一、Science in China Ser.C,Life Sciences（论文文献综述）
李钰,赵倩倩,梁胜贤,钟理,郭蕊[1]（2021）在《TFEB与线粒体稳态在脓毒症并发症中的调控机制》文中提出脓毒症是由宿主感染引起的炎症反应综合征,伴随着多器官功能障碍,对心血管系统的影响尤为显着.脓毒症患者心肌功能障碍包括炎症、线粒体功能紊乱、氧化应激、低代谢等.线粒体稳态是维持机体健康的重要基础,线粒体功能障碍会引发心肌炎症甚至心力衰竭.转录因子EB（transcription factor EB, TFEB）是调控自噬和溶酶体生物发生的关键转录因子,在线粒体自噬和线粒体生物发生,以及心血管的稳态调控中发挥至关重要的作用.本文总结了近年来脓毒症中TFEB与线粒体调控和功能的研究进展,并讨论了TFEB在细胞内稳态和脓毒症并发症中的潜在作用.
张玥[2]（2021）在《BM2通道蛋白质子传递的影响因素及其与质子通道阻断剂相互作用的理论研究》文中进行了进一步梳理流行性感冒病毒（简称流感）引起的传染性极强的急性呼吸道传染严重威胁着人类生命健康和社会经济发展。据世界卫生组织统计,季节性流感每年都会造成数百万例严重病例,并导致数十万人死亡。人类流感主要由甲型和乙型流感病毒引起,乙型流感病毒引起的疾病占流感病毒感染总数约为50%。位于流感病毒包膜上的通道蛋白M2,可以在酸性环境下激活并传递质子,在病毒的复制、出芽等生命活动中扮演着重要的角色。阻断M2通道蛋白质子传递就可阻止病毒脱壳,从而阻止病毒RNA释放到细胞质中,达到中断病毒早期复制的目的,起到抗流感病毒的作用。迄今为止,尚无有效的靶向乙型流感病毒抑制剂。研发抗乙型流感病毒药物是应对流感大规模爆发的迫切需要。功能域高度保守的乙型流感病毒通道蛋白（BM2）被视为抗乙型流感的理想靶点。BM2通道蛋白质子传递过程的深入研究,对探讨该蛋白的生理机制具有重要意义,可为抗乙型流感病毒药物研发提供可靠的理论依据。BM2通道蛋白以同源四聚体的形式发挥其生理功能。2009年,James J Chou等人通过突变和质子流实验指出,位于BM2通道蛋白N端的极性丝氨酸三联体的突变会显着降低通道的质子传导率。Mei Hong课题组的NMR实验以及Gai Feng课题组的荧光光谱结果表明,BM2通道蛋白的构象以及与质子传递密切相关的水合作用可能会受到负电细胞膜环境和胆固醇的影响。上述研究工作提出了可能对通道质子传递过程有影响的因素,对BM2通道质子传递过程的理解起到了积极的作用,但是具体的微观动态机制尚不明确。因此,明确影响BM2通道质子传递的关键因素,阐明其微观作用机制,对相关的实验探索和药物研发具有重要的现实意义。随着科学技术发展,单从生化实验等研究方法研究蛋白质功能已经无法满足科研工作者的需求,这也成为研究蛋白质功能中的艰巨挑战。以计算机模拟技术为依托的分子模拟方法应运而生。近年来,分子模拟技术日益发展,在蛋白质等复杂生物体系的应用为蛋白质结构和功能预测以及蛋白质模型构建提供了全新的手段。同时,对于实验手段难以涉及的研究领域,如蛋白质与抑制剂的相互作用的动态信息和通道蛋白的变构机制等,提供了有力的补充,实现了多学科多领域的交叉结合。现在,分子模拟在化学、物理、生物、医学、材料等诸多研究领域得到了广泛的应用。借助计算机技术的分子模拟方法已经成为研究蛋白质结构与功能的有力工具。本论文主要采用分子模拟手段,通过多种分子动力学模拟方法,对BM2通道蛋白质子传递的影响因素以及BM2通道蛋白与目前已有的质子通道阻断剂的相互作用机制进行了系统、深入的理论研究。论文的主要研究内容如下:1.极性氨基酸对BM2通道蛋白质子传递的影响为了阐明丝氨酸三联体对BM2通道蛋白质子传递的影响,我们利用分子动力学模拟和计算平均力势（PMF）的方法在原子尺度上研究了丝氨酸三联体对BM2通道蛋白构象、水合作用以及质子传递的影响。分子动力学模拟结果显示,丝氨酸三联体的存在与His19四分体形成稳定的氢键网络,有利于BM2通道C端的打开,通道可以容纳更多的水分子进入,增强通道内水合作用。我们还通过自适应拉伸分子动力学模拟了水合质子在BM2通道内的扩散过程,并计算了相应的PMF值。计算结果表明,丝氨酸三联体形成的极性环境有利于质子在BM2通道蛋白内的扩散和传递。该项研究工作在原子水平上阐述了丝氨酸三联体调控BM2通道蛋白构象,水合作用和质子传递的微观机制,这将有助于我们在原子尺度上进一步了解BM2通道蛋白结构与功能的关系。此外,我们指出丝氨酸三联体所形成的极性环境是影响BM2通道功能的关键因素,这将有助于阻断BM2通道蛋白质子传递的抗乙型流感药物设计。2.细胞膜环境对BM2通道蛋白结构和水合作用的影响为了阐明负电脂质和胆固醇影响BM2通道蛋白功能的微观机制,我们构建了不同的细胞膜环境-BM2通道蛋白复合模型,利用分子动力学模拟方法对不同细胞膜环境下BM2通道蛋白的构象变化和水合作用进行了研究。分子动力学模拟结果表明,在细胞膜中引入负电脂质,细胞膜有序性和膜厚度增加,脂质堆积得更加紧密,通道有更大的打开空间。脂质与BM2通道蛋白C端形成稳定的氢键网络,该氢键网络的存在可以有效维持BM2通道C端处于稳定的打开状态。通道内水密度的计算结果表明,负电脂质的引入可以增强通道内部的水合作用。此外,我们还构建了不同浓度的胆固醇膜环境模型,研究了胆固醇对BM2通道蛋白构象和水合作用的微观调控。结果表明,随着胆固醇在细胞膜环境中占比增加,细胞膜有序性和膜厚度增加,脂质堆积更紧密,通道打开程度增大,通道内部的水合作用增强。该项工作指出了膜环境是影响BM2通道蛋白结构与水合作用的重要因素,明确了BM2通道蛋白膜环境对其功能的微观调控过程,丰富了我们对BM2通道蛋白结构-功能的理解与认识。3.质子通道阻断剂金刚烷胺与BM2通道蛋白的相互作用功能域高度保守的BM2通道蛋白被视为抗乙型流感病毒的有效靶点。但迄今为止,针对BM2通道蛋白的有效抑制剂尚未出现。为了深入了解BM2通道蛋白详细的结构特征信息进行相应的药物研发设计,本工作中,我们通过多种分子动力学模拟方法（包括经典分子动力学模拟、自适应拉伸分子动力学模拟和加速分子动力学模拟）探索了现有的质子通道阻断剂金刚烷胺与BM2通道蛋白的相互作用细节。我们的计算结果表明,金刚烷胺与BM2通道蛋白相互作用遵循结合翻转机制（bind and flip mechanism）。金刚烷胺主要采取up模式结合在BM2通道蛋白N端。当金刚烷胺采取down结合模式时,在BM2通道C端的静电排斥作用驱动下,质子通道阻断剂金刚烷胺会从down模式翻转成up模式。此外,我们还发现质子通道阻断剂金刚烷胺不能有效抑制BM2通道蛋白的另一重要原因是金刚烷胺与BM2通道蛋白内部空腔的空间几何构型不匹配。与此同时,在本工作中,我们还明确了设计靶向BM2通道蛋白的抑制剂应考虑的因素。该项研究结果丰富了BM2通道蛋白结构特征信息,为靶向BM2通道蛋白的抗流感药物设计研发提供了理论依据。
王耀振[3]（2021）在《基于血管紧张素转化酶2探究人参皂苷Rc改善内皮细胞胰岛素抵抗与血管内皮功能障碍的作用及机制》文中提出二型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）是全球范围内的主要健康问题,其对血管可产生严重的危害作用,即糖尿病血管病变,这也是导致T2DM患者致残致死的主要原因。胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）作为T2DM的典型特点,不仅是促进其发生发展的关键因素,还是代谢综合征导致内皮功能障碍的重要原因。内皮是血管的第一道屏障,承担多种自分泌、旁分泌和内分泌功能,而内皮功能障碍是血管功能障碍的早期致病事件,其与IR相互促进,共同在糖尿病心血管并发症中发挥了重要作用。肾素血管紧张素系统（renin-angiotensin system,RAS）是一种具有内分泌特点的肽能系统,主要负责维持血压和水电解质的平衡,其中血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）/血管紧张素II（angiotensin II,Ang II）/血管紧张素1型受体（angiotensin type 1 receptor,AT1R）轴在糖尿病及其并发症的发生发展中起到了重要作用,该轴的关键效应分子-Ang II,参与多种病理生理过程,包括氧化应激、炎症反应、纤维化、肥大和内皮功能障碍等。血管紧张素转化酶2（angiotensin-converting enzyme 2,ACE2）/血管紧张素1-7[angiotensin-（1-7）,Ang-（1-7）]/Mas轴拮抗了ACE/Ang II/AT1R轴的功能,其保护作用不仅依赖于对Ang II的降解,还依赖于生成Ang-（1-7）作用于Mas所产生的抗氧化、抗炎、抗肥大、血管舒张及改善内皮功能障碍等作用。尽管有研究表明ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴可改善代谢IR,并且Ang-（1-7）可改善db/db小鼠内皮功能障碍和Ang II诱导的内皮细胞IR,但ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴与内皮IR的相关研究仍鲜有报道,因此进一步研究其与内皮细胞IR的关系有助于深入理解IR的分子机制,从而以新的角度防治糖尿病心血管并发症。人参皂苷Rc是原人参二醇组皂苷的单体成分并且是人参皂苷的主要成分之一,有关人参皂苷Rc药理活性的研究相对较少,仅有少数研究报道了其具有强大的抗炎和抗氧化活性,而人参皂苷Rc对糖尿病心血管并发症是否具有潜在的保护作用尚不清楚。其同分异构体人参皂苷Rb2与人参皂苷Rb3已被证实具有显着的心血管保护作用,并且还有研究表明了人参皂苷与RAS具有密切关系。鉴于炎症和氧化应激是导致IR的关键机制以及ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴在心血管疾病中的重要保护作用,我们推测人参皂苷Rc可能通过激活ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴改善内皮IR与内皮功能障碍,故开展此研究对其进行初步验证。我们首先应用高糖（high glucose,HG）建立了人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）IR模型（30 mmol/L D-葡萄糖处理24 h）。实验结果显示,HG对HUVECs的存活率和形态无明显影响;HG可显着降低HUVECs的NO分泌含量并升高ET-1 mRNA水平,提示其破坏了血管舒缩因子的平衡;HG可显着降低HUVECs的p-IRS1Tyr896、p-PI3K p85Tyr607、p-Akt Ser473及p-eNOSSer1177水平并升高p-IRS1Ser307水平,提示其损害了胰岛素信号转导;HG可显着减少HUVECs的ACE2及Mas蛋白表达,提示其可能损害了ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴的保护作用。以上结果表明HG成功诱导HUVECs IR并可减少ACE2及Mas蛋白表达。我们进而加入人参皂苷Rc（25、50 mmol/L）与HG同步处理,观察其对HUVECs IR是否具有改善作用。