导读:本文包含了抗体中和试验论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:CVA6,中和试验,中和抗体,酶联免疫斑点法
抗体中和试验论文文献综述
尹志超,朱瑞,徐龙发,刘东晓,叶江辉[1]（2018）在《柯萨奇病毒A组6型抗体中和试验Nt-ELISPOT方法的建立》一文中研究指出目的建立快速、高效的柯萨奇病毒A组6型(CVA6)抗体中和试验Nt-ELISPOT检测法。方法取CVA6单克隆抗体(1D5)用HRP标记,以此为检测抗体,基于酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)建立CVA6抗体中和试验Nt-ELISPOT,通过对不同效价血清以及手足口病疑似患者血清标本的检测,比较该方法与传统抗体中和试验(NtCPE)的一致性。结果以CVA6单克隆抗体1D5为检测抗体,建立了快速检测针对CVA6中和抗体的Nt-ELISPOT检测法;该方法与Nt-CPE法相比,其检测时间显着缩短;运用这两种方法分别对4份不同效价血清样品及70份手足口病疑似患者血清样品进行CVA6抗体检测,其中和试验结果的一致性为100%。结论建立的Nt-ELISPOT方法快速、高效,可用于手足口病CVA6感染检测,为CVA6的疫苗免疫原性评价、血清流行病学调查等提供了技术支持。(本文来源于《中国病原生物学杂志》期刊2018年10期）
翁代慧[2]（2016）在《基于qRT-PCR建立评价Ⅱ型登革病毒抗体中和效应的微量中和试验方法》一文中研究指出登革病毒(Dengue virus,DENV)是热带与亚热带地区发病最多、危害最大的虫媒病毒,DENV感染一般可引起登革热(Dengue fever,DF),严重的还能引起登革出血热(dengue haemorrhagic fever,DHF)、甚至是死亡率极高的登革休克综合征(dengue shock syndrome,DSS)。目前正在研制中的DENV疫苗种类较多,但仅有赛诺菲公司生产的四价疫苗于2015年12月才在墨西哥获得批准。如何准确、高效地测定和评价疫苗刺激产生的抗体的中和效应一直是DENV疫苗研制的难题之一。传统的测定中和抗体效价的方法是中和试验(Neutralization Test,NT),其中空斑减少中和试验(Plaque Reduction Neutralization Test,PRNT)一直被誉为“金标准”,但其操作繁琐、耗时长、通量低。而微量中和试验(Micro-neutralization Test,MN)的基本原理与PRNT相同,优点在于试剂用量少、通量高。目前基于Taq Man探针的实时定量PCR(q RT-PCR)具有高特异性、高敏感性和易于高通量检测等诸多优势,已被广泛用于病毒核酸的定量检测。近年来,多项研究表明基于q RT-PCR建立的MN方法可有效地应用于测定病毒中和抗体效价,譬如在流感病毒、CMV和SV40的中和抗体效价测定方面已经成功建立了q RT-PCR-MN方法。本研究以DENV2为研究对象,首先建立了基于一步法Taq Man探针q RT-PCR检测DENV2 RNA的方法并进行优化,然后在此基础上建立了测定DENV2中和抗体效价的q RT-PCR-MN方法,并进行了一系列条件优化。【研究方法及结果】一、一步法Taq Man探针q RT-PCR检测DENV2 RNA的建立及优化首先培养DENV2的易感细胞C6/36,按MOI=0.1接种细胞进行病毒大量增殖,获得的病毒经浓缩后保存于-80℃备用。然后分别用空斑实验、TCID50检测、免疫荧光实验对DENV2毒力进行测定,病毒滴度分别为2×106 PFU/m L、2.53×105TCID50/m L。针对DENV2保守区域NS5基因,分别设计并合成引物和探针,PCR扩增得到目的片段并制备RNA标准品,经核酸电泳验证均与预期大小一致。将标准品10倍系列稀释作为模板,进行一步法Taq Man探针q RT-PCR,绘制标准曲线,并进一步探索PCR反应体系中引物与探针的最佳配比。结果显示,q RT-PCR方法检测DENV2 RNA的线性范围为1.0×102~108 copies/μl。与空斑实验结果进行比较,1PFU对应大约7500 copies。计算出q RT-PCR方法检测DENV2的灵敏度为0.013PFU,大约是空斑实验的75倍。