(1.昆山市第六人民医院，江苏昆山2153002.昆山市妇幼保健所，江苏昆山2153003.昆山市淀山湖人民医院，江苏昆山2153004南京中医药大学昆山附属医院，江苏昆山215300)
【摘要】：目的探讨乳腺癌患者组织中的血管内皮生长因子（vascularethdothelialgrowthfactorVEGF）表达的临床意义。方法采用组织芯片技术和免疫组织化学的方法检测60例乳腺癌患者、31例正常乳腺组织中VEGF基因蛋白的表达，并分析其与临床病理特征之间的关系，并进行了比较性分析。结果VEGF分别在正常乳腺组织、乳腺癌组织之间的阳性表达差异具有非常显著的统计学意义（P<0.05），VEGF阳性表达率与患者淋巴结转移情况亦具有统计学意义（P<0.05），VEGF阳性表达率与患者年龄，肿块大小情况无统计学意义（P均>0.05），单因素和多因素logistic回归分析显示：VEGF表达是乳腺癌的危险因素，VEGF阳性患者乳腺癌风险是阴性者的4.84倍（95%CI为1.39-16.8）结论在乳腺癌患者中VEGF呈高表达，提示VEGF在乳腺癌发生和发展过程中发挥着重要的作用，VEGF亦可作为预后评估的指标。
【关键词】：血管内皮生长因子（VEGF）乳腺癌免疫组织化学
【Abstract】ObjectiveToexploretheexpressionofVEGFinproteinwithbreastcanceranditsclinicalsignificance.MethodsImmunohistochemicalSPstainingmethodandtissuechipwereadoptedtoresearchtheexpressionofVEGFin60patientswithbreastcancerand31casesnobreastcancertissueascontrol.Multivariatelogisticregressionandspearmancorrelationwereperformedtoanalysistherelationshipofbetweenthesecasesandtheirclinicopathologiccharacteristicsandwasdonecomparedanalysis.ResultsThedifferenceofpositiveexpressionofVEGFwassignificantdifferencebetweenpatientswithbreastcancerandthosewithoutbreastcancerascontrol(P<0.05)；ThedifferenceofpositiverateofVEGFwasnotsignificantbetweenpatientswithbreastcancerandthosewithoutbreastcancerascontrol（Pall>0.05）；ThepositiveexpressionrateofVEGFwasrelatedtoclinicopathologiccharacteristicsofmigration(P<0.05).ThepositiveexpressionrateofVEGFdidnotappeartorelatetoageandthesizeofbreastcancer(P>0.05).ConclusionTherewashighpositiveexpressionofVEGF,whichsuggeststhatthesefactorswereconcernedwiththedevelopmentofbreastcancersoastobecontributedtoprognosticjudgment.
【keywords】:Vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)；immunohistochemistry；breastcancer
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，通常发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。据资料统计，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10%。它的发病常与遗传有关，40~60岁之间、绝经期前后的妇女发病率较高。近年来乳腺癌的发病率在全世界范围内都呈现上升趋势VEGF又称血管通透因子（Vascularpermeabilityfactor，VPF），是一种特异性作用于内皮细胞的多功能因子[2]，作为特异的内皮细胞有丝分裂素，它是最主要的血管生成因子。近来研究表明，VEGF可能参与了肿瘤演变过程且与乳腺癌的恶性程度相关。为此本研究选取乳腺癌的石蜡标本制成病理组织切片，结合组织芯片，采用免疫组化SP法检测乳腺癌组织中VEGF的表达，以期了解VEGF在乳腺癌发生和发展中的关系，为寻求乳腺癌的早期诊断、预后评估及基因治疗靶位提供新的思路和有价值的科学依据。
