导读:本文包含了壳聚糖硬脂酸嫁接物论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:壳聚糖,硬脂酸,顺乌头酸,聚谷氨酸
壳聚糖硬脂酸嫁接物论文文献综述
姚晶晶[1]（2014）在《羧基对壳聚糖—硬脂酸嫁接物介导的基因传递的影响》一文中研究指出本研究为了进一步增加壳聚糖硬脂酸的转染效率,分别从化学嫁接和物理混合两种方式引入羧基,以研究促进CSO-SA基因转染效率的方法,并探讨其机理。通过碳二亚胺法,将小分子阴离子-顺乌头酸化学嫁接到CSO-SA上得到CA-CSO-SA。氢核磁共振确证了嫁接物的化学组成。经TNBS法测得CSO-SA和CA-CSO-SA的实际氨基取代度为4.03%和6.31%,临界胶束浓度80.3μg/L和78.4μg/L。微粒粒度与表面电位分析仪测得1.0mg/mL的CSO-SA和CA-CSO-SA胶束的数均粒径为55.3±7.6nm和60.0±7.1nm,电位为38.3±2.8mV和30.8±1.0mV。透射电子显微镜结果显示这两种胶束呈不规则的球形,粒径较小,分布均一。分别制备了CSO-SA/DNA, CA-CSO-SA/DNA复合物,虽然在顺乌头酸修饰后,CA-CSO-SA与DNA密接略有下降但是依然可以有效的保护DNA免受酶降解的能力,且形成的复合物具有良好的血清稳定性。CA-CSO-SA/DNA复合物在HEK293细胞介导的转染效率达到37%,与CSO-SA/DNA相比,转染效率增加一倍,优于阳性对照lipofectamineTM2000。虽然顺乌头酸修饰降低了细胞摄取的速率,但是在24h时细胞摄取总量是没有差异的。CA-CSO-SA/DNA在HEK293细胞中,主要通过网格蛋白介导的内吞作用,以及小窝蛋白介导的胞吞作用和巨胞饮作用。CSO-SA/DNA复合物容易陷在内溶酶体中,但CA-CSO-SA/DNA能够更有效的从内溶酶体中逃逸出来并分布在细胞质中。顺乌头酸修饰提高了CSO-SA的生物安全性,且在转染剂量下对细胞基本不呈现毒性。将聚谷氨酸PGA分别与DNA混合后,再与CSO-SA嫁接物胶束混合,制备不同N/P/C比CSO-SA/DNA/PGA叁元复合物。随着PGA增加,叁元复合物起始粒径变化不大,而在N/P/C比为10/1/6时粒径显着性增加,而多分散系数以及电位都随着PGA的加入而出现明显的下降趋势。以绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-C1)为报告基因,流式细胞仪测定细胞转染百分率的结果表明CSO-SA/DNA/PGA叁元复合物的基因转染效率随着PGA先增加后降低；在N/P/C=10/1/4时转染效率为27.4%,是CSO-SA/DNA二元复合物的两倍,且接近阳性LipofectamineTM2000对照,以虫荧光素酶质粒为报告基因,化学发光仪测定其发光值得结果表明CSO-SA/DNA/PGA叁元复合物在N/P/C=10/1/4虫荧光素酶的表达最高,达到5.32*105RLU/mg Protein,约是二元复合物表达的10倍。共聚焦观察细胞内过程和Bafilomycin Al抑制实验结果显示CSO-SA/DNA/PGA复合物具有更高的溶酶体逃逸的效率归结于叁元复合物质子缓冲能力的增加,从而获得了更高效的基因转染效率。研究结果表明化学嫁接或者物理混合适量的负电荷都是有利于CSO-SA介导的基因转染,且引入的羧基对于促进内溶酶体的逃逸起了重要作用。(本文来源于《浙江大学》期刊2014-01-01）
