=0.004）、术前近胸弯侧屈位Cobb角（P=0.006）、术前胸腰弯/腰弯侧屈位Cobb角（P=0.050）、术后近胸弯Cobb角（P=0.036）、术后近胸弯顶椎偏移（P=0.006）、末次随访近胸弯顶椎偏移（P=0.004）和adding-on角（P=0.004）存在显着的统计学差异。校正的二元Logistic回归显示术后近胸弯顶椎偏移（P=0.035）和Adding-on角（P=0.026）是AIS患者发生术后双肩失平衡的主要危险因素,并成功建立双肩失平衡的预测公式:PSI指数=1.2*术后近胸弯顶椎偏移+1.1*Adding-on角。绘制受试者工作特征（ROC）曲线计算并计算当PSI指数大于15,AIS患者发生双肩失平衡的概率为87%,反之,当PSI指数小于15,术后双肩平衡的概率则达到80%。结论:术后近胸弯的顶椎偏移和Adding-on角是AIS患者发生术后双肩失平衡的主要危险因素。AIS术后双肩失平衡和adding-on现象互为代偿机制以实现脊柱的整体平衡。本研究成功建立起AIS患者术后双肩失平衡的预测公式:PSI指数=1.2*术后近胸弯的顶椎偏移+1.1*Adding-on角,可以有效地预测AIS患者术后双肩失平衡的发生。因此,我们建议应该充分矫正近胸弯的顶椎偏移,同时通过合理选择融合节段等措施减小adding-on角度,从而预防AIS患者发生术后双肩失平衡。第二节Lenke 1型和2型青少年特发性脊柱侧凸患者术后颈椎倾斜现象:一种新的预测方法目的:颈椎倾斜是青少年特发性脊柱侧凸术后常见的影像学并发症,其与双肩失平衡是不同的术后并发症概念,但同样可以对患者外观形象和健康相关生存质量产生较大影响。然而目前AIS术后颈椎倾斜的相关研究较少,结果也并无定论。因此,本研究致力于研究胸弯型（Lenke 1型和2型）AIS患者术后颈椎倾斜的危险因素,并试图探索全新的预测公式以期有效地预测并减少术后颈椎倾斜的发生。方法:回顾性分析2013年2月至2015年2月在我院行手术治疗的Lenke 1型和2型AIS患者,测量患者术前、术后和末次随访的全脊柱正侧位X光平片、侧屈位X光平片。根据术后颈椎轴向倾斜角（CAT）将患者分为颈椎倾斜组和正常组,单因素分析和二元Logistic回归分析术后颈椎倾斜的危险因素,建立Lenke 1型和2型AIS患者术后颈椎倾斜的预测公式,绘制ROC曲线并计算预测公式的阈值。结果:本研究共纳入102例Lenke 1型和2型AIS患者,根据是否发生术后颈椎倾斜分为颈椎倾斜组41人（CAT≧5°）)和正常组61人（CAT<5°）。两组间的单因素分析发现术后T1倾斜角（P=0.003）、术前近胸弯Cobb角（P<0.001）、术后近胸弯Cobb角（P<0.001）、术后近胸弯顶椎偏移（P<0.001）和术后冠状面平衡（P<0.001）是AIS患者发生术后颈椎倾斜的危险因素。二元Logistic回归结果提示术后近胸弯Cobb角（P=0.0019）和术后冠状面平衡（P<0.001）是Lenke 1型和2型AIS患者发生术后颈椎倾斜的主要危险因素,并成功建立了Lenke 1型和2型AIS患者术后颈椎倾斜的预测公式:PNT指数=1.1*术后近胸弯Cobb角-0.9*术后冠状面平衡。绘制ROC曲线并计算当PNT指数大于10,则Lenke 1型和2型AIS患者发生术后颈椎倾斜的概率为86%,反之,当PNT指数小于10,Lenke 1型和2型AIS患者术后颈椎轴向倾斜角正常的概率则为81%。结论:Lenke 1型和2型AIS患者术后颈椎倾斜的发生率为40.2%,术后近胸弯Cobb角和术后冠状面平衡是AIS发生术后颈椎倾斜的主要危险因素。本研究成功建立起Lenke 1型和2型AIS患者术后颈椎倾斜的预测公式:PNT指数=1.1*术后近胸弯Cobb角-0.9*术后冠状面平衡,可以有效地预测Lenke 1型和2型AIS患者术后颈椎倾斜的发生。据此,我们建议应该尽可能矫正Lenke 1型和2型AIS患者近胸弯的同时适度矫正冠状面平衡,从而预防发生术后颈椎倾斜。
王大伟[3]（2019）在《基于Wnt3a/β-catenin信号通路探究补肾益气活血方对绝经后骨质疏松症疗效机制研究》文中研究说明研究目的:肾虚血瘀为骨质疏松症常见病机,补肾益气活血方临床疗效确切。本研究基于Wnt3a/β-catenin信号通路及骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖成骨分化,探讨补肾益气活血方防治绝经后骨质疏松症的作用机制,为“肾藏精”藏象理论及应用提供部分实验依据,对临床防治绝经后骨质疏松症具有一定的理论意义和应用价值。材料与方法:第一部分:理论研究通过梳理古今文献及检索现代临床研究资料,运用理论分析方法,对骨质疏松症相关的中医学病名、病因、病机、辨证、治疗进行归纳和总结,重点对骨质疏松症病机进入深入的探讨和剖析,阐释骨质疏松症的名、因、机、证、治的深刻内涵。第二部分:体内实验研究将90只SPF级SD雌性大鼠随机分为5组:正常组、模型组、补肾益气活血方低剂量组、补肾益气活血方高剂量组、福善美组（阳性药对照组）。除正常组外,其余各组均使用手术摘除双侧卵巢法建立绝经后骨质疏松症大鼠模型。正常组、模型组以生理盐水灌胃,其余各组灌胃相应等容积实验药物。各组均于手术后第2天给药。每日am9:00准时给药,共计12周。最后一次灌胃后,禁食24h,处死动物,取材检测相应指标。应用qRT-PCR和ELISA法检测各组大鼠骨、肾组织Wnt3a、CyclinD1mRNA及蛋白表达。第三部分:体外实验研究实验细胞来源:OriCellTMWistar大鼠骨髓间质干细胞购于赛业（苏州）生物科技有限公司,细胞复苏及培养参照OriCellTMWistar大鼠骨髓间质干细胞说明书步骤规范操作。实验所用药物:补肾益气活血方的有效组分,按功能配伍分为补肾组、益气活血组、补肾益气活血组。实验三的目的是筛选功能配伍各组促进BMSCs增殖与成骨分化的最佳量效。实验分为11组:正常组;成骨诱导组;补肾高剂量组（1）;补肾中剂量组（2）;补肾低剂量组（3）;益气活血高剂量组（4）;益气活血中剂量组（5）;益气活血低剂量组（6）;补肾益气活血高剂量组（7）;补肾益气活血中剂量组（8）;补肾益气活血低剂量组（9）。分别作用于BMSCs。实验四、五是通过Wnt3a/β-catenin信号通路相关指标观察最佳剂量功能配伍各组对BMSCs增殖与成骨分化的作用机制。Wnt通路抑制剂为DKK1。分为9组:正常组、成骨诱导组、补肾中剂量组（1）;益气活血中剂量组（2）;补肾益气活血中剂量组（3）;成骨诱导+DKK1组（4）;补肾中剂量+DKK1组（5）;益气活血中剂量+DKK1组（6）;补肾益气活血中剂量+DKK1组（7）。实验指标检测:实验三:MTT法检测各组BMSCs24、48、72h增殖情况;ELISA法检测各组细胞12、15d ALP、BGP水平;茜素红染色法观察对15d骨钙结节。实验四:ELISA法检测各组（加入DKK1）15d ALP、BGP水平变化情况;茜素红染色法观察18d骨钙结节;实验五:qRT-PCR法检测各组15dWnt3a、CyclinD1 mRNA表达情况;ELISA法检测各组Wnt3a蛋白表达。实验研究全部采用SPSS17.0统计软件处理实验数据,所有数据以±s表示,体内、体外实验各组数据均用单因素方差分析进行统计分析,P<0.05具有统计学意义。结果:第一部分:理论研究骨质疏松症多归属于中医学的“骨痿”“骨枯”“骨痹”范畴。肾虚髓减,为骨质疏松症发生、发展、变化的基本病机;脾胃虚弱,气血生化乏源;或脾虚及肾,精血互化不及;肝失疏泄,气血失和或运行不畅;或肝肾亏虚,精血不足;久病及肾,多虚多瘀,肾虚血瘀;为骨质疏松症的常见病机;外因多为诱发因素;骨质疏松症性骨折多见气滞血瘀。现代专家共识将骨质疏松症分为肾虚血瘀、肝肾阴虚、气滞血瘀、肾阳亏虚、脾胃虚弱、脾肾阳虚六种证候,以肾虚血瘀证为新增证候,令人关注。临床对于防治肾虚血瘀证骨质疏松症,在补肾方剂中酌情加入益气活血之品,往往可收良效。故本研究补肾益气活血方为基础,开展实验研究,以部分阐明其作用机制。第二部分:体内实验研究1.各组大鼠骨组织Wnt3amRNA表达及蛋白表达变化的情况与正常组比较,模型组骨组织Wnt3a mRNA表达明显降低（P<0.01）;与模型组比较,各用药组骨组织中Wnt3a mRNA表达有不同程度上调（P<0.01）,以福善美组最明显（P<0.01）;福善美组及补肾益气活血高剂量组均可上调骨组织中Wnt3a mRNA表达,两组比较无统计学意义（P>0.05）。与正常组比较,模型组骨组织Wnt3a蛋白表达明显降低（P<0.01）;与模型组比较,各用药组骨组织中Wnt3a蛋白表达有不同程度上调（P<0.01）,以补肾益气活血方高剂量组最明显（P<0.01）;补肾益气活血高剂量组及福善美组均可上调骨组织中Wnt3a蛋白表达,两组比较无统计学意义（P>0.05）。2.各组大鼠骨组织CyclinD1 mRNA表达的变化情况与正常组比较,模型组骨组织CyclinD1 mRNA表达明显降低（P<0.01）;与模型组比较,各用药组骨组织中CyclinD1 mRNA表达有不同程度上调（P<0.01）,以福善美组最明显（P<0.01）;福善美组及补肾益气活血高剂量组均可上调骨组织中CyclinD1mRNA表达,两组比较无统计学意义（P>0.05）。3.各组大鼠肾组织Wnt3amRNA表达及蛋白表达变化的情况与正常组比较,模型组肾组织Wnt3a mRNA表达明显降低（P<0.01）;与模型组比较,各用药组肾组织中Wnt3a mRNA表达有不同程度上调（P<0.01）,以福善美组最明显（P<0.01）;福善美组及补肾益气活血高剂量组均可上调骨组织中Wnt3a mRNA表达,两组比较无统计学意义（P>0.05）。与正常组比较,模型组肾组织Wnt3a蛋白表达明显降低（P<0.01）;与模型组比较,其他各用药组肾组织中Wnt3a蛋白表达有不同程度上调（P<0.01）,以补肾益气活血方高剂量组最明显（P<0.01）;其次为福善美组。4.各组大鼠肾组织CyclinD1 mRNA表达的变化情况与正常组比较,模型组肾组织CyclinD1 mRNA表达明显降低（P<0.01）;与模型组比较,其他各用药组肾组织中CyclinD1 mRNA表达有不同程度上调（P<0.01）,以福善美组最明显（P<0.01）;福善美及补肾益气活血高剂量组均可上调肾组织中CyclinD1 mRNA表达,两组比较无统计学意义（P>0.05）。第三部分:体外实验研究1.24h、48h、72h各组BMSCs增殖情况（实验三）24h:与成骨诱导组比较,补肾高剂量组BMSCs增殖能力提高差异不明显（P>0.05）、补肾中剂量组、补肾益气活血中剂量组BMSCs增殖能力略有升高差异不明显（P>0.05）,其他各用药组BMSCs增殖有所降低,但无统计学意义（P>0.05）。