二、检测DENV2抗体中和效应的q RT-PCR-MN方法的建立在上述实验的基础上,通过q RT-PCR方法测定系列稀释病毒感染BHK-21细胞后上清中的病毒量随时间的动态变化,确定最佳感染剂量为2000 TCID50和最佳检测时间为感染后24小时。然后两倍系列稀释病毒感染BHK-21细胞24小时后,q RT-PCR方法同时检测细胞上清(未提取RNA)和细胞内(提取RNA)的病毒量,结果发现细胞内外病毒量呈正相关,相关系数r=0.998,而且感染细胞上清中病毒量与感染剂量呈正相关,r=0.982。以上结果证明了直接以感染细胞上清作为PCR检测样品的可行性,q RT-PCR方法可以至少辨别两倍病毒感染剂量的变化。在此基础上,建立了测定DENV2中和抗体效价的q RT-PCR-MN方法。以35份血清为研究对象时,分别用PRNT和q RT-PCR-MN方法测定抗体的中和效应,两者相关系数r=0.928;再以抗DENV2的单克隆抗体4G2为研究对象时,结果显示PRNT(IC50)为0.17μg/m L,q RT-PCR-MN(IC50)为0.10μg/m L,两者相关系数r=0.944。以PRNT为对照,分析35份血清的检测结果,q RT-PCR-MN的灵敏度为100%(7/7,95%CI:0.59–1.00),特异性为96.43%(27/28,95%CI:0.82–1.00),Kappa系数为0.915,说明一致性较好。最后,我们在叁台不同品牌实时定量PCR仪上用q RT-PCR-MN方法同时检测10份血清的中和效价,结果无统计学差异,这说明建立的q RT-PCR-MN方法在不同仪器上具有较好的可比性,有利于各实验室之间结果的互认。【结论】本研究成功建立了以q RT-PCR为基础的测定DENV2中和抗体效价的微量中和试验方法。以经典PRNT为参照,该方法灵敏度、特异性、一致性评价均较好。本方法中以上清液直接作为PCR检测样品,简便快捷,而且便于自动化检测。不同仪器之间的检测结果具有较好的可比性,有利于在临床实验室推广。本研究不仅适用于快速有效地检测和评价DENV疫苗刺激产生的中和抗体效价,也适用于DENV爆发流行时的大规模流行病学调查研究。(本文来源于《第四军医大学》期刊2016-05-01）
郑伟[3]（2016）在《探讨应用化学发光试验在检测丙型肝炎病毒抗体中的敏感性和特异性》一文中研究指出目的:探讨应用化学发光试验在检测丙型肝炎病毒抗体中的敏感性和特异性。方法:选取我院在2014年11月至2015年9月间1240例住院患者的血清样本,所有样本均采用化学发光法(CLIA)及酶联免疫吸附法(ELISA)进行检查,对两组方法检测出的阳性样本与可疑样本再采用重组免疫印迹法(RIBA)进行检测确认,观察两种方法检测丙型肝炎病毒(HCV)抗体的敏感性及特异性。结果:CLIA检测HCV抗体的敏感性为100%,特异性为99.93%;ELISA检测为95.34%,99.64%;CLIA法均略高于ELISA法。结论:在丙型肝炎病毒抗体中的检测中采用CLIA法,更为准确、灵敏,能够使漏诊的情况减少,具有较高的临床应有价值。(本文来源于《世界最新医学信息文摘》期刊2016年31期）
秦凤英[4]（2014）在《酶联免疫吸附法与金免疫层析试验在检测梅毒特异性抗体中的应用价值》一文中研究指出目的探讨酶联免疫吸附法(ELISA)与金免疫层析试验(GICA)在检测梅毒特异性抗体中的应用价值。方法分别采用ELISA与GICA检测方法对6250例门诊标本及术前标本进行检测,检测结果以梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)作为"金标准",比较ELISA与GICA法对梅毒特异性抗体的临床诊断价值。结果 GICA法对一期梅毒、叁期梅毒、不明期梅毒的检出率及总检出率低于ELISA法和TPPA法,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。ELISA法与TPPA法各时期TP的检出率及总检出率差异无统计学意义(P>0.05)结论与GICA法相比,ELISA法检测梅毒特异性抗体检出率更高,漏检率更低,可用于临床梅毒感染患者的诊断之中。(本文来源于《临床合理用药杂志》期刊2014年22期）