严晶晶[2]（2013）在《壳聚糖—硬脂酸嫁接物/蛋白质/DNA叁元复合物基因给药系统研究》一文中研究指出壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束具有较强的肿瘤细胞摄取能力和细胞核转运功能,其阳离子特性可有效密接质粒DNA,实现有效的基因转染和体内外抗肿瘤疗效。前期研究结果表明：壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束负载基因药物进入靶细胞后,基因药物的有效释放是制约其基因转染效率的主要因素。本研究为实现基因药物在靶细胞内的有效释放,构建壳聚糖-硬脂酸嫁接物／蛋白质／质粒DNA叁元基因给药系统,考察蛋白质的等电点对其基因转染效率的影响。采用酶解法制备低分子量的壳聚糖(chitosan, CS),以碳二亚胺(EDC)为交联耦合剂,合成壳聚糖-硬脂酸嫁接物(stearic acid grafted chitosan, CS-SA)。核磁共振氢谱确证嫁接物的化学结构；叁硝基苯磺酸法测定氨基取代度；芘荧光法测定临界胶束浓度；动态光散射法测定嫁接物胶束的粒径；透射电镜观察胶束的形态学特征。采用乙酰氯催化法酯化牛血清白蛋白(BSA)合成不同等电点的BSA, Zeta电位法测定等电点。分别制备CS-SA/DNA二元复合物和含有不同等电点蛋白质的CS-SA/BSA/DNA叁元复合物。测定二元、叁元复合物的粒径并观察复合物的形态；凝胶电泳分析嫁接物胶束与DNA的密接程度。以pEGFP-C1作为报告基因,HEK293细胞为模型细胞,荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪测定转染效率,比较二元复合物及叁元复合物的转染差异；激光共聚焦比较二元、叁元复合物的细胞摄取及胞内释放行为,流式细胞仪定量摄取效果；MTT法考察给药系统的细胞毒性。本研究进一步以survivin为靶点,设计并合成shRNA重组质粒(pshSUR).建立实时荧光定量PCR方法,筛选最佳干扰质粒；采用最佳转染处方制备干扰RNA给药系统CS-SA/BSA/pshSUR,并以人乳腺癌药物敏感细胞(MCF-7)和耐药细胞(MCF-7/Adr)为模型细胞,考察基因治疗联合化疗药物紫杉醇给药后,逆转耐药细胞MCF-7/Adr耐药行为。研究结果表明,通过碳二亚胺介导得到了两亲性的壳聚糖-硬脂酸嫁接物(CS-SA).核磁共振氢谱确证了CS-SA的化学组成；所合成的CS-SA的氨基取代度为7.4%；临界胶束浓度为81.0μg/L；浓度为1mg/mL的嫁接物胶束数均粒径为36.4±0.9nm,电位为32.7±1.2mV；透射电子显微镜结果显示胶束呈球形,粒径较小,分布均一嫁接物胶束具有较强的密接DNA能力,所形成的CS-SA/DNA-二元复合物,粒径较小且分布均一。通过乙酰氯催化法合成了等电点分别为4.7、6.0、9.3的BSA,采用共孵育法制备CS-SA/BSA/DNA叁元复合物。结果表明：当WBSA/WCS-SA比由0.1增至0.5时,嫁接物仍可有效密接DNA。当BSA含量较低时,叁元复合物与二元复合物相比较粒径差异不是很明显均小于200nm,且不影响细胞摄取；体外基因转染结果显示：BSA的等电点显着影响嫁接物介导的基因转染效率。与二元复合物相比,CS-SA/BSA(6.0)/DNA叁元复合物的基因转染效率略有增加;CS-SA/BSA(4.7)DNA转染效果进一步增加,且接近阳性LipofectamineTM2000对照;而CS-SA/BSA(9.3)/DNA对转染效率起抑制作用。采用等电点为4.7的BSA促进基因转染的效率,在于其负电荷性质促进基因药物的释放。本研究建立了准确可靠的实时荧光定量PCR (RT-PCR)方法学,并采用RT-PCR技术筛选出最佳干扰质粒。以叁元复合给药系统基因治疗结合紫杉醇的化疗研究结果表明,经基因治疗后可有效增加耐药细胞MCF-7/Adr对紫杉醇的敏感性,其逆转耐药倍数为9倍,而对敏感细胞MCF-7无明显作用。(本文来源于《浙江大学》期刊2013-01-01）
