导读:本文包含了黑曲霉植酸酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:植酸酶,定点突变,表达载体pPICZαC-FS,phyA,植酸酶表面展示
黑曲霉植酸酶论文文献综述
余道兵[1]（2017）在《黑曲霉植酸酶基因的定点突变及其在毕赤酵母的表面展示》一文中研究指出黑曲霉植酸酶PHYA目前被公认为最具应用前景的饲用植酸酶之一,但是野生型菌株所产生的植酸酶不能满足工业生产的需求,本研究以Aspergillus niger ZJUY中的植酸酶基因phyA为亲本,借助定点突变的方法,对植酸酶的关键位点的密码子进行优化,并引入氢键(T295S,Q296R和V43N)和对二硫键Cys196-Cys446进行缺失突变,以解决植酸酶在制粒过程中易变性失活的问题。最终将絮凝素Flo1p与改造过的植酸酶以N端融合的方式,展示在Pichia pastoris GS115细胞表面,用1%的甲醇进行诱导表达,通过细胞免疫荧光染色和流式细胞仪检测,证实植酸酶在毕赤酵母细胞表面成功展示。本研究的主要研究结果如下:(1)以黑曲霉基因组为模板,通过叁轮PCR获得去除内含子的植酸酶基因phyA,该法的优势在于在所提取的RNA质量较差的情况下仍可获得完整的去除内含子的植酸酶基因。(2)以野生型的PHYA为亲本,通过PCR最终成功引入R62、H63、G64、R66、P68、R146、H342、D343、S295、R296、N43和S446等12个突变位点,突变效率较高,操作简便易行。(3)借助无缝克隆的方法,成功将锚定片段FS、携带标签Flag的目的片段phyA插入到酵母表达载体pPICZαC中,相比于采用传统的载体构建方法,该法阳性克隆效率较高。(4)采用氯化锂转化的方法,成功将构建的8种表达载体pPICZαC-FS/phyA通过同源重组的方式整合到毕赤酵母GS115基因组上,并通过甲醇的诱导成功展示到GS115细胞表面。(5)通过展示酶特性的研究发现,二硫键Cys196-Cys446的缺失能够使展示酶的内源荧光的发射波长发生红移,改变了酶分子的构象。此外,二硫键Cys196-Cys446的缺失突变能够提高展示酶对底物的亲和力和底物专一性,但会使催化效率下降。(6)展示植酸酶引入氢键和缺失二硫键会导致酶促反应的最适温度和最适pH发生一定程度的改变。(7)通过热稳定性的研究发现,重组菌株A61在90℃水浴处理的过程中,展示酶活丧失比较缓慢,这一特性可以克服制粒过程中(60~90℃)植酸酶变性失活的不足。(8)通过酸碱耐受性研究发现,重组菌株A31、A61、A84在pH 1.6-4.0的范围内,残余酶活均保持在80%以上,可以较好的满足动物饲料用酶的要求。(9)金属离子Na~+、K~+、Fe~(2+)、Zn~(2+)在低浓度时可以激活展示植酸酶的活性,而Cu2+、Mn2+、Co2+对展示植酸酶主要表现为抑制作用。(本文来源于《浙江农林大学》期刊2017-06-18）
王陶,李文,董玉玮,高明侠,李同祥[2]（2016）在《黑曲霉植酸酶对豆粕中植酸的脱磷作用》一文中研究指出单胃动物不能有效利用植物性饲料中的磷,因为磷主要以植酸磷的形式存在。通常通过在饲料中添加植酸酶,水解植酸脱磷,来提高动物对磷的利用率。利用黑曲霉发酵产生的植酸酶粗酶液对豆粕中的植酸进行脱磷作用研究。通过单因素试验和正交试验确定植酸酶水解豆粕中植酸的最适条件为:酶加量为600 U/g,底物浓度为60 mg/m L,p H为4,温度为55℃,脱去无机磷的量为4.127 mg/g。最优条件下,豆粕中植酸水解5 h后的水解率为87.34%。(本文来源于《食品工业》期刊2016年05期）
