童正喜张克昌（通讯作者）（滁州市第一人民医院检验科安徽滁州239000）
【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）30-0105-02
流感嗜血杆菌是一种革兰氏阴性小杆菌，常寄生于人体呼吸道，可引起儿童严重细菌性感染如脑膜炎、肺炎、菌血症等。氨苄西林和阿莫西林是治疗流感嗜血杆菌常用的首选药物，但在抗生素的广泛使用下，耐药菌株经常有报道。1972年在欧洲首次报道氨苄西林耐药，随后的三十多年这种细菌对各种抗生素的耐药性不断上升，如β-内酰胺类抗生素、氯霉素、复方新诺明和大环内酯类等。
1对β-内酰胺类抗生素的耐药现状
β-内酰胺类抗生素发生耐药的主要机制是产生β-内酰胺酶。1941年首次发现质粒介导的TEM-1型酶，此后，产生耐药菌株的比例在所有血清型中都不断提高。流感嗜血杆菌产生β-内酰胺酶耐药菌株在不同地区的差异很大。2002年Hoban等报道产β-内酰胺酶流感嗜血杆菌菌株流行情况，美国是25.7%，法国是31.1%，英国是14.6%，德国是3.2%，日本是8.5%，如今在一些国家已经开始下降，美国从1994年的36%降到2002年的26%，日本从1995年的25%降到1999年的3%[1]。
1.1对氨苄西林的耐药性
自1974年首次报道流感嗜血杆菌对氨苄青霉素耐药以来，其耐药性逐渐上升并出现明显的地区差异。GLOBALE对5828株流感嗜血杆菌监测中显示对氨苄西林的耐药率从8.7%（南非）到28.6%（亚洲）[2]。我国2009年14家医院流感嗜血杆菌氨苄西林的耐药率为26.8%[3]。
1.2对其他β-内酰胺类抗生素的耐药性
流感嗜血杆菌对其他β-内酰胺类抗生素的敏感性较高。英国1999-2007期间跟踪监测显示除了头孢克洛耐药率为11.7%外，其他头孢类抗生素几乎100%敏感[4]。故二三代头孢类抗生素可作为临床治疗流感嗜血杆菌感染的首选药物。
1.3对非β-内酰胺类抗生素的耐药性
古巴1990～2002年期间对非β-内酰胺类抗生素的耐药性呈上升趋势，氯霉素40.1％-51.6％，四环素23％-45.2％，复方新诺明45.4％-58.1%。
2003-2005年对15个国家的5828株流感嗜血杆菌菌株监测表明对复方新诺明的耐药率为15.3%（美国）-40.3%（亚洲）[5]。英国对1999-2007年7371份菌株的监测中，复方新诺明的耐药率从9.7%上升至17.4%。四环素和大环内酯类的耐药率也在上升。除了对环丙沙星有较低的耐药率外，对氟喹诺酮类几乎100%敏感[6]。
2流感嗜血杆菌对抗生素的耐药机制
2.1对β-内酰胺类抗生素的耐药机制
对β-内酰胺类抗生素的耐药机制①流感嗜血杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制主要有：被细菌产生的β-内酰胺酶分解而失活。常见的β-内酰胺酶有TEM-1和ROB-1型，其中最常见的是TEM-1型。②结合靶位PBPs（青霉素结合蛋白）改变而引起亲和力降低。③细胞膜通透性改变而引起细菌对药物摄取量减少。④外排泵机制，将进入细胞从内药物泵出细胞集阻止药物与核糖体结合从而降低药物发挥作用。
2.1.1对β-内酰胺类抗生素产酶机制
β-内酰胺酶分为TEM型和ROB型[7]。编码TEM-1型β-内酰胺酶的耐药基因位于质粒BR322上或转座子A上，对该启动子的进一步研究已经发现了两个变异启动子的存在，即Pdel和Prpt。某些菌株在G23bp到C157bp之间有一段135bp缺失而被G162T取代，这在理论上产生了一个由Pa/Pb和P3启动子组成的功能上更强的启动子(Pdel)。还有一些菌株在145Tbp和198Abp之间有一段54bp插入序列，这在理论上产生一个额外的启动子(Prpt)。研究中有Pdel启动子的基因被检测到[7]。这种菌株对头孢克洛和氯碳头孢有更高的MIC值，与基因表达增加是一致的[8]。
2.1.2对β-内酰胺类抗生素不产酶耐药机制
β-内酰胺酶阴性的耐药机制主要是一种或多种PBP改变，导致PBPs与靶位亲和力降低，也有可能是外膜通透性的下降或主动外排机制的作用或是两种机制的结合。由于编码PBPs的基因位于细菌染色体上而不是位于质粒上，因此，PBP不是引起耐药播散的主要原因。
2.1.2.1PBPs的改变