谢贻珽[3]（2012）在《壳聚糖硬脂酸嫁接物给药系统的脑靶向研究》一文中研究指出血脑屏障可阻止大多数药物进入脑组织,影响脑部疾病的药物治疗效果。采用脑靶向技术,有可能成为脑部疾病药物治疗的突破口。为此,开发有效的脑靶向给药系统,成为当前研究最为迫切也是最具挑战的课题。壳聚糖是一种生物可降解生物材料,以碳二亚胺为交联耦合剂,经硬脂酸疏水修饰,合成得到壳寡糖硬脂酸嫁接物(stearic acid grafted chitosaccharide, CSO-SA),该嫁接物可在水中形成胶束。本课题以CSO-SA胶束为基本材料,考察其在脑靶向给药系统上应用的潜能。CSO-SA的氨基取代度为26.9±1.08%,CSO-SA可在水性介质中自聚集形成粒径为81.35±5.16 nm、表面电位为36.4±0.71mV的胶束。选用大脑内皮细胞bEnd.3为模型细胞,CSO-SA胶束与细胞共孵育6 h后,即被大部分细胞摄取,显示CSO-SA良好的细胞摄取能力。MTT法测得IC50为237.6±6.61μg·mL-l,表明CSO-SA胶束可作为一种潜在的较为安全的药物载体,应用于脑靶向给药系统。以阿霉素为模型药物,透析法制备载药CSO-SA胶束。测得的药物包封率为81.23%,载药后粒径减小,48 h在体外释放量达72%。以DiR为示踪剂,活体荧光成像观察CSO-SA胶束体内分布。结果显示,CSO-SA可快速穿透(blood-brain barrier, BBB)进入脑组织,脑内分布随时间逐渐降低。以盐酸阿霉素为对照,研究阿霉素载药胶束的组织分布和体内药动学。脑组织分布研究表明,载药胶束在给药15 min后达到峰值,为1.01%/g,1 h内维持在0.45%/g以上。盐酸阿霉素对照给药组,未在脑内检测到药物,显示盐酸阿霉素不能透过BBB。体内药动学结果显示,与游离药物相比,载药胶束给药后AUC增加了4.1倍。在其他脏器的分布中,载药胶束主要分布于肝、脾、肺。与盐酸阿霉素相比,载药胶束在心脏的药物分布量,减小了一倍。选用angiopep-2为主动脑靶向多肽,通过PEG链接,合成angiopep-2修饰CSO-SA,研究多肽修饰对载体脑靶向功能的影响。angiopep-2修饰后,嫁接物胶束粒径增加,载药能力略有下降,体外药物释放动力学没有显着性变化。载药胶束给药后,脑内分布略有增加,AUC可提高17.5倍。(本文来源于《浙江大学》期刊2012-01-01）
蔡莉莉[4]（2012）在《A54多肽修饰壳聚糖硬脂酸嫁接物胶团的肿瘤靶向治疗研究》一文中研究指出肿瘤靶向治疗的终极目标是将所给予的全部化疗药物通过载体技术递送到肿瘤细胞内,以提高药物的抗肿瘤疗效和消除毒副作用。但是,到目前为止,只有通过被动靶向作用,即所谓的“增强渗透与滞留(EPR)”效应,被广泛认可为可提高药物的肿瘤组织靶向,并且只有极少数的靶向给药系统实现了商业化,用于临床肿瘤治疗。本研究在具有肿瘤组织被动靶向功能和肿瘤细胞转运功能的壳聚糖硬脂酸嫁接物(CS-SA)胶团的研究基础上,设计并合成了经噬菌体展示技术筛选得到的主动靶向多肽A54修饰聚乙二醇化壳聚糖硬脂酸嫁接物(A54-PEG-CS-SA)胶团,用于提高肿瘤组织的主动靶向性和细胞摄取的特异性,增强药物的抗肿瘤疗效,实现抗肿瘤药物的主动靶向给药系统高效治疗肿瘤的目标。本研究所合成的A54-PEG-CS-SA嫁接物在水性介质中能自聚形成纳米尺寸的嫁接物胶团,其数均粒径为77.85±8.31 nm,表面电位为40.4±1.9 mV。经探头超声-透析法包裹抗肿瘤药物阿霉素(DOX)后,制备得到的嫁接物载药胶团(A54-PEG-CS-SA/DOX),其数均粒径仍保持在100 nm以下,表面电位有所下降。