48h:与成骨诱导组比较,补肾高剂量组BMSCs增殖能力提高差异不明显（P>0.05）、益气活血中剂量组、补肾益气活血中剂量组BMSCs增殖能力接近,无统计学意义（P>0.05）,其他各用药组BMSCs增殖有所降低,但无统计学意义（P>0.05）。72h:与成骨诱导组比较,补肾高剂量组、益气活血低剂量组、补肾益气活血中剂量组BMSCs增殖能力接近,无统计学意义（P>0.05）,其他各用药组BMSCs增殖有所降低,但无统计学意义（P>0.05）。2.12d、15d各组细胞ALP水平的变化情况（实验三）12d:与成骨诱导组比较,补肾高、中、低剂量组、益气活血高、中、低剂量组、补肾益气活血低剂量组ALP水平均有下降（P<0.01）,而补肾益气活血高、中剂量组ALP水平与成骨诱导组接近（P>0.05）。15d:与成骨诱导组比较,用药各组ALP水平均有下降（P<0.01）;其中,补肾中剂量组、益气活血中剂量组、补肾益气活血高、中剂量组ALP水平略高,但无统计学意义（P>0.05）。3.12d、15d各组细胞BGP水平的变化情况（实验三）12d:与成骨诱导组比较,用药各组BGP水平均有下降（P<0.01）,其中,补肾中剂量组、补肾益气活血高、中、低剂量组BGP水平略高,但无统计学意义（P>0.05）。15d:与成骨诱导组比较,用药各组BGP水平均有下降（P<0.01）;其中,补肾益气活血高、中、低剂量组BGP水平略高,但无统计学意义（P>0.05）。4.15d细胞形态学骨钙结节情况（实验三）从茜素红染色对骨钙结节的细胞形态学观察,以成骨诱导组、补肾中剂量组、补肾益气活血中剂量组最为明显,提示在BMSCs成骨分化过程中对骨钙结节形成有促进作用。5.15d各组细胞（用药组加入DKK1）ALP水平的变化情况（实验四）与正常组比较,成骨诱导组ALP水平明显升高（P<0.01）;成骨诱导+DKK1组ALP水平明显上升（P<0.01）。与成骨诱导组比较,益气活血组ALP水平有显着性差异（P<0.01）;补肾组、补肾益气活血组略有降低（P<0.01）。与成骨诱导组+DKK1组比较,补肾+DKK1组、益气活血+DKK1组、补肾益气活血+DKK1组ALP水平均有降低（P<0.01）,但补肾益气活血组ALP水平比补肾+DKK1组、益气活血+DKK1组明显升高（P<0.01）。6.15d各组细胞（用药组加入DKK1）BGP水平的变化情况（实验四）与正常组比较,成骨诱导组BGP水平明显升高（P<0.01）;成骨诱导+DKK1组BGP水平明显上升（P<0.01）。与成骨诱导组比较,补肾组BGP水平无显着性差异（P>0.05）;益气活血组、补肾益气活血组略有降低（P>0.05）。与成骨诱导组+DKK1组比较,补肾+DKK1组、益气活血+DKK1组、补肾益气活血+DKK1组BGP水平均有降低（P<0.01）,但补肾益气活血+DKK1组BGP水平比补肾+DKK1组、益气活血+DKK1组明显升高（P<0.01）。7.18d（用药组加入DKK1）细胞形态学骨钙结节情况（实验四）从茜素红染色对骨钙结节的细胞形态学观察,以成骨诱导组、补肾中剂量组、补肾益气活血中剂量组最为明显,提示在BMSCs成骨分化过程中对骨钙结节形成有促进作用。8.15d各组细胞（用药组加入DKK1）Wnt3a mRNA及蛋白表达情况（实验五）与正常组比较,成骨诱导组Wnt3a mRNA表达明显上调（P<0.01）;成骨诱导+DKK1组Wnt3a mRNA表达明显降低（P<0.01）;与成骨诱导组比较,补肾组、益气活血组Wnt3a mRNA表达明显降低（P<0.01）,补肾益气活血组有所上调（P<0.01）;与成骨诱导+DKK1组比较,补肾益气活血+DKK1组Wnt3a mRNA表达明显上调（P<0.01）;补肾+DKK1组明显上调（P<0.01）。与正常组比较,成骨诱导组、成骨诱导+DKK1组Wnt3a蛋白表达明显上调（P<0.01）;与成骨诱导组比较,补肾组、益气活血组、补肾益气活血组Wnt3a蛋白表达则有所降低（P<0.01）;与成骨诱导+DKK1组比较,补肾益气活血+DKK1组Wnt3a蛋白表达无明显差异（P>0.05）,益气活血+DKK1组明显降低（P<0.01）。9.15d各组细胞（用药组加入DKK1）CyclinD1mRNA表达情况（实验五）与正常组比较,成骨诱导组明显上调（P<0.01）;与成骨诱导组比较,补肾益气活血组CyclinD1mRNA表达明显上调（P<0.01）,补肾组、益气活血组则有所降低（P<0.05）;与成骨诱导+DKK1组比较,补肾益气活血+DKK1组CyclinD1mRNA表达明显上调（P<0.01）,其次为补肾+DKK1组（P<0.05）,益气活血+DKK1组则无明显差异（P>0.05）。结论:1.骨质疏松症属于中医学“骨痿”“骨枯”“骨痹”的范畴,其发病脏腑主要责之肾、肝、脾。肾虚髓减为骨质疏松症的基本病机,贯穿病变始终;脾胃虚弱、肝肾亏虚、脾肾不足、肾虚血瘀等为骨质疏松症的常见病机。故临床治疗多以补肾益髓、补益肝肾、健脾养血、益气活血为主。2.补肾益气活血方可以上调绝经后骨质疏松症模型大鼠骨、肾组织Wnt3a、CyclinD1mRNA表达及Wnt3a蛋白表达,从而起到防治骨质疏松症的作用。3.补肾益气活血方有效组分功能配伍,补肾、益气活血、补肾益气活血方各组均可以促进BMSCs增殖和成骨分化,以补肾益气活血方有效组分效果最为明显,可以升高ALP、BGP水平,促进骨钙结节形成。4.BMSCs成骨分化与Wnt细胞通路上游启动蛋白Wnt3a mRNA及蛋白表达、下游蛋白CyclinD1mRNA表达有关;在Wnt通路抑制剂DKK1作用下,补肾益气活血方有效组分可以对Wnt信号通路的抑制具有激活作用,有效上调Wnt3a/β-catenin信号通路上游启动蛋白Wnt3a的mRNA及蛋白表达、下游相关指标CyclinD1mRNA表达,从而起到防治骨质疏松症的作用。5.补肾益气活血方及其有效组分能够通过调控Wnt3a/β-catenin信号通路,对骨质疏松症发挥防治的作用。
李平[4]（2018）在《HB-EGF在骨发育及骨代谢中的作用》文中提出肝素结合表皮生长因子HB-EGF属于EGF超家族,它可以在蛋白酶的作用下形成可溶性形式,通过自分泌或旁分泌作用发挥功能。有报道称关节炎病人样本及关节手术造模鼠中HB-EGF表达升高,EGFR信号通路被激活。HB-EGF还可以通过调控成骨细胞相关基因表达促进破骨细胞的形成。本课题在前人研究基础上,使用Cre/lox P技术,构建了间质干细胞（MSC）、软骨细胞、破骨细胞中特异性过表达或敲除HB-EGF的突变体小鼠,系统研究HB-EGF在骨骼系统中的作用及潜在机制。我们发现在Dermo1标记的MSC中特异性敲除HB-EGF时,敲除鼠骨骼大小和关节软骨均无异常,而骨量及骨密度都有一定程度上升。相反,Dermo1标记的MSC中过表达HB-EGF,小鼠骨量及骨密度均显着下降,骨形成明显减弱且骨矿化不足。组织学研究发现,实验鼠关节严重畸形,关节膨大,关节软骨退化,关节软骨下有内生软骨瘤样结构。进一步分析还发现,生长板软骨增殖增加,关节软骨纤维化显着提高,并且Dermo1-HB-EGF小鼠脊柱软骨板也有软骨瘤样表型。与此同时,本研究发现MSC中过表达HB-EGF的小鼠中,破骨细胞的数量及分化并未受到影响。为了更全面的说明HB-EGF对骨代谢的作用,我们构建了在Ly M标记的破骨祖细胞中过表达HB-EGF的小鼠。实验鼠骨骼大小和生长板软骨均无异常,骨量及骨密度均无变化。实验鼠骨髓细胞体外破骨分化能力没有差别,这说明自分泌及旁分泌的HB-EGF对成骨-破骨之间的偶联及破骨细胞自身的调控都没有作用。通过分子生物学研究发现,HB-EGF通过激活EGFR信号下游的Erk及Akt信号通路促进MSC的增殖。另外,HB-EGF通过抑制BMP信号通路下游Smad1/5/8信号抑制MSC分化。EGFR信号通路的抑制剂AG1478对过表达小鼠软骨异常表型具有良好的挽救作用。综上所述,本研究首次发现并详细的分析了HB-EGF在小鼠骨骼发育及骨代谢中的作用。研究结果表明HB-EGF在MSC中无论敲除和过表达都会对成年之后骨代谢平衡产生影响,MSC中敲除HB-EGF不影响软骨的正常发育,相反HB-EGF的过表达却对关节及生长板的发育造成严重破坏,导致软骨发育缺陷和关节炎的发生。以上研究结果拓展了我们对关节炎的发生及内生软骨瘤的产生的认识,也为临床提供了新的检测指标和治疗策略。
李鹏飞[5]（2018）在《唑来膦酸辅助治疗脊柱破骨细胞瘤的实验研究及临床应用》文中进行了进一步梳理第一部分唑来膦酸抑制体外培养破骨细胞功能的实验研究目的:双膦酸盐类药物是瑞士所研发,并逐渐应用于临床的一类调节骨代谢的药物。唑来膦酸的化学结构与焦磷酸比较相似,能够抵抗一些酶的水解作用。唑来膦酸可以抑制破骨细胞所介导下的骨质代谢和吸收。国外文献报道早在1980年左右,第一代双膦酸盐类药物即逐渐开始用于老年骨质疏松症的预防治疗。但有学者研究发现长期或大剂量使用唑来膦酸时,发现唑来膦酸可以阻止正常骨组织的矿化作用,甚至引起骨折。唑来膦酸是由瑞士诺华公司所研发的咪唑杂环双膦酸盐。唑来膦酸属于第三代的双膦酸盐类药物。文献报道唑来膦酸首先在加拿大首次临床应用。随后唑来膦酸逐渐在全球80多个国家和地区获得批准。唑来膦酸用于治疗恶性肿瘤所致高钙血症疗效满意。以及唑来膦酸用于治疗多发性的骨髓瘤和实体瘤的骨转移均有良好的疗效。该药唑来膦酸能有效的治疗高钙血症患者。同时,唑来膦酸对于晚期肿瘤骨转移和变形性骨炎,可以降低骨相关事件的发生。唑来膦酸能够明显缓解患者症状,提高患者生活质量。唑来膦酸生物活性目前已被临床前试验证实。唑来膦酸是至今已发现的双膦酸盐类药物中抗骨吸收能力最强的。唑来膦酸作用约是前几代双膦酸盐类药物的100倍到850倍。唑来膦酸同时也是目前FDA批准对实体瘤骨转移有效的双膦酸盐药物之一。我们将唑来膦酸治疗脊柱破骨细胞瘤,发现其治疗效果确切。但是,我们对于唑来膦酸抑制破骨细胞功能的特点尚未完全了解。因此我们课题组设计了此项实验研究,目的是通过实验手段明确唑来膦酸抑制体外培养破骨细胞功能的特点。方法:取6周龄C57小鼠骨髓单核细胞体外培养,由小鼠骨髓单核细胞诱导分化产生破骨细胞。实验组根据体外培养液中加入唑来膦酸的浓度不同。逐级分为:1×10-8mol/L,1×10-7mol/L,1×10-6mol/L,1×10-5mol/L,1×10-4mol/L。并且实验设置不含有任何双膦酸盐类药物的缓冲液作为对照组。通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）;进行多核细胞计数。计算通过滤网细胞计数。进行附壁细胞计数和骨吸收陷窝计数。