导读:本文包含了介导的病毒抗性论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:黄瓜绿斑驳花叶病毒,黄瓜microRNA,靶基因,功能
介导的病毒抗性论文文献综述
梁超琼[1]（2018）在《响应黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染的黄瓜miRNA功能分析及人工miRNA介导的病毒抗性评价》一文中研究指出作为一种新的外来入侵有害生物,黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是危害葫芦科(Cucurbitaceae)作物的重要病毒之一,由其引起的瓜类作物病毒病在生产中发生和危害日趋严重。该病毒病已对我国多个省市的葫芦科作物生产造成巨大经济损失,目前尚无针对该病毒病的抗病品种和高效的山间病害防治方法。本论文以CGMMV-黄瓜、CGMMV-本生烟互作的病害系统为研究对象,开展以下3个方面的研究:1)筛选CGMMV胁迫下黄瓜中稳定表达的内参基因,为miRNA表达特性分析提供可靠依据。2)挖掘参与黄瓜-CGMMV互作过程的miRNA及其靶基因,分析其表达特性,探究响应CGMMV侵染的黄瓜miRNA的功能和调控网络,为筛选黄瓜抗病基因提供新视角。3)通过人工miRNA技术特异性沉默CGMMV的功能基因,获得抗CGMMV的转基因本生烟(Nicotianabenthamiana)植株,为培育抗病品种提供新思路。主要研究结果如下:1)CGMMV胁迫下黄瓜miRNA定量表达中内参基因的筛选。采用RT-qPCR方法对Actin、Tubulin、EF-1α、18SrRNA、Ubiquitin、GAPDH和 Cyclophilin 共 7 个内参基因在 CGMMV 侵染的黄瓜植株叶、茎和根中的表达水平进行了检测。使用delta-Ct、geNorm、NormFinder、BestKeeper以及在线工具RefFinder等对内参基因的表达稳定性进行了分析和评价,并在miR159等多个黄瓜miRNA上验证了上述内参基闪的表达稳定性。结果表明:EF-1α在黄瓜叶片和根中是最稳定的可用于标准化miRNA表达的内参基因,在系组织中,GAPDH表达最为稳定,而Ubiquitin和EF-1α则是最适合所有类型样品的内参基因组合。2)响应CGMMV侵染的黄瓜miRNA功能分析。通过降解组测序和生物信息学分析,获得了响应CGMMV侵染的47个黄瓜miRNA家族和3046个靶标转录本信息。采用实时定量PCR、Northern blot和5'-RLM-RACE等方法,对参与植物-病原物互作、植物激素信号转导等生物过程的部分黄瓜miRNA及其靶基因的表达特性、剪切位点等进行分析和验证,结果表明:10个黄瓜miRNA及其调控的11个靶基因的表达水平在CGMMV接种后12 h～15 d的叶片样品中发生了不同程度的差异表达,其中miRl 72与其靶基因XM011656616.1、miR3 93与其靶基因NM001280617.1以及miR858与其靶基因XM004140251.2等的表达呈负相关关系;miRNA与其靶标mRNA的剪切作用发生在miRNA成熟序列5'端开始的第10位核苷酸处。此外,构建了 miRNA-靶基因-下游生物过程之间紧密联系的调控网络,其中黄瓜miR159靶向应对生物和非生物胁迫的正调控因子丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PBS,csa-miRn6-3p可调控钙依赖蛋白激酶CPK32,进而参与植物抗病反应。3)人工miRNA介导的病毒抗性评价。构建了分别靶向CGMMV外壳蛋白(coat protein,CP)、移动蛋白(movement protein,MP)和复制酶(replicase,Rep)基因保守序列的6个人工miRNA表达载体,采用农杆菌介导的遗传转化法获得过表达人工miRNA的转基因本生烟植株。结果显示,表达高水平的amiR1-CP、amiR4-MP和amiR6-Rep的转基因植株表现出一定程度的病毒“抗性”或“耐受性”,可减少病毒复制,降低发病率。表达低水平的amiR2-CP的转基因植株,或表达中等水平的amiR3-MP和amiR5-Rep的转基因植株则易受到CGMMV侵染的影响,并表现出花叶、斑驳等病毒病的症状。综合分析得出,靶向CGMMV CP基因的人工miRNA介导的抗性水平最高。上述结果证明了应用人工miRNA介导的基因沉默技术有助于保护植物免受病毒病的危害。(本文来源于《中国农业大学》期刊2018-12-01）
高乐,李凯,智海剑[2]（2017）在《RNAi介导的大豆对大豆花叶病毒抗性的改良》一文中研究指出大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)引致的病毒病是一种全球性病害,造成大豆大幅减产和品质恶化。转基因手段能够极大缩短抗病品种的选育进程,尤其是RNAi技术已成为培育抗病毒转基因作物的热门方法。因此,本研究旨在应用RNAi技术获得对SMV具有广谱、持久抗性的转基因大豆新材料。对国内外11个SMV流行株系进行核苷酸序列同源性比对,克隆了长度为268 bp的SMV HC-.Pro基因干扰片段,利用GATEWAY技术构建RNAi载体并进行PCR、测序、酶切鉴定。应用农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化体系,选用大豆品种天隆1号、华春3号、华春6号、Williams 82和Jack为受体材料,以bar基因作为筛选标记进行大豆转基因实验,共计获得抗性组培幼苗233株。