此外,该嫁接物胶团的药物包封率达79.44%以上。A54-PEG-CS-SA/DOX嫁接物载药胶团的体外药物释放能持续72小时以上。A54-PEG-CS-SA嫁接物胶团载药前后的粒径与聚乙二醇化壳聚糖硬脂酸嫁接物胶团(PEG-CS-SA)和壳聚糖硬脂酸嫁接物胶团(CS-SA)的粒径相比有所增加,但均小于100 nm,而其药物负载和体外释放性能无显着性差异。采用BEL-7402和HepG2肝癌细胞和BRL-3A肝正常细胞的体外细胞毒性和细胞竞争性摄取实验结果显示：本研究所合成的嫁接物胶团具有较低的细胞毒性；在细胞共孵育系统(BEL-7402/BRL-3A及BEL-7402/HepG2)中,A54-PEG-CS-SA嫁接物胶团能特异性地靶向肝癌细胞BEL-7402；嫁接物胶团分别与叁种细胞的共孵育实验结果表明,经A54修饰的嫁接物胶团与未经修饰的嫁接物胶团相比,其在BEL-7402肝癌上的摄取可增加2倍以上；A54修饰的嫁接物载药胶团对BEL-7402肝癌具有最大的细胞毒性。以荷BEL-7402肝癌裸鼠为模型动物的体内靶向分布研究结果表明,A54-PEG-CS-SA嫁接物胶团具有肝脏的靶向功能,与未修饰的胶团相比在肝癌组织的聚集明显增强,这表明A54-PEG-CS-SA嫁接物胶团有望通过靶向多肽A54介导的靶向及内在化作用,成为主动靶向肝癌组织与细胞的嫁接物胶团给药系统。模型动物的抗肿瘤药效学研究表明,A54-PEG-CS-SA/DOX嫁接物载药胶团能有效地抑制肿瘤的生长,与市售的盐酸阿霉素注射剂相比,能显着地提高阿霉素的抗肿瘤疗效,并能降低药物的毒副作用。本研究的结果表明A54-PEG-CS-SA嫁接物胶团通过A54靶向肽的介导,大幅度地提高抗肿瘤药物的肿瘤组织靶向性和实现BEL7402肝癌细胞的特异性摄取,从而可在提高药物的抗肿瘤疗效的同时降低其系统毒性,是一种具有潜力的肿瘤靶向治疗给药载体。(本文来源于《浙江大学》期刊2012-01-01）
蒙盼[5]（2008）在《壳聚糖硬脂酸嫁接物胶团的靶向修饰研究》一文中研究指出聚合物胶团是一类胶体型药物载体,一般呈球形,纳米尺度大小(10～100nm),具有独特的核-壳结构,其疏水性内核提供药物储库作用,亲水性外壳有利于胶团在水性环境的稳定性。聚合物胶团可以通过主动或被动的方式,实现药物的靶向给药:可通过“渗透与保留作用”(permeability and retention effect,EPR)被动靶向肿瘤部位;胶团表面可嫁接配体(如叶酸等),实现药物的主动靶向。最新研究表明,聚合物胶团还可作为选择性的细胞器靶向药物载体,靶向特定的细胞器,如线粒体、高尔基体等。这种细胞器靶向的载体功能,在基因给药系统中具有广泛的应用前景。壳聚糖(chitosan,CSO)是一类由氨基葡萄糖组成的阳离子聚合物,具有很好的生物相容性、低毒性和可生物降解性。研究发现,壳聚糖及其衍生物对生物大分子药物具有保护作用,以该类聚合物为载体制备的多肽、蛋白质、核酸类药物的口服制剂已成为该类药物的研究热点,近年来已广泛应用于携带质粒DNA的基因治疗研究。低分子量壳聚糖不存在难以被消化道吸收而在人体内蓄积的问题,因此,研究低分子量壳聚糖作为药物载体材料具有非常重要的意义。本课题以1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropl)carbodiimide,EDC)为交联偶合剂,通过壳聚糖的氨基和硬脂酸(stearic acid,SA)的羧基结合,将SA嫁接到CSO主链上形成壳寡糖-硬脂酸嫁接物(stearic acid gafted chitosan,CSO-SA),作为药物载体材料。为减少巨噬细胞的对聚合物胶团的摄取,进一步将PEG嫁接到CSO主链上,以期延长胶团在血液中的半衰期。