导读:本文包含了辅助蛋白论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:传染性支气管炎病毒,IBV,辅助基因,Sc
辅助蛋白论文文献综述
赵秀美,姜逸,程旭,高明燕,俞燕[1]（2018）在《鸡传染性支气管炎病毒辅助蛋白3a、3b对病毒毒力的影响》一文中研究指出引言为了探讨鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)辅助蛋白对IBV毒力的影响,本课题组利用前期建立的IBV反向遗传操作系统,通过在辅助蛋白基因起始密码子中引入点突变的方式,分别构建了辅助基因3a、3b、3ab表达沉默的毒株r IBYZ-Sc3a、r IBYZ-Sc3b和r IBYZ-Sc3ab。将这叁株毒株与亲本株r IBYZ分别接种1日龄SPF雏鸡,通过分析不同组别雏鸡的死亡情况、体重变化情(本文来源于《中国畜牧兽医学会2018年学术年会禽病学分会第十九次学术研讨会论文集》期刊2018-11-21）
朱昊[2]（2018）在《粘质沙雷氏菌磷脂酶A1辅助蛋白可溶性表达及其与磷脂酶A1相互作用研究》一文中研究指出磷脂酶A1辅助蛋白PlaS是一段在编码基因plaA的下游序列,它与磷脂酶A1在大肠杆菌中的高活性表达密切相关。为研究辅助蛋白PlaS的性质及其对磷脂酶A1的酶活调控机制,构建SP28重组质粒。实验表明,重组质粒中辅助蛋白PlaS的表达量极低,不能被SDS-PAGE检测到,仅通过Western Blot技术,才检测到其极微量的表达。本论文通过对辅助蛋白PlaS的蛋白结构进行生物信息学分析,并以此确定利用PCR技术对辅助蛋白PlaS的N端35个氨基酸进行截短处理,成功构建重组质粒dSP28。对构建的重组质粒dSP28进行诱导表达,结合发酵培养基优化,获得了大量的可溶性目的蛋白。最后,通过酵母双杂交技术,共表达菌株dBP28的构建,以及Biacore蛋白互作实验,对辅助蛋白PlaS与磷脂酶A1的体内和体外相互作用特性进行研究。主要研究内容和结果如下:(1)磷脂酶A1辅助蛋白PlaS表达系统的构建利用生物信息学手段,对plaS基因序列进行分析,为促进磷脂酶A1辅助蛋白胞内可溶性表达,将辅助蛋白PlaS的N端截短了35AA。辅助蛋白截短后的dplaS基因插入载体p ET-28a(+)中,再将测序验证正确的重组质粒转化到BL21(DE3)宿主菌中进行表达,从而成功构建重组表达菌株dSP28。(2)磷脂酶A1辅助蛋白发酵培养基优化及蛋白分离纯化将构建成功的dSP28菌株进行发酵培养,为使目的蛋白在细胞内大量可溶性表达,比较不同组分的发酵培养基对目的蛋白可溶表达的影响,筛选出最适发酵培养基为TB加3%甘油的发酵培养基。利用该发酵培养基对dPlaS诱导表达,并用AKTA系统对目的蛋白进行纯化,得到纯化后的目的蛋白浓度为33.78μg/mL。(3)PlaA与辅助蛋白PlaS和dPlaS体内相互作用研究采用酵母双杂交技术,通过分子克隆成功构建诱饵质粒pGBKT7-PlaA,猎物质粒pGADT7-PlaS和pGADT7-dPlaS。先将诱饵质粒pGBKT7-PlaA转入酵母感受态细胞进行自激活验证,若未发生自激活反应,则将诱饵质粒pGBKT7-PlaA分别和猎物质粒pGADT7-PlaS,pGADT7-dPlaS共转进Y2HGold酵母感受态细胞,并增加阴性和阳性对照。结果表明,诱饵蛋白未发生自激活,随后进行的共转化实验中,阳性对照组中的菌落颜色与诱饵质粒和猎物质粒共转化平板上菌落颜色一致,均为蓝色,而阴性对照组中的菌落颜色为白色,说明PlaA与PlaS蛋白及PlaA与dPlaS在体内发生相互作用,激活酵母中的报告基因,所以二者间存在相互作用。为进一步验证PlaA与辅助蛋白PlaS和dPlaS体内相互作用,构建了plaA基因和dplaS基因的共表达菌株dSP28,并与实验室前期构建的含有pla A基因和plaS基因重迭菌株BP28的磷脂酶A1的酶活相比较。