实验结果显示,人参皂苷Rc可显着升高HUVECs的NO分泌含量并降低ET-1 mRNA水平,提示其纠正了血管舒缩因子的失衡;人参皂苷Rc可减少HUVECs的ROS产生,显着降低培养液上清MDA含量并升高SOD活性,提示其增强了HUVECs的抗氧化应激能力;人参皂苷Rc可显着降低HUVECs的TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA水平,提示其增强了HUVECs的抗炎能力;人参皂苷Rc可显着降低HUVECs培养液上清Ang II含量,进一步升高Ang-（1-7）含量,增加ACE2及Mas蛋白表达,而HG或人参皂苷Rc对ACE2及Mas mRNA水平无明显影响,提示人参皂苷Rc可通过非转录调控方式激活ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴;人参皂苷Rc可显着升高HUVECs的p-IRS1Tyr896、p-PI3K p85Tyr607、p-AktSer473及p-eNOSSer1177水平并降低p-IRS1Ser307水平,提示其恢复了胰岛素信号转导;人参皂苷Rc可显着减少NOX2蛋白表达,降低p-IKKβSer177/181、p-JNKThr183/Tyr185及p-NF-κB p65Ser536水平,提示其抑制了IR相关的氧化应激和炎症信号。以上结果表明,人参皂苷Rc可能通过抗氧化、抗炎和上调ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴改善内皮IR。为进一步明确人参皂苷Rc改善内皮IR的潜在机制,我们应用ACE2特异性抑制剂MLN-4760（100 nmol/L）与HG及人参皂苷Rc同步处理。实验结果显示,MLN-4760可显着抑制人参皂苷Rc纠正血管舒缩因子失衡、抗炎、激活ACE2/Ang-（1-7）/Mas轴、恢复胰岛素信号转导及抑制IR相关氧化应激和炎症信号的作用;然而,MLN-4760未能抑制人参皂苷Rc减少HUVECs的ROS产生、降低培养液上清MDA含量并升高SOD活性的作用,提示人参皂苷Rc具有独立于ACE2的抗氧化应激能力。以上结果表明,人参皂苷Rc的抗氧化及抗炎作用一定程度上依赖于上调ACE2,并且其通过上调ACE2改善了内皮IR。基于体外实验结果,我们应用T2DM模型的db/db小鼠和MLN-4760,进一步观察人参皂苷Rc是否对在体的内皮功能障碍同样具有改善作用及其机制是否同样依赖于上调ACE2。实验结果显示,人参皂苷Rc对db/db小鼠体重、空腹血糖、血清脂质（TC、TG、LDL-C、HDL-C）及胰岛素含量无明显影响,提示其无降血糖及调血脂的作用;人参皂苷Rc可显着降低db/db小鼠血清TNF-α含量,提示其在体内同样具有抗炎作用,而这种作用被MLN-4760显着拮抗;人参皂苷Rc对db/db小鼠血清Ang II、Ang-（1-7）及主动脉Ang-（1-7）含量无明显影响,但可显着降低主动脉Ang II含量并增加ACE2及Mas蛋白表达,提示其在体内同样可上调ACE2及Mas,而这种作用被MLN-4760显着拮抗;人参皂苷Rc可显着改善db/db小鼠胸主动脉内皮依赖性舒张并恢复Akt/eNOS信号转导,提示其在体内可改善内皮功能,而这种作用被MLN-4760显着拮抗;人参皂苷Rc可显着减少db/db小鼠主动脉NOX2及NOX4蛋白表达,提示其在体内同样具有抗氧化作用,而MLN-4760可一定程度拮抗这种作用。以上结果表明,人参皂苷Rc可改善db/db小鼠主动脉内皮功能障碍,其机制可能更依赖于降解Ang II而不是生成Ang-（1-7）,且不依赖于对血糖和血脂的调节。综上所述,本研究从细胞水平和整体动物水平上,证实了人参皂苷Rc可通过上调ACE2蛋白改善HUVECs IR及db/db小鼠内皮功能障碍,不仅发现了人参皂苷Rc的新作用及其潜在机制,还为防治糖尿病心血管并发症提供了新的视角。
马洪鑫[4]（2021）在《藜麦蛋白抗氧化肽的制备及其作用机制研究》文中指出本文以藜麦为原料,采用不同方法提取藜麦蛋白,筛选出最佳提取法,然后通过酶解法制备抗氧化肽,利用体外化学测定和体内动物模型综合评价藜麦蛋白抗氧化肽的抗氧化活性,以期为其在食品加工行业的应用提供一些理论依据。主要研究结果如下:1、对藜麦基本营养成分进行测定,发现藜麦中蛋白质含量为12.05±0.02g/100g,水分含量为10.50±0.34 g/100g,灰分含量为2.43±0.03 g/100g,淀粉含量为64.87±0.29 g/100g,残油量为6.57±0.03 g/100g,且富含K、Mg、Zn等微量元素和Thr、Trp、Val、Met等必需氨基酸。2、采用碱溶酸沉法、盐析法、酸提法和水提法制备藜麦蛋白,发现碱溶酸沉法为最佳提取法,其蛋白质提取率和纯度分别为67.36±2.61%和69.08±1.16%;通过RSM法对碱溶酸沉法制备藜麦蛋白提取工艺进行优化,确定其最优提取工艺参数为:温度45℃,液料比1:25 g/m L,p H值10.5,提取时间2.5 h,此条件下蛋白质最大提取率为76.84±0.11%。藜麦蛋白功能特性测定结果表明,p H为4.0即等电点时,藜麦蛋白的溶解性最低,其吸水性为11.89 g/g,吸油性为4.0m L/g,乳化性和乳化稳定性分别为15.42 m2/g和91.20%,蛋白质最小凝胶浓度为180 mg/m L。3、以DH和抗氧化能力为指标,比较不同蛋白酶的水解效果,结果表明,胃蛋白酶为最优蛋白酶,通过RSM法优化其水解工艺显示各因素影响顺序为:p H>温度>加酶量>底物浓度,优化后的最优水解条件为:温度40℃,液料比5%,p H值2.0,加酶量5000 U/g,在此条件下,DPPH自由基清除率达74.82±0.04%。其氨基酸分析结果表明,胃蛋白酶多肽液中必需氨基酸含量占总氨基酸含量的55.37%,其中多肽液中Leu、Phe和Arg占比较高,是胃蛋白酶多肽液的主要氨基酸。4、采用D-半乳糖构建衰老小鼠模型,以小鼠脏器指数、脏器病理切片,血清和肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、总抗氧化能力（T-AOC）的活性和含量,以及SOD1、SOD2、CAT、GSH在基因和蛋白水平上的表达为指标,综合评价藜麦蛋白抗氧化肽对D-半乳糖诱导衰老小鼠模型的抗衰老效果与作用机制。结果表明:藜麦蛋白抗氧化肽能在一定程度上缓解小鼠脏器指数的降低和有效缓解肝脏、肾脏和肺组织的病理症状,延缓器官的退化。与衰老模型组相比,藜麦蛋白抗氧化肽可以显着提高衰老小鼠血清和肝脏中SOD、CAT、GSH和T-AOC的活性（P<0.01）,降低MDA的生成（P<0.01）,具有较强的抗衰老效果。此外藜麦蛋白抗氧化肽能有效提高D-半乳糖衰老小鼠肝组织中SOD1、SOD2、CAT和GSH在m RNA和蛋白水平上的表达量（P<0.05）,从分子生物学水平上揭示藜麦蛋白抗氧化肽的抗衰老机制。综上所述,藜麦蛋白抗氧化肽能提高机体抗氧化能力,清除多余自由基,从而抑制机体脂质过氧化损伤,起到延缓衰老的作用。
曾思静,刘永辉,龙静,关鹏,胡鲜,王晨昱,何流琴,李铁军,邓近平,印遇龙[5]（2021）在《围产期母猪饲粮补充丝氨酸对泌乳母猪和哺乳仔猪血清生化指标和抗氧化功能的影响》文中研究说明本试验研究了围产期母猪饲粮补充丝氨酸（Ser）对泌乳母猪和哺乳仔猪血清生化指标和抗氧化功能的影响。选择胎次、体况相近、健康状况良好的妊娠85日龄长白×约克夏杂交母猪100头,随机分为4组,每组25头,单栏饲喂。在基础饲粮基础上,分别按照基础饲粮Ser含量的0（对照组）、25%（L-Ser组）、50%（M-Ser组）、100%（H-Ser组）补充Ser。其中,对照组妊娠后期母猪饲粮Ser含量为0.55%,泌乳期母猪饲粮Ser含量为0.66%;L-Ser组妊娠后期母猪饲粮Ser含量为0.69%,泌乳期母猪饲粮Ser含量为0.83%;M-Ser组妊娠后期母猪饲粮Ser含量为0.83%,泌乳期母猪饲粮Ser含量为0.99%;H-Ser组妊娠后期母猪饲粮Ser含量为1.10%,泌乳期母猪饲粮Ser含量为1.32%。饲养试验从母猪妊娠85日龄开始,至哺乳21 d结束。结果表明:1)M-Ser组泌乳母猪血清总蛋白（TP）含量显着低于其他3组（P<0.05）,初乳中Ser、甘氨酸（Gly）和半胱氨酸（Cys）含量显着高于L-Ser组（P<0.05）。2)围产期母猪饲粮补充不同水平Ser对21日龄哺乳仔猪血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）活性以及TP、尿素氮（UN）和葡萄糖（GLU）含量均无显着影响（P>0.05）;H-Ser组哺乳仔猪血清Ser含量极显着高于其他3组（P<0.01）;L-Ser组哺乳仔猪血清Gly和Cys含量显着高于对照组（P<0.05）。3) M-Ser组泌乳母猪血清丙二醛（MDA）含量极显着低于其他3组（P <0.01）;M-Ser组和H-Ser组泌乳母猪血清谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性极显着高于对照组和L-Ser组（P<0.01）;3个Ser补充组哺乳仔猪血清MDA含量显着低于对照组（P<0.05）;同时,M-Ser组和L-Ser组哺乳仔猪空肠谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基（GCLM）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPx4）的mRNA相对表达量较对照组显着升高（P<0.05）。上述结果表明,围产期母猪饲粮补充适量Ser,使得妊娠后期饲粮Ser含量为0.83%、泌乳期饲粮Ser含量为0.99%时,可提高泌乳母猪的抗氧化能力,并可通过母乳传递提高哺乳仔猪的抗氧化能力。
