导读:本文包含了纤维细胞起始论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:棉花(Gossypium,hirsutum),纤维发育,GhHOX4,磷脂酸(PA)
纤维细胞起始论文文献综述
卫莹丽[1]（2019）在《GhHOX4在棉花纤维细胞起始和伸长发育中的调控作用研究》一文中研究指出棉花是最世界上重要的纤维作物之一,生物学家和育种学家一直利用现代生物技术和方法来改善棉纤维品质,提高棉花产量。棉纤维是一种单细胞结构的表皮毛,由棉花胚珠表皮细胞极性伸长而来,它与拟南芥表皮毛发育模式相似。以往的研究表明,拟南芥GLABRA2(AtGL2)基因在拟南芥叶表皮毛和根表皮毛细胞的分化中起重要作用。通过同源序列比对,我们发现棉花GhHOX1、GhHOX2、GhHOX3、GhHOX4与AtGL2的Homeobox结构域相同,氨基酸水平上的同源性分别达到了95%、71%、72%和63%。在前期工作中,从陆地棉中克隆鉴定了 GhHOX4基因,并且对该基因在拟南芥中的功能及其分子机制进行了研究。本研究根据前期研究结果,继续对GhHOX4转基因拟南芥表皮毛的长度做了进一步研究;并对获得的GhHOX4 RNAi转基因棉花及GhHOX4 OE转基因棉花进行T2、T3、T4代的遗传表型分析及纤维品质检测,通过RNA-Seq技术对GhHOX4转基因棉花开花后6天棉纤维进行转录组分析,解析GhHOX4在棉花纤维起始和伸长发育中的调控作用。所得的主要结果如下:1.GhHOX4调控棉花纤维细胞起始和伸长发育为了研究GhHOX4基因在棉花纤维发育中的功能,我们通过农杆菌介导的棉花转化方法,分别获得了GhHOX 过量表达和RNAi转基因棉花植株。连续种植了 GhHOX4转基因棉花后代株系的不同世代(T1-T4代),观察分析转基因棉花后代株系的遗传表型。研究结果表明,在GhHOX4过量表达转基因棉花纤维中GhHOX4表达量明显提高,而在GhHOX4 RNAi棉花纤维中GhHOX4表达量显着下降。在T2、T3和T4代GhHOX4过量表达和RNAi转基因棉花纤维中该基因的表达量也与T1代的分析结果一致。统计分析了转基因棉花成熟棉纤维长度,结果显示与野生型相比,GhHOX4过量表达转基因棉花成熟纤维明显变长,而GhHOX4 RNAi转基因棉花纤维明显变短。此外,进行GhHOX4转基因棉花胚珠离体培养实验,所得结果也与成熟纤维的统计分析结果一致。以上结果说明GhHOX4基因在棉花纤维伸长阶段发挥正调控作用。利用徒手切片技术,观察GhHOX4 OE及RNAi转基因棉花株系及野生型植株开花后0天、1天和2天的胚珠表面纤维细胞突起,发现GhHOX4OE株系的胚珠表面上突起的纤维细胞较野生型细胞更长且更稀疏,而GhHOX4 RNAi株系与野生型相比没有明显差异。这暗示GhHOX4基因可能影响棉纤维细胞的早期起始分化及其随后的伸长发育。棉纤维平均长度、整齐度、断裂比强度和马克隆值等是衡量棉纤维品质的几个重要指标。从棉纤维品质检测结果中可以看到:GhHOX4 RNAi转基因棉花的纤维长度变短4.1%,GhHOX4 OE转基因棉花的纤维长度变长3.9%;而棉纤维的整齐度均较高,超过84%。断裂比强度则是GhHOX4 RNAi转基因棉花变弱7.6%,GhHOX4 OE转基因棉花变强1.8%。这说明该基因影响棉纤维长度等关键品质性状的形成。2.GhHOX4影响棉花纤维伸长发育过程中的下游基因表达为研究转基因棉花纤维中GhHOX4基因对下游基因的表达调控,我们选择T2代开花后6天的GhHOX4 RNAi棉花纤维RNA样品以及野生型RNA样品,进行了RNA-seq测序分析,筛查陆地棉中可能受GhHOX4调控的差异表达基因。转录组分析发现,与野生型相比较,GhHOX4 RNAi转基因棉花纤维中有453个基因的表达发生了改变,其中,有86个基因表达上调,367个基因表达下调。这些差异表达基因主要包含一些细胞与细胞器相关基因,以及结合、催化活性、转运活性、分子传感器活性等相关的基因,这可能表明在棉纤维细胞起始分化及快速伸长时期细胞代谢活跃,细胞内迅速合成及转运纤维伸长所需要的物质,从而保证纤维细胞能够不断的伸长。随之,结合差异基因的热图分析及已有的文献资料发现了一些参与棉纤维发育的基因,可能受到GhHOX4的调控。所以,转录组分析结果表明GhHOX4基因可能在棉花纤维起始和伸长阶段广泛调控或影响下游基因表达而调节棉纤维伸长发育。(本文来源于《华中师范大学》期刊2019-05-01）