为实现载体的主动靶向性,将半乳糖配体引入嫁接物分子,以增加胶团在富含半乳糖受体的肝癌细胞中的摄取,实现肝靶向作用。为延缓药物从胶团中的释放过程,以使更多的药物能在治疗部位蓄积,参照阳离子载体利用正负电荷的相互作用而包载并浓缩带负电的基因的原理,采用叁磷酸腺苷对CSO-SA胶团进行物理修饰,利用正负电荷复合作用使胶团的结构更为紧密,延缓药物的释放,以期提高药物在靶部位的蓄积。在PEG修饰胶团的研究中,为寻求PEG修饰的最优化条件,设定不同的修饰比例并加以筛选。采用H~1-NMR对CSO-SA和PEG修饰的CSO-SA(PEG-CS-SA)进行了结构确证。芘荧光法测定临界胶团浓度(critical micelleconcentration,CMC),微粒粒度及表面电位分析仪测定胶团的粒径和表面电位,原子力显微镜观察胶团的形态,以考察PEG修饰前后载体材料的理化性质。以芘为荧光探针,1-十二烷基氯化吡啶(1-Dodecylpyridinium chloride,DPC)为荧光淬灭剂,测定PEG修饰前后胶团的疏水核个数,考察PEG修饰后胶团多个疏水核的特殊结构变化。采用细胞定量摄取实验,考察胶团的PEG修饰对减少巨噬细胞(小鼠巨噬细胞RAW264.7)摄取的影响。为考察亲水性PEG在减少巨噬细胞对载体的摄取的同时,是否会减少肿瘤细胞和正常细胞对胶团的摄取,本研究进一步定量考察了CSO-SA和PEG-CSO-SA胶团在人肝癌细胞HepG2、永生化小鼠正常肝细胞株BRL-3A的摄取情况。以丝裂霉素(Mitomycin C,MMC)为模型药物,制备嫁接物载药胶团;在评价载药胶团的理化性质的基础上,探讨嫁接物胶团PEG修饰前后对抗肿瘤药物疗效的影响。本研究采用重均分子量为28 Kda的低分子量壳聚糖合成CSO-SA和PEG-CSO-SA。PEG-CSO-SA的核磁共振(H~1-NMR)图谱中,δ=3.4～3.6 ppm的峰归属于PEG,表明PEG嫁接到CSO-SA上。采用叁硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)法测定CSO-SA和PEG-CSO-SA的氨基取代度(DS)。TNBS可以和游离氨基反应,其产物在344 nm处有吸收。经测定,CSO-SA的氨基取代度为8.8±0.2%,而不同修饰比例的PEG-CSO-SA的氨基取代度为11.8%～19.8%,略高于CSO-SA,并且随着PEG的用量增加而增加,表明PEG已嫁接到CSO-SA上。CSO-SA和PEG-CSO-SA在水性介质中具有自聚集的能力,芘荧光法测得CSO-SA在PBS(pH7.4)中的临界胶团浓度(CMC)为13.8μg/mL,而不同修饰比例的PEG-CSO-SA的CMC为11.5～12.5μg/mL,表明引入PEG亲水性链后嫁接物形成胶团的能力并没有下降。硬脂酸(SA)只是部分取代了壳聚糖(CSO)上的游离氨基,尚有80%左右的氨基未被取代,因此CSO-SA及其PEG修饰胶团表面仍然荷正电,表面电位分析仪测得胶团在PBS(pH7.4)中表面电位在15mV左右。以1-十二烷基氯化吡啶(1-Dodecylpyridinium chloride,DPC)为荧光淬灭剂,采用稳定荧光淬灭方法,测得CSO-SA胶团中,每个疏水核区域中硬脂酸的个数n_(SA)为4.5±0.3个,平均每个聚合物分子链上有3.2±0.2个疏水核区域;而不同修饰比例的PEG-CSO-SA胶团中,每个疏水核区域中硬脂酸的个数n_(SA)为5.4～7.8个,平均每个聚合物分子链上有2.7～1.8个疏水核区域,表明PEG修饰后,由于亲水性的增加,每个疏水核区域需要的硬脂酸基团数量增加,胶团的结构有所改变,但仍保留多个疏水核的特殊结构。