导读:本文包含了核酸疫苗表达载体论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:刚地弓形虫,ROP11,真核表达质粒,核酸疫苗
核酸疫苗表达载体论文文献综述
张晓磊[1]（2014）在《刚地弓形虫RH株ROP11基因真核表达载体的构建及核酸疫苗免疫保护作用的研究》一文中研究指出刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性有核细胞内寄生原虫，能感染所有的恒温动物，据估计1/3的人口感染过弓形虫。因其能导致视网膜瘢痕，脑损伤和孕妇流产后感染而成为引起人类疾病的一个主要原生物。弓形虫棒状体蛋白由其分泌器官棒状体分泌，在虫体入侵宿主细胞时具有重要的作用，尤其是与纳虫空泡的形成和修饰过程密切相关。本课题构建了刚地弓形虫RH株ROP11基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-ROP11，将重组质粒转染HeLa细胞，间接免疫荧光法检测细胞内蛋白表达情况；将重组质粒肌肉注射免疫BALB/C小鼠，检测小鼠血清IgG，细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平并记录弓形虫感染小鼠后的存活时间评价其免疫保护力，以期为进一步研究弓形虫ROP11基因核酸疫苗提供理论和物质基础。首先提取弓形虫RH株速殖子总RNA，根据TgROP11基因全长编码序列（登录号为DQ077905）的开放阅读框设计引物并进行逆转录PCR（RT-PCR）扩增，将扩增的目的片段ROP11基因克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)上，构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-ROP11，之后将PCR产物经EcoR I和Not I酶切后与同样经EcoR I和Not I酶切的pcDNA3.1(+)真核表达载体连接，对重组质粒做菌落PCR、EcoR I和Not I双酶切和测序鉴定。结果显示，RT-PCR扩增产物约为1548bp，菌落PCR及双酶切结果正确，序列测序结果与GenBank上报告的ROP11序列相比，8个核苷酸存在变异，导致5个氨基酸发生改变，其中在第56个氨基酸位置多了一个天冬酰胺。证明成功构建了弓形虫ROP11的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ROP11。确定表达质粒成功构建后，将pcDNA3.1(+)-ROP11重组质粒转化到制备好的感受态大肠埃希菌（E.coli）XL-Blue内，筛选阳性克隆后扩大培养，提取质粒，之后通过Lipofector阳离子脂质体转染试剂将pcDNA3.1(+)-ROP11重组质粒转染至HeLa细胞内。间接免疫荧光法检测发现重组质粒转染的HeLa细胞胞浆观察到黄绿色荧光，对照组无荧光，证明了构建的真核表达质粒能够在体外真核细胞内表达目的蛋白。最后碱裂解法大量提取质粒，免疫小鼠。将40只8周龄BALB/C小鼠随机分为4组，每组10只：实验组、空质粒对照组、PBS对照组和空白对照组，每组均通过股四头肌注射免疫小鼠，其中实验组注射pcDNA3.1(+)-ROP11重组质粒为100μg(1μg/μl)，空质粒对照组注射pcDNA3.1(+)质粒为100μg(1μg/μl)，PBS对照组注射无菌PBS缓冲液为100μl，空白对照组不注射，共免疫3次，每次间隔2周，末次接种量均加倍。分别于每次注射前和末次注射后第二周取小鼠血清检测抗体和细胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10）。末次注射后2周各组小鼠腹腔攻击感染RH株弓形虫速殖子1×103个/只，观察其存活时间及免疫保护力。小鼠免疫接种后，实验组小鼠血清抗体IgG随着免疫次数的增加而明显增高，但空质粒对照组、PBS对照组和空白对照组相应的血清中均未出现明显升高，末次注射后实验组小鼠血清IgG与空质粒对照组、PBS对照组和空白对照组比较均有统计学意义（P<0.05）。