杨思思[2]（2015）在《真核起始因子6(eIF6)在皮肤肌成纤维细胞分化中的作用及机制研究》一文中研究指出背景:真核起始因子6(Eukaryotic initiation factor 6,e IF6)是一种在进化过程中的保守蛋白,e IF6通过调控核糖体40S和60S亚基的结合在核糖体合成及翻译调控中发挥重要作用。研究发现:(1)细胞核内e IF6是酵母和哺乳动物细胞60S核糖体亚基生物合成必须的;(2)细胞浆内e IF6是哺乳动物细胞胰岛素和生长因子刺激蛋白质翻译所必须的。e IF6在体外的表达具有看家基因的特征,而其在体内的表达是可变的。此外,e IF6还在快速增殖的细胞的高表达。其表达异常已被证实与一些病理状态相关,比如结直肠癌、头颈部肿瘤、恶性间皮细胞瘤。有文献报道称e IF6高表达会引起非洲爪蟾眼睛发育畸变。e IF6被认为是翻译起始的限速因子,可影响肿瘤发生及肿瘤生长。胞浆中e IF6活性受损可限制淋巴瘤生成及肿瘤进展。本课题组前期研究发现e IF6是神经元蛋白3.1(neuronal protein 3.1,又名P311)的相互作用蛋白,P311通过增加TGF-β1的表达促进增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)的形成和收缩。基因表达谱研究及比较蛋白质组学研究发现,P311蛋白是纤维化相关肌成纤维细胞中显着高表达的差异蛋白。肌成纤维细胞是几乎所有纤维化疾病发生的关键效应细胞,肌成纤维细胞通过合成细胞外基质(extracellular matrix,ECM)及执行收缩力参与结缔组织重塑。肌成纤维细胞的特征是表达α肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),α-SMA是公认的标志肌成纤维细胞分化的关键因素及肌成纤维细胞产生收缩力的主要效应分子。大量研究证实前纤维化细胞因子TGF-β1和细胞外基质维持的机械力是目前诱导肌成纤维细胞分化和维持肌成纤维细胞持续存在不发生凋亡的最重要的因素。因此,根据前期研究基础及对文献分析,我们推测e IF6可能参与肌成纤维细胞的分化。目的:本研究的目的是探索e IF6是否能影响肌成纤维细胞细胞的分化?这种作用是否通过调控TGF-β1的表达实现?e IF6又是通过什么分子机制参与TGF-β1基因的表达调控?第一部分e IF6基因缺陷的杂合子小鼠皮肤肌成纤维细胞分离培养及鉴定方法:1.分离新生e IF6+/-杂合子小鼠及野生型小鼠(日龄3天内)真皮细胞进行原代培养(e IF6基因完全敲除的e IF6纯合子小鼠胚胎在着床前即是致死性的)。本课题实验中使用的是第1代至第3代的细胞。2.应用免疫细胞化学方法检测分离培养的真皮细胞中Vimentin及α-SMA的表达。3.应用逆转录PCR法对分离培养的真皮细胞进行基因型鉴定,区分来自e IF6+/-杂合子小鼠及野生型小鼠的细胞。4.应用Real-Time PCR及Western blotting技术检测e IF6+/-杂合子及野生型细胞中e IF6 m RNA及蛋白的表达。结果:1.我们成功分离培养了新生小鼠真皮肌成纤维细胞,细胞呈单层贴壁生长,呈典型的梭型及多角形形态,细胞体积较大。2.免疫细胞化学结果显示Vimentin及α-SMA在体外培养的新生小鼠真皮胞浆中呈强阳性表达,阳性细胞率为100%。3.逆转录PCR实验结果显示,PCR产物在琼脂糖凝胶电泳仅显示320bp一条带的是来自于野生型小鼠的样本,而显示650bp及320bp两条带的是来自于e IF6基因表达缺陷的杂合子小鼠的样本。4.Western blotting实验及Real-Time PCR实验结果进一步确证,与野生型小鼠真皮来源的肌成纤维细胞相比,e IF6 m RNA的表达在e IF6+/-杂合子小鼠的真皮肌成纤维细胞中降低了约40%,e IF6蛋白的表达在e IF6+/-杂合子小鼠的真皮肌成纤维细胞中降低了约60%。第二部分e IF6对皮肤肌成纤维细胞生物学特性及功能的影响方法:1.采用流式细胞技术检测体外培养的来源于野生型及e IF6+/-杂合子小鼠真皮肌成纤维细胞的细胞周期。2.采用TUNEL法比较来源于野生型及e IF6+/-杂合子小鼠真皮肌成纤维细胞细胞凋亡的情况。3.