结果发现,共表达菌株中辅助蛋白dPlaS对PlaA的表达有促进作用,且酶活有明显提高。说明,截短后的辅助蛋白dPlaS与PlaA间存在相互作用。(4)PlaA与辅助蛋白dPlaS体外相互作用将实验室前期构建得到的AP28重组质粒进行发酵培养,得到大量PlaA的包涵体,对得到的包涵体进行变复性,并用AKTA蛋白纯化仪纯化得到PlaA纯蛋白。同时,对大量可溶性表达的辅助蛋白进行纯化,使纯化后的PlaA与辅助蛋白dPlaS纯度均达到90%以上。随后,将得到的纯蛋白在Biacore蛋白互作仪进行互作,发现PlaA与辅助蛋白dPlaS能够特异结合,并呈现很好的浓度依赖,两蛋白间的结合速率ka为9223 Ms~(-1),解离速率kd为1.054E-5 s~(-1),平衡亲和力KD为1.143E-9 M。(本文来源于《安徽工程大学》期刊2018-06-12）
方谱县[3]（2018）在《猪δ冠状病毒辅助蛋白的鉴定及NS6抑制IFN-β产生的机制研究》一文中研究指出冠状病毒(Coronavirus,CoV)属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae),其感染宿主范围十分广泛,包括鸟类、人以及其他哺乳动物。根据国际病毒分类委员会第九次报告,冠状病毒可分为α、β、γ、δ4个属。在冠状病毒编码的蛋白中,除了传统的结构蛋白和非结构蛋白,还存在数量不等、零散分布在结构蛋白之间或内部的辅助蛋白(accessory protein)。这些辅助蛋白具有种属特异性,与其他已知蛋白没有同源性或者同源性非常低。根据目前关于SARS-CoV等冠状病毒辅助蛋白的研究结果,证实冠状病毒辅助蛋白是病毒复制非必需的,但参与了免疫调控,并且与病毒的毒力相关。2014年美国首次报道猪场爆发猪δ冠状病毒(PDCoV),引起新生仔猪的腹泻、呕吐、死亡。随后,多个国家报道了该病的发生与流行,引起养猪业的高度关注。根据基因组序列预测PDCoV可编码两个辅助蛋白NS6和NS7,但没有得到实验验证,其功能也有待分析。另外,除了NS6和NS7外,PDCoV是否还编码其它的辅助蛋白也不清楚。因此,本研究以PDCoV CHN-HN-2014毒株为代表,对其假定编码的辅助蛋白进行鉴定,同时探究它们与宿主天然免疫反应之间的关系。具体研究内容如下:1.PDCoV辅助蛋白NS6的鉴定参照PDCoV CHN-HN-2014全基因组序列,设计两条特异性引物(Leader-F,NS6r),分别位于基因组5'端前导序列以及NS6基因3'末端。提取病毒感染的细胞总RNA,进行RT-PCR和测序分析,结果显示NS6是一个独立的亚基因组(subgenomic RNA,sgmRNA),采用了非经典的调控序列(transcription regulating sequences,TRS),且位于预测的TRS上游。随后,通过单克隆抗体的制备成功获得两株稳定分泌NS6特异性抗体的杂交瘤细胞。间接免疫荧光(IFA)和Western blot分析表明:两株单抗(2G3和4B9)可特异性识别过表达的NS6蛋白或PDCoV感染的LLC-PK1细胞,证实NS6蛋白在病毒感染早期表达,而且定位于细胞质中。进一步分析发现,NS6蛋白主要定位于内质网和内质网高尔基体室,部分定位于高尔基体。这些结果首次证实了NS6蛋白在PDCoV感染细胞中的表达,而且NS6是一个独立的亚基因组,采用了非经典的TRS(ACACCT)。2.PDCoV辅助蛋白NS7的鉴定及NS7a的发现根据预测的PDCoV NS7的序列,设计引物将预测的NS7基因克隆至pGEX-KG原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-KG-NS7。随后,经IPTG诱导表达获得GST-NS7融合蛋白,进一步通过单克隆抗体制备成功获得4株稳定分泌NS7蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞。IFA证实4株单克隆抗体都能特异性识别PDCoV感染的或过表达NS7的LLC-PK1细胞。Western blot分析发现,4株单克隆抗体与PDCoV感染的细胞反应时,除了能检测到NS7蛋白条带外,还出现了一条大小约12 kDa的特异性蛋白条带。但是,这个小蛋白条带在过表达NS7的细胞中并没有出现。随后,通过分析PDCoV感染细胞后病毒的亚基因组RNA,发现存在一条采用非经典TRS的新的亚基因组RNA,其ORF的3'末端与NS7 3'末端完全相同,可编码大小为100个氨基酸的多肽,说明可能存在一个新的辅助蛋白,将其命名为NS7a。进一步研究发现,过表达的NS7a蛋白能被4株针对NS7的单克隆抗体特异性识别,并且与病毒感染条件下检测到的较小的蛋白大小一致。这些结果表明PDCoV确实编码了一个新的辅助蛋白NS7a,是一个独立的亚基因组,而且采用了非经典的TRS(ACCCCA)。3.PDCoV辅助蛋白NS6拮抗IFN-β产生的机制先前的研究已经证实PDCoV编码了3个辅助蛋白(NS6、NS7、NS7a),但是这些辅助蛋白是否也具有免疫调节功能尚不清楚。因此,我们以NS6为代表对PDCoV辅助蛋白调控天然免疫的特性进行了进一步研究。将NS6克隆至pCAGGS-HA载体中获得真核表达质粒pCAGGS-HA-NS6,转染细胞进行超表达,发现NS6蛋白能显着抑制仙台病毒(Sendai virus,SeV)诱导的IFN-β启动子活性以及IFN-β蛋白表达,而且抑制SeV诱导的关键转录因子IRF3和NF-κB的磷酸化以及入核,表明NS6蛋白能够拮抗IFN-β产生。但令人惊奇的是,NS6蛋白对RLRs(RIG-I-like receptors)信号通路关键分子(RIG-I/RIG-IN、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、IRF3)介导的IFN-β启动子活性并没有抑制作用,提示NS6蛋白可能靶向RIG-I/MDA5或其上游。同时,通过免疫共沉淀实验(Co-IP)和IFA分析发现,NS6与RIG-I/MDA5存在相互作用,而且这种相互作用并不依赖于RNA;进一步分析表明,NS6蛋白与RIG-I的CTD区域以及MDA5的Hel和CTD区域发生相互作用,RNA pull-down分析证实NS6不是一个RNA结合蛋白。随后的Co-IP竞争性试验结果也证实NS6蛋白能显着减弱RIG-I/MDA5与dsRNA的结合。上述结果表明NS6采用了一种新的免疫抑制策略,抑制RLRs介导的IFN-β产生。(本文来源于《华中农业大学》期刊2018-06-01）
杨笑[4]（2018）在《共表达辅助蛋白促进酿酒酵母异源蛋白分泌》一文中研究指出酿酒酵母是食品级安全性真菌,广泛应用于食品工业和生物医药领域。酿酒酵母细胞具有完善的蛋白质加工体系,确保蛋白质的折迭、翻译后修饰,目前已有多种药物蛋白由酿酒酵母生产。然而,酿酒酵母对异源蛋白的分泌水平普遍较低,严重制约了其的工业化应用。提高酿酒酵母分泌水平的方法主要是优化发酵和从基因层面调节异源蛋白分泌。目前酿酒酵母异源蛋白基因层面上的分泌策略主要以小分子蛋白质为研究对象,对30KDa以上的蛋白质种类研究较少。本文以漆酶(53KDa)为例,尝试寻找一系列适合较大分子的分泌表达策略。本文通过在酿酒酵母中优化漆酶的启动子、信号肽和共表达与异源蛋白合成和分泌相关的蛋白质(简称“辅助蛋白”),使漆酶的胞外分泌水平提高,还发现辅助蛋白组合可提高α-淀粉酶和增强型绿色荧光蛋白EGFP的分泌水平,具有一定的普遍适用性。具体研究如下:1、选择启动子TEF1和GAL1,构建并发酵产胞内酶菌株,以了解漆酶在酿酒酵母胞内的表达情况;在此基础上引入α-因子信号肽,构建产胞外酶菌株,发酵并测定胞内外酶活,纯化蛋白后跑SDS-PAGE,考察各菌株的漆酶表达水平。结果表明:所选漆酶基因能在酿酒酵母胞内表达和胞外分泌。