实验组小鼠IFN-γ浓度均值为364.51pg/ml，较空质粒对照组（49.55pg/ml）、PBS对照组（46.24pg/ml）、空白对照组（47.52pg/ml）比较有统计学差异（P<0.05）；实验组小鼠IL-2浓度均值为151.54pg/ml，较空质粒对照组（49.40pg/ml）、PBS对照组（43.34pg/ml）、空白对照组（43.23pg/ml）比较有统计学差异（P<0.05）；实验组小鼠IL-4浓度均值为131.45pg/ml，较空质粒对照组（50.28pg/ml）、PBS对照组（53.17pg/ml）、空白对照组（49.14pg/ml）比较有统计学差异（P<0.05）；实验组小鼠IL-10浓度均值为159.82pg/ml较空质粒对照组（56.58pg/ml）、PBS对照组（52.18pg/ml）、空白对照组（49.29pg/ml）比较有统计学差异（P<0.05）。结果显示，实验组IgG抗体水平和细胞因子水平明显升高，与空质粒对照组、PBS对照组和空白对照组比较有统计学差异（P<0.05）。后经抗感染免疫攻击实验发现实验组、空质粒组、PBS组和空白对照组小鼠平均存活时间为236.3h、97.8h、96.3h、96.2h，实验组与叁对照组比较，实验组小鼠存活时间明显延长（P<0.05）。说明用pcDNA3.1(+)-ROP11重组质粒对小鼠进行免疫后能增强小鼠的体液免疫和细胞免疫功能，为进一步研究ROP11核酸疫苗的生物学功能提供了实验基础。(本文来源于《河北北方学院》期刊2014-03-01）
马金柱,王化磊,郑学星,吴红霞,赵永坤[2]（2013）在《西方马脑炎核酸疫苗表达载体构建及免疫原性研究》一文中研究指出为构建西方马脑炎病毒(western equine encephalomyelitis virus,WEEV)结构基因C-E3-E2-6k-E1重组真核表达载体,并研究其作为核酸疫苗的免疫原性。采用PCR方法扩增目的基因,酶切之后连接到pcDNA3.1上构建真核表达载体pcDNA3.1-C-E,用酶切和测序分析方法鉴定正确后,重组质粒被转染到293T细胞,经电镜检测和间接免疫荧光方法证明基因可以表达后,用该重组质粒免疫小鼠,免疫后检测实验组小鼠外周血中CD4+T细胞/CD8+T细胞比例和血清中细胞因子IL-2、IL-4及IFN-γ浓度,以上实验组各项免疫指标与对照组相比差异均显着(P<0.05);ELISA方法检测实验组小鼠血清中WEEV的IgG抗体效价是1∶16。研究结果表明重组质粒pcDNA3.1-C-E可在细胞中获得瞬时表达,并且重组质粒作为核酸疫苗能够刺激小鼠产生免疫反应,具有较强免疫原性,为今后WEEV核酸疫苗研制奠定了良好基础。(本文来源于《激光生物学报》期刊2013年03期）
刘斌[3]（2008）在《猪囊尾蚴TSOL18核酸疫苗表达载体构建、免疫原性及安全性研究》一文中研究指出囊虫病(Cysticercosis)是由猪带绦虫(Taenia solium)的幼虫猪囊尾蚴寄生于人或猪等中间宿主而引起的人畜共患寄生虫病,在中国大部分地区广泛流行,严重威胁着当地居民的身体健康,是一个重要的公共卫生问题。不仅如此,该病也是制约养猪业发展的重要因素,还给畜牧业生产造成重大经济损失,囊虫病的广泛存在还造成畜牧业的重大经济损失,极大影响了我国畜产品在国际市场上的竞争力,因而是公认的社会经济病之一。1.本实验将猪带绦虫六钩蚴阶段TSOL18基因定向克隆于真核表达质粒pVAX1,经筛选、鉴定及DNA序列分析正确后,将重组质粒pVAX1/TSOL18转染BHK-21细胞,通过SDS-PAGE、Western blotting、荧光抗体染色,检测细胞中表达的TSOL18抗原。结果表明,重组真核质粒pVAX1/TSOL18可在BHK-21细胞中表达,表达的TSOL18目的蛋白能被猪囊尾蚴病阳性血清所识别。动物免疫试验表明,真核表达载体能有效地诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答,这为猪囊尾蚴病核酸疫苗的研究奠定了良好的基础。2.