万春和,傅秋玲,陈珍,傅光华,施少华[5]（2013）在《乳胶凝集试验方法在检测鸭坦布苏病毒抗体中的应用》一文中研究指出以经超速和密度梯度离心浓缩纯化的鸭坦布苏病毒抗原进行方阵滴定,筛选出致敏乳胶的最佳条件,并制备成鸭坦布苏病毒乳胶凝集试验(LAT)用抗原,与特异性的鸭坦布苏病毒阳性血清反应出现肉眼可见的凝集颗粒,进而建立检测鸭坦布苏病毒抗体的乳胶凝集试验方法。经试验测定该致敏的抗原与鸭流感病毒阳性血清、鸭副粘病毒阳性血清、鸭肝炎病毒阳性血清、鸭产蛋综合症病毒阳性血清和鸭呼肠孤病毒阳性血清均不出现凝集现象,表明具有良好的特异性。以建立的LAT方法和间接ELISA同时分别对80份鸭血清进行检测,结果 LAT方法检出阳性58份、阴性22份,而间接ELISA方法检出阳性68份、阴性12份,两者阳性符合率达85.3%。以上结果表明,本方法具有简便、快速、特异等优点,可用于临床样品的快速诊断和血清流行病学调查。(本文来源于《福建农业学报》期刊2013年12期）
刘利东[6]（2012）在《构建登革病毒NS1抗原拓扑图及建立ELISPOT微中和试验快速高通量评价登革病毒抗体中和活性》一文中研究指出登革病毒(dengue virus, DENV)属于黄病毒科(Flavivirade)黄病毒属(Flavivirus),主要的传播途径是通过蚊虫叮咬敏感的脊椎动物宿主。DENV根据血清抗原反应分可为四个血清型,分别为DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4型。各型病毒感染后均可引起的症状主要有登革热(dengue fever, DF)、登革出血热(dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克综合征(dengue shock syndrome, DSS)。登革病毒的传播在早期较为局限,主要在热带和亚热带地区。但随着世界经济的一体化和各国之间的交流增强,登革病毒的传播范围日益扩大,目前在非洲、美洲、东南亚和西大平洋地区一百多个国家和地区均出现过登革病毒的流行。调查数据显示,全世界每年约有0.5-1亿人感染登革病毒,出现登革出血热症状的严重病例达50万人,2-2.5万人死亡,其中大多为儿童,死亡率为5%。因此,登革病毒的感染已成为全球重要的公共卫生问题,如何有效控制感染是解决这一问题的关键。人体在感染登革病毒后,可以无症状,也可只出现类似感冒症状,可自愈,稍重的是出现DF症状,这些病例主要出现在初次感染的患者,儿童患者多需要住院治疗。有相当部分二次感染的患者可以出现严重的病症DHF/DSS。目前还没有一个特异性的治疗方法,患者只能对症治疗,也缺乏有效的疫苗来防止感染。根据目前的研究结果显示,出现DHF和DSS的主要原因是抗体依赖增强(antibody-dependent inhancment, ADE)效应,而其根源是登革病毒存在四个不同的血清型。研究认为,病人感染其中一型病毒后,免疫系统会产生众多对各种血清型病毒有交叉反应的抗体,这些抗体短期内有一定的交叉保护性作用,但并不具有长期保护性作用。相反的,这些与其他血清型病毒有交叉反应性的非中和抗体或者是一些亚中和浓度抗体可能就是引起DHF/DSS的重要原因。这些抗体与病毒颗粒结构蛋白结合后,不能阻止病毒进入细胞,而其Fc部分会与某些细胞(如单核细胞或树突状细胞)膜上的Fc受体结合,这种结合有助于登革热病毒进入细胞,增强细胞对病毒的摄取及病毒在细胞内的复制,导致感染的增强,从而促使登革的严重疾病的发生。对于防止登革疾病传播的疫苗研发中,如果仅对一型病毒进行抗感染保护,会在病人感染异型病毒时,产生的ADE效应将会影响病人的生命。因此,各种类型的疫苗是否是引起ADE效应是登革防疫研究中一个关键点。登革病毒从首次分离至今,已有六十余年,但对其感染后疾病的防治还存在较大困难。其中的最大障碍是对登革病毒感染后的机体免疫机制不明,研究的针对性不能集中。登革病毒的基因组结构是单股正链RNA分子,长约11000nt,编码叁个结构蛋白,分别为衣壳蛋白(C)、膜蛋白(M)和包膜蛋白(E),七个非结构蛋白(non-structure protein, NS),分别为NS1、NS2A、NS2B、 NS3、NS4A、NS4B和NS5。结构蛋白中的E蛋白与病毒感染有关,主要是与靶细胞表面的病毒受体结合,参与病毒与细胞之间的膜融合。在非结构蛋白中,虽然它们并不是成熟病毒颗粒的组成成份,但从目前的研究成果看来,它们在病毒感染与机体的免疫过程中起重要的作用。其中特别受到重视的是NS1蛋白,它是登革病毒中主要的非结构蛋白,通常有叁个形式存在,一为分泌型,可以直接由感染的细胞分泌到胞外,可用于登革病毒早期诊断指标。