应用Real-Time PCR及Western blotting技术检测e IF6+/-杂合子及野生型细胞中α-SMA m RNA及蛋白的表达;应用Real-Time PCR技术检测e IF6+/-杂合子及野生型细胞中I型胶原m RNA的表达;应用罗丹明-标记鬼笔环肽染色e IF6+/-杂合子及野生型细胞中的应力纤维并用激光共聚焦显微镜观察应力纤维形成的情况;应用成纤维细胞凝胶收缩模型观察e IF6+/-杂合子及野生型细胞收缩胶原的能力。结果:1.采用流式细胞技术检测体外培养的肌成纤维细胞的细胞周期,结果显示:来源于e IF6基因缺陷杂合子小鼠的细胞处于S期的比例明显低于来源于野生型小鼠的细胞(e IF6+/-杂合子细胞处于S期的比例为6.92%,而野生型细胞的比例为11.16%)。然而e IF6+/-杂合子细胞处于G2/M期的比例为42.13%,显着高于野生型细胞(仅为27.59%)。2.TUNEL法比较来源于野生型及e IF6+/-杂合子小鼠真皮肌成纤维细胞细胞凋亡的情况,两组间凋亡细胞与有核细胞比例的差异无统计学意义3.较野生型细胞相比,α-SMA在e IF6+/-杂合子细胞中的表达在m RNA水平及蛋白水平均显着增高(m RNA表达增高2.9倍,P=0.020,n=5;蛋白表达增高1.8倍,P=0.029,n=5)。e IF6+/-杂合子细胞表达I型胶原(Col1a1and Col1a2)m RNA的量也明显高于野生型细胞中的表达量,Col1a1m RNA表达增高4.9倍(P=0.001,n=3),Col1a2m RNA表达增高4.6倍(P=0.007,n=3)。此外,激光共聚焦显微镜结果显示:与野生型细胞相比,e IF6+/-杂合子细胞中罗丹明-标记鬼笔环肽染色的应力纤维形成增加,排列分布得更加密集。分析胶原收缩能力的成纤维细胞凝胶收缩模型发现,e IF6+/-杂合子细胞收缩胶原的能力强于野生型细胞(P=0.001,n=3)。第叁部分e IF6对皮肤肌成纤维细胞分化过程中信号转导的影响方法:1.应用Real-Time PCR及Western blotting技术检测e IF6+/-杂合子及野生型细胞中TGF-β1 m RNA及蛋白的表达。2.应用Real-Time PCR技术检测e IF6+/-杂合子及野生型细胞中TGF-β1 I型受体(Tgfbr1)及TGF-β1 II型受体(Tgfbr2)m RNA的表达;应用Western blotting技术检测在外源性TGF-β1刺激条件下,e IF6+/-杂合子及野生型细胞中Smad蛋白的表达。3.应用Western blotting技术检测在用SB431542阻断TGF-β/Smad信号通路后,e IF6+/-杂合子及野生型细胞中p-Smad2及α-SMA蛋白的表达。结果:1.Real-Time PCR实验结果显示,TGF-β1(Tgfb1)m RNA在e IF6+/-杂合子细胞中的表达显着高于其在野生型细胞中的表达量,Tgfb1m RNA表达增高2.7倍(P<0.001,n=5)。ELISA实验也发现e IF6+/-杂合子细胞分泌到培养上清中的TGF-β1也明显增高(增高1.8倍,P<0.001,n=5)。2.Real-Time PCR实验结果显示,Tgfbr1及Tgfbr2m RNA的表达在e IF6+/-杂合子细胞及野生型细胞中无显着差异(P=NS,n=3)。Western blotting实验结果显示:较野生型细胞相比,e IF6+/-杂合子细胞中p-Smad2蛋白的表达增高1.5倍(P=0.008,n=3),与此同时抑制性Smad7蛋白的表达量在e IF6+/-杂合子细胞中降低50%(P=0.002,n=3)。e IF6+/-杂合子细胞中p-Smad3蛋白的表达也增高了,但差异不具有统计学意义(P=NS,n=3)。3.Western blotting实验结果表明,SB431542处理可显着抑制e IF6+/-杂合子细胞中p-Smad2及α-SMA的增高,使其表达水平与在野生型细胞中表达量相当。第四部分e IF6通过影响TGF-β1转录调控皮肤肌成纤维细胞分化的机制探究方法:1.应用多核糖体谱实验技术检测TGF-β1 m RNA在野生型细胞组与e IF6+/-杂合子细胞中翻译效率。2.用放线菌素D(actinomycin D)预处理细胞旨在抑制细胞中新的m RNA的合成,并在处理后不同时间通过Real-Time PCR的方法检测细胞中原有m RNA随时间降解的情况,比较TGF-β1 m RNA在野生型细胞组与e IF6+/-杂合子细胞中m RNA稳定性差异。3.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)检测肌成纤维细胞中TGF-β1启动子区域甲基化程度。4.