陈晓彤[6]（2021）在《PDCD4通过eIF4A依赖的方式抑制TFEB翻译并负向调控溶酶体功能和巨噬细胞抗肿瘤能力》文中研究表明研究目的转录因子EB（TFEB）是调控溶酶体发生和溶酶体功能的关键转录因子,能够参与调控90%的溶酶体相关基因的表达,在调控溶酶体方面起着总体协调的重要作用。TFEB的相关研究在近十年成为研究热点,靶向TFEB治疗溶酶体储积症、溶酶体功能异常相关疾病和神经退行性疾病已经得到广泛证实。但是TFEB在肿瘤、肿瘤相关免疫细胞和肿瘤免疫治疗中的作用尚不清楚。目前关于TFEB的调控机制研究主要集中在其磷酸化和去磷酸化调控机制以及亚细胞定位调控方面,对于TFEB本身的转录和翻译的研究尚未见报道。程序性死亡因子4（PDCD4）是我们课题组长期关注的抑癌基因和蛋白质翻译抑制分子。在多数肿瘤细胞中,PDCD4表达下调或缺失;回补或过表达PDCD4能够抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。在抑制蛋白质翻译方面,PDCD4能够通过eIF4A依赖和eIF4A非依赖的方式分别抑制翻译的起始和延伸过程,最终抑制蛋白质表达。我们已经发表的文章发现,PDCD4基因敲除抑制小鼠巨噬细胞泡沫化,促进巨噬细胞中的脂质代谢;PDCD4抑制自噬相关基因ATG5的表达,机制上PDCD4通过eIF4A依赖的方式抑制ATG5蛋白质翻译,敲除PDCD4能够促进ATG5表达,提高细胞自噬水平。然而,PDCD4能否参与调控溶酶体功能尚不清楚,有待实验探究。本研究旨在通过体内外实验明确PDCD4是否参与调控溶酶体发生和溶酶体功能,进一步探究其相关调控机制。探究PDCD4是否调控TFEB的转录或者翻译过程。为完善TFEB的调控网络,提供重要理论基础;为改善溶酶体功能,治疗溶酶体相关疾病、神经退行性疾病和肿瘤提供新的思路。研究方法一.PDCD4通过TFEB调控溶酶体发生和溶酶体功能1.溶酶体形态和数目检测:使用免疫荧光技术染色溶酶体标志性蛋白,分别检测PDCD4敲除或过表达后小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中溶酶体的形态、大小和数目。2.溶酶体活性检测:使用流式细胞术染色溶酶体特异性活性探针,检测PDCD4敲除或过表达对小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中溶酶体活性的调控。3.溶酶体相关蛋白表达检测:使用免疫蛋白印迹技术,检测PDCD4敲除或过表达后小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中溶酶体相关膜蛋白和溶酶体酶的表达情况。4.PDCD4通过TFEB调控溶酶体:分别在PDCD4敲除的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,干扰TFEB表达,使用免疫荧光、流式细胞术和免疫蛋白印迹分别检测溶酶体形态大小、数目、活性和溶酶体相关蛋白表达情况;使用实时定量PCR技术检测PDCD4敲除和过表达,以及干扰TFEB表达后,TFEB调控的一系列下游基因的表达情况。二.PDCD4调控TFEB细胞核定位的分子机制1.TFEB活性和亚细胞定位检测:活性的TFEB能够进入细胞核发挥其转录调控作用。在PDCD4敲除或过表达的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,分离细胞浆和细胞核蛋白,使用免疫蛋白印迹检测TFEB在细胞浆和细胞核中表达情况;使用免疫荧光技术,特异性染色TFEB,检测其亚细胞定位情况。2.TFEB细胞核定位是否依赖于mTORC1活性:在PDCD4敲除或过表达的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,分别使用EBSS饥饿或mTORC1特异性抑制剂来抑制mTORC1活性,通过免疫蛋白印迹和免疫荧光,检测TFEB在细胞浆和细胞核中的表达情况;同时检测PDCD4表达变化过程中,mTORC1活性情况;以干扰TFEB组为对照。3.TFEB细胞核定位是否依赖于ERK2活性:在PDCD4敲除的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,使用免疫蛋白印迹检测ERK2活性情况。三.PDCD4调控TFEB表达的分子机制1.检测PDCD4对TFEB mRNA水平的影响:在多种细胞系中,敲除、干扰或梯度过表达PDCD4,使用实时定量PCR技术,检测PDCD4表达变化对TFEB mRNA表达水平的影响。2.检测PDCD4对TFEB蛋白水平的调控:在多种细胞系中,敲除、干扰或梯度过表达PDCD4,使用免疫蛋白印迹,检测PDCD4表达变化对TFEB蛋白水平的影响。3.检测PDCD4对TFEB降解和稳定性的调控:使用PDCD4基因敲除体系,通过免疫蛋白印迹,检测MG132阻断蛋白质降解途径和CHX阻断蛋白质合成途径后PDCD4敲除对TFEB的影响;使用PDCD4基因敲除体系,通过免疫蛋白印迹,检测PDCD4敲除对TFEB泛素化修饰的影响。4.检测PDCD4调控TFEB翻译是否依赖于eIF4A:在PDCD4敲除或过表达的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,分别干扰或过表达eIF4A,免疫蛋白印迹检测PDCD4调控TFEB是否依赖于eIF4A。5.明确PDCD4调控TFEB翻译的分子机制和结构域:使用RNA-蛋白免疫共沉淀技术检测PDCD4是否结合TFEB mRNA;使用报告酶基因技术检测PDCD4调控TFEB的三个5’UTR情况。根据PDCD4抑制蛋白质翻译的两种方式,构建PDCD4功能域截短体质粒,使用PDCD4敲除的小鼠胚胎成纤维细胞探究PDCD4调控TFEB翻译的分子机制和结构域。四.PDCD4通过TFEB调控巨噬细胞极化和抗肿瘤作用1.检测PDCD4对巨噬细胞极化的影响:体外实验使用野生型和PDCD4基因敲除小鼠巨噬细胞,分别使用LPS和IL-4诱导巨噬细胞极化,通过实时定量PCR技术、免疫蛋白印迹和流式细胞术,检测巨噬细胞M1和M2极化的相关分子marker表达情况,探究PDCD4对巨噬细胞极化的影响。2.检测PDCD4对肿瘤相关巨噬细胞的极化调控:使用肿瘤培养上清和肿瘤-巨噬细胞共培养两种体系,通过实时定量PCR技术、免疫蛋白印迹和流式细胞术,检测肿瘤微环境中PDCD4对巨噬细胞极化的影响。3.检测PDCD4调控巨噬细胞的抗肿瘤作用:使用体外肿瘤-巨噬细胞共培养体系,检测肿瘤细胞的增殖能力。使用两种体内小鼠皮下成瘤模型,检测PDCD4敲除巨噬细胞对肿瘤生长和质量的影响。结果一.PDCD4通过TFEB负向调控溶酶体功能1.PDCD4负向调控溶酶体数目:使用免疫荧光技术染色溶酶体标志性蛋白LAMP1,分别检测PDCD4敲除或过表达后小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞溶酶体形态、大小和数目。结果显示,PDCD4对溶酶体的形态和大小没有影响,但明显改变溶酶体的数目。2.PDCD4负向调控溶酶体活性:使用流式细胞术染色溶酶体特异性活性探针Lysotracker,检测PDCD4敲除或过表达对小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中溶酶体活性的影响。结果显示,PDCD4敲除显着提高溶酶体活性,过表达PDCD4抑制溶酶体活性。3.PDCD4抑制溶酶体相关蛋白表达:使用免疫蛋白印迹技术,检测PDCD4敲除或过表达对小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中检测溶酶体相关膜蛋白和溶酶体酶的表达情况。结果显示,PDCD4敲除显着提高溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）和溶酶体重要的组织蛋白酶B和D的（CTSB/CTSD）表达;过表达PDCD4则抑制溶酶体相关蛋白表达。4.PDCD4通过TFEB负向调控溶酶体:①分别在PDCD4敲除或过表达的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,干扰TFEB表达,使用免疫荧光、流式细胞术和免疫蛋白印迹检测溶酶体数目、活性和相关蛋白表达情况。结果显示,干扰TFEB能够逆转由PDCD4敲除带来的溶酶体数目增加、活性提高和相关蛋白表达增加,说明PDCD4是通过TFEB调控溶酶体。②使用实时定量PCR技术检测TFEB调控的一系列下游基因的表达情况。结果显示,PDCD4负向调控TFEB下游基因的表达。在PDCD4敲除体系中,干扰TFEB可以逆转由PDCD4敲除带来的表达增加。二.PDCD4抑制TFEB入核不依赖于mTOR和ERK活性1.PDCD4抑制TFEB细胞核定位:①在PDCD4敲除的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,分离细胞浆和细胞核蛋白,使用免疫蛋白印迹检测TFEB在细胞浆和细胞核中表达情况。结果显示,PDCD4抑制细胞核中TFEB表达,敲除PDCD4显着提高细胞核中TFEB的表达。②使用免疫荧光,特异性染色TFEB检测其亚细胞定位情况。结果显示,PDCD4敲除促进TFEB细胞核定位,过表达PDCD4则抑制其细胞核定位。2.PDCD4抑制TFEB细胞核定位不依赖mTORC1活性:在PDCD4敲除或过表达的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,分别使用EBSS饥饿或mTORC1特异性抑制剂来抑制mTORC1活性,检测TFEB在细胞浆和细胞核中的表达情况;同时检测PDCD4表达变化过程中,mTORC1活性情况;以干扰TFEB组为对照。免疫蛋白印迹结果显示,抑制mTORC1活性不改变PDCD4对TFEB入核的负向调控作用;敲除或过表达PDCD4也不影响mTORC1活性,说明PDCD4调控TFEB细胞核定位不依赖于mTORC1活性。3.PDCD4抑制TFEB细胞核定位不依赖ERK2活性:在敲除PDCD4的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,使用免疫蛋白印迹检测ERK2活性情况。结果显示,PDCD4表达变化不影响ERK2活性,说明PDCD4调控TFEB细胞核定位也不依赖于ERK2活性。三.PDCD4通过其MA-3结构域以eIF4A依赖的方式抑制TFEB翻译进而在总体水平上调控TFEB1.PDCD4不影响TFEB的mRNA表达:在多种细胞系中,敲除、干扰或梯度过表达PDCD4,使用实时定量PCR技术,检测PDCD4表达变化对TFEB mRNA表达的影响。结果显示,改变PDCD4的表达对TFEB mRNA表达没有明显影响。2.PDCD4抑制TFEB蛋白表达:在多种细胞系中,敲除、干扰或梯度过表达PDCD4,使用免疫蛋白印迹,检测PDCD4表达变化对TFEB蛋白水平的影响。结果显示,敲除或干扰PDCD4可以明显增加TFEB的蛋白表达水平,过表达PDCD4则明显抑制TFEB表达且存在梯度依赖性。3.PDCD4不影响TFEB的降解和稳定性:①使用免疫蛋白印迹,通过MG132阻断蛋白质降解途径和CHX阻断蛋白质合成途径,检测PDCD4对TFEB的影响。结果显示,PDCD4不影响TFEB的降解途径和蛋白质稳定性。②使用免疫蛋白印迹检测PDCD4敲除对TFEB泛素化修饰的影响。结果显示,PDCD4不影响TFEB的泛素化修饰情况。4.PDCD4抑制TFEB翻译依赖于eIF4A:在PDCD4敲除或过表达的小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞中,分别干扰或过表达eIF4A,免疫蛋白印迹检测PDCD4调控TFEB是否依赖于eIF4A。结果显示,在敲除PDCD4体系中干扰eIF4A能够抑制TFEB表达,在PDCD4过表达体系中同时过表达eIF4A则能够提高TFEB表达,说明PDCD4抑制TFEB翻译是eIF4A依赖的方式。5.PDCD4通过其MA-3结构域抑制TFEB翻译:①使用RNA-蛋白免疫共沉淀技术发现PDCD4可以结合TFEB mRNA。②使用报告酶基因技术发现PDCD4调控TFEB的三个5’UTR且主要作用于第二种类型的5’UTR。③根据PDCD4抑制蛋白质翻译的两种方式,构建PDCD4功能域截短体质粒,使用PDCD4敲除的小鼠胚胎成纤维细胞过表达全长和各截短体质粒。结果显示,PDCD4通过其MA-3结构域抑制TFEB翻译,并且通过检测细胞浆和细胞核中TFEB的表达情况发现PDCD4是通过抑制TFEB总体表达水平来抑制其入核。