本文主要研究内容
作者张海星（2019）在《丹参多酚氧化酶互作蛋白的筛选与验证》一文中研究指出：丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是我国传统的大宗药材,在治疗心血管疾病、保护肝脏和抗菌消炎等方面效果显著,被广泛应用于国内外临床治疗。其次生代谢产物主要分为酚酸类化合物和丹参酮类化合物。其中丹酚酸B为酚酸类成分的代表,主要通过苯丙氨酸途径和酪氨酸途径合成。同时,多酚氧化酶为家族基因,丹参多酚氧化酶基因家族研究不完整。本课题组前期研究表明丹参多酚氧化酶(SmPPO,GenBank登陆号为KF712274)能正向调控丹酚酸B的积累,并且能够响应干旱胁迫,但响应机制并不清楚。本文通过生物信息学方法对丹参多酚氧化酶基因家族进行分析,结合分子生物学方法探索SmPPO互作蛋白,探索SmPPO基因与丹酚酸B合成途径的联系,进行相关试验得出以下结果:1.通过HMM Search法分别从中国中药数据库和昆明理工大学公布的丹参基因组中搜索多酚氧化酶基因家族成员,最终确定出丹参多酚氧化酶基因家族成员有26个。对丹参基因家族进行家族内进化分析和物种间进化分析,结果表明家族内进化分为三个亚家族,SmPPO在第三个亚家族,这三个亚家族在数量上有明显差异;在物种间多酚氧化酶家族进化中丹参与马铃薯、菠菜的进化关系较近,物种间多酚氧化酶进化树呈单子叶植物、双子叶植物、藓类、真菌的顺序进行排列。2.分别以丹参的根、茎、叶、花为材料提取RNA,后对SmPPO进行组织特异性表达分析,结果表明丹参多酚氧化酶主要在根和茎中表达,在花中少量表达,在叶中几乎不表达;以SmPPO序列为模板扩增序列,构建重组35S-1301-GFP亚细胞定位载体,通过农杆菌转染烟草后,在生物激光共聚焦显微镜下观察荧光,确定出SmPPO定位于细胞核、细胞膜和叶绿体上。3.以丹酚酸B合成路径中的关键酶和实验室前期酵母双杂交筛选出的可能与SmPPO互作的阳性蛋白的基因为模板,分别构建pGADT7的载体,后分别与pGBKT7-SmPPO进行共转化验证,结果表明酪氨酸氨基转移酶(GenBank登陆号为DQ334606.1,TAT)和苯丙氨酸解氨酶(GenBank登陆号为EF462460.1,PAL1)均与SmPPO互作;分别以SmPPO、TAT和PAL1基因的编码区构建重组p SPYNE(R)173载体和p SPYCE(M)载体,通过烟草注射法进行双分子荧光检测(BiFC)试验,结果显示只有TAT与SmPPO互作,PAL1并不与SmPPO互作。4.分析SmPPO和TAT的氨基酸序列,根据其结构域对SmPPO和TAT氨基酸序列进行截短,构建诱饵载体和猎物载体,分别进行共转化验证试验,结果表明SmPPO与TAT互作位点为SmPPO N端前126aa;截短的TAT结构域部分不与SmPPO全长互作,表明只有完整的TAT才能和SmPPO发生互作。5.分别对TAT、PPO-N端(前165aa)和PPO去N端部分(166aa-589aa)进行亚细胞定位分析,结果表明:TAT定位在细胞膜上;PPO-N端(前165aa)定位于细胞核、细胞膜、叶绿体上;PPO去N端部分(166aa-589aa)定位于叶绿体上,几乎没有在细胞膜表达,不在细胞核中表达。
Abstract
dan can (Salvia miltiorrhiza Bunge)shi wo guo chuan tong de da zong yao cai ,zai zhi liao xin xie guan ji bing 、bao hu gan zang he kang jun xiao yan deng fang mian xiao guo xian zhe ,bei an fan ying yong yu guo nei wai lin chuang zhi liao 。ji ci sheng dai xie chan wu zhu yao fen wei fen suan lei hua ge wu he dan can tong lei hua ge wu 。ji zhong dan fen suan Bwei fen suan lei cheng fen de dai biao ,zhu yao tong guo ben bing an suan tu jing he lao an suan tu jing ge cheng 。tong shi ,duo fen yang hua mei wei jia zu ji yin ,dan can duo fen yang hua mei ji yin jia zu yan jiu bu wan zheng 。ben ke ti zu qian ji yan jiu biao ming dan can duo fen yang hua mei (SmPPO,GenBankdeng liu hao wei KF712274)neng zheng xiang diao kong dan fen suan Bde ji lei ,bing ju neng gou xiang ying gan han xie pai ,dan xiang ying ji zhi bing bu qing chu 。ben wen tong guo sheng wu xin xi xue fang fa dui dan can duo fen yang hua mei ji yin jia zu jin hang fen xi ,jie ge fen zi sheng wu xue fang fa tan suo SmPPOhu zuo dan bai ,tan suo SmPPOji yin yu dan fen suan Bge cheng tu jing de lian ji ,jin hang xiang guan shi yan de chu yi xia jie guo :1.tong guo HMM Searchfa fen bie cong zhong guo zhong yao shu ju ku he kun ming li gong da xue gong bu de dan can ji yin zu zhong sou suo duo fen yang hua mei ji yin jia zu cheng yuan ,zui zhong que ding chu dan can duo fen yang hua mei ji yin jia zu cheng yuan you 26ge 。