导读:本文包含了鞭毛展示论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:大肠杆菌Nissle,1917,自杀性载体,鞭毛蛋白,6His标签
鞭毛展示论文文献综述
杨颖,区炳明,杨溢,张倩,杨玮枫[1]（2016）在《大肠杆菌Nissle 1917株鞭毛展示6His标签的构建及相关生物学特性分析》一文中研究指出为探索大肠杆菌Nissle 1917株(EcN)鞭毛展示的应用,本研究以重组质粒p UC18-fli C为模板,反向PCR产物经DpnⅠ、Exnase~(TM)Ⅱ重组环化,将6His标签基因分别插入无质粒大肠杆菌Nissle 1917(EcNcured of its two cryptic plasmids p MUT1和p MUT2;EcNc)fli C高变区774 bp~775 bp和792 bp~811 bp之间,构建嵌合鞭毛基因片段fliC01和fliC02。分别将其克隆于自杀性载体pRE112中,构建重组质粒pRE112-fliC01和pRE112-fliC02,并分别转化至EcNc中。通过一次重组和二次重组将嵌合鞭毛基因整合于EcNc基因组中,构建无抗性筛选的重组菌株EcNc fliC01和EcNc fliC02。对重组菌株进行生长状况、鞭毛形成以及体外细胞黏附试验和小鼠体内定植试验检测,结果表明EcNc fliC01和EcNc fliC02的生长未受影响,表达的嵌合鞭毛能够被H1多抗或His-Tag单克隆抗体识别并组装形成鞭毛丝;重组菌对IPEC-J2细胞的黏附能力及小鼠肠道定植能力与亲本株EcNc相比无显着性差异。本实验结果为进一步研究EcNc鞭毛展示技术应用于活疫苗研制奠定了基础。(本文来源于《中国预防兽医学报》期刊2016年05期）
杨颖[2]（2016）在《大肠杆菌Nissle 1917无质粒克隆菌株鞭毛表面展示功能探析》一文中研究指出大肠杆菌Nissle 1917 (Escherichia coli Nissle 1917;EcN)是德国医生Alfred Nissle于1917年从一名抗腹泻士兵粪便中首次分离出的一株益生菌,由于肠道内存在该株“强大效能且具有拮抗活性”的大肠杆菌,该士兵免受肠道传染病流行区疾病的侵扰。随后,在德国和其他一些欧洲国家,EcN作为人用药Mutaflor(?)的活性成分,在治疗各种肠道疾病中扮演着重要角色。近年来,EcN表达外源基因作为疾病诊治载体的研究越来越多,其内含的pMUT2、I型分泌系统以及V型分泌系统等皆用于将外源抗原展呈于EcN表面。鞭毛表面展示属于细菌表面展示技术之一,其基于鞭毛蛋白的高变区可容纳外源多肽且组装成鞭毛丝进而实现外源多肽的表面展示。鞭毛表面展示技术较多在报道沙门氏菌中,而未曾在EcN菌株中探索研究。鉴于EcN是强大效能益生菌,本研究首先构建了EcN无质粒克隆菌株EcNc (EcN cured of its two cryptic plasmids pMUT1 and pMUT2; EcNc),以其鞭毛蛋白高变区为切入点来探讨EcNc鞭毛表面展示。EcN中含有pMUT1、pMUT2两个隐秘大质粒,且2个质粒在传代中很稳定,不易丢失；pMUT1带有ColE1类型复制系统,pMUT2含有类ColE2复制系统,然而对这2个隐秘大质粒的生物学意义了解较少。有研究报道大肠杆菌的致病性受到质粒的调控,且部分大肠杆菌菌株的抗性基因也可能与其隐秘质粒有关。