赵雪峰刘福全张晓微
（大连大学附属新华医院胃肠微创外科中心辽宁大连116021）
【摘要】目的：研究Claudin-7基因敲除对裸鼠结肠癌肝转移模型中的致癌作用及其前临床意义。方法：采用Claudin-7基因敲除及基因重组质粒pcDNA6-Claudin-7基因敲除转染的HT29结肠癌细胞建立裸鼠结肠癌肝转移模型，随机分为2组，即Claudin-7敲除组和对照组。制模60天后比较两组间转移瘤形成情况，并采用免疫组织化学检测两组肝转移组织的Claudin-7表达程度。结果：Claudin-7敲除组肝质量、肝转移评分、淋巴结转移发生率、血性腹水成率、腹膜种植转移发生率、远处转移发生率明显高于对照组，两组间差异有统计学意义(p<0.05)。肝转移的组织病理学检测中，发现Claudin-7表达在两组间有显著差异，并有统计学意义(p<0.05)。生命表证实，Claudin-7敲除组生存率明显低于对照组，差异有统计学意义(p<0.01)。结论：Claudin-7基因敲除可促进裸鼠结肠癌肝转移的形成，况且Claudin-7表达可作为肿瘤转移的评价指标。
【关键词】Claudin-7基因敲除裸鼠结肠癌肝转移
【中图分类号】R446.5【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2014）03-0034-03
【Abstract】Objective:TostudythecarcinogeniceffectsofClaudin-7geneknockdownonthelivermetastasisofcoloncancer(LMCC)nudemicemodel(NMM)anditspreclinicalresearch.Methods:After60daysofthespleeninjection,HT29coloncancercellstransfectedbyrecombinantclonevectorpcDNA6-Claudin-7geneknockdownwereusedtoestablishtheLMCC-NMM.Thetumorbearingnudemicewererandomizedinto2groups,Claudin-7knockdowngroupandScramblecontrolgroup.Inaddition,Claudin-7knockdowngroupwascancercellsinjectedintospleentostudygroupandcontrolgroup,evaluatingmetastatictumorformation,livermetastasistissueswereinvestigatedexpressionofClaudin-7proteinviaimmunohistochemistry.Results:Theliverweight,livermetastasisscores,lymphnodemetastasisrate,bloodyascitesrate,peritonealseedingrate,anddistantmetastasisrateofClaudin-7knockdowngroupweresignificantlygreaterthanthatinthecontrolgroup(p<0.05).ExpressionofClaudin-7proteinwasmarkedhistopathologicaldifferenceoflivermetastasistissuesbetweenClaudin-7knockdowngroupandcontrolgroup，anddifferencewasstatisticallysignificant(p<0.05).LivetablesshowedthatClaudin-7knockdowngroupisinverselycorrelatedwithcumulativesurvivalofLMCC-NMM(p<0.01).Conclusion:Claudin-7geneknockdownmaybepromotetheformationofLMCC-NMM,andexpressionofClaudin-7asanevaluatingindexfortumormetastasis
【Keywords】Claudin-7;Geneknockdown;Nudemice;Coloncancer;Livermetastasis
Claudins是构成细胞紧密连接的骨架蛋白，其异常表达与肿瘤浸润和转移有关[1]。其中，Claudin-7是Claudins多基因家族中的重要成分之一，目前认为Claudin-7是潜在的抑癌基因。近年来研究发现Claudin-7对原发癌的抑制作用之研究非常活跃，但对于转移癌的研究报道极少。为更加深入研究Claudin-7在肝转移中作用，实验构建Claudin-7基因敲除及基因重组载体，转染到结肠癌细胞，进行体内探索性实验，发现Claudine-7基因敲除可促进HT29结肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移。在此基础上，本实验拟建立裸鼠结肠癌肝转移模型，以观察研究Claudin-7基因敲除对肝转移的促进作用及其前临床意义。
1、材料与方法：
1.1材料：HT29人结肠癌细胞株购自美国ATCC细胞研究所。转染基因重组质粒pcDNA6-Claudin-7基因敲除和质粒pcDNA6(Scramble)的结肠癌细胞由本研究组构建。RPMI-1640及新生胎牛血清购自Invitrogen，免疫组织化学试剂盒购自DAKO，Claudin-7鼠抗人单克隆抗体购自SantaCruz，24只7周龄雌性BALB/c裸鼠购自大连医科大学实验动物中心。
1.2方法与评估指标：