二为胞内型,主要存在于细胞内生物腔膜上,叁为膜型,存在于感染细胞膜上,它的功能推测可以通过细胞毒作用,直接参与病毒的清除,另外,也可能在病毒RNA的复制中起一定作用,但因为对其的蛋白结构未完成了解,与抗体的结合形式不清楚,所以其真正功能还需进一步研究。在抗原蛋白的结构未完全阐明之前,可以利用各种技术分析预测它们的二级结构,如冷冻电镜、酵母展示、点突变和多肽结合位点分析等。本研究利用合成的NS1重迭多肽与148株NS1单克隆抗体进行结合反应,可以得到单抗的线性结合位点。依据这些单抗的结合位点的特性,如一个单抗与多个位点结合,表明这些位点的物理位置是相近的,从而可以构建出NS1抗原蛋白的拓扑图。同时,我们也用流式细胞术,筛查各抗体与感染后细胞的表达的NS1蛋白抗原的结合类型,了解有哪些抗体是可以与感染细胞膜表面抗原进行结合的,从而可以为解释NS1蛋白在登革病毒感染免疫机制中的作用奠定基础。疫苗是一个有效预防感染性疾病的方式。如前所述,登革病毒存在四个不同的血清型,病人在二次感染异型病毒时,会产生严重的疾病,因此,疫苗的研制除了要有良好的中和保护作用外,还必须验证是否存在ADE效应。从目前的研究来看,无论是单一价的疫苗或多价疫苗,能同时符合这两个要求的疫苗还没有面世。在疫苗的研究中,中和实验是病毒研究中应用相当普遍的技术。传统的方法是蚀斑减少中和实验(plaque reducing neutralization test, PRNT),但这种方法费时费力,对结果的判断较为主观,许多研究者在开发一些可以替代它的方法。包括有基于流式细胞术的方法、基于ELISA技术的方法等。这些方法虽然是可以省时省力,但也存在一些问题,如病毒用量远比PRNT大。另外,在实际应用中,并不是所有的病毒特别是一些临床分离株,重复性较差。新近有研究者结合前期开发主要用于原位检测细胞因子分泌的技术----基于酶联免疫斑点分析(enzyme-linked immunospot-based microneutralization assay, ELISPOT)的微中和实验。本研究将从实际应用出发,建立和评价这一种技术,并应用这一方法检测临床收集的29例1型登革病毒感染患者恢复期血清的中和效价。本研究共分为如下叁个部分：第一部分：分析登革病毒NS1抗体结合位点构建NS1拓扑图登革病毒NS1蛋白在登革病毒感染后免疫机制中的作用越来越受到重视,主要原因是它不是病毒颗粒的组成成份,可以避免引起ADE效应。它有多种表达形式,其中在感染细胞膜表面表达的部分,研究认为可能介导细胞杀伤功能而在病毒清除中起重要作用。研究结果显示,NS1蛋白应有叁个区域,分别为RⅠ、RⅡ和RⅢ,但因其结构尚未解晰,对于它的真正分区功能未能从理论或实验中得到充分的证明。本研究合成DENV-1NS1的重迭多肽(每条多肽与上一多肽重迭5个氨基酸,最后一条重迭8个氨基酸,共35条),检测它们与148株NS1单克隆抗体的结合情况,分析它们的结合位点。检测结果表明,148株抗体中,有82株抗体可以与多肽进行结合,其中有七株抗体具有结合两个区域,具体为1A11A9、2E8A5与RI区的1肽和RⅡ22肽结合,6D14A4与RⅠ区的1肽、14肽和RⅡ区的22肽结合,1F32A1与RI区的1肽和RⅡ区的31肽结合,7E1A4和7E9A2与RI区的5肽和RⅢ区的27肽结合,1B7A1与RⅡ区的22肽和RⅢ区的32肽结合,叁个区域相互之间有密切连接位点。利用以上多肽结合的位点,根据单抗结合位点在物理位置上的相近性,我们构建出NS1抗原蛋白的二级结构模拟图。另外,研究证明WNV的NS1抗体可以通过抗体依赖细胞杀伤功能对感染细胞进行吞噬清除,其基础是此抗体须与N在细胞表面表达NS1进行结合。我们用流式细胞术分析了以上148株抗体与感染病毒后细胞膜表面的NS1蛋白结合情况。结果显示,分别有92株、87株、75株和91株抗体与同型病毒感染后细胞膜表面的NS1蛋白结合。按照单抗与多肽的结合位点结果,针对RⅡ区结合的单抗,有82%(18/22)的抗体可以与DENV1-4任一型或多型病毒感染后细胞膜上抗原结合,而针对结合RI和RⅢ的抗体,分别有60%(29/48)和54%(6/11)的抗体可与膜抗原结合。这一结合模式可能与膜型NS1蛋白在感染细胞膜上嵌合形式有关。我们的研究结果与前期对黄病毒NS1的研究数据基本一致。这些数据可为研究NS1的功能和NS1抗体应用打下坚实基础。第二部分：酶联免疫斑点微中和实验方法检测登革病毒抗体中和活性方法的建立与评价目前中和实验的金标准方法是PRNT方法,这一方法在六孔板中进行,在病毒感染细胞后,需要在7-10天的时间孵育来形成可以用于检测的蚀斑。