为减少上述隐秘质粒对外源性重组质粒转化和基因组DNA操作带来的不便,同时考虑EcN作为载体菌时其隐秘质粒对人和宿主动物可能产生的副作用,本试验使用限制性内切酶Sph I将携带sacB的自杀性质粒载体pRE112分别与隐秘质粒pMUT1、pMUT2连接,构建重组质粒载体pMUT1-pRE112和pMUT2-pRE112,进一步应用竞争性抑制分别去除EcN自身携带的隐秘质粒,基于自杀性质粒sacB基因的特性,在含10%蔗糖的培养基平板上实施自杀质粒自身消除,最后获得EcN无质粒克隆菌株即EcN△pMUT1△ApMUT2,命名为EcNc (EcN cured of its twocryptic plasmids pMUT1 and pMUT2)对无质粒菌株EcNc生长状况、生化试验、电镜观察以及体外细胞黏附检测,试验结果表明去除两个隐秘大质粒后的EcNc,其生长、生化特性、血清学、形态学特征、体外细胞黏附与原型EcN一致,利用获得的EcNc菌株,将更加方便质粒的转化和遗传相关生物学操作。基于编码EcN菌株鞭毛蛋白的fliC基因序列,利用λ噬菌体Red同源重组系统对EcNc菌株的fliC基因进行敲除。首先纯化回收含有fliC基因同源臂片段和氯霉素抗性基因(cat)表达盒的PCR扩增产物,电转化至已携带pKD46质粒的EcNc菌株中,在Red同源重组酶Gam、Exo、Beta的作用下,PCR回收片段通过两翼同源序列与染色体对应靶基因序列同源重组,在氯霉素抗性平板上筛选到一次同源重组菌株EcNc △fliC::cat。再将质粒pCP20电转化EcNc △fliC::cat菌株,通过其在42℃C表达的Flp重组酶消除PCR片段中FRT位点之间的氯霉素抗性基因。经过PCR鉴定和DNA测序证明二次重组菌,即fliC缺失菌株EcNc △fliC构建成功。将pBR322-fliC电转化EcNc △fliC构建了回补菌株EcNc △fliC/pBR322-fliC。同时,以构建好的pU18-fliC重组质粒为模板,通过反向PCR分别构建了鞭毛蛋白基因859-888位、829-858位缺失的片段fliC1、fliC2,双酶切后连接到自杀载体pRE112中,构建重组自杀载体pRE 112-fliC1、pRE112-fliC2,将其分别导入EcNc菌株中,通过一次重组、二次重组及DNA测序筛选到EcNc鞭毛蛋白基因部分高变区缺失的菌株EcNcfliC1、EcNcfliC2。上述EcNc、EcNc △fliC、EcNc △fliC/pBR322-fliC、EcNc fliC1、EcNc fliC2的成功构建,旨在进一步探索鞭毛蛋白高变区序列改变对EcNc性状的影响。测试EcNc、EcNc △fliC、EcNc △fliC/pBR322-fliC、EcNc fliC1、EcNcfliC2的生长性能、运动性、鞭毛的抗原性、鞭毛形成以及体外细胞黏附、体内肠道定植能力。结果显示,各株细菌生化特性一致,生长性能没有差异变化；EcNc △fliC在半固体培养基上无运动性能,Western blot检测不到鞭毛蛋白的表达,且电镜下观察不到鞭毛形态,其对IPEC-J2的黏附能力相对于EcNc则下降64%(p=0.002)、相对于EcNc fliC1下降52%(p=0.018)、相对于EcNc fliC2下降50%(p=0.01)。EcNc △fliC回补菌株EcNc △filC/pBR322-fliC与EcNc的特性相一致,对IPEC-J2的黏附能力恢复到EcNc的黏附水平；用Western blot能检测到EcNc fliC1、EcNc fliC2鞭毛蛋白的表达,电镜下亦能观察到鞭毛丝,但它们在半固体培养基上几乎不能运动,EcNc fliC1、EcNc fliC2对IPEC-J2的黏附能力相对于EcNc则分别下降26%(p=0.124),29%(p=0.586),差异不显着；但EcNc fliC1对IPEC-J2的黏附能力比EcNc △fliC高52%(p=0.018),EcNc fliC2对IPEC-J2的黏附能力比EcNc △fliC高50%(p=0.01)。