应用定量蛋白组学i TRAQ技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation)筛选野生型及e IF6基因表达缺陷的肌成纤维细胞中差异表达蛋白,并进行Western blotting实验验证。5.应用染色质免疫共沉淀(Ch IP)技术检测组蛋白变体H2A.Z和转录因子Sp1与TGF-β1基因启动子区域的结合情况,并用Real-Time PCR方法对相同处理条件下TGF-β1 m RNA表达进行检测。结果:1.多核糖体谱实验发现,在含有质量大的多聚核糖体的馏分中TGF-β1 m RNA的含量在野生型细胞组与e IF6+/-杂合子细胞组无显着差异。2.TGF-β1 m RNA在野生型细胞组与e IF6+/-杂合子细胞中的半衰期均为10.5h,两组间TGF-β1 m RNA稳定性并无差异。3.BSP实验结果显示:在野生型细胞组TGF-β1启动子甲基化比例为61.9%,在e IF6+/-杂合子细胞组TGF-β1启动子甲基化比例为73.8%,二者差异无统计学意义4.i TRAQ实验发现302个与e IF6表达缺陷相关的差异表达蛋白。Go分析发现,e IF6表达缺陷导致表达下调的差异蛋白与染色体染色质组装、染色质聚集解聚、DNA包装、蛋白-DNA复合物聚集以及核小体聚集密切相关。其中,e IF6表达缺陷导致一些组蛋白的表达显着降低。在这些差异表达的组蛋白中,变化程度最大的为Histone variant H2A.Z(表达下降50%,P=4.30×10-11<0.0001)以及Histone H2B(表达下降约40%,P=1.11×10-5<0.0001)。我们通过Western blotting实验对部分差异表达蛋白进行验证,结果发现,较野生型细胞相比,组蛋白H2B及组蛋白变体H2A.Z在e IF6+/-杂合子细胞中的表达显着降低,H2B蛋白表达降低了45%,H2A.Z蛋白降低了40%(P=0.051,n=3),该结果与定量蛋白质组学结果一致。此外,我还通过Real-Time PCR技术检测了e IF6+/-杂合子细胞中的H2A.Z(H2afz)m RNA的表达,H2afz m RNA表达较野生型细胞中降低了20%(P=0.015,n=3)5.Ch IP-q PCR实验结果显示,经外源性TGF-β1预处理的野生型细胞及e IF6+/-杂合子细胞,在e IF6+/-杂合子细胞中H2A.Z与TGF-β1启动子相应区域的结合较野生型细胞相比显着降低,而此时在野生型细胞中TGF-β1启动子相应区域有大量的H2A.Z蛋白的结合(相应结合区域为区域1:-120/+73;区域2:-37/+175;区域3:-118/+246)。此外,Ch IP-q PCR实验结果也显示:e IF6+/-杂合子细胞中Sp1结合TGF-β1启动子的量显着高于其在野生型细胞中的结合量,并且结合区域包含所有Sp1在TGF-β1启动子上的预期结合位点。与此同时,在外源性TGF-β1刺激的条件下TGF-β1诱导自身m RNA表达量在e IF6+/-杂合子细胞中显着增高,是野生型细胞表达量的3.4倍(P=0.001,n=5)。全文结论:总结本课题研究,可得出以下结论:1.e IF6参与调控肌成纤维细胞的分化,e IF6表达缺陷诱导肌成纤维细胞分化,促进肌成纤维细胞表达α-SMA、合成胶原及增强细胞收缩胶原的能力。2.e IF6负性调控肌成纤维细胞中TGF-β1的表达,并且该调控作用主要发生在转录层面。3.e IF6表达缺陷通过下调组蛋白变体H2A.Z对TGF-β1启动子的结合,可能通过增加染色质的空间可接近性,从而促进转录因子Sp1对TGF-β1启动子的结合,导致TGF-β1转录活性增强。4.TGF-β/Smad信号通路参与了e IF6介导的肌成纤维细胞活化及分化。因此,我们的研究发现了目前尚未有报道的e IF6分子新的生物学功能及调控机制,即e IF6通过调控TGF-β1的转录介导肌成纤维细胞的分化,本研究拓展了对e IF6这个重要分子的认识。此外,e IF6具有抑制肌成纤维细胞分化的功能,而肌成纤维细胞本身是创面修复和纤维化形成中的主要功能细胞,故该研究可能为今后创面修复和纤维化形成的研究提供新的线索。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2015-10-01）