1资料与方法
1.1标本：收集2007年1月~2011年12月昆山市第一人民医院手术切除的乳腺癌标本存档蜡块并经病理确诊60例。年龄28～84岁，平均51岁，年龄<50岁者26例，≥50岁者34例。肿瘤直径≤2cm24例，肿瘤直径﹥2cm36例。所有病例均为原发性乳腺癌，术前未做过任何化疗和放疗。正常乳腺组织对照组标本共31例，选自该院病人正常乳腺组织。所有病例标本经两位病理医师确诊。
1.2组织芯片制作：通过组织芯片制作机细针打孔的方法，从众多的组织蜡块(供体蜡块)中采集到数十至上千的圆柱形小组织(组织芯)，并将其整齐排放到另一个空白蜡块(受体蜡块)中而制成组织芯片蜡块。然后对组织芯片蜡块进行切片，再将切片转移到载玻片上制成组织芯片。
1.3组织芯片免疫组化标记：采用免疫组化(SP)方法,单克隆抗p16抗体(ZJ11)、单克隆抗cyclinD1抗体(DCS/6)和S-P试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司,即用型。滴加抗体前,切片经高压处理,修复暴露抗原。已知阳性切片作为阳性对照,以PBS代替一抗作空白对照,DAB显色。
1.4染色对照
每组实验均设阳性和阴性对照，用PBS溶液取代一抗作为阴性对照，结果为阴性。阳性对照由试剂公司提供及用已知乳腺癌的STAT3、SOCS3和VEGF阳性标本作为阳性对照，结果为阳性。
1.5结果判断
以细胞核及细胞浆出现棕褐色或棕黄色颗粒为阳性反应，VEGF的表达均参考Fromowitz的评分标准[3]，即高倍镜下（×400）综合染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定，染色强度：无色计为0分，淡黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色为3分；阳性细胞数所占比例：无阳性细胞计为0分，＜25％为1分，25％～50％为2分，51％～75%为3分，＞75%计为4分。两者评分相加，0～1分计为阴性(一)，2～3分计为弱阳性(+)，4～5分计为中度阳性(++)，＞5分为强阳性(+++)。
1.6统计学方法
实验数据资料统计采用统计学SAS9.2软件包进行统计学分析，两分类SVEGF在乳腺癌病例组和对照组间的表达差异及相关性用四格表卡方检验，多分类VEGF在乳腺癌病例组和对照组间的表达差异及与临床各个病理参数之间的表达差异用Cmh检验，比较多分类VEGF在乳腺癌病例组和对照组间的趋势用卡方趋势性检验，采用单因素和多因素logistic回归分析进行STAT3，SOCS3，VEGF疾病风险的探讨。双侧P<0.05具有统计学意义。
2结果
VEGF在乳腺癌细胞中阳性着色定位于胞质和(或)胞膜,见淡黄-棕黄色颗粒沉积(见图1)。以VEGF两分类作为结局，VEGF在正常乳腺细胞、乳腺癌细胞中表达率依次为65%，90%，乳腺癌组织阳性率高于对照组，其在正常乳腺细胞中的表达率与乳腺癌细胞中的表达率相比差异有统计学显著性(P<0.05)，相关性分析有统计学意义(Spearman秩相关分析：r=0.292=6.89P=0.01)
以VEGF表达“-”“+”“++”“+++”四分类作为有序结局，其在正常乳腺细胞中的表达率与乳腺癌细胞中的表达率相比差异有统计学显著性意义(fisherP=0.04)，2趋势性检验有统计学差异（trendP=0.01712均分=5.61P=0.02），即VEGF水平越高患乳腺癌的风
险越大(详见表2)。
VEGF的阳性表达率与淋巴结是否转移有关(P<0.05)，与患者年龄、肿瘤大小均无相关性(P均>0.05)（详见表)3。
单因素logistic分析及多因素logistic分析均显示VEGF是乳腺癌的危险因素，VEGF阳性者患乳腺癌风险是阴性者的4.94倍（详见表4)。
3讨论
本研究显示，以VEGF表达“-”“+”“++”“+++”四分类作为有序结局，乳腺癌组织中的VEGF平均表达水平高于相应正常乳腺组织，即VEGF水平越高患乳腺癌的风险越大。VEGF的阳性表达率与淋巴结是否转移有关。单因素与多因素logistic回归分析均提示VEGF阳性增加患乳腺癌的风险，这与国内外的报道相一致有研究发现VEGF的水平与乳腺癌的分期直接相关。临床和组织提示VEGF参与肿瘤演变的过程，且与乳腺癌的恶性程度有关，分析其原因可能是VEGF诱导乳腺癌的血管形成，新生的血管又为肿瘤生长提供营养并间接促进肿瘤细胞的增殖，在乳腺癌的浸润和转移中起到了重要作用，是乳腺癌肿瘤的血管生成和浸袭的有价值的预测指标。