四.PDCD4通过TFEB调控巨噬细胞极化和抗肿瘤作用1.PDCD4敲除促进巨噬细胞向M1型极化:体外实验使用LPS和IL-4诱导巨噬细胞极化,通过实时定量PCR技术、免疫蛋白印迹和流式细胞术,检测巨噬细胞M1和M2极化的相关分子marker。结果显示,PDCD4敲除能够明显促进巨噬细胞向M1型极化,抑制巨噬细胞向M2型极化。2.PDCD4敲除抑制肿瘤相关巨噬细胞向M2型极化:使用肿瘤培养上清和肿瘤-巨噬细胞共培养两种体系,通过实时定量PCR技术、免疫蛋白印迹和流式细胞术,检测肿瘤微环境中PDCD4对巨噬细胞极化的影响。结果显示,PDCD4敲除能够抑制肿瘤相关巨噬细胞向M2型极化。3.PDCD4敲除提高巨噬细胞的抗肿瘤作用:①使用体外肿瘤-巨噬细胞共培养体系,检测肿瘤细胞的增殖能力。结果显示,敲除PDCD4基因的巨噬细胞能够抑制肿瘤细胞增殖,干扰TFEB则逆转其对肿瘤细胞的抑制能力。②使用两种体内小鼠皮下成瘤模型,检测PDCD4敲除巨噬细胞对肿瘤生长和质量的影响。结果显示,PDCD4敲除巨噬细胞能够明显抑制肿瘤的生长和肿瘤质量;PDCD4敲除的巨噬细胞中干扰TFEB表达,则逆转其对肿瘤生长和质量的抑制能力,降低其抗肿瘤能力。说明PDCD4敲除能够通过上调TFEB的表达,提高巨噬细胞抗肿瘤能力。结论1.PDCD4能够参与并且负向调控溶酶体发生和溶酶体功能。2.PDCD4抑制TFEB的细胞核定位不依赖于mTORC1和ERK2活性。3.PDCD4通过抑制TFEB的蛋白质翻译在总体水平上抑制其表达和细胞核定位,实现对溶酶体发生和溶酶体功能的负向调控。4.PDCD4通过其MA-3结构域以eIF4A依赖的方式抑制TFEB翻译,PDCD4能够调控TFEB的三个5’UTR但主要作用于第二种5’UTR。5.PDCD4敲除能够抑制巨噬细胞向M2型极化,并且通过提高TFEB的表达来提高巨噬细胞的抗肿瘤能力。创新性和意义1.PDCD4是重要的抑癌基因和蛋白质翻译抑制因子,我们的实验发现了PDCD4新的靶基因TFEB,证实PDCD4能够通过其MA-3结构域以eIF4A依赖的方式抑制TFEB翻译。首次发现PDCD4可以通过抑制TFEB翻译来负向调控溶酶体功能,为明确PDCD4在溶酶体发生和溶酶体功能方面的作用提供了新的理论依据。2.结合前期已经发表的关于PDCD4抑制细胞自噬的相关机制,我们的实验完整的阐述了 PDCD4在溶酶体和自噬方面的调控机制,为调控细胞的能量感知、维持细胞的代谢稳态和了解细胞的自噬溶酶体通路提供了重要的理论基础。3.TFEB是调控溶酶体的关键转录因子,目前关于TFEB的调控主要集中在其磷酸化修饰方面,我们的研究首次阐明了 TFEB在蛋白翻译水平上的调控机制,为充分了解TFEB的整个调控网络提供了重要的理论依据。为靶向溶酶体治疗溶酶体储存障碍、神经退行性疾病和肿瘤等溶酶体相关疾病提供了很好的理论支撑。4.PDCD4分子是抑癌基因,在肿瘤细胞中过表达PDCD4能够抑制肿瘤细胞的溶酶体功能进而抑制其增殖和迁移能力。然而,在肿瘤相关的免疫细胞中,需要敲除或降低PDCD4表达来提高免疫细胞溶酶体功能,增强免疫细胞的生物学功能。说明PDCD4在肿瘤细胞和肿瘤相关免疫细胞中表现出相反的作用,我们的研究为靶向PDCD4治疗肿瘤提供了非常重要理论指导。局限性1.TFEB属于MIT-TFE家族成员,我们的研究关注了 PDCD4对TFEB的调控机制和生理作用。然而,PDCD4能否参与调节MIT-TFE家族的其他成员尚不清楚,需要进一步实验研究。2.TFEB能够参与并调控非常多的溶酶体相关疾病,我们的研究主要关注TFEB在肿瘤相关巨噬细胞中的作用和意义。然而,靶向PDCD4调控TFEB在其他溶酶体相关疾病,如神经退行性疾病和代谢性疾病中的作用有待进一步实验探究。
汪凯[7]（2020）在《口服次血红素六肽改善2型糖尿病肝脏胰岛素抵抗的机制研究》文中研究说明2型糖尿病是一种由多因素引起的代谢性疾病,以高血糖、胰岛素抵抗为主要特征。2型糖尿病的发病率持续增加,已成为全球最大的公共健康问题之一。研究表明,过量活性氧（reactive oxygen species,ROS）会引起氧化应激,导致细胞功能障碍,包括能量代谢紊乱、细胞信号受损、细胞转运机制障碍、免疫激活和炎症。慢性氧化应激是导致胰岛素抵抗、代谢失调、糖尿病等疾病发展的潜在因素。因此,抗氧化应激药物的研发是治疗2型糖尿病的新思路。次血红素三肽（Deuterohemin-βAla-His-Lys,Dh HP-3）是本实验室基于天然过氧化物酶（microperoxidase-11,MP-11）设计合成的新型过氧化物酶模拟物。前期研究发现,Dh HP-3能够降低2型糖尿病大鼠血糖,激活PI3K/AKT信号通路抑制高糖诱导的胰岛β细胞凋亡。Dh HP-3因其较短的半衰期及较快的血浆清除率而采用注射给药。注射导致依从性差,且有感染的风险,因此,口服途径仍是最理想的给药方式。基于此,我们设计合成了次血红素六肽（Deuterohemin-βAla-His-Thr-Val-Glu-Lys,Dh HP-6）。前期研究发现,Dh HP-6的相对酶活要高于Dh HP-3。Dh HP-6在人工胃肠液及血浆中具有较高稳定性,且降解产物的相对酶活与Dh HP-6一致。为了探讨口服Dh HP-6对于2型糖尿病的影响,本论文主要从三个方面进行了研究:1.本文通过高脂饮食联合腹腔注射链脲霉素构建了2型糖尿病小鼠模型,从动物水平探究了口服Dh HP-6对于2型糖尿病的影响。结果表明,口服Dh HP-6能够有效降低2型糖尿病小鼠的血糖,改善胰岛素抵抗。血清学研究发现,Dh HP-6能够增强SOD、GSH及CAT的活性,降低MDA的含量,从而降低氧化应激水平;此外,Dh HP-6还能降低T-CHO、TG及LDL-C含量,增加HDL-C的含量,改善2型糖尿病小鼠的血脂紊乱;通过对肝功指标（AST、ALT和ALP）的检测及肝脏形态结构的观察发现,Dh HP-6能够有效维持2型糖尿病小鼠肝脏的功能及结构完整性。同时,通过对胰岛和肾脏形态结构的观察发现,Dh HP-6能够有效改善2型糖尿病小鼠胰岛萎缩及空泡变性,维持肾小球结构完整性。值得一提的是,Dh HP-6能够显着降低2型糖尿病小鼠FBPase和G6Pase含量,升高HK含量;肝脏PAS染色发现,Dh HP-6能够有效促进2型糖尿病小鼠肝脏糖原的合成。通过western blot分析发现,Dh HP-6能够促进IRS-1（Tyr632）、AKT（Ser473）及GSK-3β（Ser9）的磷酸化,抑制IRS-1（Ser307）的磷酸化,激活2型糖尿病小鼠肝脏PI3K/AKT信号通路;同时,Dh HP-6能够促进AMPK的Thr172磷酸化,抑制G6Pase及PEPCK的表达,激活2型糖尿病小鼠AMPK信号通路;此外,Dh HP-6促进了Nrf2的表达,抑制了Keap1的表达,改善2型糖尿病小鼠的抗氧化系统。因此,Dh HP-6能够激活2型糖尿病小鼠PI3K/AKT、AMPK及Nrf2-Keap1信号通路,改善其肝脏胰岛素抵抗症状。2.通过葡萄糖胺诱导建立了Hep G2细胞胰岛素抵抗模型,进一步从细胞水平探究了Dh HP-6改善肝脏胰岛素抵抗的作用机制。研究结果表明,Dh HP-6能够有效抑制葡萄糖胺诱导引起的细胞损伤,促进Hep G2细胞的葡萄糖吸收及糖原合成,抑制ROS的生成,改善线粒体功能损伤。Western blot结果表明,Dh HP-6能够激活Hep G2细胞胰岛素抵抗模型的PI3K/AKT、AMPK及Nrf2-Keap1信号通路。当加入PI3K的特异性抑制剂LY294002后,PI3K/AKT信号通路并不能完全被抑制,同时发现,LY294002也能部分抑制AMPK及Nrf2-Keap1信号通路;当加入AMPK的抑制剂复合物C后,AMPK信号通路不能被完全抑制,而PI3K/AKT及Nrf2-Keap1信号通路也被部分抑制。由此可知,PI3K/AKT、AMPK及Nrf2-Keap1信号通路并非独立作用,而是相互影响相互促进的。因此,Dh HP-6能够激活PI3K/AKT、AMPK及Nrf2-Keap1信号通路改善葡萄糖胺诱导的Hep G2细胞胰岛素抵抗。3.为了进一步探讨Dh HP-6的口服递送策略,我们合成了靶向叶酸受体的叶酸-羧甲基壳聚糖,制备了由Dh HP-6、细胞穿膜肽、叶酸-羧甲基壳聚糖组成的微球,并初步验证了其作为Dh HP-6口服递送系统的可行性。结果表明,相同浓度下,细胞穿膜肽RR-9相较于FI-6和LK-18能够显着降低Caco-2细胞模型的跨膜电阻,降低细胞膜连续性,因此,选用RR-9进行后续实验。叶酸-羧甲基壳聚糖对Caco-2细胞几乎没有毒性,且黏附能力比羧甲基壳聚糖更强。Dh HP-6-细胞穿膜肽-叶酸-羧甲基壳聚糖微球在人工胃液中释放缓慢,在人工肠液中释放显着变快。在Caco-2细胞口服吸收模型中,Dh HP-6-细胞穿膜肽-叶酸-羧甲基壳聚糖微球能够显着促进Dh HP-6的跨膜转运。因此,Dh HP-6-细胞穿膜肽-叶酸-羧甲基壳聚糖微球能够增强壳聚糖对于Caco-2细胞的黏附能力,促进Dh HP-6的跨膜转运。综上,Dh HP-6通过激活PI3K/AKT、AMPK及Nrf2-Keap1信号通路改善2型糖尿病肝脏胰岛素抵抗;此外,Dh HP-6-细胞穿膜肽-叶酸-羧甲基壳聚糖微球作为Dh HP-6口服递送系统具有可行性。
罗明昊,胡舒鹏,王瑞钰,李畅,吕鼎一,杨茜洋,罗素新[8]（2020）在《IL-1β通过抑制AKT下调人脐静脉内皮细胞eNOS Ser1177磷酸化水平》文中研究表明目的:探讨白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）能否调控人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）中内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）第1 177位丝氨酸（Ser1177）磷酸化水平及其可能的机制。方法:将HUVECs随机分为正常对照组、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）处理组、IL-1β处理组、IL-6处理组、单纯SC79[蛋白激酶B（protein kinase B,PKB/AKT）特异性激动剂]处理组和SC79+IL-1β处理组。用Western blot方法检测HUVECs中eNOS、p-eNOS-Ser1177、AKT和pAKT-Ser473的蛋白水平。采用化学比色法检测HUVECs培养液中一氧化氮（nitric oxide,NO）的含量。结果:与正常对照组相比,TNF-α和IL-6处理对HUVECs中p-eNOS-Ser1177的蛋白水平均无显着影响（P>0.05）,而IL-1β处理则显着降低细胞中p-eNOS-Ser1177蛋白水平和培养液中NO含量（P<0.05）,同时伴有p-AKT-Ser473的下调（P<0.05）。IL-1β对细胞中p-eNOS-Ser1177蛋白水平和培养液中NO含量的调节能被SC79所阻断（P<0.05）。结论:IL-1β可下调HUVECs中p-eNOS-Ser1177蛋白水平进而影响eNOS活性,这种效应可能涉及到AKT/eNOS通路。