王正明[3]（2012）在《棉花纤维细胞起始期相关miRNA的鉴定与功能研究》一文中研究指出棉花是重要的经济作物，为人类提供大量的纤维、蛋白以及油脂。棉花纤维的形态建成经历起始期、伸长期、次生壁合成期、成熟期四个阶段，起始作为纤维发育的第一步，很大程度上决定了纤维最终的数量。miRNA作为一类重要的调控分子，调控植物生长发育、以及应答胁迫等许多重要的生物学过程，推测其在棉花纤维发育中可能也起到重要的作用。棉花miRNA在纤维细胞起始中所发挥的功能还没有报道，因此，本研究以陆地棉徐州142野生型及其无纤维突变体的胚珠组织为材料，采用高通量测序法，分析小RNA文库，旨在筛选与鉴定相关与纤维起始的miRNA，进而分析这些miRNA在纤维细胞起始过程中的作用。从构建的陆地棉徐州142野生型和突变体两个小RNA库中，高通量测序总共获得可分析的序列数分别为5896335和3747020。我们从中鉴定到41个保守的miRNA家族，和36个新的miRNA家族。通过对两个小RNA库中miRNA测序数进行统计分析，共鉴定出31个野生型和突变体差异表达的miRNA。通过Northern杂交检测了其中13个差异表达miRNA在纤维起始期胚珠中的表达模式，利用5’RACE验证了其中5个miRNA的靶标，并用实时定量PCR的方法检测了7个miRNA靶标或预测靶标在起始期胚珠中的表达，发现大部分靶标表达与对应的miRNA呈现负相关，暗示这些miRNA很可能是通过调控这些靶标在纤维细胞起始中发挥作用，从而构建了一个与纤维起始相关miRNA的调控网络。为了进一步理解GhmiR156在纤维早期发育中的作用，我们利用高通量测序分析了其在伸长期纤维中的表达，结果显示，GhmiR156的丰度至开花后20天达到峰值。靶标GhSPL9的表达与GhmiR156完全呈负相关，拟南芥中AtSPL9通过负向调控花青素合成相关基因DFR、F3H、ANS的表达抑制花青素的合成，而棉花DFR、F3H、ANS的同源基因在伸长期纤维中的表达模式与GhSPL9十分类似，暗示了在纤维中GhSPL9可能正向调控这叁个基因的表达。我们克隆了DFR和F3H基因的启动子，凝胶滞留实验结果显示，GhSPL9重组蛋白能够与上述基因的启动子结合，并且在烟草瞬时表达实验中，GhSPL9能够显着激活上述启动子驱动的报告基因的转录。另一方面，伸长期纤维中花青素的含量变化也与GhSPL9的表达模式相一致。以上实验表明，GhmiR156在伸长期的纤维中通过抑制GhSPL9的表达，间接抑制了DFR、F3H、ANS的表达，最终抑制花青素的合成，导致开花后20天纤维中花青素的含量达到最低，可能促成H2O2迸发，形成纤维伸长终止的信号。(本文来源于《清华大学》期刊2012-10-01）
[4]（2007）在《棉花类固醇5α-还原酶在纤维细胞的起始和伸长中具有重要作用》一文中研究指出棉花纤维是胚珠外珠被表皮细胞经突起和伸长而成的单细胞,具有极度伸长的结构(长径比达1000～3000)和特殊的细胞壁(纤维素含量达95%)组成,是研究植物细胞(本文来源于《科学通报》期刊2007年18期）
陶磊,周梁,谢明,金晓杰[5]（2001）在《喉鳞状细胞癌标本中真核细胞起始因子4E和碱性成纤维细胞生长因子的检测》一文中研究指出真核细胞起始因子 (ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ 4Ｅ ,ｅＩＦ4Ｅ)参与从“ｍＲＮＡ池”中选择某一“弱ｍＲＮＡ”形成复合体[1] 。大多数哺乳动物中碱性成纤维细胞生长因子 (ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ(本文来源于《中华耳鼻咽喉科杂志》期刊2001年06期）
杨佑明,贾君镇,徐楚年,李海燕,郭玉海[6]（1999）在《棉花纤维细胞起始及温度、植物生长物质对其影响》一文中研究指出利用扫描电镜研究了陆地棉（GossypiumhirsutumL．）品种中棉所12号胚珠表面纤维细胞起始的过程。观察到最早在开花前5d纤维细胞即已起始，比前人报道早5d；也注意到起始的纤维细胞相对集中分布于胚珠的珠柄附近等部位，并且在开花前未见伸长。温度对纤维细胞起始的时间和数目有明显的影响，25～30℃是纤维细胞起始的适宜温度；开花前6d的胚珠只在添加NAA5μmol·L-1和GA35．7μmol·L-1的培养基中形成了纤维，表明棉纤维原始细胞的起始和进一步发育需要适当的激素条件。还讨论了通过调节纤维细胞分化、起始来增加纤维数目和提高纤维长度整齐度的潜力。(本文来源于《中国农业大学学报》期刊1999年03期）
纤维细胞起始论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