分别观察不同浓度唑来膦酸对体外培养破骨细胞的抑制作用特征。结果:OCLs早期（60min）即附壁生长,培育5天后,发现随着唑来膦酸浓度的增大,实验组多核细胞数量随着浓度的增加而减少。唑来磷酸抑制体外破骨细胞形成的最低有效抑制浓度为1×10-6mol/L。在1×10-5mol/L浓度下抑制破骨细胞迁移和骨吸收的作用更为显着;在1×10-4mol/L浓度下效果进一步增强,但浓度和抑制能力相关曲线逐渐趋于平缓。小结:不同浓度唑来膦酸对破骨细胞分化形成、附壁、迁移和骨吸收作用的影响程度不同。1×10-6mol/L浓度的唑来膦酸有明显抗破骨细胞作用。第二部分关于唑来膦酸和伊班膦酸抑制破骨细胞特征比较的实验研究目的:鉴于之前培养破骨细胞的经验,我们进一步对于伊班膦酸抑制破骨细胞的特征进行研究。唑来膦酸和伊班膦酸均为临床工作中常用的双膦酸盐类药物。在治疗破骨细胞瘤的过程中发现,当伊班膦酸的抑制作用减弱,破骨细胞瘤复发时,应用唑来膦酸治疗复发的破骨细胞瘤依然有效。同时,在临床应用中发现,静脉应用4mg唑来膦酸的药物作用效果较强,但是药物不良反应发生率较高。如:流感样症状、下颌骨坏死、肾功能异常、发热等。静脉应用4mg伊班膦酸的药物作用效果虽然较唑来膦酸弱,但是这些不良反应发生率及程度均较轻。我们此次研究即通过体外实验研究的方法,发现唑来膦酸和伊班膦酸抑制破骨细胞特征。通过比较唑来膦酸和伊班膦酸的抑制曲线,发现唑来膦酸和伊班膦酸的最低有效浓度,以此来指导临床应用。方法:取6周龄C57小鼠骨髓单核细胞体外培养,由小鼠骨髓单核细胞诱导分化产生破骨细胞。唑来膦酸组根据体外培养液中加入唑来膦酸的浓度不同。进一步逐级分为:1×10-8mol/L,1×10-7mol/L,1×10-6mol/L,1×10-5mol/L,1×10-4mol/L,1×10-3mol/L。伊班膦酸组根据体外培养液中加入唑来膦酸的浓度不同。逐级分为:1×10-8mol/L,1×10-7mol/L,1×10-6mol/L,1×10-5mol/L,1×10-4mol/L,1×10-3mol/L。并且实验设置不含有任何双膦酸盐类药物的缓冲液作为对照组。通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）;进行多核细胞计数。计算通过滤网细胞计数。进行附壁细胞计数和骨吸收陷窝计数。分别观察不同浓度唑来膦酸和伊班膦酸对体外培养破骨细胞的抑制作用特征,并对两者进行比较。结果:OCLs培育5天后,发现随着唑来膦酸和伊班膦酸浓度的逐级增大,唑来膦酸组和伊班膦酸组多核细胞数量随着浓度的增加而减少。唑来磷酸抑制体外破骨细胞形成的最低有效抑制浓度为1×10-6mol/L。在1×10-5mol/L浓度下抑制破骨细胞迁移和骨吸收的作用更为显着;在1×10-4mol/L、1×10-3mol/L浓度下效果进一步增强,但浓度和抑制能力相关曲线逐渐趋于平缓。然而,伊班磷酸抑制体外破骨细胞形成的最低有效抑制浓度为1×10-5mol/L。在1×10-4mol/L浓度下抑制破骨细胞迁移和骨吸收的作用更为显着;在1×10-3mol/L浓度下效果进一步增强,但浓度和抑制能力相关曲线逐渐趋于平缓。小结:伊班膦酸在1×10-5mol/L浓度下才能发挥有效抗破骨细胞作用,为最低有效抑制浓度。相比,1×10-6mol/L浓度的唑来磷酸即有明显的抗破骨细胞作用。第三部分基于双膦酸盐类药物辅助治疗脊柱破骨细胞瘤的临床研究目的:破骨细胞瘤属于良性的侵袭性的肿瘤,发生于四肢的骨巨细胞瘤治疗方法及手术种类多样,并且治疗效果好。但是脊柱的骨巨细胞瘤会造成严重的后果。手术操作空间较小,术中的出血较多,脊髓在手术过程中可能出现损伤造成术后的神经症状。并且,脊柱骨巨细胞瘤尤其是骶骨的骨巨细胞瘤治疗尤为棘手。术中出血较多,手术视野模糊,造成神经分布及走形术中分辨不清。同时,扩大切除的副作用非常大,出血多可以导致休克,神经损伤可以造成大小便失禁及瘫痪。但是脊柱破骨细胞瘤仍然难以完全刮除,术后复发率非常高,文献报道甚至高达百分之五十。但是临床发现脊柱破骨细胞瘤切刮术后应用化疗无效。传统的辅助治疗为放射治疗,但是放射治疗可能引起伤口难以愈合、破骨细胞肿瘤的肉瘤变。因此,本研究回顾性分析脊柱破骨细胞瘤术后采用不同辅助治疗方法的临床病例进行统计学分析,旨在进一步完善脊柱破骨细胞瘤切刮术后的辅助治疗方法。方法:2008年7月至2016年7月,回顾性分析128例脊柱破骨细胞瘤患者,在华北地区六个地级市开展脊柱破骨细胞瘤术后辅助治疗方法的临床病例进行统计学研究。唑来膦酸组患者33例,脊柱切刮植骨融合内固定术后每月应用唑来膦酸4mg治疗,疗程24个月。伊班膦酸组患者32例,脊柱切刮植骨融合内固定术后每月应用伊班膦酸4mg治疗,疗程24个月。常规放疗组患者31例,术后应用常规放疗。即采用直线加速器X射线进行照射。照射野为肉眼所见的破骨细胞瘤;以及肿瘤床边缘向外扩大2cm。照射肿瘤吸收剂量为30到50Gy,每次2Gy,每周5次。狄诺塞麦组患者32例,脊柱切刮植骨融合内固定术后每月应用狄诺塞麦皮下注射120mg治疗,疗程24个月。所有脊柱破骨细胞瘤患者术前必须行MRI检查。同时所有患者术前及术后随访均行脊柱正侧位X线、脊柱椎体CT平扫及二维重建检查。对四组患者的实际手术时间、术中出血量、术后伤口愈合情况、伤口引流量等指标进行统计学比较。同时比较四组患者术后采用辅助治疗的临床治疗效果评分、破骨细胞肿瘤复发率、病灶骨化率。术后辅助治疗的不良反应发生情况。结果:本临床研究对脊柱切刮植骨融合内固定术后患者规律随访26个月到86个月,平均58个月。对四组患者的实际手术时间、术中出血量、术后伤口愈合情况、伤口引流量等指标进行统计学比较无明显学意义（P﹥0.05）。四组患者术后临床疗效VAS评分和ODI评分比较有明显统计学意义（P﹤0.01）。唑来膦酸组术后肿瘤复发率为6.0%,伊班膦酸组为12.5%,常规放疗组为32.2%,狄诺塞麦组为3.1%。四组术后肿瘤复发率比较有统计学意义（P﹤0.01）。唑来膦酸组椎体修复重建率为86.6%,伊班膦酸组为76.2%,常规放疗组为58.5%,狄诺塞麦组为92.8%。四组术后椎体修复重建率比较有统计学意义（P﹤0.01）。唑来膦酸组不良反应发生率为51.5%,伊班膦酸组为31.2%,常规放疗组皮肤红肿及伤口愈合差等不良反应发生率为51.6%,狄诺塞麦组为12.5%。四组术后不良反应发生率比较有统计学意义（P﹤0.01）。小结:脊柱骨巨细胞瘤切刮植骨术后仅应用常规放疗的肿瘤复发率依然较高。唑来膦酸、伊班膦酸、狄诺塞麦均能够明显降低脊柱骨巨细胞瘤切刮植骨术后复发率。第四部分基于胸椎破骨细胞瘤术后应用唑来膦酸的临床疗效观察目的:胸椎破骨细胞瘤虽然多属于侵袭性的良性肿瘤。但是,由于胸椎解剖结构特殊,胸椎破骨细胞瘤的切刮术中椎体后方的胸髓意外损伤非常容易造成截瘫、大小便失禁。因此,对于胸椎的破骨细胞瘤治疗非常棘手。胸椎破骨细胞瘤的切刮手术比较困难。术者必须要尽量在出血的模糊视野中尽量切刮肿瘤。同时,要尽量避免损伤脊髓。因此传统的胸椎破骨细胞瘤切刮手术很难将肿瘤病灶清除干净。基于胸椎破骨细胞瘤的难治性,学者们在临床工作中进行了反复的探索。摸索胸椎破骨细胞瘤治疗经验。部分学者通过改良手术方式,完整切除及次全切除病变椎体;部分学者通过术后规律的辅助治疗降低术中并发症及防止肿瘤术后复发。因此,本研究通过分析胸椎破骨细胞瘤改良手术方式及术后规律辅助治疗方法的实际手术时间、术中出血量、术后伤口愈合情况、伤口引流量、肿瘤复发率、病灶骨化率、不良事件发生情况等指标,旨在进一步讨论此两种不同思维指导下治疗方式的临床疗效。方法:2011年7月至2016年7月,回顾性分析62例胸椎破骨细胞瘤患者。整体切除组患者32例,行胸椎破骨细胞瘤整体切除植骨融合内固定术。病灶切刮组患者30例,行胸椎破骨细胞瘤切刮植骨融合术后每月应用唑来膦酸4mg治疗,疗程24个月。所有胸椎破骨细胞瘤患者术前必须行MRI检查。同时所有患者术前及术后随访均行脊柱正侧位X线、脊柱椎体CT平扫及二维重建检查。对两组患者的实际手术时间、术中出血量、术后伤口愈合情况、伤口引流量等指标进行统计学比较。同时比较两组患者的术后临床治疗效果评分、破骨细胞肿瘤复发率、病灶骨化率。围手术期以及术后不良事件发生情况。结果:本临床研究对脊柱切刮植骨融合内固定术后患者规律随访25个月到58个月,平均36个月。对两组患者的实际手术时间、术中出血量、术后伤口愈合情况、伤口引流量等指标进行统计学比较有明显学意义（P﹤0.01）。两组患者术后临床疗效VAS评分和ODI评分比较有明显统计学意义（P﹤0.01）。整体切除组术后肿瘤复发率为6.3%,病灶切刮组为6.7%。两组术后肿瘤复发率比较无统计学意义（P﹥0.05）。整体切除组病灶骨化率为89.6%,病灶切刮组为86.5%。两组术后不良反应发生率比较无统计学意义（P﹥0.05）。整体切除组不良事件发生率为53.3%,病灶切刮组为12.5%。两组术后不良反应发生率比较有统计学意义（P﹤0.01）。小结:临床研究发现胸椎破骨细胞瘤整体切除植骨融合内固定术是一种有效降低术后肿瘤复发率的手术方式。胸椎骨巨细胞瘤切刮植骨手术风险相对较小,术后应用双膦酸盐类药物辅助治疗亦取得良好临床效果。结论:1.双膦酸盐类药物在体外实验中可明显抑制破骨细胞的形成、迁移、吸附、骨吸收等作用。2.临床研究发现双膦酸盐类药物对于术后复发的破骨细胞瘤有明确的抑制作用,适合原发及复发破骨细胞瘤术后的辅助治疗,可以逐渐临床应用。3.唑来膦酸作为药效最强的双膦酸盐类药物,抑制破骨细胞形成、迁移、吸附、骨吸收等作用最为强大,其发挥明显抑制破骨细胞的有效药物浓度最低。