通过除草剂涂抹、PCR检测、PAT/bar转基因检测试纸鉴定,筛选出阳性T_0代转基因大豆植株105株,5个受体品种的转化率在0.70%-3.07%之间,平均转化率为2.30%。对全部T_0植株进行加代繁殖,共获得1605株T_1后代,筛选出阳性植株1059株。Southern blot证明T-DNA以低拷贝的形式整合至大豆基因组中。卡方(x~2)测验结果证实大部分T0家系的T_1代分离比符合3:1或15:1(P>0.05),即符合孟德尔1对或2对基因的遗传规律。通过T_1代SMV抗病鉴定,共筛选到高抗转基因大豆植株44l株(41.6%)。花期倒叁叶SMV发病等级的调查结果表明,1059棵阳性T_1植株的平均发病等级为1.42,而5个大豆基因型非转基因植株的平均发病等级高达3.2。阳性T_1植株和非转基因植株在接种SMV 15 d和30 d后进行qRT-PCR分析,结果表明SMV含量在转基因植株体内呈下降趋势,在非转基因植株中迅速增加。接种2个月后,DAS-ELISA证明阳性T_1植株的体内已经检测不到病毒的存在。进一步对75棵阳性T2植株进行SMV抗病鉴定,57株(76.0%)被鉴定为高抗类型,并且没有发现感病类型。阳性T_2植株在接种SMV 3周和5周后进行了DAS-ELISA实验,结果表明SMV呈现为阴性或是含量逐渐降低。此外,还对抗病转基因大豆植株的T_3种子进行了观察,并未发现SMV所导致的褐斑粒现象。(本文来源于《第十届全国大豆学术讨论会论文摘要集》期刊2017-07-31）
杨向东,牛陆,张伟,杨静,杜茜[3]（2016）在《RNAi介导SMV-P3基因沉默增强大豆对花叶病毒病的抗性》一文中研究指出大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)病是我国各大豆主产区最重要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒外观品质。培育抗病品种是防治该病害最经济有效的措施。本研究基于植物介导RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,将编码参与SMV运动和影响宿主域范围的P3蛋白基因RNAi片段导入栽培大豆品种,研究RNAi介导SMV-P3基因沉默对大豆抗SMV的影响。Southern杂交检测结果表明,外源RNAi片段以低拷贝的形式(1~4个)整合至大豆基因组中。对T_1~T_3代转基因大豆喷施除草剂和PCR鉴定结果表明,外源T_-DNA插入片段在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。对T_2和T_3代转基因大豆接种SMV鉴定结果表明,转基因大豆对我国大豆产区主要流行SMV株系SC-3较非转基因对照受体品种Williams 82和SN9的抗性水平显着提高,病情指数降低至4.37~18.51,且抗性能够稳定遗传。综上所述,RNAi介导SM-P3基因沉默能够显着提高转基因大豆对SMV的抗性水平。(本文来源于《作物学报》期刊2016年11期）
姜华[4]（2015）在《本氏烟中重组大豆花叶病毒的致病性，RNAi的反致病性和大豆中RNAi介导的大豆花叶病毒广谱抗性研究》一文中研究指出大豆花叶病毒(Soybean Mosaic Virus,SMV)病是一种世界性大豆病害,严重影响大豆产量和品质。由于SMV基因组的遗传变异及强大的选择压力,产生了不同的致病类型,即株系。在中国,基于一套全国统一的SMV株系鉴别体系,我国研究者鉴定报道了 SC1～SC22 共 22 个株系,其中 SC3、SC7、SC8、SC9、SC10、SC11、SC13、SC15、SC18为中国各大豆生态区危害的强毒株系。据报道大豆对SMV各株系抗性的遗传多数由个别基因控制,以株系分类体系的不同而有不同。伴随着SMV的变异可能出现新株系,从而打破原有的抗性。鉴于同一地区存在多个株系,新株系还在产生,抗病毒育种要求一个品种兼抗多个株系,或者要求品种具有广谱抗性。为此,需要探索具有广谱抗性的基因,RNAi机制近年来被广泛认知,它可以保护生物免受病毒感染,是公认的生物体内的抗病毒调节机制,据研究报道应用RNAi机制获得了广谱的抗番木瓜环斑病毒植株,因此,应用RNAi原理获得对病毒的广谱抗性具有较大潜力。同时,为了检验广谱抗性基因的功能,还需要建立一个快速验证的技术体系,利用同一种转有抗性基因的大豆基因型检验对不同株系的抗性。本研究的目的是探求对大豆SMV株系具有广谱抗性的RNA干扰基因,同时建立一套广谱抗性鉴定的技术体系。研究的基本路线如下:(1)利用病原物来源的抗病(Pathogen-derived Resistance,PDR)机制,设计SMV来源的RNA干扰基因和过表达基因,期望从中获得具有广谱抗性的基因。(2)对所获基因进行抗SMV功能验证需要建立一个快速验证体系,鉴于大豆再生和转基因技术的困难,尝试了2种设想:一是寻找可以被SMV侵染的可做瞬时表达的烟草或拟南芥,建立SMV与烟草或拟南芥的抗性鉴定技术体系;二是建立大豆发状根抗性鉴定技术体系。研究结果两条路线都有发现:SMV分离物4278-1打破了本氏烟非寄主抗性,由此建立了一对一的抗性鉴定体系;还成功建立了 SMV侵染发状根体系,此体系可应用于同时对多个株系的抗性鉴定。(3)利用设计的RNA干扰基因和抗性鉴定体系,对我国各生态区的强毒株系进行了相对广谱抗性功能检验。主要结果如下:1.