背景:真核起始因子6(Eukaryotic initiation factor 6,e IF6)是一种在进化过程中的保守蛋白,e IF6通过调控核糖体40S和60S亚基的结合在核糖体合成及翻译调控中发挥重要作用。研究发现:(1)细胞核内e IF6是酵母和哺乳动物细胞60S核糖体亚基生物合成必须的;(2)细胞浆内e IF6是哺乳动物细胞胰岛素和生长因子刺激蛋白质翻译所必须的。e IF6在体外的表达具有看家基因的特征,而其在体内的表达是可变的。此外,e IF6还在快速增殖的细胞的高表达。其表达异常已被证实与一些病理状态相关,比如结直肠癌、头颈部肿瘤、恶性间皮细胞瘤。有文献报道称e IF6高表达会引起非洲爪蟾眼睛发育畸变。e IF6被认为是翻译起始的限速因子,可影响肿瘤发生及肿瘤生长。胞浆中e IF6活性受损可限制淋巴瘤生成及肿瘤进展。本课题组前期研究发现e IF6是神经元蛋白3.1(neuronal protein 3.1,又名P311)的相互作用蛋白,P311通过增加TGF-β1的表达促进增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)的形成和收缩。基因表达谱研究及比较蛋白质组学研究发现,P311蛋白是纤维化相关肌成纤维细胞中显着高表达的差异蛋白。肌成纤维细胞是几乎所有纤维化疾病发生的关键效应细胞,肌成纤维细胞通过合成细胞外基质(extracellular matrix,ECM)及执行收缩力参与结缔组织重塑。肌成纤维细胞的特征是表达α肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),α-SMA是公认的标志肌成纤维细胞分化的关键因素及肌成纤维细胞产生收缩力的主要效应分子。大量研究证实前纤维化细胞因子TGF-β1和细胞外基质维持的机械力是目前诱导肌成纤维细胞分化和维持肌成纤维细胞持续存在不发生凋亡的最重要的因素。因此,根据前期研究基础及对文献分析,我们推测e IF6可能参与肌成纤维细胞的分化。目的:本研究的目的是探索e IF6是否能影响肌成纤维细胞细胞的分化?这种作用是否通过调控TGF-β1的表达实现?e IF6又是通过什么分子机制参与TGF-β1基因的表达调控?第一部分e IF6基因缺陷的杂合子小鼠皮肤肌成纤维细胞分离培养及鉴定方法:1.分离新生e IF6+/-杂合子小鼠及野生型小鼠(日龄3天内)真皮细胞进行原代培养(e IF6基因完全敲除的e IF6纯合子小鼠胚胎在着床前即是致死性的)。本课题实验中使用的是第1代至第3代的细胞。2.应用免疫细胞化学方法检测分离培养的真皮细胞中Vimentin及α-SMA的表达。3.应用逆转录PCR法对分离培养的真皮细胞进行基因型鉴定,区分来自e IF6+/-杂合子小鼠及野生型小鼠的细胞。4.应用Real-Time PCR及Western blotting技术检测e IF6+/-杂合子及野生型细胞中e IF6 m RNA及蛋白的表达。结果:1.我们成功分离培养了新生小鼠真皮肌成纤维细胞,细胞呈单层贴壁生长,呈典型的梭型及多角形形态,细胞体积较大。2.免疫细胞化学结果显示Vimentin及α-SMA在体外培养的新生小鼠真皮胞浆中呈强阳性表达,阳性细胞率为100%。3.逆转录PCR实验结果显示,PCR产物在琼脂糖凝胶电泳仅显示320bp一条带的是来自于野生型小鼠的样本,而显示650bp及320bp两条带的是来自于e IF6基因表达缺陷的杂合子小鼠的样本。4.Western blotting实验及Real-Time PCR实验结果进一步确证,与野生型小鼠真皮来源的肌成纤维细胞相比,e IF6 m RNA的表达在e IF6+/-杂合子小鼠的真皮肌成纤维细胞中降低了约40%,e IF6蛋白的表达在e IF6+/-杂合子小鼠的真皮肌成纤维细胞中降低了约60%。第二部分e IF6对皮肤肌成纤维细胞生物学特性及功能的影响方法:1.采用流式细胞技术检测体外培养的来源于野生型及e IF6+/-杂合子小鼠真皮肌成纤维细胞的细胞周期。2.采用TUNEL法比较来源于野生型及e IF6+/-杂合子小鼠真皮肌成纤维细胞细胞凋亡的情况。3.应用Real-Time PCR及Western blotting技术检测e IF6+/-杂合子及野生型细胞中α-SMA m RNA及蛋白的表达;应用Real-Time PCR技术检测e IF6+/-杂合子及野生型细胞中I型胶原m RNA的表达;应用罗丹明-标记鬼笔环肽染色e IF6+/-杂合子及野生型细胞中的应力纤维并用激光共聚焦显微镜观察应力纤维形成的情况;应用成纤维细胞凝胶收缩模型观察e IF6+/-杂合子及野生型细胞收缩胶原的能力。