陈丽珍[6]（2015）在《基于细胞水平抗骨质疏松中药筛选研究》文中进行了进一步梳理骨质疏松症是危害人类健康的主要疾病之一,寻找切实有效的抗骨质疏松药物已成为当今医药领域的重大课题。中药以其资源丰富、价格便宜、毒副作用小等诸多优势在防治骨质疏松症方面具有较大的潜力与优势。随着中药现代化的发展,中药治疗骨质疏松可望深入到细胞分子水平并从中筛选出高效、稳定、低毒的中药单体或复方组分,充分发挥中药防治骨质疏松症的优势。本研究目的是基于细胞水平筛选具有抑制骨吸收、促进骨形成作用的中药。第一部分进行了体外破骨细胞和成骨细胞的培养。采用1α,25-（OH）2VitD3诱导兔骨髓细胞法获得破骨细胞,以形态学观察、HE染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色来鉴定破骨细胞;培养MC3T3-E1Subclone 14（小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14）细胞,采用碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色鉴定成骨细胞。第二部分进行了中药的选择和制备。根据骨质疏松的中医病因病机,从20余种具有补肝肾、强筋骨、和胃健脾、活血化瘀等功能的中药处方中选出30余种具有潜在的抗骨质疏松药理作用的中药。然后对中药进行了75%醇提和水煎,得到20余种中药粗提物浸膏。第三部分进行了中药对破骨细胞活性作用的研究。采用TRAP染色阳性细胞计数、TRAP活力测定和骨吸收陷窝的数量及面积为指标检测每种中药醇提物和水煎物的低、中、高剂量组（2 mg/L、20 mg/L、200 mg/L）对破骨细胞活性作用的影响。结果表明:黄柏、大血藤、豨莶草、槲寄生、锁阳、当归、吴茱萸、韭菜子、狗脊、威灵仙、续断的醇提物和水煎物对破骨细胞活性有显着性的抑制作用,且成剂量依赖性;墨旱莲、红花、肉苁蓉、黄芪的水煎物对破骨细胞活性有显着性的抑制作用,且成剂量依赖性;木瓜、女贞子醇提物对破骨细胞活性有显着性的抑制作用,且成剂量依赖性;何首乌醇提物和水煎物破骨细胞活性有显着性抑制作用;独活和牛膝对破骨细胞活性基本没有抑制作用。第四部分进行了中药对成骨细胞增殖分化作用的研究。采用MTT法检测中药对成骨细胞增殖作用的影响,结果表明:黄柏、大血藤、墨旱莲、红花、木瓜、续断、女贞子、牛膝的醇提物和水煎物高剂量组对成骨细胞增殖均有显着性的抑制进作用,低、中剂量组均能显着性促进成骨细胞增殖;槲寄生、肉苁蓉、何首乌、吴茱萸均对成骨细胞的增殖有促进作用,其中,槲寄生醇提物和水煎物高剂量组具有显着性的促进作用,肉苁蓉醇提物各剂量组和水煎物高剂量组具有显着性的促进作用,何首乌醇提物和水煎物低、中剂量组具有显着性的促进作用,吴茱萸醇提物高剂量组和水煎物各剂量组具有显着性的促进作用;威灵仙醇提物能促进成骨细胞增殖,但不具有显着性差异,水煎物抑制成骨细胞增殖;当归除醇提物高剂量组外均能促进成骨细胞增殖,其中醇提物中剂量组和水煎物高剂量组具有显着性差异;狗脊、黄芪、独活的醇提物和水煎物高剂量组及黄芪、独活的醇提物中剂量组均抑制成骨细胞增殖,其他剂量组均能促进增殖且狗脊和独活低剂量组具有显着性差异;豨莶草、锁阳、韭菜子抑制成骨细胞的增殖,韭菜子具有显着性抑制作用。采用ALP活力测定检测中药对成骨细胞分化作用的影响,结果表明:黄柏、大血藤、狗脊、红花、黄芪、续断、牛膝的醇提物和水煎物均能显着性促进成骨细胞分化,其中中剂量组促进作用最好;槲寄生、吴茱萸、锁阳、墨旱莲、木瓜的醇提物和水煎物均能显着性促进成骨细胞分化,且成剂量依赖性;当归、肉苁蓉的醇提物和水煎物均能显着性促进成骨细胞分化,醇提物中剂量促进作用最好,水煎物成剂量依赖性;女贞子醇提物和水煎物均能显着性促进成骨细胞分化,醇提物成剂量依赖性,水煎物中剂量促进作用最好;豨莶草、何首乌的醇提物和水煎物低、中剂量组能显着性促进成骨细胞分化,中剂量组作用最好;独活的醇提物低、中剂量组和水煎物中剂量组能显着性促进成骨细胞分化,中剂量组作用最好;韭菜子、威灵仙醇提物和水提物虽然能促进成骨细胞分化,但不具有显着性差异。综上所述,本研究通过体外破骨细胞模型和成骨细胞模型筛选发现,既能抑制骨吸收又能促进骨形成的中药有:黄柏、大血藤、墨旱莲、红花、木瓜、续断、女贞子、槲寄生、肉苁蓉、何首乌、吴茱萸、当归、黄芪、狗脊、锁阳;抑制骨吸收的中药有:豨莶草、韭菜子、威灵仙;促进骨形成的中药有:牛膝、独活。
杨婷[7]（2014）在《骨髓间充质干细胞Wnt5a/Ror2信号调控颞下颌关节骨关节病模型大鼠软骨下骨的改建》文中研究指明颞下颌关节紊乱病（temporomandibular joint disorder，TMD）是口腔临床的常见疾病。颞下颌关节（temporomandibular joint，TMJ）骨关节病（osteoarthrosis，OA）是TMD中最严重的类型。OA主要表现为软骨的退变和软骨下骨的异常改建。软骨下骨的改建参与了OA的病理进程。由成骨细胞和破骨细胞活性异常增强引起的软骨下骨骨转换增加是OA的主要标志之一。由于早期OA在临床上难以诊断，因此动物实验为研究OA早期病理变化提供了可能。我课题组建立的前牙单侧反牙合（unilateral anterior crossbite，UAC）模型可导致TMJ髁突OA样改变。在以往的研究中，我们发现，UAC可致大鼠TMJ髁突软骨下骨骨量丢失，伴破骨细胞活性增强、成骨细胞活性先减弱（实验2W）后增强（实验4W）。在本实验中，我们通过TRAP和免疫组织化学染色检测大鼠TMJ髁突软骨下骨中破骨细胞和成骨细胞的数量。结果显示，UAC可致大鼠TMJ髁突软骨下骨中破骨细胞数量在2W时减少（P<0.05），在4W和8W时增多（P<0.05），而成骨细胞数量在2W、4W和8W时均减少（P<0.05）。破骨细胞和成骨细胞数量和活性的不匹配导致大鼠TMJ髁突软骨下骨的异常改建。成骨细胞活性的增强不足以弥补破骨细胞活性显着增强引起的骨吸收，最终导致软骨下骨骨量的丢失。由于UAC大鼠TMJ髁突软骨下骨中破骨细胞活性从实验2W开始增强，而成骨细胞活性从4W开始增强。因此，我们对实验2W和4W组进一步进行了细胞和分子水平的研究。骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）具有向成骨细胞分化的潜能，在骨修复中起重要作用。那么，UAC是否通过降低BMSCs的数量导致大鼠TMJ髁突软骨下骨中成骨细胞数量减少？流式细胞术检测显示，UAC在4W时可致大鼠TMJ髁突软骨下骨骨髓细胞中BMSCs比例降低（P<0.001），这可能是4W时大鼠TMJ髁突软骨下骨中成骨细胞数量减少的原因。此外，UAC是否通过改变BMSCs本身的成骨能力导致大鼠TMJ髁突软骨下骨中成骨细胞活性的改变？我们体外培养2W和4W组大鼠TMJ髁突软骨下骨中的BMSCs，并对其增殖、成骨分化和趋化能力进行进一步研究。结果显示，2W时，BMSCs的增殖、成骨分化和趋化能力降低，伴Runx2mRNA的表达和Rankl/Opg比例降低，这可能是2W时大鼠TMJ髁突软骨下骨中成骨细胞数量和活性降低的原因。而4W时，BMSCs的增殖、成骨分化和趋化能力增高，伴Runx2mRNA的表达和Rankl/Opg比例升高，这可能是4W时TMJ髁突软骨下骨中成骨细胞活性增强的原因。以上结果说明UAC可通过改变软骨下骨局部BMSCs的成骨能力调控大鼠TMJ髁突软骨下骨的骨形成。破骨前体细胞与成骨细胞系细胞之间的细胞-细胞相互接触对破骨细胞的形成是必须的。由于位置上的接近性，BMSCs在破骨前体细胞的分化中可能较成熟成骨细胞更为重要。并且，BMSCs能够促进破骨前体细胞向骨表面迁移。为此，我们检测了体外培养的大鼠TMJ髁突软骨下骨中BMSCs在破骨前体细胞的趋化和分化中的作用。结果显示，UAC可致BMSCs在2W时抑制破骨前体细胞的迁移（P<0.001），这可能是2W时大鼠TMJ髁突软骨下骨中破骨细胞数量减少的原因。而在4W时UAC可促进BMSCs诱导的破骨前体细胞的迁移（P<0.001）和分化（P<0.05），伴BMSCs中CXCL12蛋白水平和Rankl/Opg mRNA比例的升高，这可能是4W时大鼠TMJ髁突软骨下骨中破骨细胞数量和活性增高的原因。以上结果说明UAC可通过改变软骨下骨局部BMSCs诱导的破骨前体细胞的迁移和分化调控大鼠TMJ髁突软骨下骨的骨吸收。Real-time PCR结果显示，UAC可致体外培养的大鼠TMJ髁突软骨下骨中BMSCs在4W时高表达Wnt5a和Ror2。文献报道，Wnt5a在细胞功能的调控方面发挥着重要的作用，包括细胞的迁移，以及成骨细胞和破骨细胞的形成等。这就提示我们，Wnt5a/Ror2通路可能参与了BMSCs介导的软骨下骨改建的调控。结果显示，外源性Wnt5a可促进GFP-BMSCs的成骨分化及其诱导的RAW264.7细胞的趋化和分化。抑制GFP-BMSCs中Ror2的表达，可下调Runx2、Cxcl12的表达和Rankl/Opg比例，并抑制GFP-BMSCs的成骨分化（P<0.001）及与其共培养的RAW264.7细胞的迁移（P<0.01）。此外，JNK抑制剂SP600125将Wnt5a引起的GFP-BMSCs向成骨细胞的分化降低到四组（JNK、Ca2+/NFAT、TGF-β和NF-κB抑制组）中的最低水平（P<0.001）。而文献报道，JNK通路能够通过增强Runx2的活性，促进BMSCs向成骨细胞的分化。Ca2+/NFAT抑制剂Cyclosporin A能将Wnt5a刺激的BMSCs诱导的破骨前体细胞的迁移降低到对照水平以下（P<0.001），并抑制破骨前体细胞向破骨细胞的分化（P<0.05）。文献报道，成骨细胞中Ca2+/NFAT通路通过调控趋化因子的表达，促进破骨前体细胞的募集。而RANKL可激活破骨前体细胞中的Ca2+/NFAT通路促进破骨细胞形成。以上结果说明BMSCs中的Wnt5a/Ror2信号一方面可通过上调Runx2的表达促进其自身的成骨分化，另一方面可通过上调Cxcl12和Rankl的表达促进BMSCs诱导的破骨前体细胞的趋化和分化。从而增强TMJ髁突软骨下骨的骨转换并最终导致骨量的丢失。综上所述，UAC可造成大鼠TMJ髁突软骨下骨BMSCs本身成骨能力及BMSCs诱导的破骨前体细胞的趋化和分化能力的改变，进而影响成骨细胞和破骨细胞的细胞学行为。BMSCs中Wnt5a/Ror2通路可能参与了该过程。UAC造成的大鼠TMJ髁突软骨下骨的异常改建，使得成骨细胞形成的新骨不足以修复破骨细胞吸收的骨量，最终导致了TMJOA早期软骨下骨骨吸收的表型。本研究从细胞学和分子学水平阐述了异常生物力致大鼠TMJ髁突软骨下骨异常改建的机理，为TMJOA的发生提供了新的解释。