探讨pVAX1/TSOL18重组表达质粒作为DNA疫苗在小鼠体内的组织分布和生物安全性。将pVAX1/TSOL18重组质粒经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,免疫后不同时间剖杀小鼠,分别采集各种组织样品,抽提gDNA,利用PCR技术分析pVAX1/TSOL18在组织内的分布及残留时间;同时,以PCR技术检测免疫动物粪便,分析pVAX1/TSOL18重组表达质粒在外界环境中的释放情况。结果显示,免疫pVAX1/TSOL18重组表达质粒1d和5d后,在小鼠组织gDNA均扩增出目的片段,但不同个体的小鼠,扩增出的目的片段的组织也不完全相同,但在血液中均扩增出了目的片段,第5d较第1d扩增出的目的片段明显变暗;免疫后15d,仅在一只小鼠的血液中检测到TSOL18基因;免疫后30d在所有动物组织中均未检测到重组表达质粒;同时,免疫1d、5d小鼠的粪便中均未检测到TSOL18基因。pVAX1/TSOL18重组表达质粒作为疫苗对动物和环境是安全的。(本文来源于《甘肃农业大学》期刊2008-06-01）
张亚丽[4]（2008）在《小鼠LIGHT真核表达载体的构建及其与乙肝核酸疫苗的联合免疫研究》一文中研究指出感染HBV能导致急性、慢性肝炎,与肝硬化及肝细胞癌有密切关系。目前,控制HBV感染的有效方法是接种乙肝疫苗。基因疫苗的兴起和发展为乙型肝炎病毒感染的防治提供了新的途径。基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫反应,特别是诱导细胞免疫反应的能力优于蛋白、多肽类疫苗,在乙型肝炎病毒的清除方面具有较好的应用前景,更适应于慢性病毒感染的预防与治疗。核酸疫苗的免疫效果在不同动物个体中差异较大,某些肿瘤及病毒的T、B细胞表位抗原性弱,难以诱导有效的T、B细胞免疫应答,提高核酸疫苗的免疫效果已成为研究热点。基因佐剂是将编码某些细胞因子及T、B细胞表面共刺激分子等的基因与目的基因克隆于同一载体或不同载体共同免疫动物,其表达的相应蛋白可起到佐剂的作用,从而大大增强T、B细胞的免疫应答水平。LIGHT是TNF配体家族的成员,可以共刺激T细胞增殖。HVEM是LIGHT介导T细胞活化的受体,LIGHT通过与HVEM结合发挥共刺激作用,参与T细胞增殖和细胞因子的产生。越来越多的证据表明LIGHT与其受体的相互作用可作为控制细胞免疫应答的潜在目标。本研究对小鼠LIGHT作为乙肝核酸疫苗的基因佐剂方面进行了初步研究。在克隆小鼠LIGHT基因的基础上,构建其胞外段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达并对其表达条件进行了初步的探索;构建LIGHT全长基因的真核表达质粒并在体外转染细胞,检测结果表明真核表达质粒中的LIGHT基因可在哺乳动物细胞中进行表达;混合淋巴细胞反应中LIGHT转染的树突状细胞可显着增强同种异体T淋巴细胞增殖;将LIGHT真核表达质粒与乙肝核酸疫苗质粒联合免疫Balb/c小鼠,细胞免疫与体液免疫功能检测结果表明LIGHT可以增强小鼠体内的特异性免疫应答,从而发挥免疫佐剂的作用。(本文来源于《华东师范大学》期刊2008-05-01）
张艳,赵大鹏,戚凤春,汪春义,张雪梅[5]（2008）在《甲型流感病毒HA基因核酸疫苗表达载体的构建及表达》一文中研究指出目的构建含有甲型流感病毒HA基因的核酸疫苗表达载体,转染COS-7细胞,并检测目的蛋白的表达。方法将甲型流感病毒New Caledonia/20/99(H1N1)接种鸡胚后,收获尿囊液,提取流感病毒总RNA,RT-PCR法扩增HA基因。经亚克隆后获得质粒pMD-T/HA,酶切鉴定后测序,将其与质粒pVAX1分别双酶切后连接,构建甲型流感病毒表达载体pVAHA。脂质体法转染COS-7细胞,并检测目的蛋白的表达。结果扩增出1700 bp片段,与预期的HA基因大小相符,测序结果与GenBank报道一致,酶切鉴定表明甲型流感病毒表达载体pVAHA构建正确,Western blot检测证明了流感病毒HA蛋白的表达。结论已成功构建了甲型流感病毒HA基因核酸疫苗表达载体pVAHA。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2008年02期）