筛选到能克服本氏烟非寄主抗性的SMV分离物4278-1为了筛选克服非寄主烟草和拟南芥抗性的SMV株系,对3种烟草(本氏烟、普通烟、黄烟)和拟南芥(Col-0)适龄幼苗分别机械接种SMV分离物SC3*(隶属SC3株系)、4278-1(隶属SC7株系)、6067-1(隶属SC15株系)、6003-2(隶属SC18株系),发现SMV分离物4278-1能侵染本氏烟,表现出皱缩和矮化症状。通过酶联免疫吸附试验(ELISA),透射电子显微镜观察病毒粒子形态和回接大豆NN1138-2试验,证实侵染本氏烟的病毒确为SMV。此外,回接试验表明该分离物在大豆NNN113-2上的毒力没有减弱、致病型未发生改变。同时,分离物4278-1在寄主大豆和非寄主本氏烟上具有相似的潜伏期,但诱导不同的症状。鉴于该分离物能侵染本氏烟,此体系将用于检验后续克隆的各RNA干扰基因对以分离物4278-1为代表的SC7株系的抗性效果。2.揭示了克服本氏烟非寄主抗性的SMV分离物4278-1的分子生物学特征为了获得SMV分离物4278-1在本氏烟上转导情况,分别收获接种后7天、14天和21天侵染植株的各片叶,利用qRT-PCR对3个时间点各片叶病毒含量进行分析,结果显示该病毒分离物能移动到非接种叶,从而引起本氏烟系统性侵染。对分离物4278-1全基因组测序,发现该分离物全基因组(单链RNA)由9994个核苷酸组成,不同于一般的SMV分离物的基因组(约含95 8 8个核苷酸)。分离物4278-1与本文涉及的其它SMV分离物在氨基酸序列上同源性大于89%,但在P1蛋白区域,该分离物氨基酸序列与其它SMV分离物的同源性较低(43.8～45.4%),而与西瓜花叶病毒(WMV,69.6%)有较高同源性。通过系统发育树构建和重组分析,发现SMV和WMV在P1基因和5'非翻译区发生了两个重组,分别位于1-476 bp和1145-1349 bp。因此,这一重组的病毒不仅可侵染寄主大豆,还可以克服本氏烟的非寄主抗性。文献报道SMV的SC7株系分离物4469-4也有类似的重组现象,这表明SC7是一个重组活跃株系,其5'端是重组活跃区域。非寄主抗性可被打破这一结果为揭示植物-病毒互作机制提供了一种新的可能。3.SMV来源的RNA干扰基因赋予了本氏烟对SMV的抗性通过 NCBI(National Center For Biotechnology Information)获得了 46 条 SMV 全基因组序列,应用BioEdit软件(muscle算法)对它们的核苷酸序列进行同源性比较分析,筛选到5个相对保守的片段(分别命名为S1～S5),它们在SMV基因组上的位置(核苷酸)分别是:S1(2595-3056 nt)、S2(5601-6013 nt)、S3(6930-7426 nt)、S4(8261-8582 nt)、S5(8919-9274 nt)。利用RNAi抗病毒机制,分别构建了 5个反向重复干扰序列的沉默载体。同时,扩增SMV基因组CP基因,构建了 1个过表达载体。在非寄主本氏烟上瞬时表达构建好的载体,分别接种SMV分离物4278-1或侵染性克隆pGreen-SMV-GUS,对5个干扰基因(S1～S5)及CP过表达基因抗SMV效果进行功能验证。研究发现设计的基因都有抗SMV分离物4278-1和侵染性克隆pGreen-SMV-GUS的效果,但各个基因的抗性水平不同。根据表型、GUS染色、GUS酶活、ELISA、Western blot和qRT-PCR试验结果,发现基因S1抗SMV效果较强,基因S2抗SMV效果较弱,基因S3～S和CP抗病效果介于S1和S2之间。因此,推测S1基因可能可以用于遗传转化那些农艺性状优异但抗SMV株系SC7能力弱的栽培大豆,进而增强品种抗病毒能力。4.沿基因介导的大豆发状根对中国各大豆生态区强毒株系的广谱抗性利用发根农杆菌K599在大豆子叶创伤处诱导愈伤组织,农杆菌接种后8～10天,对形成的愈伤组织进行针刺造成伤口,在其上接种SC15株系病毒纯化制剂,接种后14天,取从愈伤组织生长出来的发状根,进行ELISA检测和回接感病大豆NN1138-2测试。研究发现对发状根的ELISA检测呈阳性,回接的大豆表现出典型的SMV病症状,表明应用此种方法SC15确实侵染了大豆发状根。随后,对SMV株系SC3、SC7、SC8、SC9、SC10、SC11、SC13和SC18分别采取同样的方法进行接种试验,结果发现上述病毒株系均可侵染大豆发状根。因此,该体系可用于相关SMV株系抗病基因的功能验证。此外,对接种后10天、15天、20天和25天发状根的表型进行了观察,结果发现病毒与Mock(缓冲液)接种之间没有差异,二者表型类似于野生型对照,并无病症出现。为获知在发状根中RNAi是否起主要抗SMV作用,扩增了番茄丛矮病毒基因沉默抑制子基因p19,将其在大豆发状根稳定过表达,接种强毒株系SC15病毒纯化制剂,于接种后10天、15天、20天和25天对发状根中病毒含量进行qRT-PCR检测。结果发现在4个时间点,过表达基因沉默抑制子基因p19的发状根中病毒含量显着高于对照组(野生型和空载体)发状根,p19基因的表达促进了 SMV强毒株系SC15在发状根中的累积,说明在发状根对SMV的抗性中RNAi起着很大作用。利用发根农杆菌K599将干扰基因S1在大豆中稳定表达,针刺愈伤组织,接种SC15株系病毒纯化制剂,于接种后10天、15天、20天和25天对发状根中病毒含量进行qRT-PCR检测。结果发现随着接种时间延长,发状根中SMV含量逐渐累积,但表达干扰基因S1的发状根中病毒累积速度显着低于对照组(野生型和空载体)发状根。此外,相对于接种后10天、20天和25天,在病毒接种后15天时,对照组发状根和表达干扰基因S1的发状根病毒含量差异较大,因此,对于其它株系的抗性验证选此时间点取样,并进行病毒含量检测。随后,本研究用同样的病毒接种方法和qRT-PCR检测技术,验证了干扰基因S1对SMV株系SC3、SC7、SC8、SC9、SC10、SC11、SC13和SC18的抗病效果,发现S1基因对不同的株系均有抵抗作用,且抗性水平表现差异较小,说明基因S1具有相对广谱的抗SMV能力。(本文来源于《南京农业大学》期刊2015-12-01）