dui dan can ji yin jia zu jin hang jia zu nei jin hua fen xi he wu chong jian jin hua fen xi ,jie guo biao ming jia zu nei jin hua fen wei san ge ya jia zu ,SmPPOzai di san ge ya jia zu ,zhe san ge ya jia zu zai shu liang shang you ming xian cha yi ;zai wu chong jian duo fen yang hua mei jia zu jin hua zhong dan can yu ma ling shu 、bo cai de jin hua guan ji jiao jin ,wu chong jian duo fen yang hua mei jin hua shu cheng chan zi xie zhi wu 、shuang zi xie zhi wu 、xian lei 、zhen jun de shun xu jin hang pai lie 。2.fen bie yi dan can de gen 、jing 、xie 、hua wei cai liao di qu RNA,hou dui SmPPOjin hang zu zhi te yi xing biao da fen xi ,jie guo biao ming dan can duo fen yang hua mei zhu yao zai gen he jing zhong biao da ,zai hua zhong shao liang biao da ,zai xie zhong ji hu bu biao da ;yi SmPPOxu lie wei mo ban kuo zeng xu lie ,gou jian chong zu 35S-1301-GFPya xi bao ding wei zai ti ,tong guo nong gan jun zhuai ran yan cao hou ,zai sheng wu ji guang gong ju jiao xian wei jing xia guan cha ying guang ,que ding chu SmPPOding wei yu xi bao he 、xi bao mo he xie lu ti shang 。3.yi dan fen suan Bge cheng lu jing zhong de guan jian mei he shi yan shi qian ji jiao mu shuang za jiao shai shua chu de ke neng yu SmPPOhu zuo de yang xing dan bai de ji yin wei mo ban ,fen bie gou jian pGADT7de zai ti ,hou fen bie yu pGBKT7-SmPPOjin hang gong zhuai hua yan zheng ,jie guo biao ming lao an suan an ji zhuai yi mei (GenBankdeng liu hao wei DQ334606.1,TAT)he ben bing an suan jie an mei (GenBankdeng liu hao wei EF462460.1,PAL1)jun yu SmPPOhu zuo ;fen bie yi SmPPO、TAThe PAL1ji yin de bian ma ou gou jian chong zu p SPYNE(R)173zai ti he p SPYCE(M)zai ti ,tong guo yan cao zhu she fa jin hang shuang fen zi ying guang jian ce (BiFC)shi yan ,jie guo xian shi zhi you TATyu SmPPOhu zuo ,PAL1bing bu yu SmPPOhu zuo 。4.fen xi SmPPOhe TATde an ji suan xu lie ,gen ju ji jie gou yu dui SmPPOhe TATan ji suan xu lie jin hang jie duan ,gou jian you er zai ti he lie wu zai ti ,fen bie jin hang gong zhuai hua yan zheng shi yan ,jie guo biao ming SmPPOyu TAThu zuo wei dian wei SmPPO Nduan qian 126aa;jie duan de TATjie gou yu bu fen bu yu SmPPOquan chang hu zuo ,biao ming zhi you wan zheng de TATcai neng he SmPPOfa sheng hu zuo 。5.fen bie dui TAT、PPO-Nduan (qian 165aa)he PPOqu Nduan bu fen (166aa-589aa)jin hang ya xi bao ding wei fen xi ,jie guo biao ming :TATding wei zai xi bao mo shang ;PPO-Nduan (qian 165aa)ding wei yu xi bao he 、xi bao mo 、xie lu ti shang ;PPOqu Nduan bu fen (166aa-589aa)ding wei yu xie lu ti shang ,ji hu mei you zai xi bao mo biao da ,bu zai xi bao he zhong biao da 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自西北农林科技大学的张海星，发表于刊物西北农林科技大学2019-07-11论文，是一篇关于丹参论文,多酚氧化酶论文,蛋白互作论文,亚细胞定位论文,西北农林科技大学2019-07-11论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自西北农林科技大学2019-07-11论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
标签：丹参论文; 多酚氧化酶论文; 蛋白互作论文; 亚细胞定位论文; 西北农林科技大学2019-07-11论文;