一、脑挫伤早期细胞凋亡相关基因表达的实验性研究（论文文献综述）
杨永祥[1]（2019）在《外泌体源性miR-124对创伤性脑损伤后海马区神经炎症和神经再生的作用和机制研究》文中指出背景创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）是由突然的外力作用导致的急性神经损伤性疾病,是世界范围内致死致残的主要病因之一。目前,尚没有治疗措施能够在TBI后有效的修复神经损伤和改善神经功能恢复。新近的研究发现存在于成体哺乳动物中枢神经再生区域之一的海马齿状回（dentate gyrus,DG）颗粒层下区的神经干细胞（neural stem cells,NSCs）在TBI后神经损伤修复和神经功能重建过程中发挥积极作用,从而使得海马区神经再生逐渐成为一个研究焦点。致力于TBI后海马神经再生的研究者们都在不遗余力的探索能够促进NSCs增殖和向神经元分化的新策略。TBI后海马区NSCs的增殖分化能力受到许多病理因素的影响,其再生修复潜能比较低下,不足以修复受损的神经。其中,TBI后海马区的神经炎症是制约NSCs发挥修复损伤能力的重要因素之一。神经炎症在TBI的病理生理机制中发挥重要作用,其在某种程度上对于损伤脑组织具有一定的保护作用,但通常情况下神经炎症会过度反应并降低海马区NSCs的再生修复能力和导致更差的神经功能恢复。小胶质细胞（microglia,MG）在激活和调节神经炎症反应的过程中发挥关键作用。目前的研究发现MG对海马区神经再生具有“双刃剑”作用。活化的MG有M1型和M2型两种极化状态,M1型是促炎类型,M2型是抑炎类型。MG向M1型极化不利于海马区NSCs发挥再生修复功能,而MG向M2型极化则能够促进海马区NSCs增殖分化。因此,探索能够在TBI后促进海马区MG由M1型向M2型转化的新策略对于抑制过度的神经炎症反应并提升NSCs再生修复能力和改善神经功能恢复具有重要意义。微小核糖核酸（microRNAs,miRNAs）是脑组织富含并对MG极化状态具有重要调控作用的生物活性分子。其中,miR-124是脑组织特异性表达并在MG中呈高表达的miRNA。在生理情况下,miR-124可以调控MG的生物学功能并维持其处于静息状态。在病理情况下,下调miR-124的表达可以促进MG由M2型向M1型极化并增加神经炎症;而上调miR-124的表达可以促进MG由M1型向M2型极化并减轻神经炎症。鉴于此,在TBI后将miR-124输送至中枢神经系统以提高海马区miR-124的含量可能是一种促进MG由M1型向M2型转化并进而提升NSCs再生修复能力的有力策略。然而,裸露miR-124的生化性质极不稳定而脆弱,很容易被降解而失去作用。因此,寻求能够将miR-124完整递送至中枢神经系统并发挥其生物学作用的可行方法具有重要的基础研究和实际应用价值。最新研究提示外泌体也许有希望成为一种可以将miR-124输送至中枢神经系统并使其发挥功能的重要载体。外泌体是由细胞分泌的直径为30-100nm的微粒,它具有磷脂包膜并富含蛋白质、磷脂、mRNAs和miRNAs等生物活性分子。外泌体的诸多优点使得其具有递送miR-124至中枢神经系统的潜能。首先,外泌体能够自由通过血脑屏障,这使得输送miR-124至中枢神经系统成为可能;其次,外泌体的磷脂包膜可以保护其内含物在输送过程中不被分解破坏,这使得miR-124在被输送至大脑后仍然能够保持结构完整和具有生物学功能。已有研究发现富含miR-124的外泌体可以促进N9型MG由M1型向M2型极化。然而,外泌体源性miR-124（exosome miR-124,Exo-miR-124）是否能够调控TBI后海马区MG的极化状态并进而影响神经再生,以及潜在的作用机制是什么尚不清楚。基于其他研究者的发现,Toll样受体4（Toll like receptor 4,TLR4）信号通路可能与Exo-miR-124调控TBI后海马区MG极化状态的作用机制相关。首先,TLR4特异性激活分子磷酸脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）可以活化海马区MG并抑制神经再生。其次,LPS可以增加TLR4信号通路下游分子NF-κB的表达水平,并最终诱导了不利于神经再生的炎症因子IL-6和TNF-α的释放。此外,新近的研究发现抑制TLR4的表达可以诱导MG向M2型极化并减轻了神经炎症,且过表达miR-124可以通过作用于TLR4的方式抑制LPS引起的MG活化。因此,TLR4通路可能在Exo-miR-124调控TBI后海马区MG极化状态并影响神经再生的机制中发挥重要作用。目的本研究的目的是探索利用Exo-miR-124调控TBI后海马区MG的极化状态并进而影响神经炎症、神经再生的可能性;并探讨Exo-miR-124是否是通过作用于TLR4信号通路调控了MG的极化状态。本研究结果将有望为探索利用外泌体将miR-124输送至大脑并改善TBI后神经功能恢复的新策略提供理论参考。方法1.利用装载miR-124的质粒或空载质粒（Control）转染大鼠骨髓来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSCs）,通过实时定量聚合酶链法（quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）鉴定转染效果。然后应用ExoQuick-TC外泌体提取试剂盒从转染了miR-124或miR-Con的MSCs培养液上清中提取外泌体,通过电镜观察和蛋白印迹法（Western Blotting,WB）鉴定提取的外泌体,并应用qRT-PCR检测Exo-miR-124和Exo-Con这两种外泌体中miR-124的含量。2.将168只大鼠随机分为假损伤组（Sham）、TBI组、TBI+Exo-Con组和TBI+Exo-miR-124组,每组42只。利用控制性皮层损伤方法构建TBI大鼠模型,通过尾静脉在TBI构建后24小时将Exo-Con或Exo-miR-124注射入大鼠体内。在TBI后第3/7/14/28天,利用qRT-PCR检测miR-124的表达量;利用反转录聚合酶链法（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）检测M1型MG特征性分子CD32、IL-1β和M2型MG特征性分子CD206、Arginase-1的表达水平;并利用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA）以检测促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α和抑炎因子IL-4、IL-10、TGF-β的表达水平。3.为了分析Exo-miR-124对TBI后海马MG的调控机制以及TLR4信号通路在其中的作用,首先利用RT-PCR检测TBI后第3/7/14/28天海马组织内TLR4信号通路分子TLR4、MyD88、IRAK-1、TRAF6和NF-κB的表达水平。然后在体外将BV2型MG分为BV2（空白对照）组、BV2+LPS组、BV2+LPS+Exo-Con组和BV2+LPS+Exo-miR-124组。利用qRT-PCR检测BV2细胞内miR-124的表达水平;利用WB检测前述TLR4信号通路分子的表达水平;利用RT-PCR检测M1型MG特征性分子CD32、IL-1β和M2型MG特征性分子Arginase-1、CD206的表达水平;利用ELISA检测促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α和抑炎因子IL-4、IL-10、TGF-β的表达水平。4.为了探讨Exo-miR-124调控TBI大鼠海马区MG极化状态后对NSCs增殖分化能力的作用。