任芳,董雅凤,张尊平,范旭东,胡国君[5]（2015）在《酵母pac1基因介导对葡萄B病毒的抗性》一文中研究指出为明确广谱性抗病毒基因—酵母pac1基因对葡萄B病毒(Grapevine virus B,GVB)的抗性效果,通过农杆菌介导的遗传转化,将pac1基因导入西方烟37B,对转基因植株进行PCR鉴定及Southern blot分析,通过病毒摩擦接种观察症状以及实时荧光定量RT-PCR检测植株体内病毒含量,并对转基因植株抗病性进行初步鉴定。结果表明,目的基因pac1成功导入并整合至西方烟37B基因组,共获得10个转基因株系。不同株系的T1代烟草中阳性植株比例为16.7%~72.7%,表明目的基因可成功遗传到子代。接种病毒后转基因植株普遍延迟发病,但后期症状与非转基因对照相似,其中仅1个转基因株系B6具有不表现典型症状等抗性反应。接种植株病毒含量检测中,所有转基因植株均检测到病毒存在,但表现为抗病的B6株系中病毒含量显着低于非转基因对照,表明该转基因植株虽不能完全抵抗GVB侵染,但对GVB具有耐病性。(本文来源于《植物保护学报》期刊2015年04期）
邢芳宇[6]（2015）在《不同病毒基因排列顺序对RNA介导的多病毒抗性的影响》一文中研究指出马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是烟草生产中危害严重的叁种病毒,严重影响植物生长,造成重大的经济损失,培育抗病型品种势在必行。RNA介导的病毒抗性是近年来发展起来的一种有效防治植物病毒病害的策略,具有抗性持久、抗病程度高、生物安全性高等优点,为植物抗病毒策略提供了新的途径。本实验以马铃薯Y病毒(PVY)、烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的衣壳蛋白(coat protein,CP)基因、马铃薯Y病毒(PVY)的抑制子基因(HC-pro)、烟草花叶病毒(TMV)的抑制子基因(p126)和黄瓜花叶病毒(CMV)的抑制子基因(2b)为靶序列,构建了不同病毒基因排列顺序的嵌合基因发夹RNA(hairpin RNA,hpRNA)结构的植物表达载体,通过电激法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89。对获得的转基因烟草进行抗性鉴定,比较不同病毒基因排列顺序的嵌合基因对RNA介导的病毒抗性的影响,为培育多抗病毒的转基因植株提供依据。研究获得的主要结果和结论如下:(1)根据已克隆出的CMV CP基因和2b基因、PVY CP基因和HC-pro基因、TMV CP基因和p126基因的全序列,设计并合成引物,通过PCR扩增获得长度为300bp的cDNA的片段,按不同排列顺序拼接成嵌合基因,进而分别反向重复插入双元载体pROKⅡ中,构建不同病毒基因排列顺序的嵌合基因发夹RNA(hairpin RNA,hpRNA)结构的植物表达载体pPTC-CP、pCPT-CP、pTCP-CP、pPTC-2b、pCPT-126、pTCP-HC。(2)将构建好的植物表达载体pPTC-CP、pCPT-CP、pTCP-CP、pPTC-2b、pCPT-126、pTCP-HC通过电激法导入农杆菌LBA4404中,采用叶盘法转化烟草NC89。经过卡那霉素的筛选和PCR的鉴定,最终获得转基因pPTC-CP、pCPT-CP、pTCP-CP、pPTC-2b、pCPT-126、pTCP-HC的T0代植株102株、103株、116株、114株、105株、108株。(3)转基因植株的Southern杂交结果表明外源目的基因已成功地整合到了烟草基因组中。(4)转基因植株的Northern杂交结果表明转基因在RNA水平上都得到了表达,接毒感病的转基因烟草中总RNA的积累量明显高于接毒抗病的转基因烟草,也就是说目的基因的RNA的积累量与抗性能力呈现负相关,由此也证明转基因植株产生的病毒抗性是RNA介导产生的病毒抗性。(5)转基因植株的目的序列的siRNA的Northern杂交分析证明初级RNA在体内进行了表达,次级RNA在转录翻译的同时发生了信号的传递,向目的基因的上游和下游方向延伸,荧光定量PCR结果表明不同基因排列顺序的转基因植株的总RNA的表达量不同。(本文来源于《山东农业大学》期刊2015-05-01）
谢雪迎[7]（2014）在《嵌合基因结构对发夹RNA介导的病毒抗性的影响及双抗转基因水稻新材料的培育》一文中研究指出RNA沉默广泛存在于生物体中,通过阻止外源基因、转座因子、病毒等外源核酸的侵入,保护生物基因组的完整性；小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)是沉默RNA的最主要组成部分。RNA介导的病毒抗性(RNA-mediated virus resistance, RMVR)是RNA沉默的一种重要表现形式。在PTGS所引发的RNA降解过程中,因外源基因转录产物与入侵病毒基因同源或部分同源,侵入细胞的病毒基因被RNA降解系统识别并随着外源基因RNA一同被降解。RNA介导的病毒抗性具有高效且持久的病毒抗性,同时其生物安全性也相当稳定。在涉及RNA沉默的相关研究中,siRNA的有效性可能受到靶序列的结构影响。