王俊强[9]（2020）在《大肠杆菌JM109氨基酸吸收利用以及产GABA代谢调控研究》文中提出大肠杆菌（Escherichia coli）因易培养繁殖和遗传背景清楚被选为实验室模式菌株用于分子生物学、生物工程和代谢组学等学科的研究。代谢物组学是对菌体胞内外的小分子代谢物进行定性和定量研究的基础,本研究对大肠杆菌JM109在不同营养层次的生长进行了研究,重点研究了在不同情况下氨基酸吸收利用情况。其目的是分析氨基酸的利用和转化,了解大肠杆菌的氨基酸代谢特点,为在此基础上改进培养基以促进菌体的生长发酵性能和设计转化路径研究做准备。在研究中,还对合成GABA的产酶和酶活性调控为模型进行代谢控制现象水平研究。建立一套完整的氨基酸代谢检测方法。优化一套适用的FMOC-Cl衍生氨基酸参数:样品40μL、0.2 mol/L氨基酸衍生缓冲液40μL、FMOC-Cl溶液20μL、乙腈80μL、去离子水90μL,室温放置10 min;建立一套合适淬灭菌株和通透细胞膜的方法,为后续胞内物质检测分析奠定了基础;建立HPLC-MS检测代谢物的方法和氨基酸标准曲线,准确对氨基酸进行定性和定量分析。在LB中共鉴定出14种氨基酸:Arg 0.249 g/L、Glu 0.031 g/L、Gly 0.218g/L、Ala 0.035 g/L、Pro 0.040 g/L、Met 0.007 g/L、Ser 0.042 g/L、Val 0.043 g/L、Trp 0.014 g/L、Leu/Ile 0.144 g/L、Phe 0.094 g/L、Lys 0.080 g/L、Thr 0.024 g/L;大肠杆菌JM109（p UC19）在LB培养基标准条件下生长后氨基酸消耗:Arg 100%、Gly 47%、Ala 100%、Met 100%、Leu/Ile 31%、Lys 52%,Pro 100%、Thr 100%、Ser 100%、Trp 100%、Glu 100%;氨基酸产生:Val 12%、Phe 12%;细胞内五种氨基酸积累:Glu、Ala、Val和Leu/Ile,细胞内外对比发现,大肠杆菌对Glu和Ala有很强大的向胞内主动运输能力。大肠杆菌主要以单一氨基酸作为氮源培养时,结果表明:Glu和Asp被菌株较好利用,且菌株长势很好;Cys、Tyr、Val培养时产生较高浓度新物质,菌株生长状态差;Trp和Pro进行培养时,菌株生长后变酸,菌株生长情况一般,剩余量很高;His、Thr和Gly发酵后剩余量较多,但是菌体量却很高,尤其是His,剩余40%以上,其生长量比一般氨基酸高50%以上,显示可能存在特殊生理机理。根据细胞剩余情况,在今后大肠杆菌代谢路径设计中,在简单培养基上,Glu、Phe、Pro、His、Thr和Gly可能比较适合于作为生物转化出发物;在富营养条件下,Glu、Ala、Val、Leu、Ileu以及Gly、Phe和Lys可能比较适合于作为生物转化出发物。在LB培养基中不同p H条件下:胞外氨基酸Ser、Thr、Pro和Trp全部耗尽;Glu在不同p H下完全耗尽,胞内保留较高浓度;Leu/Ile在p H 5.52时,胞内积累量最高,胞外量最低;Arg在p H 4.58时,吸收受阻;Val和Phe属于产出氨基酸,随着p H升高胞外量越高。在LB培养基中不同温度条件下:胞外氨基酸Ser、Thr、Pro和Trp全部耗尽;Glu在不同温度下完全耗尽,胞内保留较高浓度;Val和Phe属于产出氨基酸,随着温度改变胞外产生量越高;Gly在35℃情况下,吸收受阻。用同尾酶Sau 3A1和Bam HI构建随机文库,筛选显着改变代谢途径的菌株,最后发现产生一种新物质的17号菌株,通过基因测序证明含有天冬氨酸脱羧酶,质谱鉴定产物应为β-羟基丙酸（3-AP）。但有意思的是17号菌株产生3-AP仅存在于LB培养基条件下,在转化Asp培养基中反而并没有产生。有可能存在某种调控机制,有待进一步分析研究。大肠杆菌转化Glu产生GABA为模型的研究中发现,（1）GABA转化产量显着受p H影响,p H 2.6比p H 7.2产量高40倍;（2）在LB培养基产生大量的谷氨酸脱羧酶,而在GI培养基中产生量减少93%以上;（3）谷氨酸脱羧酶活性在含葡萄糖的转化液中活力比在LB中高15倍（p H 2.6）;（4）在LB培养基加入5 g/L葡萄糖培养菌体时产生的谷氨酸脱羧酶量下降76%;（5）大肠杆菌在酸性和中性LB发酵培养基培养9 h,都产生了大量而且等量的谷氨酸脱羧酶。基于这些现象,可以洞察到大肠杆菌转化Glu产生GABA的复杂调控机制,酶产生和酶活力的调控都非常显着,现有理论无法完全解释。这些研究结果为我们深入研究大肠杆菌的代谢调控机理提供了一个有价值的窗口。
教育部[10]（2020）在《教育部关于印发普通高中课程方案和语文等学科课程标准（2017年版2020年修订）的通知》文中研究表明教材[2020]3号各省、自治区、直辖市教育厅（教委）,新疆生产建设兵团教育局:为深入贯彻党的十九届四中全会精神和全国教育大会精神,落实立德树人根本任务,完善中小学课程体系,我部组织对普通高中课程方案和语文等学科课程标准（2017年版）进行了修订。普通高中课程方案以及思想政治、语文、
二、Science in China Ser.C,Life Sciences（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Science in China Ser.C,Life Sciences（论文提纲范文）
（1）TFEB与线粒体稳态在脓毒症并发症中的调控机制（论文提纲范文）
| 1 TFEB活化机制 |
| 2 TFEB与线粒体调控关系 |
| 2.1 TFEB与线粒体自噬 |
| 2.2 TFEB与线粒体生物发生 |
| 3 脓毒症与心血管损伤 |
| 3.1 线粒体自噬在脓毒症心血管损伤中的作用 |
| 3.2 TFEB在脓毒症心血管并发症中的作用 |
| 4 TFEB在其他病理生理中的调控作用 |
| 4.1 清除作用 |
| 4.2 介导炎症 |
| 4.3 控制代谢 |
| 5 总结与展望 |
（2）BM2通道蛋白质子传递的影响因素及其与质子通道阻断剂相互作用的理论研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 生物信息学 |
| 1.2 蛋白质结构与功能 |
| 1.3 流感病毒M2 通道蛋白 |
| 1.4 研究目的和研究内容 |
| 第2章 理论基础与计算方法 |
| 2.1 分子力学 |
| 2.1.1 分子力场概述 |
| 2.1.2 常用分子力场 |
| 2.1.3 能量最小化 |
| 2.2 分子动力学 |
| 2.2.1 分子动力学基本理论 |
| 2.2.2 分子动力学的积分算法 |
| 2.2.3 分子动力学积分步长选取 |
| 2.2.4 周期性边界条件与长程静电力 |
| 2.2.5 分子动力学计算流程 |
| 2.3 自适应拉伸分子动力学模拟 |
| 2.4 加速分子动力学模拟 |
| 第3章 极性氨基酸对BM2 通道蛋白质子传递的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 计算方法 |
| 3.2.1 模型构建 |
| 3.2.2 经典分子动力学模拟 |
| 3.2.3 自适应拉伸分子动力学模拟和平均力势计算 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 极性氨基酸影响BM2 通道构象变化 |
| 3.3.2 极性氨基酸影响BM2 通道水合作用 |
| 3.3.3 极性氨基酸影响BM2 通道质子传递 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 细胞膜环境对BM2 通道蛋白结构和水合作用的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 计算方法 |
| 4.2.1 模型构建 |
| 4.2.2 分子动力学模拟 |
| 4.2.3 细胞膜性质分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 负电脂质对BM2 通道构象和水合作用的影响 |
| 4.3.2 胆固醇对BM2 通道构象和水合作用的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 质子通道阻断剂金刚烷胺与BM2 通道相互作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 计算方法 |
| 5.2.1 模型构建 |
| 5.2.2 经典分子动力学模拟 |
| 5.2.3 自适应拉伸分子动力学模拟和平均力势计算 |
| 5.2.4 加速分子动力学模拟 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 金刚烷胺与BM2 通道蛋白的结合翻转机制 |
| 5.3.2 金刚烷胺无效抑制BM2 通道蛋白的原因 |
| 5.4 本章小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）基于血管紧张素转化酶2探究人参皂苷Rc改善内皮细胞胰岛素抵抗与血管内皮功能障碍的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写表 |
| 第1章 绪论 |
| 综述1 胰岛素抵抗与内皮功能障碍 |
| 1.1 胰岛素信号通路 |
| 1.2 炎症与IR |
| 1.2.1 炎症信号 |
| 1.2.2 炎症介导IR的机制 |
| 1.3 内皮功能障碍 |
| 1.3.1 内皮分泌的主要血管活性物质 |
| 1.3.2 内皮功能障碍的发生机制 |
| 1.3.3 血管内皮的胰岛素信号通路 |
| 1.3.4 IR与内皮功能障碍的相互关系 |
| 1.4 结语 |
| 综述2 经典RAS在糖尿病及其并发症中的作用与ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴的生物学功能 |
| 1.1 经典RAS在糖尿病及其并发症中的作用 |
| 1.1.1 经典RAS的构成 |
| 1.1.2 经典RAS与糖尿病及其并发症 |
| 1.2 ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴的构成 |
| 1.2.1 ACE2 的生物学特性及其激动剂和抑制剂 |
| 1.2.2 Ang-(1-7)的生物学特性 |
| 1.2.3 Mas的生物学特性及其激动剂和拮抗剂 |
| 1.3 ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴在几种常见疾病中的作用 |
| 1.3.1 ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴与高血压 |
| 1.3.2 ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴与动脉粥样硬化 |
| 1.3.3 ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴与心衰 |
| 1.3.4 ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴与中风 |