首先,利用免疫荧光（immunofluorescence,IF）检测TBI后第7天海马区新生NSCs即BrdU+/SOX2+细胞和TBI后第28天由NSCs分化的神经元即BrdU+/NeuN+细胞数量。然后,利用神经功能评分（Neurological severity score,NSS）方法在TBI后7/14/21/28天评估运动、感觉等神经功能恢复情况;利用Morris水迷宫实验（Morris water maze,MWM）在TBI后24-28天评估认知记忆恢复情况。结果1.成功构建了高表达miR-124的外泌体即Exo-miR-124和Exo-Con,电镜图像显示外泌体为30-100nm的膜性微粒,WB提示CD9、CD63和CD81呈高表达,qRT-PCR提示Exo-miR-124中miR-124的表达水平明显高于Exo-Con。2.TBI后海马组织内M1型MG特征性分子CD32、IL-1β和M2型MG特征性分子Arginase-1、CD206的表达水平升高;且促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α和抑炎因子IL-4、IL-10、TGF-β的表达水平也升高。与Exo-Con相比,将Exo-miR-124输送入TBI大鼠体内后,海马组织内miR-124的表达量升高;M2型MG特征性分子Arginase-1、CD206和抑炎因子IL-4、IL-10、TGF-β的表达水平升高,而M1型MG特征性分子CD32、IL-1β和促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α的表达水平降低。3.TBI后海马组织内TLR4信号通路分子TLR4、MyD88、IRAK-1、TRAF6和NF-κB的表达水平升高。与Exo-Con相比,将Exo-miR-124输送入TBI大鼠体内降低了TLR4信号通路分子的表达水平。利用LPS刺激BV2细胞后,TLR4信号通路分子的表达水平升高。与Exo-Con相比,Exo-miR-124处理提高了BV2细胞中miR-124的表达水平并降低了TLR4信号通路分子的表达水平。LPS刺激BV2细胞后M1型MG特征性分子CD32、IL-1β和促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α的表达水平升高。与Exo-Con相比,Exo-miR-124处理降低了前述M1型MG特征性分子和促炎因子的表达水平,并提高了M2型MG特征性分子Arginase-1、CD206和抑炎因子IL-4、IL-10、TGF-β的表达水平。4.TBI后海马区新生NSCs即BrdU+/SOX2+细胞和NSCs分化为神经元即BrdU+/NeuN+细胞的数量均增多。与Exo-Con相比,将Exo-miR-124输送入TBI大鼠体内后,新生NSCs和NSCs分化为神经元的数量进一步升高。NSS和MWM评分提示TBI后大鼠的神经功能、认知记忆能力均受损;与Exo-Con相比,Exo-miR-124促进了神经功能和认知记忆能力的恢复。结论TBI后大鼠海马区M1型和M2型MG均活化,将Exo-miR-124输送入TBI大鼠体内促进了MG由M1型向M2型极化;且体内外实验均提示Exo-miR-124是通过抑制TLR4信号通路的活性促进了MG由M1型向M2型极化。进一步研究发现,Exo-miR-124促进TBI大鼠海马区MG由M1型向M2型极化后提高了NSCs的增殖分化能力和改善了神经功能恢复。
董雯雯[2]（2019）在《Nrf2在小鼠脑挫伤后动态表达及其神经保护作用机制研究》文中研究表明目的:创伤性脑损伤（Traumatic Brain Injury,TBI）是由直接外力引起的脑组织结构破坏和功能障碍,具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点。TBI是青壮年死亡和残疾的最主要的原因,全世界每年约近五千万人会遭受脑挫伤。TBI所致脑损伤包括外力直接作用引起的原发性损伤以及随后发生的继发性损伤。原发性损伤包括脑挫伤、脑血管损伤、轴索损伤等。继发性损伤是直接损伤造成的一系列细胞及生化级联反应,是导致脑损伤死亡或功能障碍的重要原因,包括氧化应激、谷氨酸兴奋性毒性、炎症反应、细胞凋亡等。氧化应激和炎症是继发性损伤的重要机制,理论上提高抗氧化反应和降低炎症反应可以减轻TBI引起的继发性脑损伤。核因子E2相关因子2（Nuclear factor-erythroid derived 2-related factors,Nrf2）,属于CNC-bZIP（cap‘n’collar subfamily of basic leucine zipper）,即CNC亮氨酸拉链转录激活因子家族,是细胞抗氧化应激反应的中枢调节因子。生理状态下,Nrf2与其胞浆蛋白伴侣分子Keap1（Kelch-like ECH associated protein1）结合形成稳定的二聚体,并锚定于细胞质的肌动蛋白上,导致Nrf2迅速泛素化和蛋白酶体依赖性的降解。当细胞处于氧化应激状态下,受到亲电子化合物或氧化物作用时,Nrf2和Keap1解偶联,由细胞质转移至细胞核内,与小Maf蛋白或其他bZIP蛋白结合成异二聚体,识别并结合抗氧化反应元件（Antioxidant response element,ARE）或亲电子元件（Electrophile Response Elements,EpRE）上的相应序列,从而启动下游基因的转录。研究表明,Nrf2在脑损伤和神经退行性疾病中发挥重要的神经保护作用。小鼠TBI后,Nrf2被激活,诱导细胞抗氧化反应。当小鼠缺乏Nrf2时,TBI引起更严重的氧化应激性损伤和功能障碍,Nrf2激动剂（包括萝卜硫素、叔丁基苯二酚等）则可以明显改善TBI引起的继发性损伤。我们推测,Nrf2可能是临床上治疗脑挫伤的重要靶点。姜黄素（curcumin）是从姜黄Curcuma longa L中分离出来一种化合物。姜黄素具有抗炎和抗氧化等生物学活性。迄今为止,研究者已经完成了100多项针对姜黄素的临床试验,这充分展现了姜黄素的安全性、耐受性及用于疾病治疗的有效性。研究表明,在TBI和缺血再灌注损伤中,姜黄素可以通过血脑屏障进而发挥神经保护作用,包括:改善脑水肿、炎症、细胞稳态、突触可塑性等,但其分子机制目前尚不清楚。细胞和动物实验研究表明,姜黄素可以激活Nrf2通路,但姜黄素是否通过激活Nrf2通路实现TBI后的神经保护作用,目前尚不清楚。在本实验中,内源性Nrf2通路在小鼠TBI后被激活,我们首先研究了Nrf2在TBI后损伤周边区神经元和胶质细胞内的表达变化,为法医学实践中推断脑损伤时间寻找生物学标志物。接下来,我们应用WT和Nrf2-KO小鼠给予姜黄素或溶剂,研究姜黄素是否通过激活Nrf2通路实现TBI后的神经保护作用,为临床上以Nrf2为靶点开展神经保护性治疗提供依据。研究方法:取8–12周成年雄性野生（WT）小鼠和Nrf2敲除（Nrf2-KO）小鼠（20–26g）,应用改良的Fenney的自由落体法制作中度脑挫伤模型。第一部分:将WT小鼠随机分为假手术组（Sham）和脑挫伤组（TBI）,并于TBI后1d、3d、7d和14d腹腔注射过量戊巴比妥钠处死实验小鼠并取脑组织。应用Western blot检测TBI后不同时间段Nrf2的蛋白表达,同时应用免疫荧光染色检测Nrf2在神经元（NeuN）、星形胶质细胞（GFAP）、小胶质细胞（IBA1）和NG2胶质细胞内的表达变化。第二部分:将WT和Nrf2-KO小鼠分别随机分为假手术组（Sham）和脑挫伤组（TBI）,TBI组又随机分为溶剂处理组（TBI+Veh）和姜黄素处理组（TBI+Cur）。TBI后24h腹腔注射过量戊巴比妥钠处死实验小鼠并取脑组织。