陈璐璐,江连洲,邓晨旭,刘君,李杰[3]（2014）在《构建食品级植酸酶黑曲霉工程菌》一文中研究指出植酸是植物种子中肌醇和磷的主要存在形式,由于单胃动物体内缺乏能分解植酸的酶,以植酸磷形式存在的磷难以被单胃动物吸收。植酸酶作为饲料添加剂已经广泛应用,但在食品中的应用研究刚刚开始。本研究以黑曲霉(Aspergillus niger)CICC2462基因组DNA为模板,PCR扩增植酸酶基因片段,并在其两端加上糖化酶基因(glaA)的5'同源臂和3'同源臂,构建农杆菌Ti质粒基因置换载体pSZHG-phy。通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化黑曲霉,筛选以植酸酶基因替换糖化酶基因的同源重组转化子,以实现植酸酶基因的高效表达。结果表明,筛选获得4株同源重组转化子,同源重组率为100%,通过分光光度计法测定重组植酸酶菌株的最高发酵酶活为316.2 U/mL,为出发菌株的20.8倍,证明植酸酶phy基因是可以在黑曲霉糖化酶生产菌中实现高效表达。本研究为进一步构建食品级植酸酶工程菌提供了基础资料。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2014年09期）
李海燕,王志,陈雄,付刚[4]（2014）在《黑曲霉产植酸酶发酵工艺优化》一文中研究指出对黑曲霉液态发酵产酸性植酸酶的发酵工艺进行了优化实验。通过正交试验进行培养基优化得到最佳配比为:5%可溶性淀粉,5%豆粕,0.9%KCl,0.1%FeSO4·7H2O,0.9%MgSO4·7H2O,0.5%MnSO4。根据极差可知,影响程度,MgSO4·7H2O>可溶性淀粉>豆粕>MnSO4>FeSO4·7H2O>KCl。通过对发酵条件进行单因素优化得到黑曲霉发酵产植酸酶的最佳发酵条件是:发酵温度30℃,初始pH5.5,摇床转速220r/min,发酵时间60h。在优化条件下,酸性植酸酶酶活力达到了20U。(本文来源于《食品研究与开发》期刊2014年11期）
陈璐璐[5]（2014）在《植酸酶黑曲霉工程菌的构建》一文中研究指出植酸的分子式为C6H6[OPO(OH)2]6,由于其自身的磷酸基团不稳定,易与植物中的二价离子及蛋白质相结合生成不溶性复合物,人类和动物在食用含有植酸的禾谷类食物时,由于植酸的抗营养作用,而使动物的肠胃减少对谷物营养的吸收。植酸酶(EC.3.1.3.8,肌醇六磷酸盐磷酸水解酶)是可将植酸盐降解为肌醇和磷酸的酶类。由于植酸酶针对单胃动物的良好饲喂效果,植酸酶作为饲料添加剂已经广泛应用。近些年,国内外已经开始研究开发植酸酶作为食品的添加剂,且发现对于脾胃虚弱的人来说,在禾谷类食品中添加植酸酶可以增加对于营养因子的吸收,特别是铁和锌。这证明植酸酶在食品加工工业将会是一个很重要的产品。并且在植酸酶降解植酸盐过程中,产生的低磷酸肌醇及终产物肌醇都是医药中的紧俏物,所以植酸酶在医药方面也将会很有发展空间；在环保方面,植酸酶作为菌肥,添加到环境中垃圾中,增加土壤和植物的营养。所以在食品、医药、环保方面植酸酶都有很大应用前景。