在体内肠道定植试验中,接种后第1 d、第3 d、第7d取样检测,各组细菌在同一肠段(回肠、盲肠或结肠)的定植能力无显着差异；但各组细菌在盲肠的定植数量高于各自在回肠和结肠的定植,尤其是接种后第1 d, EcNc/pBR322、EcNc △fliC/pBR322-fliC、EcNc fliC1/pBR322、EcNc filC2/pBR322在盲肠的定植显着高于其各自在回肠的定植数量。EcNc还具有F1A、F1C和卷曲菌毛等黏附因子,他们也共同介导和促进细菌在动物体内的定植,使得EcNc △filC/pBR322也能在小鼠肠道有效定植。EcNc鞭毛蛋白高变区分别缺失287-296位或者277-286位10个氨基酸后亦能表达鞭毛蛋白并形成鞭毛丝,且不影响重组菌在小鼠体内的定植能力,说明EcNc鞭毛蛋白高变区能容许部分氨基酸的缺失。随后本研究尝试以鞭毛基因高变区表面展示外源基因。以重组质粒pUC18-fliC为模板,设计两对含六聚组氨酸肽(6His)基因的反向PCR引物,反向PCR产物经Dpn I、 Exnase TM Ⅱ重组环化,分别获得含有嵌合鞭毛基因片段(fliC01、fliC02)的重组质粒pUC18-fliC01、pUC18-fliC02, fliC01、fliC02这两个片段为将六聚组氨酸肽(6His)基因分别插入EcNc fliC高变区774-775位和792-811位碱基之间的序列。将fliC01、fliC02片段分别插入自杀性载体pRE1 12,获得重组质粒pRE112-fliC01、pRE112-fliC02,再将其分别转化EcNc。通过一次重组和二次重组将嵌合鞭毛基因整合入EcNc基因组中,最终获得无抗性筛选盒的重组菌株EcNc fliC01、EcNc fliC02。对重组菌株生长状况、鞭毛形成以及体外细胞黏附试验和小鼠体内定植试验分析,结果表明EcNc fliC01、EcNc fliC02的生长未受影响,表达的嵌合鞭毛蛋白能被H1多抗或His-Tag单抗识别并且能组装形成鞭毛丝；EcNc fliC01、EcNc fliC02对IPEC-J2细胞的黏附能力及小鼠肠道定植能力与EcNc相比无显着性差异。EcNc鞭毛蛋白插入6His后能将其展呈于菌体表面。在利用EcNc鞭毛成功展示6His后,本研究以重组质粒pUC18-fliC为模板,设计两对分别含有BVDV (Bovine viral diarrhea virus) NADL毒株E2蛋白B、T细胞表位基因的反向PCR引物,反向PCR产物经Dpn Ⅰ、ExnaseTM Ⅱ重组环化,分别获得含有嵌合鞭毛基因片段(fliCB、fliCT)的重组质粒pUC18-fliCB、pUC18-fliCT, fliCB、fliCT片段为将B细胞表位、T细胞表位基因分别插入fliC基因792-811位碱基之间构建的嵌合鞭毛基因片段。将fliCB、fliCT片段分别插入自杀性载体pRE112,获得重组质粒pRE112-fliCB、 pRE112-fliCT,再将其分别转化EcNc。通过一次重组和二次重组将嵌合鞭毛基因整合入EcNc基因组中,筛选获得无抗性筛选盒的重组菌株EcNc fliCB、EcNc fliCT。两株重组菌株生长、鞭毛形成以及体外细胞黏附试验与EcNc无显着差异；在半固体平板上,EcNc fliCB无运动性,而EcNc fliCT具有运动性。将EcNc、EcNc fliCB、EcNc fliCT灌胃免疫SPF BALB/c小鼠,二免后一周收集血液和肠道,检测小鼠体内产生抗B、T细胞表位的特异性抗体IgA、IgG,结果表明,免疫重组菌株EcNc fliCB能够刺激机体产生抗B细胞表位的IgG抗体(0.552±0.027),免疫EcNc fliCT同样能够刺激机体产生抗T细胞表位IgG抗体(0.515±0.049),空白对照组(免疫EcN)未检测出针对相应包被蛋白的IgG抗体。