应用Western blot和qRT-PCR检测Nrf2及其下游基因（Hmox-1,Nqo1,Gclm,and Gclc）的蛋白和mRNA表达;检测氧化应激性损伤（测定MDA水平）、脑水肿（测定brain water content）、神经细胞变性（FJC、Tuj1免疫荧光染色）、细胞凋亡（Western blot检测cleaved caspase-3、Bcl-2;TUNEL染色）及炎症反应（qRT-PCR检测TNF-α,IL-6和IL-1β;MPO、IBA1免疫荧光染色）等相关指标。结果:第一部分:Nrf2的蛋白表达水平在TBI后1d达到高峰,以后逐渐下降。TBI后Nrf2在神经元内呈一过性高表达,在伤后1d达到高峰,之后急剧减少。Nrf2在星形胶质细胞内呈持续性低表达,Nrf2阳性星形胶质细胞数量在伤后7d达到高峰。TBI后Nrf2在小胶质细胞内表达明显增高,Nrf2阳性小胶质细胞数量在伤后7d达到高峰。我们也检测了Nrf2在NG2胶质细胞内的表达,Nrf2在NG2胶质细胞中的表达比率在伤后3d达到高峰。第二部分:在野生小鼠中,与溶剂处理组相比,姜黄素处理后,Nrf2及其下游基因表达水平明显升高,而且Nrf2入核增加;氧化应激性损伤减轻,脑水肿改善,变性神经细胞数量减少,存活神经元数量增加,细胞凋亡明显改善,炎症反应降低。在Nrf2-KO小鼠中,Nrf2及其下游基因表达水平明显降低;氧化应激性损伤、脑水肿加重,变性神经细胞数量增加,存活神经元数量明显降低,细胞凋亡明显加重,炎症反应增强。Nrf2-KO小鼠给予姜黄素处理后,未出现在WT小鼠实验中的明显的神经保护作用。结论:1、小鼠脑挫伤后,Nrf2在神经元和胶质细胞内表达增高。2、小鼠脑挫伤后,Nrf2在神经元和胶质细胞内表达存在时间规律性。3、小鼠脑挫伤后,内源性Nrf2通路被激活,姜黄素处理后,Nrf2通路被进一步激活。4、姜黄素通过激活Nrf2通路实现TBI后的神经保护作用。5、姜黄素通过激活Nrf2通路实现TBI后的抗炎、抗凋亡和抗氧化作用。
巴吐鲁呼[3]（2019）在《R18多肽联合亚低温抑制细胞自噬对颅脑创伤后神经元保护作用的实验研究》文中提出目的:探讨R18多肽联合亚低温通过抑制细胞自噬对颅脑创伤（Traumatic Brain Injury,TBI）后神经元的保护作用及机制。方法:1)原代分离培养E18-19 SD大鼠皮质层神经元细胞并将细胞分组:对照组和谷氨酸诱导组。用免疫荧光对原代分离的神经元进行鉴定;用MTS检测细胞谷氨酸诱导72h后细胞的活力改变。采用落体打击的方法建立SD大鼠TBI模型,对照组不予以撞击。在模型建立72h和12d后剥离大鼠脑组织并采用Nissl染色来检测神经元细胞的损失;从模型建立后第一天开始采用钉板平衡木行走测试对大鼠的行为学进行检查;同时对大鼠神经功能缺损进行评分（modified neurological severity scores,mNSS）;2)将细胞分为五组:分别为对照组、谷氨酸处理组、亚低温处理组（32.0?0.5℃）、R18多肽处理组以及亚低温联合R18多肽处理组。对照组不施加任何处理因素,谷氨酸处理组为用谷氨酸处理并诱导神经元细胞损伤组,亚低温处理组、R18多肽处理组以及亚低温联合R18多肽处理组为在谷氨酸诱导神经元细胞损伤时分别施加对应的处理因素组,同时,R18多肽设置四个浓度梯度（分别为0.2?M、0.5?M、1?M和2?M）。用MTS实验检测72h后各组的细胞活力;采用Fura-2 AM法测量各组细胞内钙离子浓度的变化;western blot法检测各组细胞内Beclin-1、LC3、caspase-3和Bcl-2蛋白表达的改变;RT-qPCR法检测各组细胞内Beclin-1、LC3、caspase-3和Bcl-2 mRNA水平的改变;3)将SD大鼠分成5组,每组8只,分别为对照组、模型组、亚低温治疗组、R18多肽治疗组以及R18多肽联合亚低温治疗组。对照组为正常未造模的大鼠,模型组为未进行治疗的TBI模型鼠,亚低温治疗组、R18多肽治疗组以及R18多肽联合亚低温治疗组为建立TBI模型后分别施加治疗的大鼠,其中亚低温治疗是采用冰袋物理降温的方法保持大鼠全身亚低温,R18多肽治疗是在TBI模型建立30min后经右侧颈静脉注射人工重组的R18多肽（300nmol/kg）。治疗72h后,对各组大鼠进行mNSS评分;采用干/湿比重法测定脑组织中含水量。脑组织HE染色和Bielschowsky’s银染色:在治疗后72h,在对照组和TBI模型组中随机选取3只大鼠,麻醉后取脑组织进行HE染色,同时,取脑组织切片进行Bielschowsky’s银染色来评估轴索损伤。免疫组化法（Immunohistochemistry,IHC）检测各组大鼠脑组织中Beclin-1和LC3的表达;分离大鼠海马组织,并用Tunnel法检测各组大鼠海马组织中细胞凋亡情况。结果:1)免疫荧光显示Tubulin染色阳性,所分离的细胞为神经元细胞。经谷氨酸诱导后细胞活力明显下降（P<0.01）,说明神经元细胞在谷氨酸诱导下发生了损伤。Nissl染色显示:TBI模型建立72h后TBI组脑组织神经元数量明显下降（5542/mm3vs 4124/mm3,P<0.01）;12天后差距缩小（5613mm3 vs 5109mm3,P<0.01）。行为学检查显示:在TBI建立后12天内模型组大鼠在平衡木上的滑落次数高于对照组;行为学评分显示在TBI模型建立后3d后mNSS评分最高,随着时间的推移,逐渐下降;2)谷氨酸处理神经元细胞后,细胞的活力明显下降（P<0.01）;与谷氨酸处理组相比,亚低温处理组和R18多肽处理组的细胞活力升高（P<0.05）,并且,随着R18多肽浓度的升高,细胞活力也逐渐升高（P<0.05）,R18多肽联合亚低温处理组细胞活力同样随着R18多肽浓度的升高而升高（P<0.05）。Fura-2 AM实时监测实验表明与对照组相比,谷氨酸处理组细胞内钙离子浓度显着升高,亚低温处理组、R18多肽处理组以及R18多肽联合亚低温处理组均降低了钙离子内流,且下降的程度为R18联合亚低温（29）R18多肽（29）亚低温,并且,随着R18多肽浓度的升高,钙离子内流下降的程度越大;荧光显微镜观察到的结果与实时监测的结果一致。谷氨酸诱导神经细胞损伤后细胞中自噬相关蛋白Beclin-1和LC3表达升高,凋亡相关蛋白caspase-3表达升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降;亚低温、R18多肽以及R18多肽联合亚低温降低了Beclin-1、LC3和caspase-3的表达和促进了Bcl-2的表达,且R18多肽联合亚低温处理比单独R18多肽处理以及亚低温处理的效果更明显;3)TBI模型后大鼠神经功能受损,mNSS评分升高（P<0.01）,而TBI后采用亚低温和R18多肽进行治疗后神经功能得以恢复,mNSS评分降低（P<0.05）,且R18多肽联合亚低温治疗组的mNSS评分最低（P<0.05）。TBI模型后大鼠脑组织中出现出血灶,细胞排列紊乱;对照组大鼠脑组织中胼胝体显得光滑,少突胶质细胞的细胞核排列规则且平行于轴突排列,而TBI后大鼠脑组织中胼胝体结构紊乱,少突胶质细胞的细胞核排列不规则且取向混乱。与对照组相比,TBI后大鼠脑组织中含水量显着升高（86.20?1.21%vs 71.12?1.32%,P<0.05）,与TBI组相比,亚低温治疗组（80.34?0.91%）、R18多肽治疗组（76.23?0.87%）和R18多肽联合亚低温治疗组（73.02?1.09%）大鼠脑组织中含水量均降低（P<0.05）。IHC显示TBI后脑组织中Beclin-1和LC3表达均升高,与TBI组相比,亚低温治疗组、R18多肽治疗组以及R18多肽联合亚低温治疗组均降低了Beclin-1和LC3的表达,且联合治疗组的效果最明显。Tunnel凋亡检测实验表明TBI后海马组织中细胞凋亡显着升高（P<0.01）,与TBI组相比,亚低温治疗组、R18多肽治疗组以及R18多肽联合亚低温治疗组均抑制了细胞凋亡（P<0.05）,且联合治疗组的抑制效果最显着（P<0.01）。结论:亚低温和R18多肽联合治疗可以抑制谷氨酸诱导的神经元细胞损伤,可能是通过升高细胞活力、抑制钙离子内流以及抑制细胞自噬和细胞凋亡的过程来发挥保护作用的。亚低温和R18多肽联合治疗可以保护TBI模型大鼠颅脑免受创伤,可能是通过恢复神经功能、减轻脑水肿的程度、抑制神经元细胞自噬发挥保护作用的,且联合治疗的效果优于单独治疗。