张睿[8]（2011）在《M-CSF RANKL 1,25-（OH）2D3对破骨细胞形成分化影响的比较研究》文中研究表明目的:利用全骨髓细胞培养系,研究M-CSF、RANKL和1,25-（OH）2D3对体外诱导培养的破骨细胞形成及分化的影响,探讨三种细胞因子间相互作用及协同作用,为进一步研究破骨细胞及合理选用细胞因子提供依据。方法:选用4周龄SD雄性大鼠（体重80-120g）,利用全骨髓细胞培养系,进行体外破骨细胞诱导培养,观察M-CSF、RANKL和1,25-（OH）2D3对破骨细胞形成及分化的影响,同时比较三种细胞因子的作用。1细胞培养及细胞因子添加:1.1全骨髓细胞培养:取4周龄SD雄性大鼠一只（80—120g）,异氟烷麻醉后,无菌条件下取其股骨和胫骨,剪掉骨垢端暴露骨髓腔,用10ml无菌注射器抽取不含胎牛血清的α-MEM培养液冲洗骨髓腔,收集全骨髓细胞,将所提取的细胞悬液充分吹打至没有细胞团块后,置于离心机内离心5分钟（1500转/分）,弃去上清液,加入含15%胎牛血清的α-MEM培养液,充分吹打混匀后形成单细胞悬液,用细胞计数板计算细胞数,计算出细胞原液浓度,然后配制浓度为2×106cells/ml的细胞悬液,加入青霉素100单位/ml和链霉素100ug/ml。将细胞播种于24孔培养板（4行6列）中,每孔加入浓度为2×106cells/ml的细胞悬液0.5ml。1.2细胞因子的添加:24孔培养板第一列为对照组,不添加任何药物;第二列加入1,25-（OH）2D3(1×10-8Mol/ml);第三列加入1,25-（OH）2D3+RANKL( 1,25-（OH）2D3 1×10-8Mol/ml +RANKL 20ng/ml );第四列加入1,25-（OH）2D3+M-CSF(1,25-（OH）2D3 1×10-8Mol/ml +M-CSF 20ng/ml);第五列加入1,25-（OH）2D3+M-CSF+RANKL(1,25-（OH）2D3 1×10-8 Mol/ml +M-CSF 20ng/ml+ RANKL 20ng/ml);第六列加入RANKL+M-CSF（RANKL 20ng/ml+M-CSF 20ng/ml）。1.3细胞培养:细胞因子添加完毕后将培养板置于37℃、5% CO2培养箱中培养,培养至第4天时更换培养液一次,共培养7天。2抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色:培养至第7天后行TRAP染色,倒置光镜下观察,计算3核以上染色阳性细胞数。3统计学分析:使用SPSS13.0软件进行统计学分析。数据处理采用非参数检验的方差分析和S-N-K检验。结果:1破骨细胞的形态学特征培养前三天各组均未见破骨细胞形成,培养第五天开始实验组可见少量破骨细胞形成,培养至第七天实验组破骨细胞已经分化成熟,而对照组始终没有破骨细胞的形成。对全骨髓细胞培养进行TRAP染色后,光镜下可见到大量成熟的破骨细胞,其形态学特征为:细胞体积较大,呈椭圆形、漏斗形、油煎蛋样、条索状或不规则形。细胞浆丰富呈紫红色,细胞核较大,数目达几个甚至多达几十个,核仁清晰,细胞浆内可见空泡结构（见图1-5）。2 M-CSF、RANKL和1,25-（OH）2D3对破骨细胞的形成和分化均具有促进作用,多因子比单因子和双因子在相同条件下形成的破骨细胞数目多。全骨髓培养系中,培养板第一列（对照组）没有添加细胞因子,最终没有破骨细胞的形成;第二列加入1,25-（OH）2D3形成了破骨细胞,证明1,25-（OH）2D3对破骨细胞的形成和分化具有促进作用;第三列、第四列除加入1,25-（OH）2D3外,还分别加入了RANKL和M-CSF,最终都有破骨细胞的形成,并且形成破骨细胞的数目较第二列多,与第二列相比统计学有显着性差异（P<0.05）,说明RANKL和M-CSF对破骨细胞的形成和分化也具有促进作用,但第三、四列间无显着性差异（P>0.05）;第五列同时加入M-CSF、RANKL和1,25-（OH）2D3后形成的破骨细胞数目最多,说明三种细胞因子对破骨细胞形成和分化具有协同促进作用,与第二、三、四、六列比较,有显着性差异（P<0.05）。第六列只加入RANKL和M-CSF后也形成了破骨细胞,但数量和第三、四列相似（见表1、直方图）。结论:1 M-CSF、RANKL和1,25-（OH）2D3对破骨细胞的形成和分化均具有促进作用。2单因子和双因子间对破骨细胞形成和分化有显着性差异。3三种细胞因子共存在对破骨细胞形成和分化具有协同促进作用。
刘长庚[9]（2008）在《灯盏花加快正畸牙移动的机理研究》文中指出目的:观察大鼠正畸牙移动牙周组织改建中OPG（Osteoprotegerin,护骨素）、RANKL（receptor activator of nuclearfactor-κB ligand,细胞核因子-κB受体活化因子配体）的表达和分布以及灯盏花对其影响。方法:选用Wistar大鼠64只,随机分为A、B、C、D四组,每组均以右侧上颌第一磨牙近中腭侧根的牙周组织为实验观察部位。A组正畸加力合并局部注射灯盏花,B组单纯正畸加力,C组单纯注射灯盏花,D组为空白对照。A、B、C组又分设1、3、7、10、14d观察小组,每小组4只鼠。每小组鼠到期处死取材,分别进行HE染色法观察各组的组织学改变,原位杂交法检测OPG和RANKL阳性表达的强度和部位。结果:①实验观察部位的组织学改变符合正常正畸牙槽骨改建的变化;B组张力侧成骨细胞增多和新骨形成,压力侧破骨细胞增多和骨吸收;A组张力侧和压力侧除上述变化更明显外,新生血管增多。②OPG表达在加力第1、3、7d的张力侧和压力侧牙周组织中均逐渐增强,而在10、14d则逐渐减弱;OPG的表达部位主要在张力侧的成骨细胞、骨衬里细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞和压力侧的成牙骨质细胞、成纤维细胞,但在破骨细胞中不表达;合并灯盏花注射组的OPG表达部位不变,但阳性表达有所减弱。③RANKL表达在加力第1、3、7d的张力侧和压力侧牙周组织中均逐渐增强,而在10、14d则逐渐减弱;RANKL的表达部位在张力侧和压力侧的成骨细胞、破骨细胞、骨衬里细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞;合并灯盏花注射组的RANKL表达部位不变,阳性表达明显增强。结论:在大鼠正畸牙移动过程中,OPG和RANKL参与了牙周组织的改建;而灯盏花能抑制OPG的表达和增加RANKL的表达,增加RANKL/OPG的比值,从而加快正畸牙移动。目的:通过MTT法、[3H]TdR掺入法和台盼蓝拒染法体外研究不同浓度灯盏花对成骨细胞和破骨前体细胞的增殖和分化的影响。方法:体外培养MG-63成骨样细胞和RAW264.7破骨前体细胞。破骨细胞诱导分化:RAW264.7细胞以1×105/孔接种于6孔板,分别用50ng/ml RANKL+25ng/ml M-CSF和不同浓度（0.001～1mg/m1）的灯盏花干预,第6天TRAP染色,显微镜下计数TRAP阳性多核破骨细胞。MTT法:MG63细胞或RAW264.7细胞以1×104个/孔接种于96孔板,培养24小时后用含不同浓度的灯盏花的无血清的DMEM培养液干预,继续培养36小时,每孔加入MTT,继续孵育4小时,每孔加入150μl的DMSO,测570nm波长的吸光值（OD值）。[3H]TdR掺入法:MG63细胞或RAW264.7细胞以2×104个/孔密度培养于24孔板中,24小时后用0、0.001、0.01、0.1、1mg/ml灯盏花干预32小时后,每孔加入[3H]TdR,测定细胞内标记的[3H]TdR量。台盼蓝拒染法:MG63细胞或RAW264.7细胞以2.5×104/ml密度接种于24孔细胞培养板,实验组用1mg/ml灯盏花干预细胞16天。每天取细胞台盼蓝染色,计数活细胞,连续计数6天,绘制细胞生长曲线。结果:单独应用灯盏花不能使RAW264.7细胞形成TRAP阳性多核破骨细胞,但0.01-1mg/ml浓度灯盏花均能促进RANKL和M-CSF共同作用下诱导的RAW264.7细胞分化为成熟的破骨细胞。MTT法和[3H]TdR掺入法检测显示灯盏花促进MG-63细胞和RAW264.7细胞增殖并呈现剂量依赖性,于1mg/ml剂量时,促增殖的作用最为显着。台盼蓝拒染法检测显示,MG63和RAW264.7细胞对照组和干预组在培养时间内生长呈现上升趋势,灯盏花干预组的细胞数增加更明显,且随着时间的延长,灯盏花的促增殖作用越明显。结论:灯盏花能促进成骨细胞和破骨前体细胞的增殖并呈现剂量和时间依赖性,同时能协同RANKL和M-CSF诱导破骨前体细胞分化为成熟的破骨细胞。目的:研究灯盏花在不同浓度不同时间下对体外培养的成骨细胞和破骨前体细胞中OPG/RANKL/RANK mRNA和蛋白表达的影响,以初步探讨灯盏花对骨改建的作用及其机理。方法:体外培养MG63细胞和RAW264.7细胞,取第三代细胞分为对照组和不同的实验组,分别应用不同浓度的灯盏花(0、0.001、0.01、0.1、1mg/ml干预不同时间（12、24、48h）后,提取总RNA和蛋白质,用半定量RT-PCR方法检测MG63细胞OPGmRNA和RANKL mRNA的表达以及RAW264.7细胞RANK mRNA的表达,用Western blot方法检测MG63细胞OPG蛋白和RANKL蛋白的表达以及RAW264.7细胞RANK蛋白的表达。结果:RT-PCR和Western blot结果显示,灯盏花随浓度（0、0.001、0.01、0.1、1mg/ml）增高,呈剂量依赖性抑制MG63细胞OPGmRNA和蛋白的表达,同时呈剂量依赖性促进MG63细胞RANKL mRNA和蛋白的表达。Western blot结果还显示灯盏花呈时间依赖性地促进MG63细胞RANKL蛋白的表达。1mg/ml灯盏花干预12h、24h、48h后,RANKL蛋白量均显着增高。RT-PCR和Western blot结果显示,灯盏花随浓度（0、0.001、0.01、0.1、1mg/ml）增高,呈剂量依赖性促进RAW264.7细胞RANKmRNA和蛋白的表达。Western blot结果还显示灯盏花呈时间依赖性地促进RAW264.7细胞RANK蛋白的表达。1mg/ml灯盏花干预12h、24h、48h后,RANK蛋白量均显着增高结论:灯盏花呈剂量和时间依赖性抑制成骨细胞OPG表达,促进成骨细胞RANKL的表达和破骨前体细胞RANK的表达,提示灯盏花可能有促进骨吸收的作用。目的:分别研究灯盏花、机械牵张力以及灯盏花与机械牵张力联合作用下对体外培养的成骨细胞和破骨前体细胞中OPG/RANKL/RANKmRNA和蛋白表达的影响,以进一步探讨灯盏花对骨改建的作用及其机理。方法:体外培养MG63细胞和RAW264.7细胞,采用SXG4201型四点弯曲细胞力学加载仪对细胞进行机械牵张力刺激。分别单用机械牵张力刺激（2000μstrain,0.2Hz）、单用灯盏花（1mg/ml）干预、以及机械牵张力（2000μstrain,0.2Hz）和灯盏花（1mg/ml）联合干预MG63细胞和RAW264.7细胞不同时间（3,6,12,24h）后,提取总RNA和蛋白质,用半定量RT-PCR方法检测MG63细胞OPGmRNA和RANKL mRNA的表达以及RAW264.7细胞RANKmRNA的表达,用Western blot方法检测MG63细胞OPG蛋白和RANKL蛋白的表达以及RAW264.7细胞RANK蛋白的表达。结果:在选定的3、6、12、24h四个时间段,随着机械牵张力对细胞刺激时间的增加,MG-63细胞OPG蛋白的表达逐渐增强,MG-63细胞RANKL蛋白和RAW264.7细胞RANK蛋白的表达没有显着改变。单用机械牵张力刺激MG63细胞后OPG蛋白表达上调,而RANKL蛋白表达无明显变化;单用灯盏花干预MG63细胞后OPG蛋白表达下调,而RANKL蛋白表达增加;两者联合干预MG-63细胞后,OPG蛋白表达量减少,而RANKL蛋白表达显着增加。单用机械牵张力刺激RAW264.7细胞后RANK蛋白表达无明显改变;单用灯盏花干预RAW264.7细胞后,RANK蛋白表达增加;两者联合干预RAW264.7细胞后,RANK蛋白表达量显着增加。结论:灯盏花能拮抗机械牵张力对成骨细胞OPG分泌的刺激作用,促进机械牵张力对成骨细胞RANKL分泌的刺激作用。灯盏花能使破骨前体细胞分化为成熟破骨细胞并分泌RANK,但机械牵张力却无明显作用。