在T=72h,启动子GAL1对应菌株的漆酶胞外酶活高于启动子TEF1对应菌株,分别为 129.73 ±2.57 U/L 和 30.52 ±2.56 U/L。因此,选 GAL1为胞外产酶菌的启动子用于后续实验。2、选取酿酒酵母天然α-因子信号肽、菊粉酶天然信号肽、合成信号肽以及漆酶天然信号肽,比较其介导的漆酶分泌效果。合成信号肽介导的漆酶胞外酶活和分泌率较α-因子信号肽分别提高了 1.39倍和99%,另外两种信号肽对应菌株未检测到胞外酶活。综合考虑胞外酶活和分泌率,确定合成信号肽用于后续实验。3、选取八个辅助蛋白,将其过表达,考察对漆酶分泌的作用。结果表明RPP0、SS02、BIP、PDI四个辅助蛋白使漆酶胞外酶活和分泌率提高,其胞外酶活依次下降。其中RPPO过表达的菌株B/pGSLC-yPRP的胞外酶活为444.24 ±2.82 U/L,分泌率为25.73 ±0.73%,分别较空白对照B/pGSLC-YEplac181 提高了 69%和 46%。4、考察分泌效果较好的PDI、BIP、SS02和RPP0四个辅助蛋白间的协同作用。结果表明RPP0和SS02,RPP0和BIP,RPP0和SecI叁组蛋白存在促进蛋白胞内表达和胞外分泌的协同作用。其中,RPP0和SS02的协同作用对漆酶分泌最显着,其胞外酶活为585.21 ±1.28 U/L,分泌率为30.36±0.71%,较过表达RPP0的菌株B/pGSLC-yPRP分别提高了 31%和18%,较空白对照B/pGSLC-YEplac181分别提高了 1.23倍和73.19%。5、考察辅助蛋白RPP0和SS02共表达对提高其他异源蛋白分泌水平的普遍适用性。结果表明RPP0和SS02共表达使得菌株的α-淀粉酶的胞外酶活较空白对照提高了 73%,EGFP发酵液上清的荧光强度较空白对照提高8%,RPPO和SS02共表达对于大分子蛋白质α-淀粉酶表现出更明显的促进分泌效果。最终,通过优化启动子、信号肽和过表达辅助蛋白,漆酶的胞外酶活从 30.52 ± 2.56 U/L 提高到 585.21 ± 1.28 U/L,提高了 18.17 倍。本课题的研究意义在于:运用基因层面上的调控策略,不仅提高了大分子蛋白质-漆酶在酿酒酵母中的分泌量,而且首次发现了辅助蛋白RPP0和SS02在提高异源蛋白分泌水平上具有较强的协同作用和普遍适用性,对提高其他异源蛋白在酿酒酵母的分泌水平具有一定的指导意义。(本文来源于《北京化工大学》期刊2018-06-01）
李学鹏,陈杨,王金厢,李睿智,仪淑敏[5]（2018）在《冷藏大菱鲆新鲜度评价辅助蛋白指标和指示物》一文中研究指出以大菱鲆为对象,通过测定4℃冷藏过程中肌原纤维蛋白盐溶性、Ca2+-ATPase、总巯基含量、表面疏水性、TCA可溶性肽含量、SDS-PAGE,以及TVB-N值和菌落总数等指标,考察冷藏过程中大菱鲆肌肉蛋白质的变化,并分析其与新鲜度指标的相关性,筛选评价新鲜度的辅助蛋白指标及指示物。结果显示:随着贮藏时间的延长,大菱鲆肌原纤维蛋白盐溶性、Ca2+-ATPase活性均显着下降(P<0.05),表面疏水性、TCA可溶肽含量显着上升(P<0.05);总巯基含量呈先上升后下降趋势。SDS-PAGE电泳显示总蛋白中的条带I(25~26 ku),低盐溶蛋白中的条带III(41 ku)、条带IV(38~39 ku),高盐溶蛋白中的肌球蛋白重链、原肌球蛋白、条带II(37 ku)等的光密度值发生规律性升高或降低。TVB-N值、菌落总数均随贮藏时间的延长显着增加,贮藏15 d达到货架期终点。相关性分析表明:肌原纤维蛋白的盐溶性、表面疏水性、Ca2+-ATPase活性、TCA可溶性肽与菌落总数、TVBN值均具显着相关性,可作为4℃冷藏大菱鲆新鲜度评价的辅助蛋白指标;低盐溶性蛋白中的条带III、条带IV,高盐溶性蛋白中的肌球蛋白重链、原肌球蛋白以及条带II,总蛋白中的条带I均与菌落总数、TVB-N值有显着的相关性,均有望作为冷藏大菱鲆的新鲜度指示物。(本文来源于《中国食品学报》期刊2018年04期）