免疫EcNc fliCB小鼠肠道能检测出针对B细胞表位的IgA抗体(0.367±0.030),与空白对照组差异显着(0.040±0.017；p=0.040)；免疫EcNc fliCT小鼠肠道能检测出针对T细胞表位的IgA抗体(0.371±0.034),与空白对照组差异显着(0.024±0.010;p=0.025)。EcNc fliCB、EcNc fliCT能诱导B、T细胞表位抗原特异的体液及黏膜免疫应答。上述试验结果证明EcNc鞭毛蛋白不同高变区能携带一定大小的外源抗原并较好展呈于菌体表面,为优质益生菌EcN更好的潜在应用研究奠定了基础。(本文来源于《扬州大学》期刊2016-05-01）
安烨,王宏俊,徐慧,龚玉梅,张培君[3]（2009）在《IBV抗原模拟表位在大肠杆菌鞭毛上的展示》一文中研究指出目的为进一步验证通过噬菌体肽库筛选得到的2个IBV抗原模拟表位在脱离噬菌体后仍具有与IBV抗体结合的生物学活性。方法应用基因工程技术,合成这2个IBV抗原模拟表位:KSPKIHSSSALHF和SIIQMNLHRPTS的编码碱基序列,将其分别插入质粒pFliTrx,成功构建重组展示载体p1和p2,并分别转化大肠杆菌GI826,形成展示IBV模拟抗原表位肽的重组菌F1和F2。结果体外抗原抗体反应试验表明重组菌F1与F2可以与IBV阳性鸡血清特异性结合。结论提示得到的2个抗原模拟表位在脱离噬菌体后,仍具有与IBV抗体结合的生物学活性,在研制IBV新型疫苗和诊断试剂方面具有潜在的应用价值。(本文来源于《微生物与人类健康科技论坛论文汇编》期刊2009-01-09）
安烨,王宏俊,徐慧,龚玉梅,张培君[4]（2008）在《传染性支气管炎病毒抗原模拟表位在大肠杆菌鞭毛上的展示》一文中研究指出目的:进一步验证通过噬菌体肽库筛选得到的2个传染性支气管炎病毒(IBV)抗原模拟表位在脱离噬菌体后仍具有与IBV抗体结合的生物学活性。方法:应用基因工程技术合成2个IBV抗原模拟表位(KSPKHSSSALHF和SⅡQMNLHR PTS)的编码碱基序列,将其分别插入质粒pFliTrx,构建重组展示载体p1和p2,并分别转化大肠杆菌GI826,形成展示IBV模拟抗原表位肽的重组菌F1和F2,进行体外抗原抗体反应。结果:体外抗原抗体反应试验表明,重组菌F1与F2可以与IBV阳性鸡血清特异性结合。结论:提示得到的2个抗原模拟表位在脱离噬菌体后,仍具有与IBV抗体结合的生物学活性,在研制IBV新型疫苗和诊断试剂方面具有潜在的应用价值。(本文来源于《生物技术通讯》期刊2008年03期）
辛忠涛,薛沿宁,高亚萍,茆灿泉,柳川[5]（2003）在《利用细菌鞭毛展示的随机肽库筛选HBV-PreS2蛋白表位》一文中研究指出目的建立、改进并完善从细菌表面展示随机肽库中进行抗原表位筛选及鉴定的方法。方法以1株抗HBV-PreS2的单克隆抗体3B9为靶标,对FliTrxTM随机肽库进行筛选;监测每轮与抗体特异性结合的细菌克隆富集情况;通过逐轮增加洗涤强度筛选高亲和力克隆;对筛选出的克隆进行序列测定和Westernblot鉴定。结果筛选过程中与抗体特异性结合的细菌克隆逐轮得到富集,对16个克隆进行序列测定,共获得10种序列,其中7个序列含典型的RXR(K)GXY保守序列,与病毒PreS蛋白135～140位氨基酸高度同源,Westernblot反应为阳性;另外3个序列均不含典型的RXR(K)GXY结构,Westernblot反应结果不一。结论细菌表面展示的随机肽库是一种简捷、快速的抗原表位筛选方法。(本文来源于《中国医学科学院学报》期刊2003年01期）