郭帮富[10]（2008）在《骨质疏松症患者成骨细胞基因表达与中医证型的相关性研究》文中研究说明临床研究目的:通过建立原发性骨质疏松症患者不同证型（肾阴虚和肾阳虚）的OB体外培养体系,探讨骨质疏松症患者OB的基因表达谱与不同证型的相关性,为骨质疏松症中医证型的研究提供直接的实验资料,为骨质疏松中医证型实质和病情分级的研究提供合理的客观量化依据,为中医药防治OP的临床研究建立必备的评估系统和提供科研资料,同时为中医“肾主骨”理论提供实验资料。方法:收集临床病例24例,共分为3组。其中:正常对照组8例,骨质疏松症肾阴虚组和肾阳虚组各8例。所有病例资料均来自湖南省长沙市及周边地区2007年5-10月在中南大学湘雅二医院关节外科住院的患者。待患者分别行手术治疗后,取患者股骨头松质骨以改良酶消化法作人成骨细胞体外分离培养。所培养的人成骨细胞经过鉴定合格以后,每例患者选2瓶培养细胞,加入Trizol溶液转移至无RNA酶离心管中,冻存于-80℃冰箱备用。成骨细胞收集完毕以后,按Illumina公司的Trizol试剂盒操作程序,以Trizol一步法抽提肾阴虚组、肾阳虚组和正常组成骨细胞的总RNA。使用QIAGEN公司的QIAGEN RNeasy?Kit进一步纯化总RNA。琼脂糖凝胶电泳（180V,0.5h）检测总RNA的28s和18s比例,以评估总RNA的完整性;用分光光度计在260/280nm测定总RNA吸光度,以计算总RNA的纯度。按Illumina公司芯片制作要求,进行生物素标记的cRNA合成,并将其片段化处理,然后进行Illumina Sentrix芯片杂交。在对基因芯片进行质量控制和标准化之后,采用“Cubic Spline”标准化信号值,根据课题设计将样本分组,选择参考组,计算归一化信号值。一般选取｜DiffScore｜≥13（相当于ChangeP-value≤0.05）的点,认为是表达差异显着的基因,输出成《差异基因.xls》,作为初筛的结果,用于后续的分析。使用NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）、GENEONTOLOGY数据库（http://www.geneontology.org）以及KEGG数据库（http://www.biorcart.com）等工具查询相关差异基因的信息。结果:1.各组总RNA提取结果良好,总RNA的吸光度OD260/280值均在1.76-2.0,热稳定实验显示70℃lh与20℃lh电泳条带比较,28s条带无明显降解。RNA主要集中于0.5-2.0kb的连续条带。电泳结果证实己抽提高纯度的RNA。2.本实验结果完全符合Illumina基因芯片质量控制标准,信号强度达到要求。检测系统正常,保证了杂交结果的可靠性。3.以正常组为对照比较,筛选出肾阴虚与肾阳虚差异基因表达谱。通过对其进行生物信息学比对分析,筛选出在肾阴虚组和肾阳虚组中共同差异表达的基因419个。结论:1.有多种基因共同参与骨质疏松发生的整个过程。利用基因芯片技术分析不同中医证型基因表达谱变化,能够快速了解相关基因与不同证型的关系。2.对这419个差异表达基因功能分析有助于对骨质疏松发生机制的深入研究,为中医辨证论治提供相关依据。实验研究目的:本实验研究采用RT-PCR的检测方法观察中药骨康含药血清对肾阳虚型骨质疏松症患者成骨细胞细胞因子OPG和RANKL mRNA表达的影响,力求从细胞和分子水平探讨骨康抗骨质疏松的作用机制,为骨康在临床上防治骨质疏松提供有力的实验依据。方法:6月龄体重2.5～3.0kg的新西兰大耳白兔6只,雌雄各半,随机分为3组（中药骨康组、雌激素组、空白对照组）,每组2只。中药骨康组灌服1g/ml的骨康煎剂4.2ml/kg/d,雌激素组灌服0.01mg/ml浓度的倍美力2.4ml/kg/d,空白对照组给予与雌激素组等容积的生理盐水灌胃,1次/天,3组分别连续灌胃共7天,最后一次灌胃2小时后所有动物行心脏采血,收集血清备用。将分离培养的人成骨细胞消化传代,取第三代成骨细胞,制成2×105/ml的细胞悬液。所培养细胞分为7组（每组4瓶）,分别加入不同浓度（5%、10%、20%）的含药血清进行干预,对照组仅加培养液,继续培养。48h后用Trizol一步法提取总RAN,然后用RT-PCR检测OPG、RANKL mRNA的表达。结果:5%骨康浓度组的OPG mRNA的表达量上升,与对照组比较有显着的统计学差异（P＜0.05）;10%、20%骨康组与对照组相比,OPG mRNA的表达量上升,具有非常显着性差异（P＜0.01）;并且10%与5%、20%与10%组间比较也有显着的统计学差异（P＜0.05）;20%骨康组与5%倍美力组比较无显着性差异（P＞0.05）。表明随着进行干预的骨康含药血清浓度的增加,体外培养的人成骨细胞OPG mRNA表达量的上调作用就越强,具有明显的浓度剂量依赖性。骨康含药血清以5%、10%、20%浓度递增时,RANKL mRNA的表达量下降,与对照组比较均有显着性的统计学差异（P＜0.05）,与5%倍美力含药血清相比较,均无显着性差异（P＞0.05）。并且10%与5%,20%与5%组间RANKL mRNA的表达量改变无显着性统计学差异（P＞0.05）;表明在药物干预过程中,骨康含药血清浓度递增时,对人成骨细胞RANKL mRNA的表达无明显影响。结论:实验表明,骨康可以上调肾阳虚骨质疏松症患者成骨细胞OPG mRNA的表达,下调成骨细胞RANKL mRNA的表达,从而抑制破骨细胞的产生和功能,为骨康防治骨质疏松提供了有力的实验依据。
二、成人破骨细胞的体外培养（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、成人破骨细胞的体外培养（论文提纲范文）
（1）microRNA-1286调控BMSCs成骨分化在骨质疏松骨重建作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分:人骨髄间充质干细胞体外培养与成骨分化诱导 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验设备及方法 |
| 2.2 研究方法与步骤 |
| 2.3 统计学处理 |
| 2.4 研究技术路线图 |
| 3 结果 |
| 3.1 BMSCs体外诱导成骨分化及ALP、茜素红染色 |
| 3.2 miR-1286在OP患者血清和正常健康人群血清的表达及miR-1286在hBMSCs成骨分化过程中的表达 |
| 4 讨论 |
| 第二部分:miR-1286对BMSCs成骨分化作用及其与FZD4 结合特性 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验设备及方法 |
| 2.2 实验方法及步骤 |
| 2.3 统计学处理 |
| 2.4 研究技术路线图 |
| 3 结果 |
| 3.1 miR-1286 过表达抑制人骨髓间充质干细胞成骨分化 |
| 3.2 miR-1286 靶向结合FZD4 并调控其表达 |
| 4 讨论 |
| 第三部分:miR-1286 通过介导FZD4 调控OP骨重建中BMSCs成骨分化作用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验设备及方法 |
| 2.2 实验方法及步骤 |
| 2.3 统计学处理 |
| 2.4 研究技术路线图 |
| 3 结果 |
| 3.1 FZD4 高表达促进人骨髓间充质干细胞成骨分化 |
| 3.2 miR-1286 通过介导FZD4 调控人骨髓间充质干细胞成骨分化 |
| 4 讨论 |
| 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 本研究特色创新之处 |
| 3 进一步工作的方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 论文综述 卷曲受体蛋白在内分泌代谢疾病、肿瘤及诱导骨分化的研究进展 |
| 参考文献 |
（2）青少年特发性脊柱侧凸单细胞转录组病因学分析及脊柱畸形相关临床研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 青少年特发性脊柱侧凸松质骨组织高通量单细胞转录组学测序分析 |
| 一、引言 |
| 二、方法与资料 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 RhoA/ROCK信号通路异常对青少年特发性脊柱侧凸间充质干细胞向软骨细胞分化的影响及其机制研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 青少年特发性脊柱侧凸相关临床研究 |
| 第一节 青少年特发性脊柱侧凸术后双肩失平衡现象的危险因素分析与预测公式建立 |
| 一、引言 |
| 二、资料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第二节 Lenke1型和2型青少年特发性脊柱侧凸患者术后颈椎倾斜现象:一项新的预测方法 |
| 一、前言 |
| 二、资料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 综述一 褪黑素及其信号传导通路异常与青少年特发性脊柱侧凸病因学相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 前庭反射异常与青少年特发性脊柱侧凸病因学相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表学术论文 |
| 在读期间申请基金、专利、会议发言及论着 |
| 致谢 |
（3）基于Wnt3a/β-catenin信号通路探究补肾益气活血方对绝经后骨质疏松症疗效机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分:理论研究 |
| 中医学对骨质疏松症的认识 |
| 1 中医学对骨质疏松症病名的认识 |
| 2 中医学对骨质疏松症病因病机的认识 |
| 3 中医学对骨质疏松症辨证论治的认识 |