布日额,王金良,吴金花,孙立杰,锡林高娃[6]（2018）在《牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛辅助蛋白AP1、AP2主要抗原域串联表达及其免疫活性鉴定》一文中研究指出利用DNAStar Protean功能筛选AP1和AP2主要抗原结构域,引入15位柔性多肽,通过重迭延伸PCR技术串联融合AP1、AP2主要抗原域基因,PCR扩增串联体基因片段,将其克隆至pET-30a(+)载体,转化BL21(DM3)细胞,进行高效表达,目的蛋白经亲和层析纯化后进行Western blot鉴定。PCR扩增出320bp的AP1和759bp的AP2主要抗原域,经重迭延伸PCR获得了1 065bp的AP1、AP2串联体基因片段,DNA测序结果表明,无碱基的缺失、突变和移码。构建的重组表达载体经诱导能够可溶性表达,目的蛋白相对分子质量大小约46 000,纯化后重组蛋白的纯度>96%,Western blot分析重组融合蛋白结果表明,能够被兔源抗无乳链球菌阳性血清所识别。重迭延伸PCR获得了AP1、AP2主要抗原域串联体,构建了pET-30a(+)/AP1+AP2重组表达载体,诱导目的蛋白呈可溶性表达,表达产物具有良好的免疫反应原性,为进一步研究基于AP1、AP2蛋白的致病机制,检测制剂及疫苗奠定了试验基础。(本文来源于《中国兽医学报》期刊2018年03期）
刘南,祁峰,李力,赵雪冰,刘德华[7]（2018）在《纤维素降解辅助蛋白及其作用机理研究进展》一文中研究指出化石燃料的日渐枯竭及环境污染的日益严重使得生物质原料的资源化、能源化利用受到广泛关注。木质纤维素是地球上最丰富的可再生生物质,其通过生物转化可获得多种燃料和化学品,而纤维素难以有效糖化是木质纤维素生物转化的主要瓶颈。本文介绍了某些纤维素非降解性辅助蛋白提高纤维素酶解效率的相关研究进展,重点分析了近些年发现并研究较多的裂解性多糖单加氧酶(AA9和CBM33)、纤维二糖脱氢酶(CDH)、扩展蛋白(expansin)、膨胀素(SWOI)等几种纤维素辅助蛋白及其协助纤维素降解的机理,总结出这些辅助蛋白主要是通过促进木质素或半纤维素降解以及破坏纤维素的氢键网络和结构来协同纤维素酶催化纤维素的糖化降解。通过以上概括和评述,认为这些辅助蛋白虽然一定程度上可以促进纤维素的酶解,但其研究和应用还仅限于实验室基础研究,如何将其有效并廉价应用于木质纤维素生物转化的工业过程还面临着巨大挑战。指出相关研究工作的重点还需要从廉价而有效的蛋白筛选与构建、协同作用机理解析、过程优化与强化等方面深入开展。(本文来源于《化工进展》期刊2018年03期）
布日额,王金良,吴金花,锡林高娃,陈金龙[8]（2018）在《牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白AP1、BP、AP2叁基因的串联表达及其免疫原性研究》一文中研究指出为探究无乳链球菌菌毛岛屿3个亚基AP1、AP2、BP融合蛋白的抗原性,本研究根据该3个亚基基因的主要抗原结构域序列设计并合成引物,通过重迭延伸PCR技术获得上述3个亚基的串联核苷酸片段,并插入pET-30a(+)载体,转化至BL21(DE3)感受态细胞后诱导表达,表达蛋白经亲和层析纯化后进行western blot鉴定和小鼠免疫实验。结果表明,AP1-AP2-BP融合抗原具有良好的反应原性和免疫原性。本研究为进一步研究无乳链球菌基于AP1-BP-AP2融合蛋白的致病机制、检测制剂及亚单位疫苗研制提供了实验依据。(本文来源于《中国预防兽医学报》期刊2018年02期）