李朝,周艳荣,程度胜,黄培堂[6]（2002）在《利用大肠杆菌鞭毛展示的随机肽库筛选TNF-α拮抗肽》一文中研究指出TNF α是一种在机体抗感染、抗肿瘤过程中发挥重要作用的细胞因子 ,其对机体具有保护和损伤两方面的作用 ,为了探讨新的抑制TNF α所致炎症损伤等反应的手段 ,构建了细菌鞭毛递呈的随机肽库 ,利用构建得到的肽库 ,进行TNF α特异性结合肽的筛选工作。经过 5轮筛选及DNA测序 ,共得到 6条小肽编码序列。其中 2条序列中含有一V N WG的相同序列框架。进行 6条序列与TNF α结合力的确证后 ,选择了其中的 4条肽序列进行人工化学合成、纯化及鉴定。利用L92 9细胞及MTT法对 4条小肽进行活性测定 ,检测其对TNF α的抑制活性。结果表明 ,在TNF α对L92 9细胞毒性为 30 %左右时 ,含同源序列框架的 2条肽可抑制 90 %左右的TNF α活性(本文来源于《生物工程学报》期刊2002年05期）
鞭毛展示论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
大肠杆菌Nissle 1917 (Escherichia coli Nissle 1917;EcN)是德国医生Alfred Nissle于1917年从一名抗腹泻士兵粪便中首次分离出的一株益生菌,由于肠道内存在该株“强大效能且具有拮抗活性”的大肠杆菌,该士兵免受肠道传染病流行区疾病的侵扰。随后,在德国和其他一些欧洲国家,EcN作为人用药Mutaflor(?)的活性成分,在治疗各种肠道疾病中扮演着重要角色。近年来,EcN表达外源基因作为疾病诊治载体的研究越来越多,其内含的pMUT2、I型分泌系统以及V型分泌系统等皆用于将外源抗原展呈于EcN表面。鞭毛表面展示属于细菌表面展示技术之一,其基于鞭毛蛋白的高变区可容纳外源多肽且组装成鞭毛丝进而实现外源多肽的表面展示。鞭毛表面展示技术较多在报道沙门氏菌中,而未曾在EcN菌株中探索研究。鉴于EcN是强大效能益生菌,本研究首先构建了EcN无质粒克隆菌株EcNc (EcN cured of its two cryptic plasmids pMUT1 and pMUT2; EcNc),以其鞭毛蛋白高变区为切入点来探讨EcNc鞭毛表面展示。EcN中含有pMUT1、pMUT2两个隐秘大质粒,且2个质粒在传代中很稳定,不易丢失；pMUT1带有ColE1类型复制系统,pMUT2含有类ColE2复制系统,然而对这2个隐秘大质粒的生物学意义了解较少。有研究报道大肠杆菌的致病性受到质粒的调控,且部分大肠杆菌菌株的抗性基因也可能与其隐秘质粒有关。为减少上述隐秘质粒对外源性重组质粒转化和基因组DNA操作带来的不便,同时考虑EcN作为载体菌时其隐秘质粒对人和宿主动物可能产生的副作用,本试验使用限制性内切酶Sph I将携带sacB的自杀性质粒载体pRE112分别与隐秘质粒pMUT1、pMUT2连接,构建重组质粒载体pMUT1-pRE112和pMUT2-pRE112,进一步应用竞争性抑制分别去除EcN自身携带的隐秘质粒,基于自杀性质粒sacB基因的特性,在含10%蔗糖的培养基平板上实施自杀质粒自身消除,最后获得EcN无质粒克隆菌株即EcN△pMUT1△ApMUT2,命名为EcNc (EcN cured of its twocryptic plasmids pMUT1 and pMUT2)对无质粒菌株EcNc生长状况、生化试验、电镜观察以及体外细胞黏附检测,试验结果表明去除两个隐秘大质粒后的EcNc,其生长、生化特性、血清学、形态学特征、体外细胞黏附与原型EcN一致,利用获得的EcNc菌株,将更加方便质粒的转化和遗传相关生物学操作。基于编码EcN菌株鞭毛蛋白的fliC基因序列,利用λ噬菌体Red同源重组系统对EcNc菌株的fliC基因进行敲除。首先纯化回收含有fliC基因同源臂片段和氯霉素抗性基因(cat)表达盒的PCR扩增产物,电转化至已携带pKD46质粒的EcNc菌株中,在Red同源重组酶Gam、Exo、Beta的作用下,PCR回收片段通过两翼同源序列与染色体对应靶基因序列同源重组,在氯霉素抗性平板上筛选到一次同源重组菌株EcNc △fliC::cat。