张冲[4]（2017）在《低频弱磁诱导移植神经干细胞上调β-Ⅲtubulin mRNA表达修复脑损伤大鼠爬行功能的研究》文中研究指明目的:通过体内体外实验设计观察低频弱磁（low frequency magnetic flux）在骨髓源神经干细胞移植对脑损伤大鼠（rats with brain injury）爬行功能改善的作用。观察到相关神经元标志物以及神经递质的表达改变,为脑损伤的临床治疗提供基础研究依据。方法:建立脑损伤大鼠模型,将64只SD大鼠随机分成四组,每组16只大鼠,分别为对照组（C组）、BM-NPCs组（B组）、磁场组（L组）和磁场+BM-NPCs组（LB组）。取3周龄SD大鼠骨髓来源的骨髓间充质干细胞,体外培养骨髓源神经干细胞（Bone Marrow Stroma Cells-derived Neural Progenitor Cells,BM-NPCs）,在成功造模第7d,移植体外CD-Dil标记的BM-NPCs。其中,L组和LB组分别进行低频弱磁场（50Hz、5mT）干预,60min/d,连续干预60d。在实验过程中,分别在移植1d、3d、7d、30d和60 d对各组大鼠进行水平爬楼梯评分、Wayne clark行为学评分,并于移植1d、7d和30d取材进行HE染色,观察各组脑组织病理表现;在外伤区,免疫荧光检测移植细胞的神经细胞标志物NeuN、GFAP、β-Ⅲtubulin表达。在体外实验中,使用50Hz、5mT弱磁场对BM-NPCs进行处理,时间为60min/天,连续作用15天,同时设置对照组。细胞免疫荧光技术检测Q-PCR分析BM-NPCs表达Nestin（神经干细胞标志物）、PSA-NCAM、β-Ⅲtubulin（神经元标志物）、ACHE、5-HT、GABA（神经递质）等情况。结果:BM-NPCs移植后第1d,经Wayne clark评分以及水平爬楼梯评分后,各组结果差异无统计学意义（P>0.05）;移植后第3d、7d、30d、60d,各组Wayne clark评分、水平爬楼梯评分结果显示,组间比较差异有统计学意义（P<0.05）,C组与其他三组比较有明显差异,不同时间点也存在差异,不同处理因素随时间增加而行为学评分的变化趋势不同,其中LB组运动功能评分改善更为明显。HE染色结果显示,造模后第7d,各组大鼠脑损伤灶周围组织血管受压变形、组织肿胀坏死形成。BM-NPCs移植后第7d,C组和L组脑损伤灶周围组织水肿明显减轻,有较大的囊性空洞,周围炎症细胞浸润,神经细胞减少明显;B组和LB组脑损伤灶周围组织水肿较轻,出现范围局限的囊性空洞,可见胶质细胞。移植后第30d,除对照组外,其他三组囊性空洞面积均较少,B组水肿组织消失,LB组脑损伤灶周围组织细胞排类整齐,炎症细胞基本消失。移植后第60d,与对照组相比,各实验组脑损伤组织结构大部分修复。留取标本进行免疫荧光技术检测显示,BM-NPCs移植后第30d,B组和LB组大鼠脑损伤组织周围出现Dil标记的NeuN和β-Ⅲtubulin阳性细胞;移植后第60d,Dil标记的NeuN和β-Ⅲtubulin阳性细胞与脑损伤周围组织融合生长。BM-NPCs移植后第30d和第60d,C组大鼠脑损伤组织周围可见大量GFAP阳性细胞,而L组和LB组较C组少。在体外实验过程中,体外培养的BM-NPCs形成细胞球并经弱磁场干预后,可观察到神经元样细胞出现。免疫荧光技术检测发现体外培养的BM-NPCs Nestin呈阳性表达;对照组和磁场组神经元样细胞Tuj-1和GFAP均呈阳性表达。与对照组相比,Q-PCR结果显示磁场组Nestin、PSA-NCAM、Ach、GABA、5-HT基因表达水平与体外诱导前有显着性差异（P<0.01）,弱磁场组β-ⅢtubulinmRNA表达水平显着高于对照组（P<0.05）。结论:低频弱磁能改善脑损伤大鼠患侧爬行功能,也能促进骨髓源神经干细胞移植脑损伤大鼠模型的修复,该过程可能与低频弱磁场上调β-Ⅲtubulin mRNA表达水平促进骨髓源神经干细胞向神经细胞分化有关。
韶峰[5]（2010）在《小鼠开放性脑损伤后MAP-2、SDF-1、SSeCKS的表达与脑损伤经过时间的实验性研究》文中提出目的:观察小鼠开放性脑损伤后不同时相内MAP-2、SDF-1和SSeCKS蛋白表达的关系,探讨其脑损伤后神经元和神经胶质细胞随脑损伤时间的变化规律,对其在脑损伤时间推断中的作用做出评价。方法:选取健康昆明小鼠55只,随即分成对照组（n=5）、假损伤组（n=5）、死后损伤组（n=5）和损伤组（n=40）。而损伤组在1h、3h、6h、12h、1d、3d、7d和14d等时相点各5只。通过建立小鼠开放性脑损伤模型,运用光学显微镜观察脑组织形态学的改变,利用免疫组织化学染色法（SP法）对对照组及伤后不同时间组内脑细胞中的MAP-2、SDF-1和SSeCKS蛋白进行检测,并作统计学分析。结果:三种蛋白的死后损伤组与生前损伤组相比较均有统计学意义（P<0.05）。伤后1h,MAP-2的表达下调,与正常对照组比较有统计学意义（P<0.05）,脑组织损伤3d时达最低峰,14d基本达正常水平,但仍低于对照组。脑损伤后SDF-1表达上调,随着损伤时间的延长,到伤后6h,与正常对照组比较有统计学意义（P<0.05）,呈持续升高状态,14d仍高于正常对照组。伤后1h,SSeCKS的表达下调,与正常对照组比较有统计学意义（P<0.05）,脑组织损伤3d时达最低峰,14d基本达正常水平,但仍低于对照组。结论:1)检测MAP-2、SDF-1与SSeCKS蛋白的表达可用于生前伤和死后脑损伤的鉴别。2)小鼠开放性脑损伤后,MAP-2、SDF-1和SSeCKS的表达呈一定的时序性变化规律,可作为推断脑损伤时间的参考指标之一。
陈国蕾[6]（2010）在《大鼠脑挫伤后低氧诱导因子-1α的表达与挫伤经过时间的推断》文中提出目的：应用免疫组化SABC法、免疫印迹Western Bloting法和实时荧光定量RT-PCR技术检测大鼠脑挫伤后HIF-1α蛋白和HIF-1αmRNA的时序性表达规律,探讨HIF-1α推断脑挫伤的可行性,旨在为法医实践中推断脑挫伤经过时间提供依据。方法：选取健康成年SD大鼠64只,随机分为对照组和实验组,每组8只。参照Feeney法建立大鼠闭合性脑挫伤模型,实验组按损伤时间不同分为伤后1h、6h、12h、48h、72h、7d、14d共7组,对照组动物仅切开头皮,有顶开骨窗,不致脑损伤,在损伤后依规定时间内处死动物,对照组动物于钻孔后1h处死,取出脑组织,以脑挫伤灶为中心旁开1mm行大鼠脑冠状切面取材,置于4%多聚甲醛PBS液中固定,用于免疫组织化学染色；于脑挫伤灶取脑组织-80℃液氮保存用于蛋白和总RNA的提取。应用免疫组化SABC法和免疫印迹Western Bloting法检测各组HIF-1α蛋白的表达,利用图像分析技术定量测定免疫组化染色切片的阳性细胞数及以条带积分光密度值,所得数据用用SPSS13.0软件对所得数据进行统计学分析。将提取的脑组织中的总RNA,逆转录合成cDNA第一条链,采用实时荧光定量PCR检测H1F-1amRNA逆转录合成第一条cDNA链的相对表达量,所得数据用用SPSS13.0软件对所得数据进行统计学分析。结果：（1）HE结果：对照组神经元细胞形态结构正常,核染色较淡、圆形,核仁清楚。损伤组可见脑实质散在出血,蛛网膜下腔、侧脑室出血。所选切面各部位均可见程度不一的神经元细胞核深染、固缩,神经元细胞水肿,周围出现空隙,逐渐发展为胞核破碎溶解,神经元坏死消失,周围胶质细胞增生；（2）免疫组织组化学SABC法染色结果：对照组神经细胞偶见HIF-1α表达,阳性产物呈棕黄色,主要位于神经细胞胞核及胞浆内：伤后1h挫伤灶周围即可观察到阳性反应细胞,呈散在少量分布；伤后12h可见表达HIF-1α的神经细胞数增多,表达强度增强,差异有显着性（P<0.05）；48h后达高峰,阳性细胞聚集成簇,周围可见大量棕黄色产物。