如果要完成大量的中和实验标本,这一方法将相当耗时而且结果判断主观性强。微中和实验是一个应用较多的高通量检测方法,这些实验是在96孔板中完成。本研究将评价一个新近开发的基于ELISPOT技术的微中和实验方法,并建立用于检测抗体或血清对登革病毒的中和活性的方法学。按照该法的基本原理是病毒感染细胞后,细胞表面可在较短时间内表达NS1蛋白,将细胞固定处理后,利用抗NS1的抗体可以建立ELISA检测方法,最后用固体原位显色方法可以通过斑点的形成指示病毒对细胞的感染情况。选用VERO E6细胞为病毒感染的靶细胞,通过对病毒加入量和登革各型病毒在感染后的孵育时间的条件优化,建立了ELISPOT方法检测登革各型病毒的方法学。方法学建立后,我们对33株抗登革病毒EDIII单克隆抗体针对四个血清型的中和活性检测,然后再从中选择十株单抗进行PRNT检测它们针对各型病毒的中和活性,两种检测方法应用相同病毒株、抗体稀释梯度进行,并对检测结果进行对比分析。结果显示,基于ELISPOT方法可以在96孔板中加入200PFUs病毒的情况下,形成的斑点清晰可辨,登革病毒四个血清型有不同的感染后孵育时间,DENV-1为4天,DENV-2和DENV-4为2天,DENV-3为3天。对比两种方法,它们之间的相关性较好,r=0.863,P<0.001；如果以PRNT方法为标准,我们将其结果与ELISPOT方法结果进行卡方检验(McNemar),结果显示ELISPOT与PRNT结果无显着性差别(P<1.000)。ELISPOT微中和实验检测这10株单抗针对四型登革病毒的中和效价的敏感性和特异性分别为95.6%(22/23)and88.24%(15/17)。如此可见,基于ELISPOT的微中和实验可以应用于四型登革病毒的中和活性实验检测,而且这种方法省时省力,适合进行批量筛查。第叁部分Ⅰ型登革病毒感染患者康复期血清中和效价分析对登革病毒引起的疾病目前还未有特异高效的治疗方法或药物,因目前也没有一个能良好复制登革病毒感染后症状的动物模型,使疫苗的研制存在一定的困难。人体在自然感染登革病毒后,免疫状态的维持可以从一个侧面了解机体的抗病毒机制。本研究收集了29例在2006年感染1登革病毒的患者恢复期血清(2010年获取),利用本实验室建立和评价的ELISPOT微中和实验方法,检测它们针对四型登革病毒的中和效价,并对结果进行对比。结果显示,大部分血清对四型病毒有交叉中和活性,对四型登革病毒的中和效价(IC50,血清稀释度倒数)进行非参数检验(Kruska-Wallis H),结果显示,四组中和活性有显着性差异(X2=21.134,P<0.001),其中对同型(DENV-1)的中和活性最高,对DENV-4的中和活性最低。结果表明,机体在感染一种血清型病毒后,对四型病毒均有可能存在一定的四型交叉中和活性,但对同型病毒的中和活性强,而对其他型病的中和活性较弱。这些弱中和活性的交叉抗体,可能会在机体受二次异型病毒感染时引起ADE效应。小结：综上所述,本研究在以下方面取得成果：1、我们合成DENV-1NS1的重迭多肽35条,与148株NS1单克隆抗体进行结合,分析它们的结合位点,有七株抗体的结合位点在不同的两个区域,根据这些位点的物理位置相近性,成功构建出NS1蛋白抗原结构二级结构模拟图,结果与前期对黄病毒NS1蛋白的研究结果一致。研究结果可以在蛋白结晶之前增加对它基本结构的了解。我们还应用流式分析术,筛查了148株单抗与感染细胞膜型NS1抗原结合情况,得到抗体对各型病毒感染分泌于膜上NS1抗原的结合模式。结果显示,分别有92、87、75和91株抗体与同型病毒感染后细胞膜表面的NS1蛋白结合,针对RⅡ区结合的单抗,有82%的抗体可以与DENV1-4任一型或多型病毒感染后细胞膜上抗原结合(18/22),而针对结合RⅠ和RⅢ的抗体,有60%(29/48)和54%(6/11)的抗体可与膜抗原结合,这些结合模式可能与NS1蛋白在感染细胞膜上的嵌合模式有关。2、建立了基于ELISPOT技术的微中和实验方法检测平台,可以为登革病毒和其他相关病毒提供快速高通量的中和效价测定支撑。同时,我们也对此方法进行评价,对比PRNT方法,方法的特异性和敏感性高,与PRNT有良好的相关性,而且结果判断更加客观,非常适合批量处理的高通量检测实验。3、从29例1型病毒感染叁年后的恢复期病人血清的中和活性检测结果中,获得了它们对同型和异型病毒的中和效价。通过统计分析,对同型病毒的中和活性远强于异型病毒的活性,这可以验证目前的有关初次感染后可以长期存在对同型病毒强的中和保护抗体而对异型病毒有弱中和抗体的理论。(本文来源于《南方医科大学》期刊2012-04-11）
