柯苑马成平马贵明（南京红十字血液中心210003）
目前，采供血机构血液检测的常规方法仍然是酶联免疫吸附试验(ELISA)，一块标准的ELISA板共有96孔，笔者通过一些实验发现样本在板中的位置排布对检测结果会有一定的影响，现报告如下：
1材料与方法
1.1样本来源
从北京康彻思坦生物技术有限公司购买的丙型肝炎病毒抗体血清（液体）标准物质，含量为1NCU/ml,批号为200905002。
1.2试剂与仪器
HCV抗体诊断试剂盒（厦门新创），其中方法一使用的试剂批号为2010055809，方法二使用的试剂批号为2010065812。ATplus2全自动加样器（瑞士哈密尔顿公司），FAME2420全自动酶免分析系统（瑞士哈密尔顿公司）。
1.3方法一
1.3.1实验设计
实验所用的HCV抗体诊断试剂盒（厦门新创）的实验步骤是加入样本孵育25分钟-洗板-加酶孵育25分钟-洗板-加入显色剂孵育10分钟后显色。ATplus2的加样顺序为A-H排。加样一块板的时间是12分钟左右，除去扫描条码和加稀释液的时间，在同一块板内A排样本和H排样本的加样时间差在10分钟左右。那么A排的样本应该比H排的样本多孵育了10分钟。虽然这10分钟的温度达不到说明书所规定的37℃，但是HCV检测的第一步孵育时间只有25分钟，方法一就是观察这10分钟对检测结果的影响。
1.3.2实验步骤
将加在HCV板的A6孔的标准物质在H12孔重复加样一次，加样条件完全相同，检测结果由FAME自动释放，记录每次的S/CO值，进行统计分析。
1.4方法二
1.4.1实验设计
在酶联免疫反应（ELISA）中常发现有“边缘效应”，即96孔板的外周孔显色较中心孔深[1]。经研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因。孔板的聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。方法二就是在孔的外周和中心加入同样的标准物质，观察“边缘效应”对FAME2420全自动酶免分析系统的影响。
1.4.2实验步骤
我们将HCV板的相应位置加入相同标准物质，加样方式为手工加样，加样顺序为从左到右。检测结果由FAME自动释放，记录每孔的S/CO值，进行统计分析。具体加样位置见图1，图中阴影部分为中间孔，其余编号的为外周孔。
2结果
2.1方法一结果
将A排和H排的检测结果S/CO值作为一组配对资料进行t检验，原始数据见表1。
表1A排和H排的标准物质检测S/CO值
计算得出T=4.361，P<0.05。可以认为两组数据有显著性差异，也就是在相同条件下,A排和H排检测同一份样本，结果是有显著性差异的。
2.2方法二结果
将中间孔和外周孔的检测结果S/CO值作为两组独立样本资料进行t检验，原始数据见表2。
表2中间孔和外周孔的标准物质检测S/CO值
计算得出T=1.253，P>0.05。可以认为两组数据没有显著性差异。即边缘效应对本实验室的FAME2420全自动酶免分析系统没有太大影响。
3讨论
目前，核酸检测还没有大规模开展，ELISA仍然是血液检测的常规方法，根据上述方法一实验结果得知，我们目前所用的HCV抗体检测试剂（厦门新创），因为A排和H排之间的加样时间差而导致同一份样本的检测结果的差异是显著的。而且都是A排高于H排。假设我们将H排标准物质的S/CO值重新绘制L-J质控图，那么A排的质控值则大部分位于该图均值上方，同理可以推测位于前几排的样本因为孵育时间较长的缘故可能会产生假阳性，从而导致血液产品的浪费。虽然我们的实验采用的是HCV抗体检测试剂，但是加样时差对HBsAg的ELISA检测结果也有类似的影响[2]。国内也有相关报道，说明同种试剂使用长短不同的孵育方法对弱阳性标本的检出能力有所不同[3]。根据上述方法二实验结果，我们实验室目前使用的全自动酶免分析系统受边缘效应的影响较小，这可能得益于FAME的加热原理以及我们实验室环境温度的相对恒定。
综上所述，笔者觉得标准物质加样位置应随机化，多点化，也就是不固定每块板中标准物质的加样位置和个数，可以考虑把标准物质随机放在96孔板的任意位置，这样在建立质控框架的时候可以减少随机误差的发生，同样可以减少上述因为孵育时间差别而导致的结果差异，同时可以较好的避免类似假阳性增加问题的发生。在目前全国大范围血液紧张的情况下，尽可能减少血液产品的浪费。
参考文献
[1]许斌，朱虎定．EIISA检测HBsAg影响因素的探讨．临床检验杂志，2000，18(4)：232．
[2]朱远雁，余俊平，刘涛．加样时差对献血者HBsAgELISA结果的影响．中国输血杂志，2002,15（4）：238．
[3]高丽，孙丽，任芙蓉等．同种试剂不同孵育时间检测抗-HCV的差异分析．中国输血杂志，2008,21（7）：531．.