金洪涛,金宁一,付延军,李臻,李萍[6]（2007）在《自杀性DNA表达载体构建及HIV多表位核酸疫苗设计与表达》一文中研究指出本文基于塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)复制子构建新型核酸疫苗质粒,并对含 HIV-1中国流行株 B 亚型核心蛋白 p24及多表位 MEG 嵌合基因的核酸疫苗进行表达鉴定。(本文来源于《第七届全国病毒学学术研讨会暨第二届武汉现代病毒学国际研讨会论文集》期刊2007-10-01）
付延军,金宁一,金洪涛,李臻,辛苏文[7]（2007）在《DNA表达载体构建及HIV多表位核酸疫苗的设计与表达》一文中研究指出目的利用塞姆利基森林病毒(SFV)复制子构建新型真核表达载体,并对含HIV-1中国流行株B亚型核心蛋白p24及多表位MEG嵌合基因的核酸疫苗进行表达与鉴定。方法将含SFV复制子的元件从pSFV-MCS中切下,连入含CMV启动子及增强子的pIRESneo载体中,构建新型真核表达载体pCS,再将含HIV-1 MEGp24基因插入至pCS载体中,构建重组核酸疫苗pCS-MEGp24。用脂质体法将重组质粒转染入BHK-21细胞,进行表达产物的检测。结果间接免疫荧光检测显示,重组质粒转染的BHK-21细胞能有效表达HIV-1 MEGp24,并与HIV阳性血清反应。结论所构建的核酸疫苗可在BHK-21细胞系内进行表达,且MEGp24基因的表达蛋白具有特异性,为构建新型HIV-1中国流行株核酸疫苗的可行性提供了重要实验依据。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2007年04期）
赵大鹏,吴晓娟,戚凤春,冷梅,张岩[8]（2006）在《核酸疫苗双表达载体的构建及表达》一文中研究指出将微小病毒内部核糖体进入位点(IRES)基因克隆到质粒pVAXI载体多克隆位点,构建出核酸疫苗双表达载体pVI。将绿色荧光蛋白(EGFP)基因和新霉素磷酸转移酶(neor)基因作为报告基因,连接到pVI载体IRES基因的前后两处多克隆位点,构建出表达载体pEIN。通过脂质体介导的方法将该载体转染COS-7细胞,筛选到同时表达绿色荧光蛋白和新霉素磷酸转移酶的表达株,表明成功地构建了核酸疫苗双表达载体,为构建多价核酸疫苗及带有分子佐剂的核酸疫苗打下了基础。(本文来源于《微生物学杂志》期刊2006年05期）
李卫华,赵连叁[9]（2005）在《甲病毒表达载体的特点及在核酸疫苗中应用》一文中研究指出甲病毒属(Alphavirus)在病毒分类学上被归属于披膜病毒科(Togaviridae)。可以在蚊、禽类和哺乳动物的宿主细胞中复制。甲病毒基因组是一条单股正链RNA,其5′端为非结构蛋白编码区(NS1-NS4),可编码病毒自身复制酶,主要与病毒的自身转(本文来源于《华西医学》期刊2005年02期）
胡永轩[10]（2005）在《日本血吸虫组织蛋白酶B表达载体的构建及其核酸疫苗对小鼠保护性免疫的研究》一文中研究指出目的:构建日本血吸虫组织蛋白酶B(Sjcb2)原核表达载体pWR450-1/sjcb2并表达;构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/sjcb2,转染HeLa细胞,并将pcDNA3.1(+)/sjcb2直接肌注BALB/c小鼠,观察其所诱导的体液免疫和细胞免疫应答水平,初步研究该核酸疫苗对BALB/c小鼠诱导的免疫保护性作用,为研制新型抗日本血吸虫感染核酸疫苗提供实验依据。 方法:用PRIMER5.0引物设计软件自行设计引物,PCR法扩增sjcb2基因片段,将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接,经蓝白斑筛选、双酶切分析和PCR鉴定后,亚克隆入pWR450-1原核表达载体及pcDNA3.1(+)真核表达载体中,经抗生素(氨苄青霉素)筛选、双酶切鉴定、PCR鉴定及测序鉴定后,将构建的pWR450-1/Sjcb2重组原核表达载体转化大肠杆菌后经IPTG诱导表达,SDS-PAGE及Western blotting鉴定表达情况。