| 1.3.5 ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴与糖尿病 |
| 1.4 结语 |
| 第2章 ACE2 在高糖诱导HUVECS胰岛素抵抗中的变化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HG对HUVECs存活率的影响 |
| 2.3.2 HG对HUVECs形态的影响 |
| 2.3.3 HG对HUVECs NO分泌含量及ET-1 mRNA水平的影响 |
| 2.3.4 HG对HUVECs胰岛素信号通路IRS1 蛋白表达的影响 |
| 2.3.5 HG对HUVECs胰岛素信号通路PI3K/Akt/eNOS蛋白表达的影响 |
| 2.3.6 HG对HUVECs ACE2及Mas蛋白表达的影响 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 人参皂苷RC改善高糖诱导HUVECS胰岛素抵抗的作用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂与仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 人参皂苷Rc对HUVECs细胞存活率的影响 |
| 3.3.2 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs NO分泌含量及ET-1mRNA水平的影响 |
| 3.3.3 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs ROS产生的影响 |
| 3.3.4 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs培养液上清MDA含量及SOD活性的影响 |
| 3.3.5 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs促炎因子mRNA水平的影响 |
| 3.3.6 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs培养液上清Ang Ⅱ及Ang-(1-7)含量的影响 |
| 3.3.7 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs ACE2及Mas蛋白表达的影响 |
| 3.3.8 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs ACE2及Mas mRNA水平的影响 |
| 3.3.9 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs胰岛素信号通路IRS1蛋白表达的影响 |
| 3.3.10 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs胰岛素信号通路PI3K/Akt/eNOS蛋白表达的影响 |
| 3.3.11 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs NADPH氧化酶蛋白表达的影响 |
| 3.3.12 人参皂苷Rc对HG处理HUVECs IR相关炎症信号通路的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 基于ACE2 探究人参皂苷RC改善高糖诱导HUVECS胰岛素抵抗的作用机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要试剂与仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs NO分泌含量及ET-1 mRNA水平的影响 |
| 4.3.2 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs ROS产生的影响 |
| 4.3.3 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs培养液上清MDA含量及SOD活性的影响 |
| 4.3.4 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs促炎因子mRNA水平的影响 |
| 4.3.5 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs培养液上清Ang Ⅱ及 Ang-(1-7)含量的影响 |
| 4.3.6 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs ACE2及Mas蛋白表达的影响 |
| 4.3.7 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs ACE2及Mas mRNA水平的影响 |
| 4.3.8 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs胰岛素信号通路IRS1 蛋白表达的影响 |
| 4.3.9 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs胰岛素信号通路PI3K/Akt/eNOS蛋白表达的影响 |
| 4.3.10 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs NOX2蛋白表达的影响 |
| 4.3.11 人参皂苷Rc和MLN-4760对HG处理HUVECs IR相关炎症信号通路的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 基于ACE2 探究人参皂苷RC改善DB/DB小鼠内皮功能障碍的作用及机制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 主要试剂与仪器 |
| 5.2.3 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 人参皂苷Rc和MLN-4760对db/db小鼠体重和空腹血糖的影响 |
| 5.3.2 人参皂苷Rc和MLN-4760对db/db小鼠血清脂质及胰岛素含量的影响 |
| 5.3.3 人参皂苷Rc和MLN-4760对db/db小鼠血清促炎因子含量的影响 |
| 5.3.4 人参皂苷Rc和MLN-4760对db/db小鼠血清和主动脉Ang Ⅱ及 Ang-(1-7)含量的影响 |
| 5.3.5 人参皂苷Rc和MLN-4760对db/db小鼠主动脉ACE2及Mas蛋白表达的影响 |
| 5.3.6 人参皂苷Rc和MLN-4760对db/db小鼠胸主动脉内皮和非内皮依赖性舒张的影响 |
| 5.3.7 人参皂苷Rc和MLN-4760对db/db小鼠Akt/eNOS信号通路的影响 |
| 5.3.8 人参皂苷Rc和MLN-4760对db/db小鼠主动脉NADPH氧化酶蛋白表达的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 讨论 |
| 第7章 结论及展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 本论文创新性 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）藜麦蛋白抗氧化肽的制备及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 藜麦研究概况 |
| 1.1.1 藜麦概述 |
| 1.1.2 藜麦的营养价值 |
| 1.1.3 藜麦的开发利用 |
| 1.1.4 藜麦的研究现状 |
| 1.2 抗氧化肽的研究概况 |
| 1.2.1 抗氧化肽的来源 |
| 1.2.2 抗氧化肽活性评价的方法 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 1.4 研究内容 |
| 第二章 藜麦蛋白质的提取及其理化性质分析 |
| 前言 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 材料与试剂 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 样品预处理 |
| 2.2.2 藜麦基本成分测定 |
| 2.2.3 藜麦蛋白质提取方法 |
| 2.2.4 藜麦蛋白提取率和纯度的测定 |
| 2.2.5 藜麦蛋白的颗粒形态 |
| 2.2.6 藜麦蛋白的SDS-PAGE电泳分析 |
| 2.2.7 藜麦蛋白氨基酸组成分析 |
| 2.2.8 藜麦蛋白提取工艺的单因素试验 |
| 2.2.9 藜麦蛋白提取工艺的响应面优化试验 |
| 2.2.10 藜麦蛋白质功能特性的测定 |
| 2.2.11 数据统计与分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 藜麦粉基本成分分析结果 |
| 2.3.2 不同方法提取藜麦蛋白的提取率 |
| 2.3.3 藜麦蛋白的颗粒形态 |
| 2.3.4 不同方法提取的藜麦蛋白的SDS-PAGE电泳图谱 |
| 2.3.5 藜麦蛋白氨基酸组成分析 |
| 2.3.6 藜麦蛋白质提取的单因素试验 |
| 2.3.7 响应面优化试验结果 |
| 2.3.8 藜麦蛋白质功能特性分析 |
| 2.4 分析讨论 |
| 第三章 藜麦蛋白抗氧化肽的制备及体外抗氧化活性分析 |
| 前言 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 材料与试剂 |
| 3.1.2 主要仪器与设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 藜麦蛋白抗氧化肽的制备 |
| 3.2.2 藜麦蛋白水解工艺优化单因素试验 |
| 3.2.3 藜麦蛋白水解工艺优化响应面试验 |
| 3.2.4 水解度的测定 |
| 3.2.5 抗氧化肽抗氧化能力的测定 |
| 3.2.6 藜麦蛋白水解液氨基酸组分分析 |
| 3.2.7 数据统计与分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 不同蛋白酶水解物的水解度和抗氧化能力的测定 |
| 3.3.2 胃蛋白酶水解藜麦蛋白的单因素试验结果 |
| 3.3.3 胃蛋白酶水解藜麦蛋白的响应面优化试验结果 |
| 3.3.4 藜麦蛋白水解液氨基酸组分分析 |
| 3.4 分析讨论 |
| 第四章 藜麦蛋白抗氧化肽的体内抗氧化活性及作用机制研究 |
| 前言 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 实验动物来源 |
| 4.1.2 材料与试剂 |
| 4.1.3 主要仪器与设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 实验动物分组及剂量设计 |
