本文主要研究内容
作者王雪（2019）在《拟南芥甘露糖结合凝集素基因At3g21380启动子功能初析》一文中研究指出：高等植物的生长发育是基因选择性表达的结果,而基因的表达受到启动子的调控。启动子如同“开关”一样,决定了基因的活动。一旦启动子活性出现异常,通常会导致基因表达的调节障碍,进而可能导致植物生长发育异常。目前的研究尽管获得了许多具备组织特异性或诱导活性的植物启动子,但是真正适于某个特定遗传改良目的的启动子数量并不多或活性不高。因此植物基因组中潜在的启动子还有待分析和鉴定。Tair网站(http://www.arabidopsis.org/)上提供的基因注释信息显示拟南芥At3g21380基因是甘露糖结合凝集素(Mannose-binding lectin superfamily protein,MBL)的编码基因。在本研究中,我们将At3g21380基因暂命名为AtMBL1基因。利用在线网站对该基因的基因表达数据进行分析,发现AtMBL1基因是一个种子特异性表达基因,因此推测AtMBL1启动子是种子特异性表达启动子。首先克隆了AtMBL1启动子,然后将其酶切,连接至植物表达载体上。通过农杆菌介导的浸花法将植物表达载体侵染转化野生型拟南芥。待种子成熟后收获种子,然后将收获的种子撒在含有潮霉素的筛选培养基上进行逐代筛选,最终获得不再发生性状分离的T3代纯合株系。利用GUS组织化学染色法对AtMBL1启动子的组织表达模式进行分析。研究结果证实AtMBL1启动子能够驱动外源基因在种子部位特异性的表达。然后基于AtMBL1启动子的全长序列的分析,设计了一系列5’端缺失启动子的引物,克隆了三个缺失片段。接下来成功构建了三个缺失片段的植物表达载体,并侵染转化野生型拟南芥然后筛选至转基因纯合株系。GUS组织化学染色分析表明,所有缺失片段均能驱动GUS报告基因在转基因拟南芥的种子中表达。本论文的主要实验结果如下:(1)AtMBL1启动子表达载体的构建。根据Tair网站上提供的拟南芥AtMBL1基因上游碱基序列,利用Primer 5.0软件,设计AtMBL1启动子的PCR反应引物,进行PCR扩增。将扩增产物酶切连接到植物表达载体pGFPGUSplus上,转化到大肠杆菌DH5α菌株,利用菌落PCR和酶切鉴定初步验证阳性克隆,最后经过测序结果比对,表明成功构建了AtMBL1启动子的植物表达载体,将其命名为pMBL1-GUS。通过农杆菌介导的浸花法将pMBL1-GUS侵染转化野生型拟南芥。通过多代筛选获得纯合株系。(2)AtMBL1启动子序列分析。使用在线分析软件如PLACE和PlantCARE,对AtMBL1启动子的序列进行分析,鉴定出很多与种子特异性表达相关的调控元件。包括RY元件(CATGCA)、ACGT元件、ACGTCA元件、as-1元件(TGACG)、GCN4元件(TGAGTCA)、skn-1基序(GTCAT)、AACA元件(AACAAAA)等。(3)AtMBL1启动子各缺失序列的克隆载体的构建。基于AtMBL1启动子的序列分析结果,设计5’端系列缺失引物。后经PCR扩增,获得了3个长度依次为621bp、514bp以及351bp的缺失片段,将这三个缺失片段依次命名为△MBL1、△MBL2以及△MBL3。将纯化后的扩增产物克隆到pEASY-Blunt Cloning Kit载体中,且转化至大肠杆菌DH5α菌株中。利用菌落PCR和双酶切的电泳结果,初步筛选阳性克隆,最后进行测序比对。测序结果表明三个缺失片段的克隆载体均构建成功,按照其片段长度从大到小依次命名为MBL1P-1,MBL1P-2以及MBL1P-3。(4)AtMBL1启动子各缺失序列的表达载体的构建。将缺失序列的克隆载体酶切后,电泳回收目的片段,将目的片段连接到pGFPGUSplus载体上。利用菌落PCR和双酶切的电泳结果,初步筛选阳性克隆。最后经过测序比对,结果表明三个缺失片段的植物表达载体均已构建成功。按照缺失片段长度从大到小依次命名为p△MBL1-GUS、p△MBL2-GUS以及p△MBL3-GUS。通过农杆菌介导的浸花法将缺失启动子的植物表达载体转化野生型拟南芥。通过筛选最终获得缺失序列的纯合株系。(5)AtMBL1启动子是种子特异性表达启动子。利用X-Gluc溶液对筛选获得的AtMBL1启动子的转基因纯合株系进行GUS组织化学染色,检测时期包括种子期,幼苗期,花期以及角果期。染色结果表明AtMBL1启动子可以驱动基因表达,而且能够有效地驱动GUS报告基因在拟南芥种子中特异的表达。(6)AtMBL1启动子各缺失序列的GUS组织化学染色。结果显示AtMBL1启动子和缺失系列均可驱动下游GUS报告基因在拟南芥种子中表达,说明它们均具备启动基因转录的活性。△MBL3仍能够驱动下游GUS报告基因的表达,是AtMBL1启动子发挥调控作用的关键区段。推测种子特异性表达元件主要存在于△MBL3中。所缺失的各部分序列不能使启动子失去活性,但这些序列中的元件对基因表达是否起促进或抑制作用、各个元件之间的相互作用关系以及各元件调控启动子活性的分子机制还需要通过启动子定点突变、酵母单杂交以及凝胶阻滞分析等实验来验证。
Abstract
gao deng zhi wu de sheng chang fa yo shi ji yin shua ze xing biao da de jie guo ,er ji yin de biao da shou dao qi dong zi de diao kong 。qi dong zi ru tong “kai guan ”yi yang ,jue ding le ji yin de huo dong 。yi dan qi dong zi huo xing chu xian yi chang ,tong chang hui dao zhi ji yin biao da de diao jie zhang ai ,jin er ke neng dao zhi zhi wu sheng chang fa yo yi chang 。mu qian de yan jiu jin guan huo de le hu duo ju bei zu zhi te yi xing huo you dao huo xing de zhi wu qi dong zi ,dan shi zhen zheng kuo yu mou ge te ding wei chuan gai liang mu de de qi dong zi shu liang bing bu duo huo huo xing bu gao 。yin ci zhi wu ji yin zu zhong qian zai de qi dong zi hai you dai fen xi he jian ding 。Tairwang zhan (http://www.arabidopsis.org/)shang di gong de ji yin zhu shi xin xi xian shi ni na gai At3g21380ji yin shi gan lou tang jie ge ning ji su (Mannose-binding lectin superfamily protein,MBL)de bian ma ji yin 。