朱昊,薛正莲,王洲,陈阿娜,杨蒙[9]（2018）在《磷脂酶A1辅助蛋白N端截短菌株的构建及其优化表达》一文中研究指出根据GenBank公布的磷脂酶A1辅助蛋白plaS基因序列,通过生物信息学软件分析,截短辅助蛋白PlaS的N端35AA。将截短后的辅助蛋白plaS基因经PCR扩增技术与原核表达载体pET-28a(+)连接,再转化到BL21(DE3)宿主菌中进行融合表达,从而成功构建dSP28表达菌株。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导辅助蛋白表达,对诱导时间、IPTG浓度、起始菌体浓度(OD_(600nm))和温度逐项进行优化,摸索得到辅助蛋白的最佳诱导表达条件为诱导时间8 h,IPTG浓度0.2 mmol/L,起始体浓度(OD_(600nm))0.7,温度40℃,转速200 r/min。在此条件下,对P28、SP28和dSP28发酵中OD_(600nm)进行测定,结果表明,加入IPTG诱导后P28和dSP28能够快速的增殖,且诱导8 h后仍显示增长趋势,而SP28的生长受到明显的抑制作用。(本文来源于《食品与发酵工业》期刊2018年05期）
朝洛蒙,王金良,布日额,吴金花,锡林高娃[10]（2017）在《牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿辅助蛋白BP、AP2主要抗原域的串联表达及其免疫活性》一文中研究指出目的构建无乳链球菌(group B Streptococcus agalactea,GBS)菌毛岛屿辅助蛋白BP、AP2主要抗原表位域融合表达重组质粒,进行高效表达,并分析其免疫活性。方法利用DNAstar生物信息软件Protean功能筛选BP和AP2主要抗原表位域,并引入15位柔性多肽,通过重迭延伸PCR技术扩增融合BP、AP2主要抗原表位域基因,PCR扩增串联体基因片段,克隆至原核表达载体p ET-30a(+),构建重组表达质粒p ET-30a(+)/BP+AP2,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白BP+AP2经亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定,并免疫昆明小白鼠,检测其免疫原性。结果 PCR扩增出675 bp的BP和759 bp的AP2主要抗原域,经重迭延伸PCR获得了1 380 bp的BP、AP2串联体基因片段,DNA测序结果表明,无碱基的缺失、突变和移码。构建的重组表达质粒经诱导后获得表达,目的蛋白相对分子质量约55 000,主要以包涵体形式存在,纯化后纯度达96%以上,浓度为2.05 mg/ml。纯化的融合蛋白能被兔抗GBS阳性血清所识别,且具有良好的免疫原性。结论构建了GBS BP、AP2主要抗原表位域串联体重组表达质粒p ET-30a(+)/BP+AP2,表达产物具有良好的免疫活性,为进一步研究基于BP、AP2蛋白的致病机制、诊断制剂及基因工程疫苗奠定了基础。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2017年11期）
辅助蛋白论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
磷脂酶A1辅助蛋白PlaS是一段在编码基因plaA的下游序列,它与磷脂酶A1在大肠杆菌中的高活性表达密切相关。为研究辅助蛋白PlaS的性质及其对磷脂酶A1的酶活调控机制,构建SP28重组质粒。实验表明,重组质粒中辅助蛋白PlaS的表达量极低,不能被SDS-PAGE检测到,仅通过Western Blot技术,才检测到其极微量的表达。本论文通过对辅助蛋白PlaS的蛋白结构进行生物信息学分析,并以此确定利用PCR技术对辅助蛋白PlaS的N端35个氨基酸进行截短处理,成功构建重组质粒dSP28。对构建的重组质粒dSP28进行诱导表达,结合发酵培养基优化,获得了大量的可溶性目的蛋白。最后,通过酵母双杂交技术,共表达菌株dBP28的构建,以及Biacore蛋白互作实验,对辅助蛋白PlaS与磷脂酶A1的体内和体外相互作用特性进行研究。