吴敏[7]（2012）在《肾综合征出血热病毒荧光抗体中和试验的建立及应用》一文中研究指出目的：本研究旨在建立一种检测人血清中肾综合征出血热病毒血清中和抗体的实验室方法，即荧光抗体病毒中和试验(FluorescentAntibody Virus Neutralization, FAVN)，并将该方法应用于河北省健康人群血清中肾综合征出血热(Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome,HFRS)病毒中和抗体的检测及HFRS双价灭活疫苗免疫水平评价，以了解河北省健康人群血清中HFRS病毒中和抗体的水平及HFRS双价灭活疫苗应用后的免疫效果，进而指导HFRS的预防控制。方法：1细胞培养：使用Vero-E6细胞，按1:3分传，使其长成单层，然后取已长成单层的Vero-E6细胞，胰酶-EDTA溶液充分消化后，以配好的细胞生长液悬浮，加100μl至96孔细胞培养板的各孔内，放置于37℃，5%CO_2细胞培养箱内培养，直至细胞长成单层。2病毒液的稀释：先测定实验用病毒株的TCID50，然后将病毒液稀释至100TCID50/100μl备用。3血清标本的稀释：将实验室保存的HFRS双价灭活疫苗接种前后的血清标本作为待检血清，将待检血清（允许检测前以一定比例稀释）做2倍稀释直至1:64。4中和过程：将稀释好的血清标本与等量病毒液混合，并将混合液置于37℃，5%CO_2细胞培养箱内孵育1h。5将混合液接种细胞：取Vero-E6细胞已生长成单层的96孔细胞培养板，倒掉原有的细胞生长液，于对照及各检测孔内加入100μl的血清病毒混合液，置于37℃，5%CO_2细胞培养箱内培养。6荧光单克隆抗体染色及显微镜下观察：用80%的丙酮固定后，加入稀释至工作浓度的荧光标记抗HV单克隆抗体，吹干后在显微镜下对感染细胞进行观察并记录结果。7检测FAVN法的敏感性、特异性及稳定性：分别采用FAVN法和空斑减少中和试验(Plaque Reduction Neutralization Tests，PRNT)法检测60份HFRS双价灭活疫苗免疫前后人血清(其中免疫前血清30份，免疫后血清30份)的中和抗体，通过比较两种方法所得结果对FAVN法的敏感性、特异性及稳定性进行检测。8FAVN法的应用：根据河北省HFRS的疫情情况，选择3个HFRS高发县为疫苗接种点，在每个接种点选择16～60岁既往无HFRS患病史的健康人群，分4个年龄组，进行分层随机抽样，每组抽取20人，共抽取观察对象240人。采集观察对象疫苗接种前后的血清标本，使用FAVN法检测血清标本中HFRS病毒中和抗体。结果：1接种病毒的细胞浓度的选择，通过使用不同的细胞浓度进行试验，只有当细胞浓度为4×104～4.5×10~4／孔时，在显微镜下观察才能看到分布均匀整齐的细胞，并且各细胞之间的界线清晰，所以只有这一区间浓度的细胞在用荧光抗体染色后才可在显微镜下观测到具有代表性的特异性荧光颗粒。本实验使用这一区间浓度的细胞来接种病毒。2血清病毒混合液中和作用时的环境条件比较，把血清病毒混合液放在37℃，5%CO_2细胞培养箱内中和1小时与在4℃冰箱内中和过夜相比较，结果发现在4℃冰箱内中和过夜的混合液接种细胞后形成的荧光颗粒多于37℃条件下中和的混合液。因此本实验血清病毒液中和作用在37℃，5%CO_2细胞培养箱内进行。3FAVN法的敏感性较好。分别采用FAVN法及PRNT法对60份HFRS双价灭活疫苗免疫前后人血清(其中免疫前血清30份，免疫后血清30份)的中和抗体进行检测，疫苗免疫后的血清用FAVN法测定的中和抗体阳性率为83.33%，用PRNT法测得的中和抗体阳性率为60%，二者存在显着性的差异(χ2=4.02，P<0.05)，表明FAVN法与PRNT法相比敏感性较好。4FAVN法的特异性和稳定性较好。用FAVN法对30份HFRS双价灭活疫苗免疫前的人血清的中和抗体进行检测，结果全部都是阴性，和PRNT法检测结果相同，表明FAVN法具有较好的特异性。不同时间内重复使用FAVN法对25份已检测为阳性的血清标本进行3次检测，经方差分析，3次的检测结果差异没有统计学意义(F=3.08，P>0.05)，表明FAVN法较稳定。