导读:本文包含了蛋白纯化与结晶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:Harpin_(Xooc),纯化,结晶,二级结构
蛋白纯化与结晶论文文献综述
朱青青[1]（2014）在《Harpin_(Xooc)蛋白纯化结晶条件及二级结构的研究》一文中研究指出Harpinxooc蛋白来源于植物病原细菌X.oryzae pv. oryzicola,与其他Harping(?)同,它也是不亲和病原细菌在烟草等植物上诱导HR或者HCD的效应分子。同时,Harpinxooc编码基因hrf2位于hrp基因簇中,受hrp基因的调控。目前研究表明,由于Harpin蛋白能够作为蛋白激发子与非寄主植物进行互作,激活多条信号通路,诱导多种抗性机制,因此,外施Harpin可以诱导植物抗虫,抗病,抗旱,还可以促进植物生长。但是,目前Harpin蛋白的受体尚未得到克隆,Harpin蛋白与植物如何互作也不清楚。X射线晶体衍射分析法是蛋白进行结构和功能研究的主要方法之一。而X射线晶体衍射分析法的前提是获得高质量的蛋白晶体。本研究通过对Harpinxooc蛋白纯化结晶条件的研究,为克隆鉴定Haprin蛋白受体提供了理论基础。本研究为了制备合适的Harpinxooc蛋白结晶样品,将pET-30a-hrf2转入BL21大肠杆菌,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE结果表明其表达产物是分子量为21 kDa左右的融合蛋白质。菌液离心后取上清破碎,超速离心去除细胞膜等杂质,然后将含有蛋白的上清液与镍柱结合并用不同浓度的咪唑进行洗脱,洗脱液浓缩后使用凝胶过滤层析进行纯化,最后使用肠激酶进行酶切,然后通过镍柱去除组氨酸标签,最终获得高纯度并符合结晶要求的蛋白。经过换算,每升pET-30a-hrf2发酵液经纯化后,可提纯得到Harpinxooc蛋白约8 mg。此外,本研究通过对小鼠进行叁次免疫获得了高效价的Harpinxooc多克隆抗体,为Harpin蛋白与非寄主植物互作时受体的定位及鉴定和外源表达Harpin蛋白转基因作物的检测提供了基础。为了解析Harpinxooc蛋白的二级结构,本研究对Harpinxooc蛋白以及其功能域片段Harpinxooc(i-94)进行远紫外光谱分析。Harpinxooc(i-94)是由Harpinxooc蛋白的1-94号氨基酸构成,远紫外光谱分析结果显示Harpinxooc蛋白主要以α-螺旋结构为主,各结构比例为：α-螺旋45%,β-折迭2.3%,β-转角9.49%,无规则卷曲42.1%。同时远紫外光谱分析结果表明Harpinxooc(i-94)蛋白也主要以α-螺旋结构为主,各结构比例为：α-螺旋40.7%,β-折迭7.4%,β-转角13.8%,无规则卷曲36.8%。同时,本研究还使用了SOPMA软件对二级结构进行了对比,两个结果基本一致。此外,温度的回复实验显示两个蛋白在温度升高的条件下,结构均有所变化,但是温度下降又基本可恢复到之前的结构,两个蛋白都有比较好的热稳定性,但是Harpinxooc(i-94)的更好,在40℃之前结构基本没有变化,因此Harpinxooc(i-94)可能更有利结晶。本研究通过检测Harpinxooc蛋白在不同温度以及不同pH条件下的稳定性,初步筛选了Harpinxooc蛋白的结晶条件,然后使用坐滴法(sitting drop),利用Hampton公司的七种试剂盒在不同温度(4℃,22℃)不同浓度下(1-10 mg/mL)进行了结晶。在试剂盒Crystal Screen HT和MembFac HT (Hampton),蛋白浓度为4 mg/mL,温度22℃这样的条件下本研究获得了Harpinxooc的微晶体,为后期获得能够进行X射线衍射分析的高质量晶体奠定了基础。(本文来源于《南京农业大学》期刊2014-06-01）