随后阳性反应细胞逐渐减少,7d后仍见少量表达,14d后基本恢复正常；（3）免疫印迹Western Bloting结果：脑挫伤后1h即可见条带,12h时条带明显增宽,48h的条带最宽,随后开始减少,到14d时条带几乎不可见。除14d组外,各实验组与对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）；实验组间两两比较,除12h组和72h组之间无统计学意义（P>0.05）外,其余各组间差异均有统计学意义（P<0.05）；（4）实时荧光定量RT-PCR检测结果：HIF-1αmRNA于脑挫伤后1h表达显着增强（P<0.01）,达到高峰,为正常组的75.58倍,随后逐渐下降,至48h时又出现一次高峰,随后又开始下降,14d时降至正常水平。结论：大鼠脑挫伤后脑组织中HIF-1α蛋白和HIF-1αmRNA的表达随着损伤时间的延长都呈时序性规律变化,但变化规律有所不同,HIF-1αmRNA的表达高峰出现较早,可用于较早损伤时间的推断,两者综合分析,可望为法医学颅脑损伤时间的推断提供客观、科学的依据。
李刚莲[7]（2009）在《大鼠皮肤MMP-2、MMP-9表达与损伤时间相关性的实验研究》文中研究指明目的:探讨创伤皮肤组织基质金属蛋白酶（ Matrix metalloproteinase-s,MMPs）-2、9的表达与损伤时间的相关性,为损伤时间推断提供实验依据。资料和方法:建立大鼠皮肤切创模型,应用免疫组织化学技术、图像分析技术检测不同损伤时间大鼠皮肤组织生前及死后MMP-2与MMP-9表达。结果:生前伤组大鼠损伤后皮肤组织内MMP-2与MMP-9在损伤区及损伤区周围皮肤组织中的表达明显高于正常对照组（P<0.05）。死后伤组皮肤组织中MMP-2与MMP-9的表达与正常对照组比较无明显差异（P>0.05）。生前伤组中MMP-2在损伤后0.5 h可见在中性粒细胞中阳性表达,随时间进展表达逐渐增强,12 h后明显增多,3 d达到高峰,第5 d后在炎细胞中表达减少,同时在成纤维细胞中有阳性表达, 12～14 d恢复正常。MMP-9在损伤后1 h可见在中性粒细胞中阳性表达,随时间进展表达逐渐增强, 12 h后明显增多,3 d达到高峰,第5 d后在炎细胞中表达减少,同时在成纤维细胞中有阳性表达, 12～14 d恢复正常。结论: MMPs在创伤修复中表达活跃而成为活体伤中的一种生活反应迹象,为法医学推断损伤时间提供新的可能的参考指标;皮肤损伤组织中MMP-2与MMP-9的表达具有规律性且有良好的时间相关性,MMP-2、MMP-9可望成为法医学损伤时间推断的指标。
傅西安[8]（2008）在《创伤性脑损伤及低温脑保护机制实验研究》文中指出创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）由于其发病率随着经济及交通的发展逐年增高已经越来越引起临床医生及科研学者的重视,多年来许多研究者致力探索促进创伤性脑损伤患者康复的途径,对创伤性脑损伤的致伤机制、临床评估、辅助诊断以及治疗方法的探索一直在以基础结合临床的模式向前延伸。他们从不同角度对颅脑损伤的发生原因、生物力学机制、病理生理学、病理形态学及分子病理学变化等方面进行了广泛而深入的研究。目前认为,颅脑创伤后的继发性因素,或称二次脑损伤因素,是造成脑损害发生、发展的重要原因。这些因素涉及:脑缺血、能量代谢障碍、钙离子超载、氧自由基堆积、兴奋性氨基酸的神经毒作用、炎性因子刺激等等。在创伤性脑损伤中创伤性昏迷是研究中的难点,其发病机制及治疗一直困扰着广大研究者,揭示创伤昏迷机制已成为神经科学工作者面临的新课题。对创伤昏迷这一临床问题的关注是推动基础研究的原动力。颅脑伤导致的长期昏迷,与颅脑创伤导致的早期脑内病理变化密切相关,从急性创伤昏迷的动物模型着手,有可能获取与创伤打击相关性较为密切的病理机制依据。在本研究的实验一我们成功建立了正中液压冲击致创伤昏迷动物模型,在此基础上分析及探讨了钙蛋白酶Ⅱ及电压门控钠通道亚型mRNA在中脑的表达,并研究了microRNA在中脑的变化,试图从mRNA表达方面及microRNA调控方面阐释创伤性昏迷的部分发病机制。低温疗法一直是创伤性脑损伤的治疗研究中的热点,自19世纪国外学者着手这方面研究到国内外学者的广泛基础研究及临床应用已有百余年历史,其研究成果令人满意,通过实验性研究及临床应用研究,对亚低温脑保护的机制,适用范围等都有了较深入的认识,并把低温治疗应用于临床,形成了较为完整的理论及应用体系。但其确切脑保护机制仍未完全清楚,研究亚低温脑保护机制仍然是个极具吸引力的课题,很多学者仍在致力于亚低温脑保护机制的探索。本研究的实验二应用侧方液压损伤建立中型颅脑损伤模型,从髓鞘结构、细胞骨架、炎症调节、免疫功能等方面较为细致地分析、阐述了亚低温脑保护的可能机理,旨在丰富亚低温脑保护作用的机制,并为亚低温更深入的实验研究以及临床应用提供实验依据。在低温脑保护的实验及临床研究方面,有关超深低温脑保护的研究较少,因为其临床应用较为困难,但超深低温脑保护作为低温脑保护的研究整体的一部分是不可或缺的,否则我们就无法全方位的了解其作用机理,无法更全面的临床应用。本研究的实验三在我院与上海交通大学合作前期研究成果的基础上进一步探讨选择性脑超深低温复苏技术对恒河猴颈动脉血流阻断时限的研究,旨在发现超深低温对全脑缺血复苏的极限时间窗,并研究热缺血不同时限超深低温的脑保护作用,为今后超深低温基础研究及临床应用奠定实验及理论基础。实验一大鼠急性创伤昏迷模型的建立及昏迷机制的实验研究目的:1.建立稳定大鼠急性创伤昏迷模型2.研究CalpainⅡ、电压门控钠通道亚型6（Nach6）mRNA在创伤昏迷大鼠中脑的表达变化。3.分析创伤昏迷大鼠中脑microRNA变化。方法:健康Sprague-Dawley（SD）大鼠12只,雌雄不限,随机分为两组。假手术对照组（n=6）:大鼠麻醉后正中钻孔埋管而不打击。急性创伤昏迷组（n=6）:麻醉,3%戊巴比妥钠腹腔注射（50mg/kg）,麻醉生效后备皮消毒,固定头部于大鼠立体定向仪。头皮正中切口3am,骨膜剥离器剥离骨膜,正中矢状缝环钻钻孔,骨窗直径约4.8mm,暴露完整硬脑膜。于骨窗前后颅骨固定螺丝两枚,骨窗内置入内径2.6mm打击管（injury tube）,即干胶粘合与颅骨连接处,牙科骨水泥牢固固定后缝合头部切口。麻醉清醒（翻正反射恢复）后使用液压损伤打击仪压力约1.7atm液压冲击大鼠硬脑膜,造成大鼠急性昏迷。实验组昏迷1小时后断头取脑,对照组麻醉1小时后断头取脑,取中脑组织采用Realtime PCR法测定CalpainⅡ、电压门控钠通道亚型（Nach6）mRNA的表达,microRNA芯片测定昏迷大鼠中脑microRNh变化。结果:1.建立较稳定大鼠创伤昏迷模型,死亡率＜20%,昏迷时间＞1h。2.Realtime PCR结果:实验组与对照组比较CalpainⅡmRNA表达明显增加（p＜0.01）,Nach6mRNA表达明显增加（p＜0.05）。3.昏迷大鼠中脑33个microRNA上调2倍以上,38个microRNA下调50%。结论:1.急性创伤昏迷大鼠中脑中钙蛋白酶起到了损害性因素的作用,溶解神经组织及髓鞘。电压门控钠通道亚型在急性创伤昏迷大鼠中脑中表达增加,钠离子内流,导致神经细胞及神经胶质细胞损伤。两者亦可能相互影响,加速钠钙离子内流,影响中脑网状激活系统,可能和创伤昏迷发病机制有关。2.创伤昏迷大鼠中脑33个microRNh上调2倍以上,38个microRNA下调50%以上。microRNA在创伤昏迷大鼠的发生机制中可能参与了中脑细胞骨架、细胞黏附、细胞凋亡、代谢相关、缺血相关等多环节,可能参与了创伤昏迷相关基因的表达调控。