zai ben yan jiu zhong ,wo men jiang At3g21380ji yin zan ming ming wei AtMBL1ji yin 。li yong zai xian wang zhan dui gai ji yin de ji yin biao da shu ju jin hang fen xi ,fa xian AtMBL1ji yin shi yi ge chong zi te yi xing biao da ji yin ,yin ci tui ce AtMBL1qi dong zi shi chong zi te yi xing biao da qi dong zi 。shou xian ke long le AtMBL1qi dong zi ,ran hou jiang ji mei qie ,lian jie zhi zhi wu biao da zai ti shang 。tong guo nong gan jun jie dao de jin hua fa jiang zhi wu biao da zai ti qin ran zhuai hua ye sheng xing ni na gai 。dai chong zi cheng shou hou shou huo chong zi ,ran hou jiang shou huo de chong zi sa zai han you chao mei su de shai shua pei yang ji shang jin hang zhu dai shai shua ,zui zhong huo de bu zai fa sheng xing zhuang fen li de T3dai chun ge zhu ji 。li yong GUSzu zhi hua xue ran se fa dui AtMBL1qi dong zi de zu zhi biao da mo shi jin hang fen xi 。yan jiu jie guo zheng shi AtMBL1qi dong zi neng gou qu dong wai yuan ji yin zai chong zi bu wei te yi xing de biao da 。ran hou ji yu AtMBL1qi dong zi de quan chang xu lie de fen xi ,she ji le yi ji lie 5’duan que shi qi dong zi de yin wu ,ke long le san ge que shi pian duan 。jie xia lai cheng gong gou jian le san ge que shi pian duan de zhi wu biao da zai ti ,bing qin ran zhuai hua ye sheng xing ni na gai ran hou shai shua zhi zhuai ji yin chun ge zhu ji 。GUSzu zhi hua xue ran se fen xi biao ming ,suo you que shi pian duan jun neng qu dong GUSbao gao ji yin zai zhuai ji yin ni na gai de chong zi zhong biao da 。ben lun wen de zhu yao shi yan jie guo ru xia :(1)AtMBL1qi dong zi biao da zai ti de gou jian 。gen ju Tairwang zhan shang di gong de ni na gai AtMBL1ji yin shang you jian ji xu lie ,li yong Primer 5.0ruan jian ,she ji AtMBL1qi dong zi de PCRfan ying yin wu ,jin hang PCRkuo zeng 。jiang kuo zeng chan wu mei qie lian jie dao zhi wu biao da zai ti pGFPGUSplusshang ,zhuai hua dao da chang gan jun DH5αjun zhu ,li yong jun la PCRhe mei qie jian ding chu bu yan zheng yang xing ke long ,zui hou jing guo ce xu jie guo bi dui ,biao ming cheng gong gou jian le AtMBL1qi dong zi de zhi wu biao da zai ti ,jiang ji ming ming wei pMBL1-GUS。tong guo nong gan jun jie dao de jin hua fa jiang pMBL1-GUSqin ran zhuai hua ye sheng xing ni na gai 。tong guo duo dai shai shua huo de chun ge zhu ji 。(2)AtMBL1qi dong zi xu lie fen xi 。shi yong zai xian fen xi ruan jian ru PLACEhe PlantCARE,dui AtMBL1qi dong zi de xu lie jin hang fen xi ,jian ding chu hen duo yu chong zi te yi xing biao da xiang guan de diao kong yuan jian 。bao gua RYyuan jian (CATGCA)、ACGTyuan jian 、ACGTCAyuan jian 、as-1yuan jian (TGACG)、GCN4yuan jian (TGAGTCA)、skn-1ji xu (GTCAT)、AACAyuan jian (AACAAAA)deng 。(3)AtMBL1qi dong zi ge que shi xu lie de ke long zai ti de gou jian 。ji yu AtMBL1qi dong zi de xu lie fen xi jie guo ,she ji 5’duan ji lie que shi yin wu 。