5FAVN法检测对240名观察对象HFRS双价灭活疫苗免疫前和免疫后血清的中和抗体，疫苗免疫前的240份血清中有7份血清为中和抗体阳性，滴度在10～20之间，疫苗免疫前人群血清中的中和抗体阳性率(隐性感染率)为2.92%，中和抗体阳性的7人中，有6人为农民；疫苗免疫后的血清中和抗体明显升高，在免疫后的240份血清中，有169份中和抗体为阳性，中和抗体阳性率为70.42%，经卡方检验，免疫前后中和抗体阳性率差异有统计学意义(χ~2=2.35，P<0.05)。从年龄构成看，免疫后中和抗体阳性的对象中有104人年龄在26～45岁这一年龄段中，占中和抗体阳性总数的61.53%，提示中青年人接种疫苗后免疫效果可能更好些。结论：1建立了用于检测人血清中HFRS病毒中和抗体的荧光抗体病毒中和试验（FAVN）方法。2FAVN法的敏感性高于PRNT法，并且具有较好的特异性和稳定性。3河北省健康人群HFRS保护性抗体阳性率很低，人群对HFRS普遍易感。4HFRS双价灭活疫苗具有较好的免疫效果，人群接种后中和抗体阳性率在70%以上。(本文来源于《河北医科大学》期刊2012-03-01）
何庆雄,程安春,汪铭书[8]（2010）在《间接酶联免疫吸附检测鸭肝炎抗体试验方法的建立及其在检测血清和卵黄抗体中的应用》一文中研究指出本试验以氯仿去脂、超速离心结合蔗糖密度梯度离心纯化的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)作为包被抗原,建立了检测鸭肝炎抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。该ELISA的特异性、敏感性及重复性较好,能用于检测鸭肝炎抗体。用DHV-Ⅰ弱毒活疫苗经皮下免疫第一组产蛋种鸭,第二组种鸭注射生理盐水作为阴性对照组。在免疫后第3、5、7、14、21、28、35、42、49、56天采血分离血清和收集种蛋提取卵黄抗体,用建立的间接ELISA法检测血清和卵黄抗体中的鸭肝炎抗体效价。第叁组种鸭间隔14天共免疫2次,在首免后每个月都收集血清检测抗体效价,持续检测6个月。试验结果表明:第一组种鸭免疫后3天时就可用ELISA检测到血清和卵黄中的鸭肝炎抗体,抗体效价分别在21、28天达到最高峰,随后稍有下降,但56天时两者仍呈阳性;阴性对照全为阴性;第叁组种鸭的血清抗体比第一组的明显高得多且在6个月内都保持在较高水平。(本文来源于《第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛论文集（下册）》期刊2010-08-01）
汤素文,沈洁,瞿伟萍,胡家瑜,施燕[9]（2007）在《定量酶联免疫吸附试验在检测风疹IgG抗体中的应用》一文中研究指出1995—2005年,上海市每年报告风疹病例100例左右,发病率控制在1/10万以下。上海市最近一次大流行在1993年,全市共报告病例58 104例,报告发病率达451.57/10万。实验室风疹检测是风疹监测工作的重要组成部分,疑似病例的最后实验室确诊对(本文来源于《上海预防医学杂志》期刊2007年10期）
孙振云,金珊[10]（2007）在《正向间接血凝试验在检测口蹄疫抗体中的应用》一文中研究指出正向间接血凝试验是用已知血凝抗原检测未知血清中抗体的试验。抗原与其对应的抗体相遇,在一定条件下形成抗原抗体复合物,但这种复合物的分子团很小,肉眼看不见。将抗原吸附在经过特殊处理的红细胞表面,只需少量抗原就能大大提高抗原和抗体的反应灵敏性,这种经过口蹄疫纯化抗原致敏的红细胞与口蹄疫抗体相遇,红细胞便出现清晰可见的凝集现象。(本文来源于《畜牧与饲料科学》期刊2007年02期）
抗体中和试验论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
登革病毒(Dengue virus,DENV)是热带与亚热带地区发病最多、危害最大的虫媒病毒,DENV感染一般可引起登革热(Dengue fever,DF),严重的还能引起登革出血热(dengue haemorrhagic fever,DHF)、甚至是死亡率极高的登革休克综合征(dengue shock syndrome,DSS)。目前正在研制中的DENV疫苗种类较多,但仅有赛诺菲公司生产的四价疫苗于2015年12月才在墨西哥获得批准。如何准确、高效地测定和评价疫苗刺激产生的抗体的中和效应一直是DENV疫苗研制的难题之一。传统的测定中和抗体效价的方法是中和试验(Neutralization Test,NT),其中空斑减少中和试验(Plaque Reduction Neutralization Test,PRNT)一直被誉为“金标准”,但其操作繁琐、耗时长、通量低。