实验二侧方液压脑损伤及亚低温脑保护机制研究第一部分大鼠侧方液压脑损伤模型的建立目的:建立稳定大鼠侧方液压脑损伤动物模型。方法:麻醉,3%戊巴比妥钠腹腔注射（50mg/kg）,麻醉生效后备皮消毒,固定头部于大鼠立体定向仪。头皮正中切口3cm,矢状缝右侧4mm环钻钻孔,暴露完整硬脑膜。于骨窗前后颅骨固定螺丝两枚,骨窗内置入内径2.6mm打击管（injury tube）,即干胶粘合与颅骨连接处,牙科骨水泥牢固固定。使用液压损伤打击仪压力约1.4atm造成中度颅脑损伤,建立稳定侧方液压脑损伤动物模型。结果:本次实验使用国际认可的侧方液压冲击建立脑损伤动物模型,压力为1.4atm,模型稳定性好,死亡率低,仅一只死亡（约为5.6%）,重复性强,可信度高。结论:本模型显着特点为:（1）致伤力定量准确,重复性好;（2）根据打击能量划分伤情,可复制出轻、中、重型脑损伤模型,打击能量越大,伤情越重,预后越差;（3）可以观察各种治疗方法对颅脑伤后死亡率和神经功能障碍的影响。第二部分侧方液压脑损伤大鼠海马CalpainⅡ及MBP、MAP2 mRNA的表达目的:研究CalpainⅡ及MBP、MAP2 mRNA在侧方液压脑损伤海马的表达。方法:健康Sprague-Dawley（SD）大鼠18只,雌雄不限,假手术对照组（n=6）:钻孔埋管而不打击。侧方液压脑损伤组（n=6）:在打击后即刻予呼吸机辅助通气,使用电热毯维持体温,监测各项生理指标。亚低温组（n=6）:在侧方液压损伤后待生理指标稳定后使用冰屑降温法将大鼠肛温降至33℃并维持亚低温不致波动,肛温计监测肛温,亚低温维持3小时。伤后3小时断头取脑,海马组织做RT-PCR实验分别检测CalpainⅡ及MBP、MAP2 mRNA在海马的表达。结果:钙蛋白酶Ⅱ常温创伤组和对照组比较,CalpainⅡmRNA表达明显增高（P＜0.01）:亚低温组和常温创伤组比较,CalpainⅡmRNA表达明显降低（P＜0.01）。MBP常温创伤组和对照组比较,MBP mRNA表达明显降低（P＜0.01）;亚低温组和常温创伤组比较,MBP mRNA表达表达明显增高（P＜0.01）。MAP2常温创伤组和对照组比较,MAP2 mRNA表达明显降低（P＜0.01）:亚低温组和常温创伤组比较,MAP2 mRNA表达表达明显增高（P＜0.01）。结论:1.亚低温可通过抑制海马CalpainⅡ表达而发挥脑保护作用。2.亚低温能通过增加海马MBP表达而减轻MBP降解及脱髓鞘,从而起到神经保护作用。3.亚低温能够通过维持海马MAP2的稳定而起到脑保护作用。4.亚低温可能通过抑制CalpainⅡ表达减轻钙离子对神经细胞及神经胶质细胞髓鞘及细胞骨架的溶解破坏而减轻MBP降解及脱髓鞘,维持MAP2的稳定而起到脑保护作用。但维持髓鞘及细胞骨架正常结构的因素很多,具体机制有待以后实验中进一步研究。第三部分侧方液压脑损伤大鼠皮层PPAR-γ、NF-κBmRNA的表达目的:研究PPAR-γ、NF-κB在侧方液压脑损伤大鼠皮层的表达。方法:健康Sprague-Dawley（SD）大鼠18只,雌雄不限,假手术对照组（n=6）:钻孔埋管而不打击。侧方液压脑损伤组（n=6）:在打击后即刻予呼吸机辅助通气,使用电热毯维持体温,监测各项生理指标。亚低温组（n=6）:在侧方液压损伤后待生理指标稳定后使用冰屑降温法将大鼠肛温降至33℃并维持亚低温不致波动,肛温计监测肛温,亚低温维持3小时。伤后3小时断头取脑,皮层组织做RT-PCR实验分别检测PPAR-γ、NF-κB在液压脑损伤大鼠皮层的表达。结果:PPAR-γmRNA在大鼠皮层的相对表达量,侧方液压打击组（n=6）与对照组（n=6）比较明显降低（P＜0.05）;亚低温组（n=6）与侧方液压打击组比较（n=6）明显升高（P＜0.05）:对照组（n=6）与亚低温组（n=6）比较,差异无显着性（P＞0.05）。NF-κB mRNA在大鼠皮层的相对表达量,侧方液压打击组（n=6）与对照组（n=6）比较明显增加（P＜0.05）;亚低温组（n=6）与侧方液压打击组（n=6）比较明显降低（P＜0.05）。结论:亚低温可能通过增加PPAR-γ表达,与NF-κB的亚基P65/P50结合增加,降低了NF-κB与DNA结合活性,抑制NF-κB DNA合成,达到抑制NF-κB表达的作用,或通过竞争结合协同活化因子P300和CBP增强来抑制NF-κB的转录。通过调节PPAR-γ和NF-κB的协同或单独发挥作用多途径减轻脑损伤,达到脑保护作用。第四部分亚低温对侧方液压脑损伤大鼠免疫功能的影响目的:研究侧方液压脑损伤大鼠亚低温治疗后血清CD4+T细胞、CD8+ T细胞、IL-2、TNF-α、IL-6、IL-10的变化。方法:将大鼠随机分为正常对照组（n=6）、液压脑损伤第1到3组（n=6）,亚低温第1到3组（n=6）。时相点分别为3h、1d、3d。动物模型完成后于不同时点分别经下腔静脉抽血,流式细胞仪检测血清CD4+T细胞、CD8+T细胞相对含量,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血清IL-2、TNF-α、IL-6、IL-10水平。结果:1.CD4+T细胞T1组、T2组、T3组与正常对照组比较相对含量明显降低（P＜0.05）,同一时间段H1组与T1组比较、H2组与T2组比较、H3组与T3组比较CD4+T细胞相对含量明显上升（P＜0.01）;CD8T细胞T1组、T2组、T3组与正常对照组比较相对含量明显升高（P＜0.05）,同一时间段H1组与T1组比较、H2组与T2组比较、H3组与T3组比较CD8+T细胞相对含量明显降低（P＜0.01）。2.血清IL-2含量T1组、T2组、T3组与正常对照组比较相对含量明显降低（P＜0.05）,同一时间段H1组与T1组比较、H2组与T2组比较、H3组与T3组比较血清IL-2含量明显上升（P＜0.05）;血清TNF-α含量T1组、T2组、T3组与正常对照组比较相对含量明显升高（P＜0.05）,同一时间段H1组与T1组比较、H2组与T2组比较、H3组与T3组比较血清TNF-α含量明显降低（P＜0.05）;血清IL-6含量T1组、T2组、T3组与正常对照组比较相对含量明显升高（P＜0.05）,同一时间段H1组与T1组比较、H2组与T2组比较、H3组与T3组比较血清IL-6含量明显升高（P＜0.05）;血清IL-10含量T1组、T2组、T3组与正常对照组比较相对含量明显升高（P＜0.05）,同一时间段H1组与T1组比较、H2组与T2组比较、H3组与T3组比较血清IL-10含量明显升高（P＜0.05）。结论:1.亚低温可增加创伤性脑损伤大鼠血清CD4+T细胞相对含量,降低CD8+T细胞相对含量。2.创伤性脑损伤后大鼠血清IL-2水平明显降低;创伤性脑损伤后大鼠血清TNF-α水平明显升高;创伤性脑损伤后大鼠血清IL-6水平明显升高:创伤性脑损伤后大鼠血清IL-10水平明显升高。3.亚低温可增加创伤性脑损伤后大鼠血清IL-2水平;亚低温可降低创伤性脑损伤后大鼠血清TNF-α水平;亚低温可提高创伤性脑损伤后大鼠血清IL-6水平;亚低温可提高创伤性脑损伤后大鼠血清IL-10水平。4.创伤性脑损伤后亚低温治疗可能通过多种途径改善机体免疫状态,抑制创伤后炎症反应来达到脑保护作用。实验三恒河猴脑常温极限缺血时间窗下选择性超深低温对其保护作用的研究目的:研究不同缺血时间窗下选择性超深低温复苏的脑保护作用,探讨脑缺血复苏的极限时间。方法:健康成年恒河猴15只（由中国科学院昆明动物研究所提供）,雄性,反应灵敏,神经功能正常,年龄4-10岁,平均年龄7.90±1.82岁,体重4.2-14kg,平均8.22±2.15 kg,随机分为四组,双侧颈总动脉阻断立即超深低温灌注组（n=4）,双侧颈动脉阻断10分钟超深低温灌注组（n=4）,双侧颈动脉阻断15分钟超深低温灌注组（n=4）,双侧颈动脉阻断20分钟超深低温灌注组（n=3）,建立超深低温复苏模型。