采用荧光分光光度计,定量研究经异硫氰基荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的CSO-SA和PEG-CSO-SA胶团被HepG2、BRL-3A和RAW264.7细胞摄取的情况。CSO-SA胶团在HepG2和BRL-3A细胞中的摄取较少,孵育24 h后只摄取了15%左右;而在RAW264.7细胞中的摄取较多,孵育24 h后摄取58.4±0.6%。亲水性PEG链的引入可以显着减少巨噬细胞对胶团的摄取量,并且随着PEG修饰比例的增加,巨噬细胞的摄取量大幅度减少。当PEG的修饰比例达到5:1时,RAW264.7对胶团的摄取量减少到了17.7±0.9%(24h)。然而,PEG-CSO-SA在HepG2和BRL-3A中的摄取几乎没有受到PEG修饰的影响。以MTT试验法测得的细胞活力结果显示,CSO-SA胶团在HepG2细胞中的IC_(50)值为392.4±7.2μg/mL,不同修饰比例的PEG-CSO-SA胶团的IC_(50)值为380～390μg/mL,细胞毒性较低,是一种安全的载体材料。以HepG2为模型细胞,丝裂霉素(Mitomycin C,MMC)为模型药物,考察CSO-SA和PEG-CSO-SA载药胶团的抗肿瘤活性。CSO-SA载药胶团(CSO-SA/MMC)和PEG-CSO-SA载药胶团(PEG-CSO-SA/MMC)的药物包封率均在35%左右。游离MMC在HepG2细胞的IC_(50)值为1.97±0.2μg/mL,CSO-SA/MMC的IC_(50)值为0.13±0.02μg/mL,药效提高了14倍。而不同PEG修饰比例的PEG-CSO-SA/MMC的IC_(50)值为0.11～0.14μg/mL,与CSO-SA/MMC的IC_(50)值没有显着性差异,说明PEG修饰后不影响嫁接物胶团对药物的细胞内转运,可保持胶团给药系统的细胞水平的疗效。哺乳动物肝细胞膜上的无唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGP-R)是一种肝结合蛋白(hepatic binding protein,HBP),能专一性识别分子末端带有半乳糖残基的糖蛋白并与之结合,定向转运到肝细胞内的溶酶体进行代谢。本研究进一步利用嫁接物分子中壳聚糖上残留的氨基,进行半乳糖的化学修饰,并评价半乳糖修饰嫁接物胶团的理化性质。采用荧光倒置显微镜研究未修饰胶团及半乳糖修饰胶团在HepG2及A549细胞的摄取情况。研究结果显示,半乳糖修饰后,嫁接物胶团在HepG2细胞中的摄取明显增加,而在A549细胞中的摄取与未修饰胶团没有差异。在利用叁磷酸腺苷(ATP)对CSO-SA胶团进行物理修饰的研究中,考察了ATP的用量对载药胶团粒径、表面电位以及药物体外释放的影响。随着ATP用量的增加,载药胶团的粒径减小,表面电位降低。当ATP与CSO-SA的质量比为0.2:1时,对药物的控释没有显着效果;当ATP与CSO-SA的质量比为0.4:1时,控释效果明显。(本文来源于《浙江大学》期刊2008-05-01）
壳聚糖硬脂酸嫁接物论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束具有较强的肿瘤细胞摄取能力和细胞核转运功能,其阳离子特性可有效密接质粒DNA,实现有效的基因转染和体内外抗肿瘤疗效。前期研究结果表明：壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束负载基因药物进入靶细胞后,基因药物的有效释放是制约其基因转染效率的主要因素。本研究为实现基因药物在靶细胞内的有效释放,构建壳聚糖-硬脂酸嫁接物／蛋白质／质粒DNA叁元基因给药系统,考察蛋白质的等电点对其基因转染效率的影响。