本研究以马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)基因和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)衣壳蛋白(coat protein, CP)基因,马铃薯Y病毒(PVY)的抑制子基因(HC-pro)和黄瓜花叶病毒(CMV)的抑制子基因(2b)为靶序列,构建了不同嵌合基因发卡RNA (hairpin RNA, hpRNA)结构的植物表达载体,转化烟草,进行病毒抗性鉴定,系统性地比较不同嵌合基因结构对RNA介导的病毒抗性的影响；进而以水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)和水稻条纹病毒(Ricestripe virus, RSV)衣壳蛋白基因为靶序列,构建了包含两种病毒CP基因的嵌合基因hpRNA表达载体,转化获得了双抗RSV和RBSDV的水稻新材料。研究的主要结果和结论如下：(1)不同嵌合基因发卡结构和功能基因差异对RNA介导的病毒抗性的影响根据已克隆的PVY CP基因、HC-pro基因和CMV CP基因、2b基因全序列,设计并合成构建嵌合基因单发夹植物表达载体所需引物。通过PCR扩增,获得长度为300bp的各基因3'端cDNA片段,分别插入克隆载体pUC19,获得嵌合基因片段；进一步PCR扩增,获得正向和反向的嵌合基因片段和内含子片段；将扩增的片段酶切,分别连入植物表达载体pROK Ⅱ中,构建了嵌合基因单发夹的hpRNA结构的植物表达载体pDCPSH和pHC2bSH。根据已克隆的PVY CP基因、HC-pro基因和CMV CP基因、2b基因全序列,设计并合成构建嵌合基因双发夹植物表达载体所需引物。通过PCR扩增,获得长度为300bp的各基因3'端cDNA片段和内含子片段；将PVY CP基因和HC-pro基因及内含子片段插入克隆载体pBSK中,获得含PVY CP基因和IC-pro基因的发卡结构cDNA；将CMVCP基因和2b基因及内含子片段插入克隆载体pT-EASY,获得含CMVCP基因和CMV2b基因的发卡结构cDNA；酶切回收两个发卡结构cDNA,连接于植物表达载体pROK Ⅱ中,构建了嵌合基因双发夹的hpRNA结构的植物表达载体pDCPDH和pHC2bDH。将构建的4个植物表达载体利用冻融法导入农杆菌LBA4404。叶盘法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测确定转基因植株,共得到转pDCPDH, pHC2bDH、 pDCPSH和pHC2bSH的T0代转基因植株各111株、108株、106株和104株。用荧光定量PCR和Northern杂交对目的基因进行转录分析,发现转化嵌合基因双发夹结构载体的转基因植株中目的基因的转录与转化嵌效率和基因单发夹结构载体的转基因植株没有明显差异,但是前者经剪切获得的siRNAs明显多于后者。抗病性分析发现pDCPDH, pHC2bDH、 pDCPSH和pHC2bSH的转基因植株,对PVY和CMV同时表现抗性的植株比例分别为63.25%、37.98%、47.08%和25.78%,转pDCPDH的株系抗病效率为最高,而转pHC2bSH为最低,两者相差近3倍,表明靶向病毒的CP基因双发卡结构具有更好抗病效果。转基因植株的Northern杂交分析发现,转基因在RNA水平上得到了表达,抗病植株中RNA积累量明显低于同类型的感病植株,抗病性与RNA积累量呈负相关,证实病毒抗性是由RNA介导的。对转基因植株的siRNA积累量的分析发现植株对病毒的敏感程度与siRNA积累量之间没有明显的相关性。转基因植株的Southern杂交结果证明外源基因已整合到烟草基因组中。对T1代的转基因植株的抗病性分析结果发现,几乎所有的低拷贝抗性转基因植株的后代遵循孟德尔遗传分离规律,并且表现很强的抗病毒侵染能力(抗病率均达到95%以上),说明由hpRNA介导的病毒抗性在T1代植株中能够稳定遗传。(2)双抗RBSDV和RSV转基因水稻的培育水稻条纹病毒(RSV)和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)是目前水稻生产中广泛存在并且危害严重的两种病毒病,培育双抗RBSDV和RSV的水稻品种能够有效降低水稻生产中由病毒病引起的生产损失。以已克隆的RBSDV CP和RSV CP基因全长的cDNA为模板,设计并合成3'端、中间和5'端序列的引物,经PCR扩增获得大小为300bp的正向和反向的片段,通过酶切分别连入植物表达载体pCAMBIA1300UNB中,获得了发卡RNA(hpRNA)结构的瞬时表达载体p1300-RBSDV3'、p1300-RBSDV-M p1300-RBSDV5、p1300-RSV3、p1300-RSV-M和p1300-RSV5'。经瞬时侵染本生烟验证其有效性。Northern杂交显示,6个瞬时表达载体均能在植物体内成功表达产生siRNA,且RBSDV CP基因和RSVCP基因中间序列下调靶基因的表达最为显着。因此,我们选择RBSDV和RSV的CP基因中间序列为靶序列,借助克隆载体pUC19和pBSK,分别构建了嵌合基因单发卡和嵌合基因双发夹的植物表达载体：p1300SH和p1300DH。将构建的2个植物表达载体利用冻融法导入农杆菌EHA105。利用农杆菌介导的转化方法,转化临稻10号,经除草剂PPT筛选和PCR检测,获得转p1300DH和p1300SH的To代转基因植株各30株和45株。