| 4.2.2 小鼠一般状态的观察 |
| 4.2.3 脏器指数的测定 |
| 4.2.4 小鼠血清和肝脏生化指标的测定 |
| 4.2.5 组织病理切片 |
| 4.2.6 透射电镜(TEM)分析 |
| 4.2.7 荧光定量PCR方法测定小鼠肝脏内相关抗氧化基因的表达 |
| 4.2.8 Western-Blot方法测定小鼠肝脏内相关酶的表达 |
| 4.2.9 数据统计与分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 藜麦蛋白抗氧化肽对衰老模型小鼠的一般状态影响 |
| 4.3.2 藜麦蛋白抗氧化肽对衰老模型小鼠脏器指数的影响 |
| 4.3.3 藜麦蛋白抗氧化肽对衰老模型小鼠血清中抗氧化酶活性的影响 |
| 4.3.4 藜麦蛋白抗氧化肽对衰老模型小鼠肝脏中抗氧化酶活性的影响 |
| 4.3.5 藜麦蛋白抗氧化肽对小鼠组织形态学的影响 |
| 4.3.6 小鼠肝细胞、线粒体超微结构的变化 |
| 4.3.7 Q-PCR方法测定小鼠肝脏内相关酶含量的表达 |
| 4.3.8 Western-Blot方法测定小鼠肝脏内相关蛋白表达的的表达 |
| 4.4 分析讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）围产期母猪饲粮补充丝氨酸对泌乳母猪和哺乳仔猪血清生化指标和抗氧化功能的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验设计 |
| 1.2 样品采集 |
| 1.3 测定指标及方法 |
| 1.3.1 血清生化指标的检测 |
| 1.3.2 初乳和血清中Ser、甘氨酸（Gly）以及半胱氨酸（Cys）含量的检测 |
| 1.3.3 血清氧化应激指标的检测 |
| 1.3.4 空肠中抗氧化酶mRNA相对表达量的检测 |
| 1.4 数据处理与统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 围产期母猪饲粮补充Ser对泌乳母猪和哺乳仔猪血清生化指标的影响 |
| 2.2 围产期母猪饲粮补充Ser对初乳和哺乳仔猪血清中Ser、Gly和Cys含量的影响 |
| 2.3 围产期母猪饲粮补充Ser对泌乳母猪和哺乳仔猪血清氧化应激指标的影响 |
| 2.4 围产期母猪饲粮补充Ser对哺乳仔猪空肠中抗氧化酶基因mRNA相对表达量的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 围产期母猪饲粮补充Ser对泌乳母猪和哺乳仔猪血清生化指标的影响 |
| 3.2 围产期母猪饲粮补充Ser对初乳和哺乳仔猪血清中Ser、Gly和Cys含量的影响 |
| 3.3 围产期母猪饲粮补充Ser对泌乳母猪和哺乳仔猪血清氧化应激指标的影响 |
| 3.4 围产期母猪饲粮补充Ser对哺乳仔猪空肠中抗氧化酶基因表达的影响 |
| 4 结论 |
（6）PDCD4通过eIF4A依赖的方式抑制TFEB翻译并负向调控溶酶体功能和巨噬细胞抗肿瘤能力（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 一、溶酶体是维持细胞稳态和介导信号传递的关键细胞器 |
| 二、调控溶酶体发生和功能的关键转录因子TFEB |
| 三、TFEB活性调节 |
| 四、PDCD4的结构和表达特点 |
| 五、PDCD4抑制蛋白质翻译和调控靶基因的机制 |
| 六、PDCD4在疾病中的作用 |
| 七、巨噬细胞及其在肿瘤中的作用 |
| 研究目的 |
| 材料和方法 |
| 一、动物和细胞系 |
| 二、实验仪器 |
| 三、主要实验方法 |
| 结果 |
| 一、PDCD4通过抑制TFEB调控溶酶体的发生和功能 |
| 二、PDCD4抑制TFEB细胞核定位 |
| 三、PDCD4调控TFEB细胞核定位不依赖于mTOR和ERK活性 |
| 四、PDCD4抑制TFEB的蛋白质翻译 |
| 五、PDCD4以eIF4A依赖的方式抑制TFEB翻译 |
| 六、PDCD4通过其MA-3结构域抑制TFEB翻译 |
| 七、PDCD4敲除促进巨噬细胞向M1型极化并抑制其M2极化 |
| 八、PDCD4基因敲除巨噬细胞通过增加TFEB表达进而提高巨噬细胞抗肿瘤能力 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间主要科研成果及获得荣誉 |
| 附件一 科研论文 |
| 附件二 论文相关综述 |
| Western Blot原始数据 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（7）口服次血红素六肽改善2型糖尿病肝脏胰岛素抵抗的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 糖尿病 |
| 1.1.1 糖尿病简介及流行性 |
| 1.1.2 糖尿病的诊断标准 |
| 1.2 2型糖尿病简介 |
| 1.2.1 2型糖尿病的发生机制 |
| 1.2.2 2型糖尿病并发症 |
| 1.2.3 2型糖尿病的临床药物 |
| 1.3 胰岛素抵抗 |
| 1.3.1 胰岛素信号转导 |
| 1.3.2 胰岛素抵抗的病理机制 |
| 1.3.3 氧化应激与胰岛素抵抗 |
| 1.4 次血红素六肽 |
| 1.4.1 次血红素六肽设计及其优点 |
| 1.4.2 次血红素六肽的稳定性 |
| 1.5 蛋白多肽类药物的口服给药 |
| 1.5.1 蛋白多肽类药物在2型糖尿病治疗中的应用 |
| 1.5.2 影响蛋白多肽类药物口服吸收生物利用度的屏障 |
| 1.5.3 提高蛋白多肽类药物口服生物利用度的策略 |
| 1.5.4 羧甲基壳聚糖 |
| 1.6 立题依据及实验设计 |
| 1.6.1 立题依据 |
| 1.6.2 实验思路 |
| 1.6.3 实验路线 |
| 第2章 口服DHHP-6抗2型糖尿病的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验动物 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 DhHP-6的合成与纯化 |
| 2.3.2 2型糖尿病小鼠模型的建立及给药 |
| 2.3.3 小鼠体重和血糖测定 |
| 2.3.4 口服葡萄糖耐受实验(OGTT) |
| 2.3.5 胰岛素抵抗实验(ITT) |
| 2.3.6 血清指标测定 |
| 2.3.7 抗氧化酶酶活/含量测定 |
| 2.3.8 肝功能指标测定 |
| 2.3.9 胰岛、肝脏及肾脏组织化学染色 |
| 2.3.10 统计学分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 DhHP-6的合成、纯化与鉴定 |
| 2.4.2 DhHP-6能够降低2型糖尿病小鼠血糖 |
| 2.4.3 DhHP-6能够增强2型糖尿病小鼠对胰岛素的敏感性 |
| 2.4.4 DhHP-6能够促进2型糖尿病小鼠胰岛素分泌 |
| 2.4.5 DhHP-6能够改善2型糖尿病小鼠的葡萄糖耐受 |
| 2.4.6 DhHP-6能够维持2型糖尿病小鼠氧化与抗氧化系统平衡 |
| 2.4.7 DhHP-6能够改善2型糖尿病小鼠的血脂紊乱 |
| 2.4.8 DhHP-6能够保护2型糖尿病小鼠的肝脏功能 |
| 2.4.9 DhHP-6能够维持2型糖尿病小鼠肝脏组织的结构完整 |
| 2.4.10 DhHP-6能够维持2型糖尿病小鼠肾小球的结构完整 |
| 2.4.11 DhHP-6能够保护2型糖尿病小鼠胰岛组织的结构完整 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 DHHP-6改善2型糖尿病肝脏胰岛素抵抗的作用机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 肝脏匀浆及相关因子检测 |
| 3.3.2 肝脏总蛋白提取及样品处理 |
| 3.3.3 细胞培养 |
| 3.3.4 DhHP-6对HepG2 细胞毒性实验 |
| 3.3.5 HepG2细胞胰岛素抵抗模型的构建 |
| 3.3.6 葡萄糖吸收检测 |
| 3.3.7 糖原合成检测 |
| 3.3.8 糖原PAS染色 |
| 3.3.9 ROS含量检测 |
| 3.3.10 线粒体膜电位检测 |
| 3.3.11 线粒体压力检测 |
| 3.3.12 糖酵解压力检测 |
| 3.3.13 细胞蛋白提取及样品处理 |
| 3.3.14 western blot检测 |
| 3.3.15 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 DhHP-6能够促进2型糖尿病小鼠糖代谢相关酶的表达 |
| 3.4.2 DhHP-6有利于2型糖尿病小鼠肝脏糖原的合成 |
| 3.4.3 DhHP-6能够激活2型糖尿病小鼠的胰岛素信号通路 |
| 3.4.4 DhHP-6 能够激活2 型糖尿病小鼠的AMPK信号通路 |
| 3.4.5 DhHP-6 能够激活2 型糖尿病小鼠的Nrf2-Keap1 信号通路 |
| 3.4.6 HepG2细胞胰岛素抵抗模型的构建 |
| 3.4.7 DhHP-6 能够促进HepG2 细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖吸收及糖原合成 |
| 3.4.8 DhHP-6 能够抑制HepG2 细胞胰岛素抵抗模型ROS的生成 |
| 3.4.9 DhHP-6 能够降低HepG2 细胞胰岛素抵抗模型的线粒体膜电位 |
| 3.4.10 DhHP-6 能够缓解HepG2 细胞胰岛素抵抗模型的线粒体压力 |
| 3.4.11 DhHP-6 能够改善HepG2 细胞胰岛素抵抗模型的糖酵解压力 |
| 3.4.12 DhHP-6 能够激活HepG2 细胞胰岛素抵抗模型的PI3K/AKT信号通路 |
| 3.4.13 DhHP-6 能够激活HepG2 细胞胰岛素抵抗模型的AMPK信号通路 |
| 3.4.14 DhHP-6 通过PI3K/AKT/Nrf2-Keap1 信号通路改善HepG2细胞胰岛素抵抗 |
| 3.4.15 DhHP-6 通过AMPK/Nrf2-Keap1 信号通路改善HepG2 细胞胰岛素抵抗 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 DHHP-6-细胞穿膜肽-叶酸-羧甲基壳聚糖微球制备 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞穿膜肽的合成及纯化 |
| 4.3.2 叶酸-羧甲基壳聚糖的合成及表征 |
| 4.3.3 Caco-2细胞培养 |
| 4.3.4 细胞毒性实验 |
| 4.3.5 Caco-2细胞吸收模型的建立 |
| 4.3.6 DhHP-6-细胞穿膜肽-叶酸-羧甲基壳聚糖微球的制备 |
| 4.3.7 DhHP-6-细胞穿膜肽-叶酸-羧甲基壳聚糖微球包封率、载药量的测定 |
| 4.3.8 单因素试验 |
| 4.3.9 正交试验 |