采用酶解法制备低分子量的壳聚糖(chitosan, CS),以碳二亚胺(EDC)为交联耦合剂,合成壳聚糖-硬脂酸嫁接物(stearic acid grafted chitosan, CS-SA)。核磁共振氢谱确证嫁接物的化学结构；叁硝基苯磺酸法测定氨基取代度；芘荧光法测定临界胶束浓度；动态光散射法测定嫁接物胶束的粒径；透射电镜观察胶束的形态学特征。采用乙酰氯催化法酯化牛血清白蛋白(BSA)合成不同等电点的BSA, Zeta电位法测定等电点。分别制备CS-SA/DNA二元复合物和含有不同等电点蛋白质的CS-SA/BSA/DNA叁元复合物。测定二元、叁元复合物的粒径并观察复合物的形态；凝胶电泳分析嫁接物胶束与DNA的密接程度。以pEGFP-C1作为报告基因,HEK293细胞为模型细胞,荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪测定转染效率,比较二元复合物及叁元复合物的转染差异；激光共聚焦比较二元、叁元复合物的细胞摄取及胞内释放行为,流式细胞仪定量摄取效果；MTT法考察给药系统的细胞毒性。本研究进一步以survivin为靶点,设计并合成shRNA重组质粒(pshSUR).建立实时荧光定量PCR方法,筛选最佳干扰质粒；采用最佳转染处方制备干扰RNA给药系统CS-SA/BSA/pshSUR,并以人乳腺癌药物敏感细胞(MCF-7)和耐药细胞(MCF-7/Adr)为模型细胞,考察基因治疗联合化疗药物紫杉醇给药后,逆转耐药细胞MCF-7/Adr耐药行为。研究结果表明,通过碳二亚胺介导得到了两亲性的壳聚糖-硬脂酸嫁接物(CS-SA).核磁共振氢谱确证了CS-SA的化学组成；所合成的CS-SA的氨基取代度为7.4%；临界胶束浓度为81.0μg/L；浓度为1mg/mL的嫁接物胶束数均粒径为36.4±0.9nm,电位为32.7±1.2mV；透射电子显微镜结果显示胶束呈球形,粒径较小,分布均一嫁接物胶束具有较强的密接DNA能力,所形成的CS-SA/DNA-二元复合物,粒径较小且分布均一。通过乙酰氯催化法合成了等电点分别为4.7、6.0、9.3的BSA,采用共孵育法制备CS-SA/BSA/DNA叁元复合物。结果表明：当WBSA/WCS-SA比由0.1增至0.5时,嫁接物仍可有效密接DNA。当BSA含量较低时,叁元复合物与二元复合物相比较粒径差异不是很明显均小于200nm,且不影响细胞摄取；体外基因转染结果显示：BSA的等电点显着影响嫁接物介导的基因转染效率。与二元复合物相比,CS-SA/BSA(6.0)/DNA叁元复合物的基因转染效率略有增加;CS-SA/BSA(4.7)DNA转染效果进一步增加,且接近阳性LipofectamineTM2000对照;而CS-SA/BSA(9.3)/DNA对转染效率起抑制作用。采用等电点为4.7的BSA促进基因转染的效率,在于其负电荷性质促进基因药物的释放。本研究建立了准确可靠的实时荧光定量PCR (RT-PCR)方法学,并采用RT-PCR技术筛选出最佳干扰质粒。以叁元复合给药系统基因治疗结合紫杉醇的化疗研究结果表明,经基因治疗后可有效增加耐药细胞MCF-7/Adr对紫杉醇的敏感性,其逆转耐药倍数为9倍,而对敏感细胞MCF-7无明显作用。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
壳聚糖硬脂酸嫁接物论文参考文献
[1].姚晶晶.羧基对壳聚糖—硬脂酸嫁接物介导的基因传递的影响[D].浙江大学.2014
[2].严晶晶.壳聚糖—硬脂酸嫁接物/蛋白质/DNA叁元复合物基因给药系统研究[D].浙江大学.2013
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