自交结实获得T1代株系,每个载体的T1代转基因株系各选取50棵抗PPT的转基因植株,分别用来自山东济宁的带毒灰飞虱接种RBSDV和RSV,按每株6头,接入2-3d龄带毒灰飞虱若虫(3头若虫携带RBSDV病毒,另3头若虫携带RSV病毒)。病毒抗性的检测结果显示：有8个p1300DH的转基因株系和8个p1300SH的转基因株系,植株的感病率都在6%以下,远远低于转野生型株系的感病率,表现为抗性株系；两个载体其余株系的感病率都在12%以上,表现为中抗和染病株系。统计结果显示,转化p1300SH和p1300DH的转基因株系中抗病株系的比率分别为17.78%和26.67%,表明转化嵌合基因双发卡结构的转基因植株的抗病效率明显高于转化单发卡结构转基因植株。T1代抗性株系的Southern杂交显示,外源基因以不同拷贝数整合于水稻的基因组中；T1代转基因株系的Northern杂交分析表明,抗病性与RNA积累量呈负相关,证明病毒抗性是由RNA介导的；对接种病毒的转基因植株的siRNA积累量分析发现,植株对病毒的敏感程度与siRNA积累量之间没有明显的相关性。选取Southern检测呈1-2谱带的T1代抗性植株SH1、 SH15、 SH27、 DH12、 DH14、 DH19、 DH23进行T2代遗传分析。结果表明,转基因及其介导的抗性可以稳定遗传至T2代,并且获得DH14和DH19两个不再发生分离的纯合体株系。(本文来源于《山东农业大学》期刊2014-06-11）
徐杰[8]（2014）在《Meq基因增强RNA沉默的分子机制及其介导病毒抗性的研究》一文中研究指出Meq基因是马立克氏病病毒的主要致瘤基因,MEQ蛋白N端为碱性亮氨酸拉链结构域,C端为富含脯氨酸结构域,在马立克氏病病毒的增殖和致病中起重要作用。农杆菌瞬时侵染分析表明,MEQ能明显增强植物瞬时侵染介导的RNA沉默,而RNA沉默是植物抵抗病毒侵染的主要防御策略,对于MEQ沉默增强机制的研究,可以使我们了解RNA沉默途径及机制的更多细节,同时为利用沉默增强基因获得植物广谱病毒抗性提供依据。为了揭示MEQ增强RNA沉默的分子机制,针对亮氨酸拉链和转录激活结构域分别构建了缺失突变体和点突变体,分析沉默增强作用的关键位点和功能域；荧光定量PCR检测Meq基因对沉默途径相关基因表达的影响,探讨其介入RNA沉默途径的可能方式；利用叶盘法和花序侵染法将Meq基因分别转化烟草和拟南芥,接种病毒进行抗性分析。主要的研究结果如下：(1)Meq基因能够显着增强瞬时侵染介导的局部和系统性RNA沉默。构建Meq基因植物表达载体,转化农杆菌GV3101,以GFP转基因本生烟16c为材料,农杆菌瞬时侵染鉴定其对RNA沉默的影响,长波紫外灯下持续观察绿色荧光蛋白的表达。结果表明,侵染后第3d (3dpi), MEQ与GFP共侵染处理已无绿色荧光,而GFP单独侵染仍有较强绿色荧光,Northern blot检测表明,GFP mRNA的积累水平与观察结果一致,而MEQ与GFP共侵染区GFP siRNA的积累水平显着高于GFP基因的单独侵染。侵染15dpi, MEQ与GFP共侵染与GFP单独侵染相比,植株上部有更多新生叶片变红,GFP mRNA的积累水平更低,发生了更强的系统性RNA沉默。(2)MEQ蛋白包含399个氨基酸,1-117位为DNA结合结构域,118-399位为转录激活结构域,其中1-28位为富含Pro/Gln区,有与转录辅阻遏物CtBp互作的位点,28-78位包含2个富含碱性氨基酸残基的DNA结合区及核定位信号,79-117位为亮氨酸拉链区。突变分析表明,△1-28突变体不影响沉默增强功能,而△1-78突变体却丧失了沉默增强功能,说明28-78之间的DNA结合区对MEQ的沉默增强功能是必须的。△118-399的突变使MEQ沉默增强能力丧失,而△175-399突变和△302-399突变都未对沉默增强功能产生影响,说明MEQ的转录激活结构域中118-174是发挥RNA沉默增强功能的核心区。将MEQ亮氨酸拉链中的亮氨酸突变掉2个或3个(L92AL99A和L92AL99AL106A)时其沉默增强功能明显减弱,而仅有1个亮氨酸突变(L92A)不影响其沉默增强功能,这说明亮氨酸拉链结构对MEQ蛋白发挥作用非常关键。亚细胞定位分析表明,与GFP融合表达的MEQ主要分布于细胞核中,而沉默增强功能需要MEQ的DNA结合结构域和转录激活结构域共同起作用,因此推测,MEQ可能以转录因子的方式通过调控其它基因的表达发挥RNA沉默增强功能。(3)为了进一步了解MEQ影响沉默途径的方式,选取本生烟中20个已知的沉默途径相关基因,通过荧光定量PCR检测MEQ基因瞬时侵染对这些基因表达的影响。结果显示,在所检测的基因中,有7个表达量明显上调,AGO10和HEN1基因的表达上调最为明显,其次为MET1、NRPD2a、SGS3、AGOla和DRM3基因。其中HEN1、MET1、NRPD2a、SGS3和DRM3基因与DNA甲基化有关,其余2个基因属于AGO蛋白家族,是RNA沉默途径的重要蛋白,由此推测,Meq基因可能通过影响AGO基因的表达介入RNA沉默途径,同时对DNA的甲基化有影响,但二者之间是否存在联系还需要进一步研究验证。(4)Meq基因农杆菌介导法转化烟草和拟南芥,经卡那霉素抗性筛选PCR检测获得转基因株系若干。选取4个转基因烟草株系扩繁,分别接种黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)进行抗病性分析,ELISA检测和Northen blot结果表明,4个转基因烟草株系对CMV表现不同抗性,而对PVX.PVY无明显抗性,CMV的抗病程度与Meq基因表达水平之间未见明显相关性。转基因拟南芥的抗病性分析还在进行中。(本文来源于《山东农业大学》期刊2014-06-01）