而微量中和试验(Micro-neutralization Test,MN)的基本原理与PRNT相同,优点在于试剂用量少、通量高。目前基于Taq Man探针的实时定量PCR(q RT-PCR)具有高特异性、高敏感性和易于高通量检测等诸多优势,已被广泛用于病毒核酸的定量检测。近年来,多项研究表明基于q RT-PCR建立的MN方法可有效地应用于测定病毒中和抗体效价,譬如在流感病毒、CMV和SV40的中和抗体效价测定方面已经成功建立了q RT-PCR-MN方法。本研究以DENV2为研究对象,首先建立了基于一步法Taq Man探针q RT-PCR检测DENV2 RNA的方法并进行优化,然后在此基础上建立了测定DENV2中和抗体效价的q RT-PCR-MN方法,并进行了一系列条件优化。【研究方法及结果】一、一步法Taq Man探针q RT-PCR检测DENV2 RNA的建立及优化首先培养DENV2的易感细胞C6/36,按MOI=0.1接种细胞进行病毒大量增殖,获得的病毒经浓缩后保存于-80℃备用。然后分别用空斑实验、TCID50检测、免疫荧光实验对DENV2毒力进行测定,病毒滴度分别为2×106 PFU/m L、2.53×105TCID50/m L。针对DENV2保守区域NS5基因,分别设计并合成引物和探针,PCR扩增得到目的片段并制备RNA标准品,经核酸电泳验证均与预期大小一致。将标准品10倍系列稀释作为模板,进行一步法Taq Man探针q RT-PCR,绘制标准曲线,并进一步探索PCR反应体系中引物与探针的最佳配比。结果显示,q RT-PCR方法检测DENV2 RNA的线性范围为1.0×102~108 copies/μl。与空斑实验结果进行比较,1PFU对应大约7500 copies。计算出q RT-PCR方法检测DENV2的灵敏度为0.013PFU,大约是空斑实验的75倍。二、检测DENV2抗体中和效应的q RT-PCR-MN方法的建立在上述实验的基础上,通过q RT-PCR方法测定系列稀释病毒感染BHK-21细胞后上清中的病毒量随时间的动态变化,确定最佳感染剂量为2000 TCID50和最佳检测时间为感染后24小时。然后两倍系列稀释病毒感染BHK-21细胞24小时后,q RT-PCR方法同时检测细胞上清(未提取RNA)和细胞内(提取RNA)的病毒量,结果发现细胞内外病毒量呈正相关,相关系数r=0.998,而且感染细胞上清中病毒量与感染剂量呈正相关,r=0.982。以上结果证明了直接以感染细胞上清作为PCR检测样品的可行性,q RT-PCR方法可以至少辨别两倍病毒感染剂量的变化。在此基础上,建立了测定DENV2中和抗体效价的q RT-PCR-MN方法。以35份血清为研究对象时,分别用PRNT和q RT-PCR-MN方法测定抗体的中和效应,两者相关系数r=0.928;再以抗DENV2的单克隆抗体4G2为研究对象时,结果显示PRNT(IC50)为0.17μg/m L,q RT-PCR-MN(IC50)为0.10μg/m L,两者相关系数r=0.944。以PRNT为对照,分析35份血清的检测结果,q RT-PCR-MN的灵敏度为100%(7/7,95%CI:0.59–1.00),特异性为96.43%(27/28,95%CI:0.82–1.00),Kappa系数为0.915,说明一致性较好。最后,我们在叁台不同品牌实时定量PCR仪上用q RT-PCR-MN方法同时检测10份血清的中和效价,结果无统计学差异,这说明建立的q RT-PCR-MN方法在不同仪器上具有较好的可比性,有利于各实验室之间结果的互认。【结论】本研究成功建立了以q RT-PCR为基础的测定DENV2中和抗体效价的微量中和试验方法。以经典PRNT为参照,该方法灵敏度、特异性、一致性评价均较好。本方法中以上清液直接作为PCR检测样品,简便快捷,而且便于自动化检测。不同仪器之间的检测结果具有较好的可比性,有利于在临床实验室推广。本研究不仅适用于快速有效地检测和评价DENV疫苗刺激产生的中和抗体效价,也适用于DENV爆发流行时的大规模流行病学调查研究。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
抗体中和试验论文参考文献
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