| 第二部分:体内实验 |
| 实验一:补肾益气活血中药方对绝经后骨质疏松症大鼠骨组织Wnt3a、CyclinD1 mRNA及蛋白表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 实验二:补肾益气活血中药方对绝经后骨质疏松症大鼠肾组织Wnt3a、CyclinD1 mRNA及蛋白表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 体内实验小结 |
| 体内实验分析讨论 |
| 第三部分:体外实验 |
| 实验三:补肾益气活血中药方对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 实验小结 |
| 实验四:补肾益气活血方对加入抑制剂DKK1 细胞ALP、BGP水平及骨钙结节形成的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 实验小结 |
| 实验五:补肾益气活血方对加入抑制剂DKK1 细胞Wnt3a、CyclinD1 mRNA及蛋白表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 实验小结 |
| 体外实验分析与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 自我创新性评价 |
| 科技查新报告 |
| 综述 |
| 中药治疗骨质疏松症研究进展 |
| 从中医“肾藏精主骨”探讨骨髓间充质干细胞成骨分化研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（4）HB-EGF在骨发育及骨代谢中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 间充质干细胞 |
| 1.1.1 MSC的发现及定义 |
| 1.1.2 MSC的标记 |
| 1.2 MSC参与骨骼系统发育及代谢中的作用调控 |
| 1.2.1 成软骨分化 |
| 1.2.2 MSC成骨分化 |
| 1.3 骨重塑 |
| 1.3.1 骨重塑过程 |
| 1.3.2 促进破骨细胞形成因子 |
| 1.3.3 抑制破骨细胞的因子 |
| 1.4 关节炎相关信号通路 |
| 1.4.1 软骨细胞代谢与自噬 |
| 1.4.2 生长因子与软骨合成代谢及软骨下骨改变 |
| 1.4.3 炎症/氧化应激/血脂异常 |
| 1.5 EGFR信号通路 |
| 1.5.1 EGFR信号通路概述 |
| 1.5.2 EGFR信号在发育中的作用 |
| 1.6 HB-EGF的结构与功能 |
| 1.6.1 HB-EGF结构 |
| 1.6.2 HB-EGF生物学功能 |
| 1.7 研究内容及拟解决的科学问题 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 常用实验试剂 |
| 2.1.2 常用试剂盒 |
| 2.1.3 细胞因子及抑制剂 |
| 2.1.4 抗体 |
| 2.1.5 实验中使用的仪器及耗材 |
| 2.1.6 实验小鼠 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验小鼠繁殖及鉴定 |
| 2.2.2 荧光实时定量PCR |
| 2.2.3 蛋白质免疫印迹 |
| 2.2.4 细胞生物学相关方法 |
| 2.2.5 组织形态学实验 |
| 2.2.6 流式分析 |
| 2.2.7 统计学处理与分析 |
| 第三章 实验结果及分析 |
| 3.1 Dermo1+ MSC中过表达HB-EGF的小鼠出现明显生长缺陷 |
| 3.1.1 Dermo1-Cre;td Tomato在骨骼中的表达谱 |
| 3.1.2 HB-EGF在MSC及分化细胞中的表达 |
| 3.1.3 Dermo1-HB-EGF小鼠软骨发育异常 |
| 3.1.4 Dermo1-HB-EGF小鼠软骨增殖增加,分化抑制 |
| 3.1.5 Dermo1-HB-EGF小鼠骨代谢异常 |
| 3.2 过表达HB-EGF对破骨细胞不产生影响 |
| 3.2.1 Dermo1-HB-EGF小鼠破骨细胞形成能力及骨吸收能力表现正常 |
| 3.2.2 在破骨祖细胞中过表达HB-EGF并不影响骨吸收 |
| 3.3 MSC中敲除HB-EGF对于骨骼发育的影响 |
| 3.4 软骨细胞中过表达HB-EGF小鼠表型分析 |
| 3.5 HB-EGF调控骨骼发育的机制 |
| 3.5.1 EGFR抑制剂AG1478可以挽救Dermo1-HB-EGF小鼠的骨骼表型 |
| 3.5.2 HB-EGF调控MSC增殖及多向分化潜能 |
| 3.6 其他标记MSC类群中过表达HB-EGF小鼠表型分析 |
| 3.6.1 Prx1在骨中的谱系表达情况 |
| 3.6.2 Prx1-HB-EGF小鼠的骨表型分析 |
| 第四章 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已发表或录用的论文 |
（5）唑来膦酸辅助治疗脊柱破骨细胞瘤的实验研究及临床应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 唑来膦酸抑制体外培养破骨细胞功能的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 关于唑来膦酸和伊班膦酸抑制破骨细胞特征比较的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于双膦酸盐类药物辅助治疗脊柱破骨细胞瘤的临床研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 基于胸椎破骨细胞瘤术后应用唑来膦酸的临床疗效观察 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 双膦酸盐治疗破骨细胞瘤研究及进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）基于细胞水平抗骨质疏松中药筛选研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 骨质疏松症的研究进展 |
| 1.1.1 骨质疏松症的定义和分类 |
| 1.1.2 骨质疏松症发病机制 |
| 1.1.3 中医对骨质疏松症的认识 |
| 1.2 抗骨质疏松中药研究进展 |
| 1.2.1 抗骨质疏松中药 |
| 1.2.2 抗骨质疏松中药复方 |
| 1.2.3 抗骨质疏松中药活性成分 |
| 1.3 抗骨质疏松药物研究模型 |
| 1.3.1 动物模型 |
| 1.3.2 细胞模型 |
| 1.4 骨质疏松相关信号通路-药物潜在靶点 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第二章 破骨细胞和成骨细胞的体外培养 |
| 2.1 实验材料及主要仪器 |
| 2.2 破骨细胞的体外培养 |
| 2.3 成骨细胞株的培养 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 中药的选择及提取物的制备 |
| 3.1 实验材料及主要仪器 |
| 3.2 中药的选择 |
| 3.3 中药提取物的制备 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 中药对破骨细胞活性作用的研究 |
| 4.1 实验材料及主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 骨吸收活性检测指标及方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 黄柏对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.4.2 大血藤对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.4.3 豨莶草对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.4.4 槲寄生对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.4.5 锁阳对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.4.6 当归对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.4.7 吴茱萸对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.4.8 韭菜子对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.4.9 狗脊对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.4.10 威灵仙对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.4.11 墨旱莲对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.4.12 红花对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.4.13 肉苁蓉对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.4.14 黄芪对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.4.15 木瓜对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.4.16 续断对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.4.17 女贞子对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.4.18 何首乌对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.4.19 独活对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.4.20 牛膝对破骨细胞活性作用的研究结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 中药对成骨细胞增殖分化作用的研究 |