主要研究内容和结果如下:(1)磷脂酶A1辅助蛋白PlaS表达系统的构建利用生物信息学手段,对plaS基因序列进行分析,为促进磷脂酶A1辅助蛋白胞内可溶性表达,将辅助蛋白PlaS的N端截短了35AA。辅助蛋白截短后的dplaS基因插入载体p ET-28a(+)中,再将测序验证正确的重组质粒转化到BL21(DE3)宿主菌中进行表达,从而成功构建重组表达菌株dSP28。(2)磷脂酶A1辅助蛋白发酵培养基优化及蛋白分离纯化将构建成功的dSP28菌株进行发酵培养,为使目的蛋白在细胞内大量可溶性表达,比较不同组分的发酵培养基对目的蛋白可溶表达的影响,筛选出最适发酵培养基为TB加3%甘油的发酵培养基。利用该发酵培养基对dPlaS诱导表达,并用AKTA系统对目的蛋白进行纯化,得到纯化后的目的蛋白浓度为33.78μg/mL。(3)PlaA与辅助蛋白PlaS和dPlaS体内相互作用研究采用酵母双杂交技术,通过分子克隆成功构建诱饵质粒pGBKT7-PlaA,猎物质粒pGADT7-PlaS和pGADT7-dPlaS。先将诱饵质粒pGBKT7-PlaA转入酵母感受态细胞进行自激活验证,若未发生自激活反应,则将诱饵质粒pGBKT7-PlaA分别和猎物质粒pGADT7-PlaS,pGADT7-dPlaS共转进Y2HGold酵母感受态细胞,并增加阴性和阳性对照。结果表明,诱饵蛋白未发生自激活,随后进行的共转化实验中,阳性对照组中的菌落颜色与诱饵质粒和猎物质粒共转化平板上菌落颜色一致,均为蓝色,而阴性对照组中的菌落颜色为白色,说明PlaA与PlaS蛋白及PlaA与dPlaS在体内发生相互作用,激活酵母中的报告基因,所以二者间存在相互作用。为进一步验证PlaA与辅助蛋白PlaS和dPlaS体内相互作用,构建了plaA基因和dplaS基因的共表达菌株dSP28,并与实验室前期构建的含有pla A基因和plaS基因重迭菌株BP28的磷脂酶A1的酶活相比较。结果发现,共表达菌株中辅助蛋白dPlaS对PlaA的表达有促进作用,且酶活有明显提高。说明,截短后的辅助蛋白dPlaS与PlaA间存在相互作用。(4)PlaA与辅助蛋白dPlaS体外相互作用将实验室前期构建得到的AP28重组质粒进行发酵培养,得到大量PlaA的包涵体,对得到的包涵体进行变复性,并用AKTA蛋白纯化仪纯化得到PlaA纯蛋白。同时,对大量可溶性表达的辅助蛋白进行纯化,使纯化后的PlaA与辅助蛋白dPlaS纯度均达到90%以上。随后,将得到的纯蛋白在Biacore蛋白互作仪进行互作,发现PlaA与辅助蛋白dPlaS能够特异结合,并呈现很好的浓度依赖,两蛋白间的结合速率ka为9223 Ms~(-1),解离速率kd为1.054E-5 s~(-1),平衡亲和力KD为1.143E-9 M。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
辅助蛋白论文参考文献
[1].赵秀美,姜逸,程旭,高明燕,俞燕.鸡传染性支气管炎病毒辅助蛋白3a、3b对病毒毒力的影响[C].中国畜牧兽医学会2018年学术年会禽病学分会第十九次学术研讨会论文集.2018
[2].朱昊.粘质沙雷氏菌磷脂酶A1辅助蛋白可溶性表达及其与磷脂酶A1相互作用研究[D].安徽工程大学.2018
[3].方谱县.猪δ冠状病毒辅助蛋白的鉴定及NS6抑制IFN-β产生的机制研究[D].华中农业大学.2018
[4].杨笑.共表达辅助蛋白促进酿酒酵母异源蛋白分泌[D].北京化工大学.2018
[5].李学鹏,陈杨,王金厢,李睿智,仪淑敏.冷藏大菱鲆新鲜度评价辅助蛋白指标和指示物[J].中国食品学报.2018
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[7].刘南,祁峰,李力,赵雪冰,刘德华.纤维素降解辅助蛋白及其作用机理研究进展[J].化工进展.2018
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