吴斌[9]（2012）在《马铃薯Y病毒及水稻黑条矮缩病毒CP基因不同区段对发夹RNA介导的病毒抗性影响》一文中研究指出RNA沉默是生物抵御外来核酸入侵以保持生物自身基因组完整性的一种高度保守的、序列特异的RNA降解机制,广泛存在于植物、动物、线虫和真菌等真核生物中。RNA介导的病毒抗性(RNA-Mediated Virus Resistance, RMVR)是近年来发展起来的一种新的抗病毒基因工程策略,它是以病毒核酸片段为转基因而诱导的转录后基因沉默,具有抗病程度高、抗性持久及生物安全性高等优点。在前期的研究中,人们发现并非所有符合条件的siRNA都同样有效,具体原因还不清楚,可能是“位置效应”(position effects)所致。本研究首先以马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)外壳蛋白基因(CP)不同区段50bp的序列为靶序列构建发夹RNA (hpRNA)结构的植物表达载体,系统性的比较PVY CP基因不同区段对RNA介导的病毒抗性的影响。在此基础上,以水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV) CP基因5’端、中间和3’端500bp的序列为靶序列,构建hpRNAi植物表达载体,转化水稻,进一步比较了不同位置的靶序列对RNA介导的病毒抗性的影响,筛选获得了高抗RBSDV的转基因水稻新材料。研究结果对有效地选择靶位点序列和高效地应用RMVR策略培育抗病毒转基因植物具有重大指导意义。研究结果和主要结论如下：1.马铃薯Y病毒CP基因不同区段对发夹RNA介导的病毒抗性的影响将PVYN CP (801bp)划分为长度为50bp的16个短片段,进而利用PCR技术扩增CP基因5’端8个目的片段,反向重复插入植物表达载体pROKⅡ中,构建了具有hpRNA结构的植物表达载体pROK-CPs (pROK-CP1～pROK-CP8)。将构建好的16个重组植物表达载体(3’端的8个载体由姜芳构建)利用冻融法导入农杆菌EHA105,并瞬时侵染本生烟以验证其有效性。Northern blot结果显示,16个植物表达载体不仅均能在植物体内成功表达产生siRNA,而且瞬时表达的siRNA能对靶基因PVYCP的农达进行有效地下调。采用冻融法将构建成功的植物表达载体导入农杆菌LBA4404,叶盘法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测获得T0代转基因植株。T0代自交所获得的种子置于含卡那霉素的筛选培养基上进行筛选,选取抗性幼苗进行温室移栽并进行PCR检测,结果农明,转化pROK-CP1～pROK-CP8分别获得60、55、70、66、66、48、68和72株T1代转基因植株。以PVYN的病毒汁液为接种物,摩擦接种16个载体的转基因烟草(3’端的8个载体的转基因烟草山姜芳转化获得),通过症状观察及ELISA检测进行抗病性分析发现,转化pROK-CP1～pROK-CP4所得的转基因植株抗性植株比例均为0%,而转化pROK-CP5～pROK-CP16的转基因株系中抗性植株的比例分别为27.15%、6.27%、67.65%、70.83%、66.01%、61.34%、66.04%、23.59%、11.11%、55.56%、77.78%和67.25%。结果表明,以CP基因3’端为靶序列比以5’端为靶序列更能有效地介导对PVY的抗性。T1代转基因植株的Northern blot杂交分析表明,转基因都在RNA水平上得到了表达,抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株,即抗性与RNA积累量呈负相关,同时,在所有转基因植株中均能检测到siRNA,表明植株对病毒的抗性是由RNA所介导的,但植株的抗病性与siRNA积累量之间没有明显的相关性。对T2代的转基因植株的抗病性分析结果表明,由hpRNA介导的PVY抗性可以在T2代植株中稳定遗传。2.水稻黑条矮缩病毒CP基因不同区段对hpRNA介导的病毒抗性影响利用PCR技术扩增来自RBSDV CP5端、中间和3’端长度为500bp (nt89-588, nt589-1088, nt1089-1588)片段,构建hpRNAi植物表达载体RBSDV-CP5'、RBSDV-CPM和RBSDV-CP3',酶切鉴定表明植物表达载体构建成功。将构建好的叁个重组表达载体利用冻融法导入农杆菌EHA105中,采用农杆菌介导法转化镇稻88。转化RBSDV-CP5'、RBSDV-CPM和RBSDV-CP3'的转基因植株,经除草剂和PCR检测,分别获得19、21和22株T0代转基因阳性植株。将T0代自交结实后获得的T1代转基因植株,利用叶片涂抹PPT的方法,筛选T1代阳性转基因植株。每个株系各选取50株阳性植株,用来自山东济宁的带毒灰飞虱接种病毒RBSDV,病毒抗性的检测结果显示：转RBSDV-CP5'、RBSDV-CPM和RBSDV-CP3'的T1代转基因株系中抗病株系的比率分别为15.80%、23.81%、27.27%,表明靶向于RBSDV CP3端的hpRNA可介导更高的抗病性。T1代转基因植株的Northern杂交分析显示,抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株,并且转基因植株中有siRNA存在,这表明病毒抗性是由RNA介导的。但同时还发现siRNA积累量与植物抗性之间没有明显的相关性。(本文来源于《山东农业大学》期刊2012-06-09）