表达食用型的植酸酶需要食品级表达系统,本研究选用FDA已经认定安全黑曲霉糖化酶生产菌CICC2462作为受体菌,其自身能分泌淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等多种酶,是构建这些酶制剂工程菌的理想宿主。同时筛选标记潮霉素基因两端设计了顺向重复序列,可在转化子后代中消除潮霉素抗性基因,完全符合食品级表达系统的要求。该黑曲霉菌株具有成熟的糖基化系统,能够正确进行翻译后加工,与哺乳动物的糖基化系统相似,以及具有高水平的蛋白质分泌能力；且黑曲霉表达系统发酵及后处理技术成熟,正是生产食用型重组植酸酶的理想宿主。本研究将黑曲霉内源基因植酸酶phy,通过酶切连接构建出黑曲霉植酸酶表达载体pSZHG-phy。目的：一是为了使植酸酶基因受糖化酶基因强启动子的调控下高表达。二是可通过同源重组技术替换黑曲霉糖化酶生产菌中高表达的糖化酶的基因位点,期望构建出高效表达、安全的食品级植酸酶黑曲霉工程菌。主要研究结果如下：1.黑曲霉植酸酶表达载体的构建运用PCR方法,用特异性引物扩增出植酸酶phy基因序列,连接pMD-18T载体,然后送交测序,测序正确后,用Nhe I和ClaⅠ酶切载体pSZHG,同时用XbaⅠ和Cla Ⅰ酶切T-phy,构建为黑曲霉植酸酶表达载体pSZHG-phy,转化大肠杆菌感受态。2.农杆菌介导转化黑曲霉菌丝体将黑曲霉植酸酶表达载体转化农杆菌感受态,获得农杆菌转化子,然后将农杆菌转化子菌液与黑曲霉菌丝体在AS200μmol/L的固体PDA培养基中共培养,然后再在含有潮霉素B和头孢噻肟钠的固体PDA培养基中筛选5d,筛选获得了阳性黑曲霉转化子。3.植酸酶phy基因在黑曲霉的表达分析将获得的阳性转化子提取基因组DNA,经PCR鉴定,4株阳性转化子皆为同源重组菌株,同源重组率为100%,同源重组转化子继代培养后,将黑曲霉转化子菌丝体接到糖化酶摇瓶发酵培养基中34℃.300rpm.min-1、3d后,取上清,进行SDS-PAGE,获得75kDa植酸酶蛋白条带,说明转化黑曲霉后植酸酶基因得到了表达,使用国标分光光度法测植酸酶酶活性,获得酶活316.2U·mL-1,高出出发菌株酶活20.8倍,提取重组菌株的总RNA,进行反转录普通PCR及荧光定量PCR,获得重组植酸酶在mRNA水平的表达量高于出发菌株781.9倍。(本文来源于《东北农业大学》期刊2014-06-01）
刘洋,金承范,刘嘉,路鑫,张良[6]（2014）在《黑曲霉液态发酵产植酸酶的条件优化研究》一文中研究指出文章以黑曲霉为出发菌株,通过初筛、复筛,得到一株产植酸酶的菌株,对发酵时间、温度及pH进行单因素试验,并利用正交设计进行工艺优化。结果表明,当培养基pH为5.5、温度为30℃、发酵时间为5d时,黑曲霉发酵产植酸酶活力最大,为14.35U/mL。(本文来源于《饲料与畜牧》期刊2014年01期）
张馨月[7]（2013）在《黑曲霉植酸酶phyA基因的分离及转化拟南芥的研究》一文中研究指出植酸(phytic acid or myo-inositol hexakisphosphate)及其盐类是植物种子中肌醇的主要来源和磷的主要储存形式,同时也是单胃动物中的一种抗营养因子。植酸酶(myo-inositol hexakisphosphate phosphohyrolases, phytase)是催化植酸及其盐类水解成肌醇和无机磷酸盐的一类磷酸酶。磷是生物机体内不可缺少的重要矿物元素之一,它在植物体内主要是以植酸磷的形式存在,在植物种子中植酸磷的含量约占其总磷量的70%左右,而植物体内天然植酸酶的含量是很低的,因此不足以使植物从大量的植酸磷中释放出足量的无机磷去供自身生长发育所用。