PBPs是具有酶活性的参与细菌细胞壁合成的青霉素结合蛋白。PBP1A和PBP1B为转肽酶和转糖苷酶，PBP2和PBP3为转肽酶。高分子量PBPs常为多模块，具有氨基末端转移酶和羧基末端转肽酶，转肽酶区的活性位点丝氨酸与酶的天然底物能特异性结合，而β-内酰胺酶与底物结构相仿，可与活性丝氨酸位点结合，使之不可逆酰化而失活。
PBP3由ftsⅠ编码，PBP3A和PBP3B的突变已被公认时BLANAR的耐药机制。所有BLANAR耐药菌株都有PBP3改变。因PBP3在机体中活力最高，在抗生素选择压力下，ftsⅠ突变株自然被选择。流感嗜血杆菌中PBPs突变的数量和累积的PBPs种类越多，氨苄西林耐药性越严重。
2.1.2.2细胞膜通透性下降
完整的外膜蛋白(OMP)的渗透性通常依赖于孔蛋白的数量和特性。OMP由5个保守区夹着4个可变区组成。4个可变区位于表面，且易与抗体结合；保守区则埋于细胞膜中，不易被抗体识别。革兰氏阴性菌外膜孔蛋白通道非常狭窄，外膜蛋白改变使细胞膜通透性下降，产生耐药。流感嗜血杆菌的细胞膜蛋白主要有OMPA、OMPF和OMPC，其中OMPF最重要。OMPF的表达水平直接影响外膜对药物的通透性和耐药水平。
2.1.2.3外排泵介导的耐药
在BLNAR菌株中，高水平耐氨苄西林机制与外排泵有关。外排泵AcrAB由基因acrR编码。已知AcrAB外排泵在流感嗜血杆菌对大环内酯类抗生素的耐药机制中起重要作用，在对β-内酰胺类抗生素中的作用是微弱的。研究中发现它和PBPs改变一起导致氨苄西林耐药。在高的氨苄西林MIC的BLNAR菌株中显示了AcrAB外排泵和PBPs相结合起作用[7]。另外，大量的研究表明，在BLNAR菌株中，重组体的氨苄西林耐药水平远低于在体内水平[9]。表明可能还有未被发现的突变acrR基因。
2.2对氯霉素的耐药机制
流感嗜血杆菌对氯霉素的耐药机制通常是由cat基因编码的质粒介导的氯霉素乙酰基转移酶引起。少数菌株是由于细胞膜通透性下降引起，cat基因由接合质粒携带，并且这些基因常携带编码四环素和氨苄西林耐药基因。这些质粒可被整合进染色体。1985年Jane等对氯霉素耐药的外膜蛋白进行分析，发现40kd外膜蛋白数量明显减少，说明渗透性降低与外膜蛋白丧失有关。
2.3对叶酸代谢抑制剂的耐药机制
甲氧氨苄嘧啶或磺胺甲基异噁唑通过干扰细胞代谢，从而抑制四氢叶酸的生成。四氢叶酸是细胞代谢的一个重要的辅因子。编码二氢叶酸还原酶的基因常由质粒或转坐子携带，它的改变引起二氢叶酸还原酶产物增加，导致亲和力下降而产生耐药。Erme等认为，流感嗜血杆菌对磺胺的耐药机制有别于以前，在英国和肯尼亚对磺胺的耐药主要是由于SUI2基因介导和变型的folp基因介导。
2.4对四环素的耐药机制
流感嗜血杆菌对四环素的耐药机制主要与tet(B)基因编码的外排泵系统有关，其次为产生核糖体保护蛋白或染色体突变导致外膜通透性下降。tet(B)基因由质粒介导。四环素通过与细菌核糖体30S亚单位结合并阻tRNA结合到A位或P位而产生抗菌作用。
2.5对大环内酯类的耐药机制
核糖体甲基化酶和核糖体蛋白或RNA的改变可产生对大环内酯类的耐药。Erm基因介导靶位点修饰,编码核糖体甲基化酶，可使细菌23SrRNAA2058位点的腺嘌呤碱基N-6位甲基化。A2085是红霉素结合与细菌核糖体的关键位点，此位点的修饰可显著降低红霉素与细菌的结合。Erm基因位于Tn1545、Tn917或类似的接合型、非接合型转座子内或由质粒携带，能在细菌间广泛传播。现已检出Erm基因20余种。其中，erm(A)和erm(B)基因比较重要。流感嗜血杆菌外排泵acrAB与大肠杆菌的外排泵同源。
2.6对喹诺酮类的耐药机制
喹诺酮类通过干扰DNA复制而产生抗菌作用。在细菌复制过程中，DNA解螺旋酶和拓扑异构酶Ⅳ比较重要。耐药菌株通过改变编码DNA解螺旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的基因而起作用。在体外实验中，暴露于喹诺酮类抗生素的细菌可自发产生耐药突变株[17]。喹诺酮类由于毒性强目前还未被批准为儿科用药。
总之，尽管欧美大多数发达国家已将流感嗜血杆菌疫苗纳入国家计划免疫中，在我国包括大多数亚洲国家仍未将其列入计划免疫中。对耐药状况的持续监测，深入了解各种药物的耐药机制十分必要。通过掌握流感嗜血杆菌耐药流行情况，指导临床医师合理用药；耐药机制的阐明，便于研制出新的抗菌药物，也有利于临床医生为合理地联合用药提供可靠依据。
参考文献
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