赵晓娟[10]（2012）在《小麦黄花叶病毒定量检测与RNAi介导的抗性材料的创制》一文中研究指出小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus, WYMV）是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）大麦黄花叶病毒属（Bymovirus）的成员，是危害我国小麦生产的一种重要病毒病害。病株上产生褪绿条纹、花叶、矮化、分蘖减少等症状，由根肿菌纲的禾谷多粘菌（Polymyxa graminis）以持久性方式传播。WYMV的基因组有二条RNA，RNA1编码P3蛋白、7K蛋白、细胞质内含体蛋白（CI）、14K蛋白、细胞核内含体蛋白（NIa）、细胞核内含体蛋白b（NIb）和外壳蛋白（CP），RNA2编码非结构蛋白P1和P2。病毒检测在植物病毒病鉴定、分类、预报预测中起重要作用，对病毒病的防治也有重要意义。本研究以荧光定量PCR技术为基础，检测靶基因序列均位于WYMV CP序列基因保守区域，以β-actin和18s rRNA为参照基因，设计高度特异性的引物和探针，建立了一套用于定量检测WYMV的One Step Real Time PCR方法。试验中所用的TaqMan探针5＇端连接FAM荧光报告基团，3＇端连接TAMRA荧光猝灭基团。对反应体系进行优化，最佳的引物和探针组合终浓度均为0.2μmol/L。标准样品建立的标准曲线，曲线斜率和扩增效率均符合定量要求。对感染WYMV小麦叶片内WYMV CP RNA进行了绝对定量检测，检测灵敏度可达到ELISA的104倍，大大提高病毒的检出率。RNAi是由dsRNA介导的基因沉默现象，是细胞内的一种防御机制，可特异地降解细胞内与之具有同源性的核酸，达到调节细胞内编码基因的表达的作用。本研究依照此原理设计了WYMVCP介导的RNA干涉的dsRNA前体，构建发夹结构，连接到适合禾本科植物转化的干涉载体pWMB006上，利用基因枪方法进行了小麦遗传转化，并剔除共转化标记的基因。探索利用分子生物学技术获得抗WYMV的基因工程新策略，最终实现利用RNAi获得抗WYMV小麦新种质的预期目标。本研究以扬麦12为受体进行转化，获得了四个载体的转基因小麦，pWMB006DsCP、pWMB006sCP、pWMB006asCP、pWMB006的阳性植株。对转基因小麦的T0代进行PCR鉴定，T0代转基因阳性小麦株数分别是15株、8株、3株、5株，转化率是分别是0.73%、0.34%、0.25%、0.15%。T1代分离的株数较少，不遵循孟德尔遗传定律。田间病圃种植的感病植株明显黄化、矮缩，并出现倒伏现象，而抗病植株长势旺盛。外源基因的整合引起了植物表型变化。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2012-05-01）
介导的病毒抗性论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)引致的病毒病是一种全球性病害,造成大豆大幅减产和品质恶化。转基因手段能够极大缩短抗病品种的选育进程,尤其是RNAi技术已成为培育抗病毒转基因作物的热门方法。因此,本研究旨在应用RNAi技术获得对SMV具有广谱、持久抗性的转基因大豆新材料。对国内外11个SMV流行株系进行核苷酸序列同源性比对,克隆了长度为268 bp的SMV HC-.Pro基因干扰片段,利用GATEWAY技术构建RNAi载体并进行PCR、测序、酶切鉴定。应用农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化体系,选用大豆品种天隆1号、华春3号、华春6号、Williams 82和Jack为受体材料,以bar基因作为筛选标记进行大豆转基因实验,共计获得抗性组培幼苗233株。通过除草剂涂抹、PCR检测、PAT/bar转基因检测试纸鉴定,筛选出阳性T_0代转基因大豆植株105株,5个受体品种的转化率在0.70%-3.07%之间,平均转化率为2.30%。对全部T_0植株进行加代繁殖,共获得1605株T_1后代,筛选出阳性植株1059株。Southern blot证明T-DNA以低拷贝的形式整合至大豆基因组中。卡方(x~2)测验结果证实大部分T0家系的T_1代分离比符合3:1或15:1(P>0.05),即符合孟德尔1对或2对基因的遗传规律。通过T_1代SMV抗病鉴定,共筛选到高抗转基因大豆植株44l株(41.6%)。花期倒叁叶SMV发病等级的调查结果表明,1059棵阳性T_1植株的平均发病等级为1.42,而5个大豆基因型非转基因植株的平均发病等级高达3.2。阳性T_1植株和非转基因植株在接种SMV 15 d和30 d后进行qRT-PCR分析,结果表明SMV含量在转基因植株体内呈下降趋势,在非转基因植株中迅速增加。接种2个月后,DAS-ELISA证明阳性T_1植株的体内已经检测不到病毒的存在。进一步对75棵阳性T2植株进行SMV抗病鉴定,57株(76.0%)被鉴定为高抗类型,并且没有发现感病类型。阳性T_2植株在接种SMV 3周和5周后进行了DAS-ELISA实验,结果表明SMV呈现为阴性或是含量逐渐降低。此外,还对抗病转基因大豆植株的T_3种子进行了观察,并未发现SMV所导致的褐斑粒现象。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
介导的病毒抗性论文参考文献
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标签：黄瓜绿斑驳花叶病毒; 黄瓜microRNA; 靶基因; 功能;