王松泰[2]（2008）在《福氏志贺氏菌耐药相关基因的克隆、表达及蛋白纯化与结晶的初步研究》一文中研究指出在细菌耐药研究中有关细菌主动外排泵的研究是相对活跃的领域。外排泵是微生物对药物和其他外来物质产生耐药性的一个重要机制,其中acrAB-tolC是一种常见的外输泵,是由药物外输蛋白AcrA、AcrB和调节蛋白MarA调控作用来完成的。本研究对福氏志贺菌多药耐药相关基因marA、acrA和acrB的克隆、蛋白表达、纯化及结晶进行研究。根据已有数据,设计marA、acrA和acrB基因引物,提取基因组DNA并通过PCR扩增目的基因,构建克隆载体后,分别将目的基因片段通过BamHⅠ和SalⅠ酶切位点插入表达载体pET-30a。经酶切鉴定及序列测定表明,目的基因片段连接正确,按正确的读码框插入表达载体中,其核苷酸序列与报道的marA和acrA基因的同源性为100%,acrB基因同源性为99.7%。重组表达质粒转化BL21(DE3)pLys, 37℃诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测表明,marA和acrA基因成功地在大肠埃希氏菌中得到了表达,表达蛋白的大小分别约为21kDa和45kDa。通过可溶性分析得知acrA为可溶性表达蛋白,marA以包涵体形式表达。利用高浓度尿素裂解包涵体,采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对marA蛋白进行复性。用金属鳌合亲合层析的方法对表达的marA和acrA蛋白进行纯化和浓缩纯化蛋白,测定表达蛋白的浓度为5 mg/mL,试验获得了能够结晶的高浓度蛋白。采用悬吊液滴蒸汽扩散法,对蛋白结晶条件进行筛选。观察发现,在多种结晶条件下出现了晶体,分别观察到八面体、菱形、针状等多种规则形态。本研究为福氏志贺菌耐药基因蛋白的高级结构,MarA,AcrA和AcrB的结合方式及探索MarA,AcrA和AcrB蛋白的其他功能奠定基础,同时为进一步研究福氏志贺菌耐药基因的作用机制提供依据。(本文来源于《甘肃农业大学》期刊2008-06-01）
周晓娜[3]（2007）在《细胞质内病毒RNA受体RIG-I的表达、蛋白纯化及结晶》一文中研究指出在真核生物体内,除了定位于内吞体膜上的TOLL样受体能够识别入侵机体的病毒RNA,启动机体抗病毒的固有免疫反应外,近年来发现了另一种能够识别病毒RNA的细胞质内受体——RIG-Ⅰ。RIG-Ⅰ能够识别病毒RNA组分,并通过自身的CARD结构域和下游信号分子MAVS的CARD结构域的直接相互作用来传递信号。激活转录因子IRF-3和NF-κB,使其进入细胞核内,诱导干扰素的表达,从而启动固有免疫反应和调节随后的获得性免疫反应,增强机体抵抗病毒的能力。RIG-Ⅰ包含有N端的相串联的两个CARD结构域和C端的一个RNA解旋酶结构域。当没有病毒入侵时,RIG-ⅠC末端的解旋酶结构域能够抑制N端CARD结构域的信号传递功能,这一抑制作用可通过RIG-Ⅰ识别入侵病毒的RNA组分而去除。我们认为这一过程是通过RIG-Ⅰ识别入侵病毒的RNA引起自身构象的改变,暴露N端的CARD结构域,来启动信号传递的,但是至今仍没有结构方面的证据来支持这一立论。我们纯化除了大量的适合结晶的RIG-Ⅰ蛋白,并通过共表达的方法证明了RIG-Ⅰ的N端和C端有相互作用,这就对RIG-Ⅰ的分子内部抑制机制提供了生化证据。通过凝胶迁移滞后实验证明RIG-Ⅰ确实可以和化学合成的5'端不含有磷酸基团的双链RNA、体外转录来的5'端含有叁磷酸基团的单链或双链直接相互作用。使用elutrap和透析的方法,我们最终获得了不同的RIG-Ⅰ/RNA的复合物。与RIG-Ⅰ单蛋白一样,利用悬吊液滴蒸汽扩散法进行蛋白质结晶后,并没有得到可以进行X-Ray衍射分析的晶体。(本文来源于《中国协和医科大学》期刊2007-06-01）
程伟[4]（2005）在《PNAi相关基因RDE-4表达、蛋白纯化及结晶》一文中研究指出根据已报道的RDE-4基因序列,设计一对引物,从含C.elegance的cDNA文库中,通过PCR扩增得到大小为1158nt的RDE-4基因,并把它重组到细菌表达载体pET-21b(+)中,该载体C-端具有6个组氨酸标记多肽。酶切鉴定及序列测定表明,重组表达质粒pET-21b-RDE-4连接区域符合设计要求,具有正确的开放阅读框架,插入片段含有385个氨基酸的完整编码区,其核苷酸序列与报道的RDE-4基因的同源性为100%。重组表达载体导入宿主菌E.coli BL21(DE3),用终浓度为3mmol/L IPTG诱导,37℃培养6小时后,RDE-4基因的表达量达到最高,每毫升菌液含目的蛋白的量约为2mg。通过大量培养,利用亲和纯化和FPLC纯化技术将RDE-4基因蛋白纯化、浓缩,并用PEG等条件养晶,进行条件筛选。