| 5.1 实验材料及主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 黄柏对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.3.2 大血藤对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.3.3 豨莶草对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.3.4 槲寄生对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.3.5 锁阳对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.3.6 当归对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.3.7 吴茱萸对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.3.8 韭菜子对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.3.9 狗脊对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.3.10 威灵仙对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.3.11 墨旱莲对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.3.12 红花对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.3.13 肉苁蓉对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.3.14 黄芪对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.3.15 木瓜对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.3.16 续断对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.3.17 女贞子对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.3.18 何首乌对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.3.19 独活对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.3.20 牛膝对成骨细胞增殖分化作用的研究结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（7）骨髓间充质干细胞Wnt5a/Ror2信号调控颞下颌关节骨关节病模型大鼠软骨下骨的改建（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、颞下颌关节骨关节 |
| 二、间充质干细胞与 OA |
| 三、破骨细胞 |
| 四、Wnt5a/Ror2 信号通路 |
| 实验一 前牙单侧反牙合大鼠模型的建立及其对 TMJ 髁突软骨下骨的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 前牙单侧反牙合对大鼠 TMJ 髁突软骨下骨 BMSCs 增殖、成骨分化和趋化能力的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 前牙单侧反牙合对大鼠 TMJ 髁突软骨下骨 BMSCs 诱导的破骨前体细胞迁移和分化的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 Wnt5a/Ror2 信号对 BMSCs 成骨分化及 BMSCs 诱导的破骨前体细胞迁移和分化的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（8）M-CSF RANKL 1,25-（OH）2D3对破骨细胞形成分化影响的比较研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 破骨细胞与细胞因子 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）灯盏花加快正畸牙移动的机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 目录 |
| 符号说明 |
| 论文正文 |
| 前言 |
| 第一章 灯盏花对鼠正畸牙周组织改建及OPG和RANKLmRNA表达的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 灯盏花对体外培养成骨细胞、破骨前体细胞增殖和分化的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 灯盏花对成骨细胞、破骨前体细胞OPG/RANKL/RANK表达的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 灯盏花联合机械牵张力对成骨细胞、破骨前体细胞OPG/RANKL/RANK表达的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 结语 |
| 1 各章结论 |
| 2 总结论 |
| 参考文献 |
| 综述1 |
| 综述2 |
| 致谢 |
| 个人简历以及在读期间主要荣誉和研究成果 |
（10）骨质疏松症患者成骨细胞基因表达与中医证型的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 第一节 原发性骨质疏松症的中医证型研究概况 |
| 1 中医证型的临床调查 |
| 2 中医证型本质的相关性探讨 |
| 3 对证型本质研究的评价与展望 |
| 第二节 成骨细胞的相关生物学特征研究概述 |
| 1 成骨细胞在体内的相关生物学特征 |
| 1.1 成骨细胞的起源与发展特征 |
| 1.2 成骨细胞的形态与结构特征 |
| 1.3 成骨细胞的标记物与表型特征 |
| 1.4 成骨细胞的主要功能特征 |
| 2 体外培养成骨细胞的一般生物学特征 |
| 2.1 原代及传代成骨细胞的形态学观察 |
| 2.2 成骨细胞活性检测与功能鉴定 |
| 2.3 体外培养成骨细胞骨形成主要基因表达特征 |
| 2.4 中药骨康对体外培养成骨细胞作用特征 |
| 第二部分 临床研究骨质疏松症患者成骨细胞基因表达与中医证型的相关性研究 |
| 第一节 肾阴虚和肾阳虚骨质疏松症患者临床资料收 |
| 1 资料收集对象与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节 人体成骨细胞体外分离培养与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三节 人体成骨细胞总RNA抽提与测定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 第四节 基因芯片检测 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 实验研究 骨康含药血清对体外培养肾阳虚骨质疏松症患者成骨细胞OPG及RANKL mRNA表达的影响 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1 中药骨康含药血清制备 |
| 2 体外人成骨细胞的复苏与传代培养 |
| 3 骨康对体外培养人成骨细胞的干预实验 |
| 4 成骨细胞总RNA的提取与鉴定 |
| 5 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) |
| 6 统计方法 |
| 第二节 结果 |
| 1 传代培养细胞的形态学观察 |
| 2 成骨细胞总RNA质量鉴定 |
| 3 人成骨细胞OPG及RANKL基因mRNA的表达 |
| 第三节 讨论 |
| 1 人成骨细胞体外传代培养体系的建立与药物干预的方法选择 |
| 2 中药骨康调控OPG、RANKL mRNA表达的机理探讨 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录一 缩略词汇表 |
| 附录二 主要试剂组成与配置表 |
| 在校期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、成人破骨细胞的体外培养（论文参考文献）
- [1]microRNA-1286调控BMSCs成骨分化在骨质疏松骨重建作用及机制研究[D]. 周建国. 南昌大学, 2021(01)
- [2]青少年特发性脊柱侧凸单细胞转录组病因学分析及脊柱畸形相关临床研究[D]. 杨依林. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [3]基于Wnt3a/β-catenin信号通路探究补肾益气活血方对绝经后骨质疏松症疗效机制研究[D]. 王大伟. 辽宁中医药大学, 2019
- [4]HB-EGF在骨发育及骨代谢中的作用[D]. 李平. 上海交通大学, 2018(01)
- [5]唑来膦酸辅助治疗脊柱破骨细胞瘤的实验研究及临床应用[D]. 李鹏飞. 河北医科大学, 2018(12)
- [6]基于细胞水平抗骨质疏松中药筛选研究[D]. 陈丽珍. 贵州大学, 2015(01)
- [7]骨髓间充质干细胞Wnt5a/Ror2信号调控颞下颌关节骨关节病模型大鼠软骨下骨的改建[D]. 杨婷. 第四军医大学, 2014(01)
- [8]M-CSF RANKL 1,25-（OH）2D3对破骨细胞形成分化影响的比较研究[D]. 张睿. 河北医科大学, 2011(10)
- [9]灯盏花加快正畸牙移动的机理研究[D]. 刘长庚. 中南大学, 2008(02)
- [10]骨质疏松症患者成骨细胞基因表达与中医证型的相关性研究[D]. 郭帮富. 广州中医药大学, 2008(09)