VEGFs基因由8个外显子和7个内含子组成，定位于染色体6p21.3，由于外显子剪切的不同而形成不同的亚型。作为特异的内皮细胞有丝分裂素，它是最主要的血管生成因子。它不仅与胚胎发育、创伤修复、骨形成改建等生理性过程有关，而且参与心血管疾病、缺血缺氧性疾病等病理性血管形成过程，尤其与肿瘤新生血管的形成[7]、生长、浸润、转移等密切相关。癌细胞的生长、转移依赖[8]新生血管的形成,VEGF是最有效的促血管生长因子。VEGF可通过调节survivin和bel-2等基因的表达抑制肿瘤细胞凋亡，增加肿瘤细胞的存在，肿瘤VEGF的高表达与肿瘤已达晚期或不良的预后密切相关，在乳腺癌中VEGF的表达水平已成为监测肿瘤复发或患者生存的预后因素，是一个很好地肿瘤标志物，也是肿瘤治疗重要靶标之一，因此VEGF及其受体VEGFR为靶点治疗癌症一直是药物研究的热点。而我们的研究更进一步证实了VEGF在乳腺癌发生过程中具有重要的作用。这对于作为其药物开发领域提供了有力的证据支持。
参考文献
[1]BeresfordSAA,JohnsonKC,RitenbaughC,etal.Low-fatdietarypatternandriskofcolorectalcancer[J].JAMA,2006,295:643-654.
[2]WangCA,JedlickaP,PatrickAN,etal.SIX1induceslymphangiogenesisandmetastasisviaupregulationofVEGF-Cinmousemodelsofbreastcancer[J].JClinInvest,2012,122:1895-1906.
[3]FromowitzFB,ViolaMV,ChaoS,etal.Rasp21expressionintheprogressionofbreastcancer[J].Humanpathology,1987,18:1268-1275.
[4]MajumderM,Tutunea-FatanE,XinX,etal.Co-Expressionofalpha9beta1IntegrinandVEGF-DConfersLymphaticMetastaticAbilitytoaHumanBreastCancerCellLineMDA-MB-468LN.PLoSOne,2012,7:e35094.
[5]邵志敏,沈镇宙,徐兵河.乳腺肿瘤学[M].上海：复旦大学出版社，2013，13~15.
[6]ValdehitaA,CarmenaMJ,BajoAM,etal.RNAinterference-directedsilencingofVPAC1receptorinhibitsVIPeffectsonbothEGFRandHER2transactivationandVEGFsecretioninhumanbreastcancercells[J].MolCellEndocrinol,2012,348:241-246.
[7]KimTH,KimK,ParkSJ,etal.ExpressionofSOCS1andSOCS3IsAlteredintheNasalMucosaofPatientswithMildandModerate/SeverePersistentAllergicRhinitis[J].IntArchAllergyImmunol,2012,158:387-396.
[8]RodriguesP,FurriolJ,TormoE,etal.Thesingle-nucleotidepolymorphisms+936C/TVEGFand-710C/TVEGFR1areassociatedwithbreastcancerprotectioninaSpanishpopulation[J].BreastCancerResTreat,2012.
[9]ShenoySK,HanS,ZhaoYL,etal.beta-arrestin1mediatesmetastaticgrowthofbreastcancercellsbyfacilitatingHIF-1-dependentVEGFexpression[J].Oncogene,2012,31:282-292.
[10]AmericanCancerSeciety.BreastCancerfactsandfigures2013-2014[M].Atlanta:AmericanCancerSeciety,2013:9~10.