在单胃动物体内由于缺乏植酸酶,所以很难充分利用植物性饲料中的植酸磷源,必须要在饲料中额外添加无机磷以满足动物机体对磷的需求,不仅造成了磷源的浪费,又增加了饲料成本,同时不能被单胃动物所吸收利用的植酸磷随动物粪便排出体外,这样的高磷粪便又造成严重的环境污染,因此利用植物来生产植酸酶具有重要的意义。本研究从黑曲霉中克隆出能够编码植酸酶的phyA基因,并构建了含有phyA基因的两个植物表达载体,通过Floral-dip法将phyA基因转入到受体材料拟南芥中,并对转基因拟南芥种子中植酸酶的活性进行了检测。主要研究结果如下：1.本研究成功从黑曲霉中克隆得到了能够编码植酸酶的phyA基因全长序列,该基因长度1506bp,该基因能够编码467个氨基酸。2.成功构建了含有phyA基因的两个植物表达载体pCAMBIA1301-phyA和pCAMBIA1301-PAO-phyA,并将这两个植物表达载体的质粒转化到农杆菌EHA105中,获得了可以用于转化植物的含phyA基因的农杆菌菌液。3.通过Floral-dip法将phyA基因转入到拟南芥中,经过1%的Basta筛选和PCR检测,共获得了13株转基因拟南芥T1代植株,其中有6株是在转基因拟南芥种子中特异性表达的植株,另外7株是在转基因拟南芥种子的油体蛋白上特异性表达的植株,证明了来源于黑曲霉中的phyA基因已成功转入到拟南芥基因组DNA中。4.通过对转基因拟南芥T1代种子中植酸酶活性的测定,初步证明了phyA基因在拟南芥种子中编码的植酸酶可以正确表达,并且转基因拟南芥种子中所表达的植酸酶具有较好的活性,在非转基因野生型拟南芥种子中植酸酶平均活性仅为2.86U/min,而在转基因拟南芥种子中特异性表达的植酸酶平均活性为57.15U/min,在转基因拟南芥油体蛋白上特异表达的植酸酶平均活性为52.61U/min。(本文来源于《吉林农业大学》期刊2013-06-01）
侯文通,杨俐苹,陈茹梅,张少军[8]（2013）在《遗传转化的黑曲霉植酸酶基因(phyA2)对玉米利用土壤有机磷能力的影响》一文中研究指出以转黑曲霉植酸酶基因(phyA2)玉米T9代纯合系及与之对应世代的阴性对照为材料,通过低磷土壤培养试验研究植酸酶基因(phyA2)对玉米利用土壤有机磷能力的影响。结果显示,在施用植酸钠和不施磷的条件下,与阴性对照相比,转基因玉米根际土壤的磷酸酶活性分别提高5.17%和5.48%,根际中等活性有机磷分别降低16.2%和28.2%;植株磷积累量分别增加140%和100%,各生长指标都明显好于阴性对照。说明遗传转化的黑曲霉植酸酶基因能提高玉米利用土壤有机磷的能力,增加玉米体内磷的积累,改善玉米的生长状况。(本文来源于《作物学报》期刊2013年08期）
康伟,马宝全[9]（2013）在《K148与K149对黑曲霉NRRL3135植酸酶A与植酸结合机制的影响》一文中研究指出为了研究黑曲霉NRRL3135植酸酶A K148与K149对底物与酶的结合反应的影响,构建了一个单位点突变体(K148E)和一个双位点突变体(K148E和K149E),由于带电的氨基酸残基发生变化,造成这2个突变体的酶活性都有不同程度的减少,利用InsightII软件模拟了2种突变体酶的3-D结构,发现酶分子突变位置的表面电势有明显的改变.这2个α-螺旋(141～160)位点的改变可能降低了活性中心附近的底物浓度,减缓了底物与活性中心的反应速度.(本文来源于《南开大学学报(自然科学版)》期刊2013年01期）