| 4.3.10 DhHP-6-细胞穿膜肽-叶酸-羧甲基壳聚糖微球体外释放 |
| 4.3.11 统计学分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 细胞穿膜肽的合成、纯化及鉴定 |
| 4.4.2 叶酸-羧甲基壳聚糖表征 |
| 4.4.3 细胞穿膜肽、DhHP-6及羧甲基壳聚糖/叶酸-羧甲基壳聚糖毒性检测 |
| 4.4.4 细胞粘附能力检测 |
| 4.4.5 细胞穿膜肽的筛选 |
| 4.4.6 单因素试验结果 |
| 4.4.7 正交试验结果 |
| 4.4.8 DhHP-6-细胞穿膜肽-叶酸-羧甲基壳聚糖微球粒径检测 |
| 4.4.9 DhHP-6-细胞穿膜肽-叶酸-羧甲基壳聚糖微球形貌观察 |
| 4.4.10 DhHP-6-细胞穿膜肽-叶酸-羧甲基壳聚糖微球体外释放 |
| 4.4.11 DhHP-6-细胞穿膜肽-叶酸-羧甲基壳聚糖微球Caco-2 细胞模型吸收能力测定 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 总结与创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）IL-1β通过抑制AKT下调人脐静脉内皮细胞eNOS Ser1177磷酸化水平（论文提纲范文）
| 材料和方法 |
| 1细胞提取与培养 |
| 2实验试剂与抗体 |
| 3 方法 |
| 3.1实验分组与实验条件 |
| 3.2Western blot |
| 3.3含量检测 |
| 4统计学处理 |
| 结果 |
| 1 TNF-α、IL-1β和IL-6处理HUVECs后p-eNOS-Ser1177蛋白水平的变化 |
| 2不同浓度的IL-1β处理HUVECs后p-eNOS-Ser1177蛋白水平的变化 |
| 3 IL-1β处理HUVECs不同时间后p-eNOS-Ser1177蛋白水平的变化 |
| 4 IL-1β处理HUVECs不同时间后培养液中NO含量的变化IL1β1μg/L |
| 5 IL-1β处理HUVECs不同时间后p-AKT-Ser473蛋白水平的变化 |
| 6 SC79预处理对IL-1β调节HUVECs中p-eNOS-Ser1177蛋白水平的影响 |
| 7 SC79预处理对IL-1β调节HUVECs培养液中NO含量的影响 |
| 讨论 |
（9）大肠杆菌JM109氨基酸吸收利用以及产GABA代谢调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词对照表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 微生物代谢工程 |
| 1.1.1 代谢工程应用 |
| 1.1.2 代谢工程的进展 |
| 1.2 微生物样品处理与信息采集 |
| 1.2.1 分析样品的代表性 |
| 1.2.2 样品快速淬灭 |
| 1.2.3 胞内代谢物提取 |
| 1.3 微生物代谢分析技术 |
| 1.3.1 气相色谱质谱联用技术 |
| 1.3.2 多平台整合与其他质谱技术 |
| 1.3.3 液相色谱质谱联用技术 |
| 1.4 氨基酸代谢及分析方法 |
| 1.4.1 氨基酸代谢 |
| 1.4.2 HPLC-MS检测氨基酸 |
| 1.4.3 氨基酸衍生方法 |
| 1.5 外源基因引入 |
| 1.5.1 基因重组 |
| 1.5.2 随机文库 |
| 1.6 本论文的研究意义与内容 |
| 2 检测方法建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株和培养基 |
| 2.2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.3 试剂制备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 优化氨基酸衍生条件 |
| 2.3.2 建立细胞内内含物检测方法 |
| 2.3.3 建立质谱和色谱定性定量检测方法 |
| 2.3.4 数据分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 不同衍生剂量的优化 |
| 2.4.2 衍生条件乙腈和水比例的优化 |
| 2.4.3 衍生条件重复性 |
| 2.4.4 标准曲线的建立 |
| 2.4.5 菌体整体细胞膜损伤评估 |
| 2.4.6 菌体洗涤次数对实验的影响 |
| 2.4.7 代谢物提取方法比较 |
| 2.4.8 菌体细胞破碎率测定 |
| 2.5 讨论与小结 |
| 3 外界条件扰动对大肠杆菌氨基酸利用影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株和培养基 |
| 3.2.2 主要仪器和试剂 |
| 3.2.3 试剂制备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 质粒提取 |
| 3.3.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.3.3 代谢样品的制备 |
| 3.3.4 菌株细胞外代谢物检测 |
| 3.3.5 菌株细胞内代谢物检测 |
| 3.3.6 单位体积内细胞内物质含量估算 |
| 3.3.7 数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 提取质粒的纯度 |
| 3.4.2 氨基酸的定性分析 |
| 3.4.3 标准发酵氨基酸利用情况 |
| 3.4.4 标准发酵细胞内外分析 |
| 3.4.5 不同条件培养下菌株生长量 |
| 3.4.6 外界扰动氨基酸利用情况 |
| 3.4.7 耐酸机制中GABA生成 |
| 3.5 讨论与小结 |
| 4 插入外源基因对大肠杆菌代谢影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株和培养基 |
| 4.2.2 主要仪器和试剂 |
| 4.2.3 试剂制备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 活化Bacillus thuringiensis BMB171 |
| 4.3.2 提取基因组DNA |
| 4.3.3 基因组DNA最佳酶切时间 |
| 4.3.4 基因组DNA部分酶切与回收 |
| 4.3.5 载体的完全酶切与去磷酸化 |
| 4.3.6 连接转化培养 |
| 4.3.7 菌株细胞外代谢物检测 |
| 4.3.8 菌株细胞内代谢物检测 |
| 4.3.9 提取质粒并电泳检测 |
| 4.3.10 PCR扩增和测序 |
| 4.3.11 测序结果与NCBI比对 |
| 4.3.12 重组菌进行L-谷氨酸转化 |
| 4.3.13 重组菌17号L-天冬氨酸转化 |
| 4.3.14 数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 BMB171 基因组DNA纯度检测 |
| 4.4.2 基因组DNA不完全酶切 |
| 4.4.3 阳性克隆菌株的筛选 |
| 4.4.4 胞外代谢物检测与分析 |
| 4.4.5 胞内产生新物质代谢检测与分析 |
| 4.4.6 重组菌体17号菌株外源基因鉴定结果 |
| 4.4.7 筛选影响GABA代谢的重组菌 |
| 4.4.8 重组菌17号和空载体菌株发酵液检测 |
| 4.5 讨论与小结 |
| 5 大肠杆菌对单个氨基酸利用情况 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 菌株和培养基 |
| 5.2.2 主要仪器和试剂 |
| 5.2.3 试剂制备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 生长培养基优化 |
| 5.3.2 单个氨基酸转化 |
| 5.3.3 数据分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 生长培养基优化 |
| 5.4.2 氨基酸转化分析 |
| 5.4.3 菌体对氨基酸利用分析 |
| 5.4.4 氨基酸转化菌体量分析 |
| 5.5 讨论与小结 |
| 6 GABA产生代谢调控因素探究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 菌株和培养基 |
| 6.2.2 主要仪器和试剂 |
| 6.2.3 试剂制备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 生长曲线的建立 |
| 6.3.2 GABA代谢因素探究 |
| 6.3.3 时间梯度转化 |
| 6.3.4 数据分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 生长曲线的建立 |
| 6.4.2 转化液对谷氨酸脱羧酶影响 |
| 6.4.3 发酵培养基对谷氨酸脱羧酶影响 |
| 6.4.4 降低pH对谷氨酸脱羧酶影响 |
| 6.4.5 谷氨酸脱羧酶的产生 |
| 6.4.6 葡萄糖阻遏谷氨酸脱羧酶产生 |
| 6.5 讨论与小结 |
| 7 结论与讨论 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、Science in China Ser.C,Life Sciences（论文参考文献）
- [1]TFEB与线粒体稳态在脓毒症并发症中的调控机制[J]. 李钰,赵倩倩,梁胜贤,钟理,郭蕊. 中国科学:生命科学, 2021(09)
- [2]BM2通道蛋白质子传递的影响因素及其与质子通道阻断剂相互作用的理论研究[D]. 张玥. 吉林大学, 2021(01)
- [3]基于血管紧张素转化酶2探究人参皂苷Rc改善内皮细胞胰岛素抵抗与血管内皮功能障碍的作用及机制[D]. 王耀振. 吉林大学, 2021(01)
- [4]藜麦蛋白抗氧化肽的制备及其作用机制研究[D]. 马洪鑫. 西北民族大学, 2021(08)
- [5]围产期母猪饲粮补充丝氨酸对泌乳母猪和哺乳仔猪血清生化指标和抗氧化功能的影响[J]. 曾思静,刘永辉,龙静,关鹏,胡鲜,王晨昱,何流琴,李铁军,邓近平,印遇龙. 动物营养学报, 2021(04)
- [6]PDCD4通过eIF4A依赖的方式抑制TFEB翻译并负向调控溶酶体功能和巨噬细胞抗肿瘤能力[D]. 陈晓彤. 山东大学, 2021(11)
- [7]口服次血红素六肽改善2型糖尿病肝脏胰岛素抵抗的机制研究[D]. 汪凯. 吉林大学, 2020(03)
- [8]IL-1β通过抑制AKT下调人脐静脉内皮细胞eNOS Ser1177磷酸化水平[J]. 罗明昊,胡舒鹏,王瑞钰,李畅,吕鼎一,杨茜洋,罗素新. 中国病理生理杂志, 2020(10)
- [9]大肠杆菌JM109氨基酸吸收利用以及产GABA代谢调控研究[D]. 王俊强. 郑州大学, 2020(02)
- [10]教育部关于印发普通高中课程方案和语文等学科课程标准（2017年版2020年修订）的通知[J]. 教育部. 中华人民共和国教育部公报, 2020(06)