结果:1.采用流式细胞技术检测体外培养的肌成纤维细胞的细胞周期,结果显示:来源于e IF6基因缺陷杂合子小鼠的细胞处于S期的比例明显低于来源于野生型小鼠的细胞(e IF6+/-杂合子细胞处于S期的比例为6.92%,而野生型细胞的比例为11.16%)。然而e IF6+/-杂合子细胞处于G2/M期的比例为42.13%,显着高于野生型细胞(仅为27.59%)。2.TUNEL法比较来源于野生型及e IF6+/-杂合子小鼠真皮肌成纤维细胞细胞凋亡的情况,两组间凋亡细胞与有核细胞比例的差异无统计学意义3.较野生型细胞相比,α-SMA在e IF6+/-杂合子细胞中的表达在m RNA水平及蛋白水平均显着增高(m RNA表达增高2.9倍,P=0.020,n=5;蛋白表达增高1.8倍,P=0.029,n=5)。e IF6+/-杂合子细胞表达I型胶原(Col1a1and Col1a2)m RNA的量也明显高于野生型细胞中的表达量,Col1a1m RNA表达增高4.9倍(P=0.001,n=3),Col1a2m RNA表达增高4.6倍(P=0.007,n=3)。此外,激光共聚焦显微镜结果显示:与野生型细胞相比,e IF6+/-杂合子细胞中罗丹明-标记鬼笔环肽染色的应力纤维形成增加,排列分布得更加密集。分析胶原收缩能力的成纤维细胞凝胶收缩模型发现,e IF6+/-杂合子细胞收缩胶原的能力强于野生型细胞(P=0.001,n=3)。第叁部分e IF6对皮肤肌成纤维细胞分化过程中信号转导的影响方法:1.应用Real-Time PCR及Western blotting技术检测e IF6+/-杂合子及野生型细胞中TGF-β1 m RNA及蛋白的表达。2.应用Real-Time PCR技术检测e IF6+/-杂合子及野生型细胞中TGF-β1 I型受体(Tgfbr1)及TGF-β1 II型受体(Tgfbr2)m RNA的表达;应用Western blotting技术检测在外源性TGF-β1刺激条件下,e IF6+/-杂合子及野生型细胞中Smad蛋白的表达。3.应用Western blotting技术检测在用SB431542阻断TGF-β/Smad信号通路后,e IF6+/-杂合子及野生型细胞中p-Smad2及α-SMA蛋白的表达。结果:1.Real-Time PCR实验结果显示,TGF-β1(Tgfb1)m RNA在e IF6+/-杂合子细胞中的表达显着高于其在野生型细胞中的表达量,Tgfb1m RNA表达增高2.7倍(P<0.001,n=5)。ELISA实验也发现e IF6+/-杂合子细胞分泌到培养上清中的TGF-β1也明显增高(增高1.8倍,P<0.001,n=5)。2.Real-Time PCR实验结果显示,Tgfbr1及Tgfbr2m RNA的表达在e IF6+/-杂合子细胞及野生型细胞中无显着差异(P=NS,n=3)。Western blotting实验结果显示:较野生型细胞相比,e IF6+/-杂合子细胞中p-Smad2蛋白的表达增高1.5倍(P=0.008,n=3),与此同时抑制性Smad7蛋白的表达量在e IF6+/-杂合子细胞中降低50%(P=0.002,n=3)。e IF6+/-杂合子细胞中p-Smad3蛋白的表达也增高了,但差异不具有统计学意义(P=NS,n=3)。3.Western blotting实验结果表明,SB431542处理可显着抑制e IF6+/-杂合子细胞中p-Smad2及α-SMA的增高,使其表达水平与在野生型细胞中表达量相当。第四部分e IF6通过影响TGF-β1转录调控皮肤肌成纤维细胞分化的机制探究方法:1.应用多核糖体谱实验技术检测TGF-β1 m RNA在野生型细胞组与e IF6+/-杂合子细胞中翻译效率。2.用放线菌素D(actinomycin D)预处理细胞旨在抑制细胞中新的m RNA的合成,并在处理后不同时间通过Real-Time PCR的方法检测细胞中原有m RNA随时间降解的情况,比较TGF-β1 m RNA在野生型细胞组与e IF6+/-杂合子细胞中m RNA稳定性差异。3.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)检测肌成纤维细胞中TGF-β1启动子区域甲基化程度。4.