1.2.1细胞培养及悬液制备：HT29人结肠癌细胞株在摄氏37℃、5%CO2，含10%血清RPMI1640培养液中传代培养，每2-3天换1次培养液。培养至80-90%融合时，用0.25%胰酶消化液消化后，1200rpm离心3min，弃上清液，加无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，显微镜下计数，用无血清RPMI1640培养液调整细胞浓度为1x107/ml。制备好的细胞悬液防冰浴保存，于30min内进行接种。
1.2.2动物模型设计:制模前1周为实验动物稳定期，防止进行对裸鼠的一切刺激性操作。实验动物共24只，随机分2组，分别为Claudin-7敲除组和Scramble对照组。
1.2.3放大镜辅助下结肠癌肝转移模型的建立:根据麻醉预试验结果，选择异氟醚进行全身麻醉。放大镜辅助下取上腹正中切口长约4mm，逐层入腹后小心牵拉大网膜并显露脾脏。脾脏中、下极牵出切口外，用31号针头在脾脏中央迷路进针约3mm，缓慢注入HT29癌细胞悬液1x106/100ul至脾被膜下，见注射部位脾被膜发白肿胀，拔针时用止血小纱布轻轻按压30sec。10min后夹闭、切断脾脏两侧血管，完整切除并移除脾脏，送回网膜等附件后，关腹。建立模型全程应防止胰腺、胃及主要血管的损伤，也要防止注入部位肿瘤细胞的渗漏。
1.2.4结肠癌肝转移评分标准：制定的肝转移评分标准如下：0为无肝转移；1为浸润范围达<0.5cm2；2为浸润范达0.5-1.0cm2；3为浸润范围达1.0-2.0cm2；4为浸润范围达>2.0cm2或累计全肝。
1.2.5观察裸鼠指标：每天常规观察记录裸鼠体重，出现频死前症状人道处死或观察期满60天予以处死。处死后立即解剖观察腹腔内、胸腔内及颅腔内转移情况，具体记入肝质量、肝转移评分、淋巴结转移、血性腹水、腹膜种植转移、远处转移程度。所有病灶肝脏取出后充分固定在4%多聚甲醛，行病理学检查。
1.2.6组织病理学和免疫组织化学检测：将肝转移组织石蜡包埋及切片后，进行苏木素-伊红染色及免疫组织化学检测。采用免疫组织化学两步法进行Claudin-7鼠抗人单克隆抗体染色，并严格按照试剂盒说明操作。依据染色强度及阳性细胞率来计算评分。染色强度：0为阴性，1为弱阳性，2为阳性，3为强阳性。阳性细胞数<5%，6-25%，26-50%，>50%分别积分为0,1,2,3。两项之和0-3为阴性，4-6为阳性。
1.2.7统计学方法：采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。研究组和对照组的比较采用ttest和χ2test进行统计分析,P<0.05认为有统计学意义。
2、结果：
2.1Claudine-7基因敲除组对转移癌形成的影响：Claudin-7敲除组肝质量、肝转移评分、淋巴结转移率、血性腹水生成率、腹膜种植转移率、远处转移率明显高于对照组，两组间差异有统计学意义(p<0.05)(表1)。大体观和显微镜下观察结果显示，Claudin-7敲除组肿瘤浸润及生长迅猛，但对照组肿瘤生长缓慢。
表1.裸鼠结肠癌肝转移模型中转移瘤的形成情况
图2.实验组和对照组裸鼠的累积生存曲线。
3、讨论
紧密连接家族的主要组成蛋白为，Claudins、Occludins及连接支持分子。其中Claudins是形成紧密连接的跨膜糖蛋白，也是紧密连接结构及功能的重要组成成分。在正常生理环境中，细胞间的紧密连接扮演着构建和维护细胞的极性和屏障机能，一旦紧密连接被破坏可引发肿瘤单个细胞的脱落、粘附、降解及移动[2]。近年来研究发现Claudins在不同组织显示了截然不同的表达模式，其中Claudin-7在多种上皮来源的原发癌组织中，由于基因启动子被甲基化而导致表达明显下调，其基因的低表达增加了如结直肠癌等上皮来源肿瘤的浸润和转移能力[3]。因此，Claudin-7被认为是潜在的肿瘤抑制剂。此外，Claudin-7的表达与淋巴结转移有明显的相关性，Claudin-7在淋巴结转移灶中的低表达与肿瘤细胞上皮-间质转化(EMT)有关。另外，Claudin-7的表达与肿瘤患者的预后有关，Claudin-7的高表达明显提高肿瘤患者的生存率，并且Claudin-7的表达水平及临床分期是肿瘤患者预后的独立预测因素[4]。
本实验结果显示，Claudin-7基因敲除对结肠癌肝转移模型中有明显的促进作用。对Claudin-7基因敲除组进行解剖观察，发现转移性肝癌形成迅猛，肿瘤生长均衡，迅速累计全肝，并伴有血性腹水、腹膜种植转移、远处转移，裸鼠数周会出现恶液质征象，60天累积生存率(如同人类5年生存率)明显低于对照组。对转移性肝癌组织进行反证实实验中发现，Claudin-7基因敲除组的Claudin-7阳性表达显著低于对照组。说明本实验的设计到结果公平、合理、完美。结肠癌肝转移模型中肝转移细胞的生长增殖能力的鉴定报道得出，侵袭能力和生长增殖能力具有反向关联，即结肠癌肝转移细胞具有更强的侵袭能力，但生长增殖速度比其他细胞更慢[5]。我们的实验结果，打破了上述传统的转移性肿瘤的生长主流，这一结局关系到Claudin-7的作用，具体的作用机理和Claudin-7(抑癌基因)的传导通路的另一个环节有待于进一步探讨。
总之，Claudin-7基因敲除可促进裸鼠结肠癌肝转移的形成，况且Claudin-7表达可作为肿瘤转移的评价指标推广应用。
参考文献
[1]KrauseG,WinklerL,MuellerSL,etal.Structureandfunctionofclaudins.BiochimBiophysActa.2008;1778(3):631-645.
[2]IravaniO,TayBW,ChuaPJ,etal.Claudinsandgastriccarcinogenesis.ExpBiolMed(Maywood).2013;238(4):344-349.
[3]王文辉,汪芳裕,魏娟,等.CpG甲基转移酶诱导紧密连接蛋白7和8基因表达下调对人结肠癌HT-29细胞增殖和凋亡的影响.中华肿瘤杂志.2013,35(6):405-11.
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[5]刘坤,王常刚,蔡健华,等.结肠癌肝转移细胞增殖能力减弱.中华实验外科杂志.2011,28(3):410-12.