再将质粒pCP20电转化EcNc △fliC::cat菌株,通过其在42℃C表达的Flp重组酶消除PCR片段中FRT位点之间的氯霉素抗性基因。经过PCR鉴定和DNA测序证明二次重组菌,即fliC缺失菌株EcNc △fliC构建成功。将pBR322-fliC电转化EcNc △fliC构建了回补菌株EcNc △fliC/pBR322-fliC。同时,以构建好的pU18-fliC重组质粒为模板,通过反向PCR分别构建了鞭毛蛋白基因859-888位、829-858位缺失的片段fliC1、fliC2,双酶切后连接到自杀载体pRE112中,构建重组自杀载体pRE 112-fliC1、pRE112-fliC2,将其分别导入EcNc菌株中,通过一次重组、二次重组及DNA测序筛选到EcNc鞭毛蛋白基因部分高变区缺失的菌株EcNcfliC1、EcNcfliC2。上述EcNc、EcNc △fliC、EcNc △fliC/pBR322-fliC、EcNc fliC1、EcNc fliC2的成功构建,旨在进一步探索鞭毛蛋白高变区序列改变对EcNc性状的影响。测试EcNc、EcNc △fliC、EcNc △fliC/pBR322-fliC、EcNc fliC1、EcNcfliC2的生长性能、运动性、鞭毛的抗原性、鞭毛形成以及体外细胞黏附、体内肠道定植能力。结果显示,各株细菌生化特性一致,生长性能没有差异变化；EcNc △fliC在半固体培养基上无运动性能,Western blot检测不到鞭毛蛋白的表达,且电镜下观察不到鞭毛形态,其对IPEC-J2的黏附能力相对于EcNc则下降64%(p=0.002)、相对于EcNc fliC1下降52%(p=0.018)、相对于EcNc fliC2下降50%(p=0.01)。EcNc △fliC回补菌株EcNc △filC/pBR322-fliC与EcNc的特性相一致,对IPEC-J2的黏附能力恢复到EcNc的黏附水平；用Western blot能检测到EcNc fliC1、EcNc fliC2鞭毛蛋白的表达,电镜下亦能观察到鞭毛丝,但它们在半固体培养基上几乎不能运动,EcNc fliC1、EcNc fliC2对IPEC-J2的黏附能力相对于EcNc则分别下降26%(p=0.124),29%(p=0.586),差异不显着；但EcNc fliC1对IPEC-J2的黏附能力比EcNc △fliC高52%(p=0.018),EcNc fliC2对IPEC-J2的黏附能力比EcNc △fliC高50%(p=0.01)。在体内肠道定植试验中,接种后第1 d、第3 d、第7d取样检测,各组细菌在同一肠段(回肠、盲肠或结肠)的定植能力无显着差异；但各组细菌在盲肠的定植数量高于各自在回肠和结肠的定植,尤其是接种后第1 d, EcNc/pBR322、EcNc △fliC/pBR322-fliC、EcNc fliC1/pBR322、EcNc filC2/pBR322在盲肠的定植显着高于其各自在回肠的定植数量。EcNc还具有F1A、F1C和卷曲菌毛等黏附因子,他们也共同介导和促进细菌在动物体内的定植,使得EcNc △filC/pBR322也能在小鼠肠道有效定植。EcNc鞭毛蛋白高变区分别缺失287-296位或者277-286位10个氨基酸后亦能表达鞭毛蛋白并形成鞭毛丝,且不影响重组菌在小鼠体内的定植能力,说明EcNc鞭毛蛋白高变区能容许部分氨基酸的缺失。随后本研究尝试以鞭毛基因高变区表面展示外源基因。以重组质粒pUC18-fliC为模板,设计两对含六聚组氨酸肽(6His)基因的反向PCR引物,反向PCR产物经Dpn I、 Exnase TM Ⅱ重组环化,分别获得含有嵌合鞭毛基因片段(fliC01、fliC02)的重组质粒pUC18-fliC01、pUC18-fliC02, fliC01、fliC02这两个片段为将六聚组氨酸肽(6His)基因分别插入EcNc fliC高变区774-775位和792-811位碱基之间的序列。