应用定量蛋白组学i TRAQ技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation)筛选野生型及e IF6基因表达缺陷的肌成纤维细胞中差异表达蛋白,并进行Western blotting实验验证。5.应用染色质免疫共沉淀(Ch IP)技术检测组蛋白变体H2A.Z和转录因子Sp1与TGF-β1基因启动子区域的结合情况,并用Real-Time PCR方法对相同处理条件下TGF-β1 m RNA表达进行检测。结果:1.多核糖体谱实验发现,在含有质量大的多聚核糖体的馏分中TGF-β1 m RNA的含量在野生型细胞组与e IF6+/-杂合子细胞组无显着差异。2.TGF-β1 m RNA在野生型细胞组与e IF6+/-杂合子细胞中的半衰期均为10.5h,两组间TGF-β1 m RNA稳定性并无差异。3.BSP实验结果显示:在野生型细胞组TGF-β1启动子甲基化比例为61.9%,在e IF6+/-杂合子细胞组TGF-β1启动子甲基化比例为73.8%,二者差异无统计学意义4.i TRAQ实验发现302个与e IF6表达缺陷相关的差异表达蛋白。Go分析发现,e IF6表达缺陷导致表达下调的差异蛋白与染色体染色质组装、染色质聚集解聚、DNA包装、蛋白-DNA复合物聚集以及核小体聚集密切相关。其中,e IF6表达缺陷导致一些组蛋白的表达显着降低。在这些差异表达的组蛋白中,变化程度最大的为Histone variant H2A.Z(表达下降50%,P=4.30×10-11<0.0001)以及Histone H2B(表达下降约40%,P=1.11×10-5<0.0001)。我们通过Western blotting实验对部分差异表达蛋白进行验证,结果发现,较野生型细胞相比,组蛋白H2B及组蛋白变体H2A.Z在e IF6+/-杂合子细胞中的表达显着降低,H2B蛋白表达降低了45%,H2A.Z蛋白降低了40%(P=0.051,n=3),该结果与定量蛋白质组学结果一致。此外,我还通过Real-Time PCR技术检测了e IF6+/-杂合子细胞中的H2A.Z(H2afz)m RNA的表达,H2afz m RNA表达较野生型细胞中降低了20%(P=0.015,n=3)5.Ch IP-q PCR实验结果显示,经外源性TGF-β1预处理的野生型细胞及e IF6+/-杂合子细胞,在e IF6+/-杂合子细胞中H2A.Z与TGF-β1启动子相应区域的结合较野生型细胞相比显着降低,而此时在野生型细胞中TGF-β1启动子相应区域有大量的H2A.Z蛋白的结合(相应结合区域为区域1:-120/+73;区域2:-37/+175;区域3:-118/+246)。此外,Ch IP-q PCR实验结果也显示:e IF6+/-杂合子细胞中Sp1结合TGF-β1启动子的量显着高于其在野生型细胞中的结合量,并且结合区域包含所有Sp1在TGF-β1启动子上的预期结合位点。与此同时,在外源性TGF-β1刺激的条件下TGF-β1诱导自身m RNA表达量在e IF6+/-杂合子细胞中显着增高,是野生型细胞表达量的3.4倍(P=0.001,n=5)。全文结论:总结本课题研究,可得出以下结论:1.e IF6参与调控肌成纤维细胞的分化,e IF6表达缺陷诱导肌成纤维细胞分化,促进肌成纤维细胞表达α-SMA、合成胶原及增强细胞收缩胶原的能力。2.e IF6负性调控肌成纤维细胞中TGF-β1的表达,并且该调控作用主要发生在转录层面。3.e IF6表达缺陷通过下调组蛋白变体H2A.Z对TGF-β1启动子的结合,可能通过增加染色质的空间可接近性,从而促进转录因子Sp1对TGF-β1启动子的结合,导致TGF-β1转录活性增强。4.TGF-β/Smad信号通路参与了e IF6介导的肌成纤维细胞活化及分化。因此,我们的研究发现了目前尚未有报道的e IF6分子新的生物学功能及调控机制,即e IF6通过调控TGF-β1的转录介导肌成纤维细胞的分化,本研究拓展了对e IF6这个重要分子的认识。此外,e IF6具有抑制肌成纤维细胞分化的功能,而肌成纤维细胞本身是创面修复和纤维化形成中的主要功能细胞,故该研究可能为今后创面修复和纤维化形成的研究提供新的线索。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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标签：棉花(Gossypium; hirsutum); 纤维发育; GhHOX4; 磷脂酸(PA);