hou jing PCRkuo zeng ,huo de le 3ge chang du yi ci wei 621bp、514bpyi ji 351bpde que shi pian duan ,jiang zhe san ge que shi pian duan yi ci ming ming wei △MBL1、△MBL2yi ji △MBL3。jiang chun hua hou de kuo zeng chan wu ke long dao pEASY-Blunt Cloning Kitzai ti zhong ,ju zhuai hua zhi da chang gan jun DH5αjun zhu zhong 。li yong jun la PCRhe shuang mei qie de dian yong jie guo ,chu bu shai shua yang xing ke long ,zui hou jin hang ce xu bi dui 。ce xu jie guo biao ming san ge que shi pian duan de ke long zai ti jun gou jian cheng gong ,an zhao ji pian duan chang du cong da dao xiao yi ci ming ming wei MBL1P-1,MBL1P-2yi ji MBL1P-3。(4)AtMBL1qi dong zi ge que shi xu lie de biao da zai ti de gou jian 。jiang que shi xu lie de ke long zai ti mei qie hou ,dian yong hui shou mu de pian duan ,jiang mu de pian duan lian jie dao pGFPGUSpluszai ti shang 。li yong jun la PCRhe shuang mei qie de dian yong jie guo ,chu bu shai shua yang xing ke long 。zui hou jing guo ce xu bi dui ,jie guo biao ming san ge que shi pian duan de zhi wu biao da zai ti jun yi gou jian cheng gong 。an zhao que shi pian duan chang du cong da dao xiao yi ci ming ming wei p△MBL1-GUS、p△MBL2-GUSyi ji p△MBL3-GUS。tong guo nong gan jun jie dao de jin hua fa jiang que shi qi dong zi de zhi wu biao da zai ti zhuai hua ye sheng xing ni na gai 。tong guo shai shua zui zhong huo de que shi xu lie de chun ge zhu ji 。(5)AtMBL1qi dong zi shi chong zi te yi xing biao da qi dong zi 。li yong X-Glucrong ye dui shai shua huo de de AtMBL1qi dong zi de zhuai ji yin chun ge zhu ji jin hang GUSzu zhi hua xue ran se ,jian ce shi ji bao gua chong zi ji ,you miao ji ,hua ji yi ji jiao guo ji 。ran se jie guo biao ming AtMBL1qi dong zi ke yi qu dong ji yin biao da ,er ju neng gou you xiao de qu dong GUSbao gao ji yin zai ni na gai chong zi zhong te yi de biao da 。(6)AtMBL1qi dong zi ge que shi xu lie de GUSzu zhi hua xue ran se 。jie guo xian shi AtMBL1qi dong zi he que shi ji lie jun ke qu dong xia you GUSbao gao ji yin zai ni na gai chong zi zhong biao da ,shui ming ta men jun ju bei qi dong ji yin zhuai lu de huo xing 。△MBL3reng neng gou qu dong xia you GUSbao gao ji yin de biao da ,shi AtMBL1qi dong zi fa hui diao kong zuo yong de guan jian ou duan 。tui ce chong zi te yi xing biao da yuan jian zhu yao cun zai yu △MBL3zhong 。suo que shi de ge bu fen xu lie bu neng shi qi dong zi shi qu huo xing ,dan zhe xie xu lie zhong de yuan jian dui ji yin biao da shi fou qi cu jin huo yi zhi zuo yong 、ge ge yuan jian zhi jian de xiang hu zuo yong guan ji yi ji ge yuan jian diao kong qi dong zi huo xing de fen zi ji zhi hai xu yao tong guo qi dong zi ding dian tu bian 、jiao mu chan za jiao yi ji ning jiao zu zhi fen xi deng shi yan lai yan zheng 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自曲阜师范大学的王雪，发表于刊物曲阜师范大学2019-10-09论文，是一篇关于甘露糖结合凝集素论文,启动子论文,启动子缺失分析论文,组织化学染色论文,组织特异性元件分析论文,曲阜师范大学2019-10-09论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自曲阜师范大学2019-10-09论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
标签：甘露糖结合凝集素论文; 启动子论文; 启动子缺失分析论文; 组织化学染色论文; 组织特异性元件分析论文; 曲阜师范大学2019-10-09论文;