将fliC01、fliC02片段分别插入自杀性载体pRE1 12,获得重组质粒pRE112-fliC01、pRE112-fliC02,再将其分别转化EcNc。通过一次重组和二次重组将嵌合鞭毛基因整合入EcNc基因组中,最终获得无抗性筛选盒的重组菌株EcNc fliC01、EcNc fliC02。对重组菌株生长状况、鞭毛形成以及体外细胞黏附试验和小鼠体内定植试验分析,结果表明EcNc fliC01、EcNc fliC02的生长未受影响,表达的嵌合鞭毛蛋白能被H1多抗或His-Tag单抗识别并且能组装形成鞭毛丝；EcNc fliC01、EcNc fliC02对IPEC-J2细胞的黏附能力及小鼠肠道定植能力与EcNc相比无显着性差异。EcNc鞭毛蛋白插入6His后能将其展呈于菌体表面。在利用EcNc鞭毛成功展示6His后,本研究以重组质粒pUC18-fliC为模板,设计两对分别含有BVDV (Bovine viral diarrhea virus) NADL毒株E2蛋白B、T细胞表位基因的反向PCR引物,反向PCR产物经Dpn Ⅰ、ExnaseTM Ⅱ重组环化,分别获得含有嵌合鞭毛基因片段(fliCB、fliCT)的重组质粒pUC18-fliCB、pUC18-fliCT, fliCB、fliCT片段为将B细胞表位、T细胞表位基因分别插入fliC基因792-811位碱基之间构建的嵌合鞭毛基因片段。将fliCB、fliCT片段分别插入自杀性载体pRE112,获得重组质粒pRE112-fliCB、 pRE112-fliCT,再将其分别转化EcNc。通过一次重组和二次重组将嵌合鞭毛基因整合入EcNc基因组中,筛选获得无抗性筛选盒的重组菌株EcNc fliCB、EcNc fliCT。两株重组菌株生长、鞭毛形成以及体外细胞黏附试验与EcNc无显着差异；在半固体平板上,EcNc fliCB无运动性,而EcNc fliCT具有运动性。将EcNc、EcNc fliCB、EcNc fliCT灌胃免疫SPF BALB/c小鼠,二免后一周收集血液和肠道,检测小鼠体内产生抗B、T细胞表位的特异性抗体IgA、IgG,结果表明,免疫重组菌株EcNc fliCB能够刺激机体产生抗B细胞表位的IgG抗体(0.552±0.027),免疫EcNc fliCT同样能够刺激机体产生抗T细胞表位IgG抗体(0.515±0.049),空白对照组(免疫EcN)未检测出针对相应包被蛋白的IgG抗体。免疫EcNc fliCB小鼠肠道能检测出针对B细胞表位的IgA抗体(0.367±0.030),与空白对照组差异显着(0.040±0.017；p=0.040)；免疫EcNc fliCT小鼠肠道能检测出针对T细胞表位的IgA抗体(0.371±0.034),与空白对照组差异显着(0.024±0.010;p=0.025)。EcNc fliCB、EcNc fliCT能诱导B、T细胞表位抗原特异的体液及黏膜免疫应答。上述试验结果证明EcNc鞭毛蛋白不同高变区能携带一定大小的外源抗原并较好展呈于菌体表面,为优质益生菌EcN更好的潜在应用研究奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
鞭毛展示论文参考文献
[1].杨颖,区炳明,杨溢,张倩,杨玮枫.大肠杆菌Nissle1917株鞭毛展示6His标签的构建及相关生物学特性分析[J].中国预防兽医学报.2016
[2].杨颖.大肠杆菌Nissle1917无质粒克隆菌株鞭毛表面展示功能探析[D].扬州大学.2016
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标签：大肠杆菌Nissle; 1917; 自杀性载体; 鞭毛蛋白; 6His标签;