结果:双侧颈总动脉阻断立即超深低温灌注组（n=4）,双侧颈动脉阻断10分钟超深低温灌注组（n=4）安全复苏,全部长期存活;双侧颈动脉阻断15分钟深低温灌注组（n=4）长期存活2只,重残1只,死亡1只;双侧颈动脉阻断20分钟深低温灌注组（n=3）复苏困难,生命体征分别维持3、7、20小时后全部死亡;双侧颈总动脉阻断立即超深低温灌注组（n=4）、双侧颈动脉阻断10分钟超深低温灌注组（n=4）、15分钟阻断复苏组磁共振（MRI、MRA、DWI、ADC）均未见明显缺血改变。微细结构观察双侧颈总动脉阻断立即超深低温灌注组、双侧颈动脉阻断10分钟超深低温灌注组脑及全身器官未见异常改变;15分钟阻断复苏组存活3只猴病理检查散在神经细胞坏死;20分钟阻断复苏组及15分钟阻断复苏组死亡1只猴见大量神经细胞死亡,全身各器官明显异常改变。结论:（1）灵长类动物恒河猴可以在单侧颈内动脉冷灌注的条件下迅速达到脑选择性超深低温（14.3-16℃）。（2）脑选择性超深低温灌注是安全、可靠及有效的,既具有明显的脑保护作用、延长断血流的安全时限,又可避免全身超深低温带来的各器官并发症。可作为脑缺血的有效复苏手段。（3）10分钟常温缺血时间窗下复苏是安全的,复苏后脑及全身各器官正常,无并发症。（4）15分钟常温脑缺血超深低温复苏是可能的,但但疗效不确切,可能存留不同程度神经功能障碍,且死残率较高。（5）20分钟常温脑缺血时间窗下复苏由于不可逆性损害已经出现,导致复苏无效。（6）脑缺血复苏的黄金时间为10分钟,在10分钟内采取超深低温复苏可完全恢复大脑功能而无器官并发症;在10分钟-15分钟时间窗内进行超深低温复苏可在大脑短暂完全缺血情况下提高缺血耐受,虽有可能挽救生命,但神经功能缺失及死残率均较高。
仁增[9]（2007）在《川芎嗪对重型颅脑损伤后神经细胞凋亡及相关基因Bcl-2、Bax表达影响的实验性研究》文中认为目的：探讨重型颅脑损伤后神经细胞凋亡、BCL-2、Bax的变化及川芎嗪对重型颅脑损伤后神经细胞凋亡及相关基因BCL-2、Bax表达的影响和脑神经元保护作用。方法：120只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、（川芎嗪）治疗组各40只。治疗组和模型组采用Feeney模型造成脑部自由落体打击伤（重型），治疗组予以川芎嗪注射液（20mg／KG．d）及5％GNS（30ml／KG．d）；模型组仅予5％GNS（30ml／KG．d）：假手术组予以5％GNS（30ml／KG．d）。三组动物分别于7h、24h、72h、168h处死。取脑组织标本，用免疫组化法检测Bcl-2、Bax的表达及细胞凋亡数及三组间的差异。各时间窗对处死前动物进行神经功能评分。结果：（1）与假手术组相比，受损伤的两组大鼠脑组织中Bcl-2、Bax蛋白基因有明显阳性表达，具有统计学意义。（2）与模型组相比，Bcl-2蛋白表达在7小时、24小时与治疗组间无显着性差异（P＞0.05），在72小时、168小时模型组的表达明显下降，与治疗组有明显差异，统计结果显示有显着性差异（P＜0.05）。Bax蛋白基因在受损两组大鼠脑组织中有明显阳性表达，在治疗组中Bax蛋白阳性细胞数低于模型组，治疗组72小时、168小时与模型组之间有显着性差异（P＜0.05）。（3）细胞凋亡数的变化：假手术组未见或少见TUNEL阳性细胞，而在受损两组中TUNEL阳性细胞表达明显增多，统计结果显示，模型组、治疗组与假手术组之间有显着性差异（P＜0.05）。治疗组中TUNEL阳性细胞数在各时间窗均低于模型组，其中治疗组在72小时、168小时与模型组有显着性差异（P＜0.05）。结论：（1）重型颅脑损伤后大鼠脑组织中存在神经细胞凋亡及细胞凋亡相关蛋白基因Bcl-2、Bax表达变化；（2）川芎嗪可能通过抑制Bax基因的表达，使促凋亡作用减弱，上调Bcl-2基因的表达，使抗凋亡作用增强，重新调整Bcl-2、Bax之间的平衡，减少神经细胞凋亡。（3）川芎嗪通过抑制细胞凋亡，减轻重型颅脑损伤后继发脑损害发挥脑神经保护作用。
闫红涛,廖志钢[10]（2007）在《细胞凋亡的法医学意义》文中认为细胞凋亡是生物界重要的生命现象之一,其不仅存在于正常组织和器官,也存在于各种损伤与疾病组织之中,因此愈来愈受到医学界包括法医学界的广泛重视。本文综述了近年来细胞凋亡在法医学领域的研究进展及应用前景。研究资料表明:凋亡与损伤时间、颅脑损伤、猝死等方面有密切关系,有望成为今后法医学研究的一个重要方面。
二、脑挫伤早期细胞凋亡相关基因表达的实验性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、脑挫伤早期细胞凋亡相关基因表达的实验性研究（论文提纲范文）
（1）外泌体源性miR-124对创伤性脑损伤后海马区神经炎症和神经再生的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 外泌体源性MIR-124 的构建、分离和鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 外泌体MIR-124 对创伤性脑损伤大鼠海马区神经炎症的调控作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 外泌体MIR-124 对创伤性脑损伤大鼠海马区神经炎症的调控机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 外泌体MIR-124 调控创伤性脑损伤大鼠海马区神经炎症后对神经再生的作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（2）Nrf2在小鼠脑挫伤后动态表达及其神经保护作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 小鼠脑挫伤后Nrf2的动态表达及其与损伤时间相关性的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 小鼠中度脑挫伤模型制作 |
| 2.3.2 组织取材与处理 |
| 2.3.3 蛋白表达检测 |
| 2.3.4 HE染色 |
| 2.3.5 双重免疫荧光染色 |
| 2.3.6 数据处理与统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 小鼠TBI后伤侧皮质损伤周边区的形态学变化 |
| 3.2 小鼠TBI后伤侧皮质损伤周边区Nrf2 蛋白表达 |
| 3.3 小鼠TBI后伤侧皮质损伤周边区神经元内Nrf2 的表达 |
| 3.4 小鼠TBI后伤侧皮质损伤周边区星形胶质细胞内Nrf2 的表达 |
| 3.5 小鼠TBI后伤侧皮质损伤周边区小胶质细胞内Nrf2 的表达 |
| 3.6 小鼠TBI后伤侧皮质损伤周边区NG2 胶质细胞内Nrf2 的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 Nrf2在小鼠脑挫伤后姜黄素神经保护中的作用及其机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 小鼠中度脑挫伤模型制作 |
| 2.3.2 组织取材与处理 |
| 2.3.3 基因型检测 |
| 2.3.4 蛋白表达检测 |
| 2.3.5 mRNA表达检测 |
| 2.3.6 HE染色 |
| 2.3.7 免疫荧光染色 |
| 2.3.8 FJC染色 |
| 2.3.9 TUNEL染色 |
| 2.3.10 脑水肿测定 |
| 2.3.11 MDA测定 |
| 2.3.12 数据处理与统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 Nrf2 基因敲除结果验证 |
| 3.2 姜黄素处理进一步激活TBI后 Nrf2 信号通路 |
