本文主要研究内容
作者朱燕,韩小韦,牛毅男,郑蓓,李学俊,徐全乐,陈鹏（2019）在《核酸外切酶Ⅷ截短体的重组表达及其在体外DNA重组反应中的应用》一文中研究指出：核酸外切酶Ⅷ(ExonucleaseⅧ,ExoⅧ)是一种不依赖于ATP的dsDNA 5?-3?核酸外切酶,可作为体外DNA重组反应极具应用价值的候选蛋白。目前关于ExoⅧ在体外DNA重组反应中的应用尚未有文献报道。本研究构建了保留完整外切活性的截短ExoⅧ(Truncated exonucleaseⅧ,tExoⅧ)的重组表达载体pET28a-tExoⅧ,实现了tExoⅧ在大肠杆菌中的高效表达,在纯化获得高纯度蛋白的基础上,对体外重组反应的温度、反应时间、同源臂长度等因素进行了优化分析。研究结果表明,tExoⅧ在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达,每升可纯化92.40 mg tExoⅧ,比活力为1.21×10~5 U/mg;在10μL的重组体系中,2.5 U的tExoⅧ于25℃反应12.5min随后50℃保温50 min时重组效率最高。添加Pfu DNA聚合酶的体外同源臂延伸策略可以有效提高重组克隆的效率。以转化效率为2.2×10~6 CFU/μg的Mach1T1为受体细胞,对于含有21 bp同源臂的1 kb片段与5.8 kb线性化载体的重组,每微克载体可形成1.1×10~4个重组克隆,且阳性率大于80%。同源臂长度在8–21bp范围内,重组反应效率随着同源臂长度增加而提高。在最佳反应条件下,同源臂长度仅为8bp仍可实现有效的重组反应。ExoⅧ介导的体外重组体系具有酶制备方法简单、对DNA的克隆无酶切位点限制及高重组克隆效率等显著优点,是分子生物学领域具有潜在应用价值的高效基因克隆新体系。
Abstract
he suan wai qie mei Ⅷ(ExonucleaseⅧ,ExoⅧ)shi yi chong bu yi lai yu ATPde dsDNA 5?-3?he suan wai qie mei ,ke zuo wei ti wai DNAchong zu fan ying ji ju ying yong jia zhi de hou shua dan bai 。mu qian guan yu ExoⅧzai ti wai DNAchong zu fan ying zhong de ying yong shang wei you wen suo bao dao 。ben yan jiu gou jian le bao liu wan zheng wai qie huo xing de jie duan ExoⅧ(Truncated exonucleaseⅧ,tExoⅧ)de chong zu biao da zai ti pET28a-tExoⅧ,shi xian le tExoⅧzai da chang gan jun zhong de gao xiao biao da ,zai chun hua huo de gao chun du dan bai de ji chu shang ,dui ti wai chong zu fan ying de wen du 、fan ying shi jian 、tong yuan bei chang du deng yin su jin hang le you hua fen xi 。yan jiu jie guo biao ming ,tExoⅧzai da chang gan jun zhong yi ke rong xing xing shi gao xiao biao da ,mei sheng ke chun hua 92.40 mg tExoⅧ,bi huo li wei 1.21×10~5 U/mg;zai 10μLde chong zu ti ji zhong ,2.5 Ude tExoⅧyu 25℃fan ying 12.5minsui hou 50℃bao wen 50 minshi chong zu xiao lv zui gao 。tian jia Pfu DNAju ge mei de ti wai tong yuan bei yan shen ce lve ke yi you xiao di gao chong zu ke long de xiao lv 。yi zhuai hua xiao lv wei 2.2×10~6 CFU/μgde Mach1T1wei shou ti xi bao ,dui yu han you 21 bptong yuan bei de 1 kbpian duan yu 5.8 kbxian xing hua zai ti de chong zu ,mei wei ke zai ti ke xing cheng 1.1×10~4ge chong zu ke long ,ju yang xing lv da yu 80%。tong yuan bei chang du zai 8–21bpfan wei nei ,chong zu fan ying xiao lv sui zhao tong yuan bei chang du zeng jia er di gao 。zai zui jia fan ying tiao jian xia ,tong yuan bei chang du jin wei 8bpreng ke shi xian you xiao de chong zu fan ying 。ExoⅧjie dao de ti wai chong zu ti ji ju you mei zhi bei fang fa jian chan 、dui DNAde ke long mo mei qie wei dian xian zhi ji gao chong zu ke long xiao lv deng xian zhe you dian ,shi fen zi sheng wu xue ling yu ju you qian zai ying yong jia zhi de gao xiao ji yin ke long xin ti ji 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自生物工程学报的朱燕,韩小韦,牛毅男,郑蓓,李学俊,徐全乐,陈鹏，发表于刊物生物工程学报2019年05期论文，是一篇关于核酸外切酶截短体论文,表达纯化论文,体外同源重组论文,生物工程学报2019年05期论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自生物工程学报2019年05期论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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