全长基因蛋白晶形不好,进而用胰蛋白酶对RDE-4基因蛋白限制性酶切,通过NI-ATK亲和柱层析,判断目的蛋白的稳定结构域在N-端。根据以上分析结果,重新设计N-端引物,亚克隆RDE-4(1-280Aa,315Aa)基因片段,并将它们插入GEX-6P-1原核载体,该载体N-端带有GST融合标签,构建pGEX-6P-1-RDE-4(1-280Aa,315Aa)表达载体。重组表达载体导入E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导高效表达。通过GST-column亲和层析,纯化RDE-4(1-280Aa)基因片段蛋白,并用PPase在柱上对其进行限制性酶切,一般过夜后洗脱、10KD孔径的超滤管浓缩至1mL,注射器被动注入FPLC上样孔,通过凝胶分子筛进一步纯化,获得高浓度和纯度蛋白,浓度为50mg/mL。用悬吊液滴蒸汽扩散法和40%PEG-600,0.1MCHES,pH6.0[Cryoll screen kit,Enedd Biostructure]加入stock Options~(TM) pH screen(Hampton Research)蛋白质养晶条进行养晶,一星期,晶体成规则八面体,通过X-Ray衍射,收到晶体电子密度图及相关数据。本论文研究为进一步研究RNAi的作用机制奠定基础,为研究在此过程中相关蛋白之间的相互作用提供结构依据。(本文来源于《华南热带农业大学》期刊2005-05-01）
蛋白纯化与结晶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
在细菌耐药研究中有关细菌主动外排泵的研究是相对活跃的领域。外排泵是微生物对药物和其他外来物质产生耐药性的一个重要机制,其中acrAB-tolC是一种常见的外输泵,是由药物外输蛋白AcrA、AcrB和调节蛋白MarA调控作用来完成的。本研究对福氏志贺菌多药耐药相关基因marA、acrA和acrB的克隆、蛋白表达、纯化及结晶进行研究。根据已有数据,设计marA、acrA和acrB基因引物,提取基因组DNA并通过PCR扩增目的基因,构建克隆载体后,分别将目的基因片段通过BamHⅠ和SalⅠ酶切位点插入表达载体pET-30a。经酶切鉴定及序列测定表明,目的基因片段连接正确,按正确的读码框插入表达载体中,其核苷酸序列与报道的marA和acrA基因的同源性为100%,acrB基因同源性为99.7%。重组表达质粒转化BL21(DE3)pLys, 37℃诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测表明,marA和acrA基因成功地在大肠埃希氏菌中得到了表达,表达蛋白的大小分别约为21kDa和45kDa。通过可溶性分析得知acrA为可溶性表达蛋白,marA以包涵体形式表达。利用高浓度尿素裂解包涵体,采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对marA蛋白进行复性。用金属鳌合亲合层析的方法对表达的marA和acrA蛋白进行纯化和浓缩纯化蛋白,测定表达蛋白的浓度为5 mg/mL,试验获得了能够结晶的高浓度蛋白。采用悬吊液滴蒸汽扩散法,对蛋白结晶条件进行筛选。观察发现,在多种结晶条件下出现了晶体,分别观察到八面体、菱形、针状等多种规则形态。本研究为福氏志贺菌耐药基因蛋白的高级结构,MarA,AcrA和AcrB的结合方式及探索MarA,AcrA和AcrB蛋白的其他功能奠定基础,同时为进一步研究福氏志贺菌耐药基因的作用机制提供依据。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
蛋白纯化与结晶论文参考文献
[1].朱青青.Harpin_(Xooc)蛋白纯化结晶条件及二级结构的研究[D].南京农业大学.2014
[2].王松泰.福氏志贺氏菌耐药相关基因的克隆、表达及蛋白纯化与结晶的初步研究[D].甘肃农业大学.2008
[3].周晓娜.细胞质内病毒RNA受体RIG-I的表达、蛋白纯化及结晶[D].中国协和医科大学.2007
[4].程伟.PNAi相关基因RDE-4表达、蛋白纯化及结晶[D].华南热带农业大学.2005
标签：Harpin_(Xooc); 纯化; 结晶; 二级结构;