构建的pcDNA3.1(+)/sjcb2重组质粒电穿孔转染HeLa细胞,免疫细胞化学法观察其在真核细胞中的表达情况;将核酸疫苗pcDNA3.1(+)/Sjcb2注射到BALB/c小鼠后腿股四头肌肌肉组织中,每2周免疫一次,共免疫3次。末次免疫后2周,用日本血吸虫尾蚴攻击感染BALR/c小鼠。PCR及免疫组化法分析Sjcb2基因在小鼠体内的稳定性及表达情况;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖反应;ELISA双抗体夹心法测定攻击感染前后小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的水平;琼脂双向扩散试验测定小鼠血清中Sjcb2抗体水平;攻击感染42天后剖杀小鼠,计算小鼠所荷成虫对数及肝脏所荷虫卵数。 结果:成功构建pWR450-1/Sjcb2重组原核表达载体,并在E.coli DH5α中表达出一分子量约为86KDa的重组融合蛋白。 成功构建pcDNA3.1(+)/sjcb2真核表达重组体,电穿孔转染HeLa细胞,免疫细胞化学法表明Sjcb2能在HeLa细胞胞浆中表达。将核酸疫苗pcDNA3.1(+)/Sjcb2(本文来源于《南华大学》期刊2005-05-01）
核酸疫苗表达载体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
为构建西方马脑炎病毒(western equine encephalomyelitis virus,WEEV)结构基因C-E3-E2-6k-E1重组真核表达载体,并研究其作为核酸疫苗的免疫原性。采用PCR方法扩增目的基因,酶切之后连接到pcDNA3.1上构建真核表达载体pcDNA3.1-C-E,用酶切和测序分析方法鉴定正确后,重组质粒被转染到293T细胞,经电镜检测和间接免疫荧光方法证明基因可以表达后,用该重组质粒免疫小鼠,免疫后检测实验组小鼠外周血中CD4+T细胞/CD8+T细胞比例和血清中细胞因子IL-2、IL-4及IFN-γ浓度,以上实验组各项免疫指标与对照组相比差异均显着(P<0.05);ELISA方法检测实验组小鼠血清中WEEV的IgG抗体效价是1∶16。研究结果表明重组质粒pcDNA3.1-C-E可在细胞中获得瞬时表达,并且重组质粒作为核酸疫苗能够刺激小鼠产生免疫反应,具有较强免疫原性,为今后WEEV核酸疫苗研制奠定了良好基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
核酸疫苗表达载体论文参考文献
[1].张晓磊.刚地弓形虫RH株ROP11基因真核表达载体的构建及核酸疫苗免疫保护作用的研究[D].河北北方学院.2014
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[3].刘斌.猪囊尾蚴TSOL18核酸疫苗表达载体构建、免疫原性及安全性研究[D].甘肃农业大学.2008
[4].张亚丽.小鼠LIGHT真核表达载体的构建及其与乙肝核酸疫苗的联合免疫研究[D].华东师范大学.2008
[5].张艳,赵大鹏,戚凤春,汪春义,张雪梅.甲型流感病毒HA基因核酸疫苗表达载体的构建及表达[J].中国生物制品学杂志.2008
[6].金洪涛,金宁一,付延军,李臻,李萍.自杀性DNA表达载体构建及HIV多表位核酸疫苗设计与表达[C].第七届全国病毒学学术研讨会暨第二届武汉现代病毒学国际研讨会论文集.2007
[7].付延军,金宁一,金洪涛,李臻,辛苏文.DNA表达载体构建及HIV多表位核酸疫苗的设计与表达[J].中国生物制品学杂志.2007
[8].赵大鹏,吴晓娟,戚凤春,冷梅,张岩.核酸疫苗双表达载体的构建及表达[J].微生物学杂志.2006
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[10].胡永轩.日本血吸虫组织蛋白酶B表达载体的构建及其核酸疫苗对小鼠保护性免疫的研究[D].南华大学.2005