王慧,桑维钧,矫强,张新强,董存琴[10]（2012）在《黄芪对黑曲霉植酸酶代谢活性的影响》一文中研究指出利用FeSO4-钼蓝法研究了中草药黄芪(Astragalus membranaceus)粉末、黄芪水提取液对黑曲霉(Aspergillus niger)植酸酶在固体培养基和液体培养基中代谢活性的影响。结果表明,在0.03 g/mL的黄芪粉末和0.03 g/mL的黄芪水提取液作用下,44 h时黑曲霉中植酸酶活性最高。与对照相比,固体培养基中加入黄芪粉末和黄芪水提取液的吸光度分别提高了33.6%和37.8%,液体培养基中加入黄芪粉末和黄芪水提取液的吸光度分别提高了21.0%和28.7%。在最佳培养时间,植酸酶活性均随着黄芪浓度的增大而呈下降趋势,其中加入黄芪粉末的液体培养基变化幅度最大,植酸酶活性浓度0.01 g/mL是浓度0.05g/mL的1.64倍;加入黄芪水提取液的液体培养基中植酸酶活性浓度0.01 g/mL是浓度0.05 g/mL的1.54倍;加入黄芪粉末和黄芪水提取液的固体培养基中植酸酶活性浓度0.01 g/mL分别是浓度0.05 g/mL的1.50和1.42倍。(本文来源于《湖北农业科学》期刊2012年17期）
黑曲霉植酸酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
单胃动物不能有效利用植物性饲料中的磷,因为磷主要以植酸磷的形式存在。通常通过在饲料中添加植酸酶,水解植酸脱磷,来提高动物对磷的利用率。利用黑曲霉发酵产生的植酸酶粗酶液对豆粕中的植酸进行脱磷作用研究。通过单因素试验和正交试验确定植酸酶水解豆粕中植酸的最适条件为:酶加量为600 U/g,底物浓度为60 mg/m L,p H为4,温度为55℃,脱去无机磷的量为4.127 mg/g。最优条件下,豆粕中植酸水解5 h后的水解率为87.34%。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
黑曲霉植酸酶论文参考文献
[1].余道兵.黑曲霉植酸酶基因的定点突变及其在毕赤酵母的表面展示[D].浙江农林大学.2017
[2].王陶,李文,董玉玮,高明侠,李同祥.黑曲霉植酸酶对豆粕中植酸的脱磷作用[J].食品工业.2016
[3].陈璐璐,江连洲,邓晨旭,刘君,李杰.构建食品级植酸酶黑曲霉工程菌[J].农业生物技术学报.2014
[4].李海燕,王志,陈雄,付刚.黑曲霉产植酸酶发酵工艺优化[J].食品研究与开发.2014
[5].陈璐璐.植酸酶黑曲霉工程菌的构建[D].东北农业大学.2014
[6].刘洋,金承范,刘嘉,路鑫,张良.黑曲霉液态发酵产植酸酶的条件优化研究[J].饲料与畜牧.2014
[7].张馨月.黑曲霉植酸酶phyA基因的分离及转化拟南芥的研究[D].吉林农业大学.2013
[8].侯文通,杨俐苹,陈茹梅,张少军.遗传转化的黑曲霉植酸酶基因(phyA2)对玉米利用土壤有机磷能力的影响[J].作物学报.2013
[9].康伟,马宝全.K148与K149对黑曲霉NRRL3135植酸酶A与植酸结合机制的影响[J].南开大学学报(自然科学版).2013
[10].王慧,桑维钧,矫强,张新强,董存琴.黄芪对黑曲霉植酸酶代谢活性的影响[J].湖北农业科学.2012
标签：植酸酶; 定点突变; 表达载体pPICZαC-FS; phyA; 植酸酶表面展示;