| 3.3 姜黄素通过Nrf2 信号通路发挥神经保护作用 |
| 3.4 姜黄素通过Nrf2 信号通路改善TBI后的氧化应激性损伤 |
| 3.5 姜黄素通过Nrf2 信号通路改善TBI后的细胞凋亡 |
| 3.6 姜黄素通过Nrf2 信号通路改善TBI后的炎症反应 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）R18多肽联合亚低温抑制细胞自噬对颅脑创伤后神经元保护作用的实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 谷氨酸诱导神经元损伤及大鼠TBI模型的建立 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 仪器和设备 |
| 1.2 试剂耗材 |
| 1.3 实验方法和步骤 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 R18多肽联合亚低温通过抑制细胞自噬保护神经元细胞的研究 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 仪器和设备 |
| 1.2 试剂和耗材 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 实验方法与步骤 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 R18多肽联合亚低温通过抑制细胞自噬对大鼠颅脑创伤后神经元保护作用的研究 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 仪器和设备 |
| 1.2 试剂和耗材 |
| 1.3 实验方法与步骤 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（4）低频弱磁诱导移植神经干细胞上调β-Ⅲtubulin mRNA表达修复脑损伤大鼠爬行功能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 低频弱磁诱导移植骨髓源神经干细胞修复脑损伤大鼠爬行功能的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计学分析 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 低频弱磁促进骨髓源神经干细胞向神经元分化的体外研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 综述 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）小鼠开放性脑损伤后MAP-2、SDF-1、SSeCKS的表达与脑损伤经过时间的实验性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 导师评阅表 |
（6）大鼠脑挫伤后低氧诱导因子-1α的表达与挫伤经过时间的推断（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 试验材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（7）大鼠皮肤MMP-2、MMP-9表达与损伤时间相关性的实验研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 大鼠皮肤MMP-2、MMP-9 表达与损伤时间 |
| 前言 |
| 1. 资料及方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 附图 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（8）创伤性脑损伤及低温脑保护机制实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一 大鼠急性创伤昏迷模型的建立及昏迷机制实验研究 |
| 第一部分 大鼠急性创伤昏迷模型的建立 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Real-time PCR测定Calpain Ⅱ及Nach6mRNA的表达 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 创伤昏迷大鼠中脑micro RNA表达变化 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验一 小结 |
| 实验二 侧方液压脑损伤及亚低温脑保护机制研究 |
| 第一部分 大鼠侧方液压脑损伤模型的建立 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 侧方液压脑损伤大鼠海马Calpain Ⅱ及MBP、MP2 mRNA的表达 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 侧方液压脑损伤大鼠皮层PPAR-γ、NF-κBmRNA的表达 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 亚低温对侧方液压损伤大鼠免疫功能的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 小结 |
| 实验三 恒河猴脑常温极限缺血时间窗下选择性超深低温保护作用的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三小结 |
| 全文总结 |
| 综述1:选择性低温脑保护方法研究进展 |
| 综述2:液压冲击脑损伤动物模型在创伤性脑损伤研究中的应用 |
| 攻读学位期间发表文章及获奖情况 |
| 致谢 |
（9）川芎嗪对重型颅脑损伤后神经细胞凋亡及相关基因Bcl-2、Bax表达影响的实验性研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、脑挫伤早期细胞凋亡相关基因表达的实验性研究（论文参考文献）
- [1]外泌体源性miR-124对创伤性脑损伤后海马区神经炎症和神经再生的作用和机制研究[D]. 杨永祥. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [2]Nrf2在小鼠脑挫伤后动态表达及其神经保护作用机制研究[D]. 董雯雯. 中国医科大学, 2019(01)
- [3]R18多肽联合亚低温抑制细胞自噬对颅脑创伤后神经元保护作用的实验研究[D]. 巴吐鲁呼. 新疆医科大学, 2019(08)
- [4]低频弱磁诱导移植神经干细胞上调β-Ⅲtubulin mRNA表达修复脑损伤大鼠爬行功能的研究[D]. 张冲. 南方医科大学, 2017(11)
- [5]小鼠开放性脑损伤后MAP-2、SDF-1、SSeCKS的表达与脑损伤经过时间的实验性研究[D]. 韶峰. 新疆医科大学, 2010(05)
- [6]大鼠脑挫伤后低氧诱导因子-1α的表达与挫伤经过时间的推断[D]. 陈国蕾. 山西医科大学, 2010(02)
- [7]大鼠皮肤MMP-2、MMP-9表达与损伤时间相关性的实验研究[D]. 李刚莲. 重庆医科大学, 2009(06)
- [8]创伤性脑损伤及低温脑保护机制实验研究[D]. 傅西安. 昆明医学院, 2008(10)
- [9]川芎嗪对重型颅脑损伤后神经细胞凋亡及相关基因Bcl-2、Bax表达影响的实验性研究[D]. 仁增. 四川大学, 2007(04)
- [10]细胞凋亡的法医学意义[J]. 闫红涛,廖志钢. 医学信息(手术学分册), 2007(03)