导读:本文包含了断裂蛋白质内含子论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:N端无半胱氨酸断裂蛋白质内含子,蛋白质N端标记,蛋白质剪接
断裂蛋白质内含子论文文献综述
李佳,孟清[1]（2019）在《N端无半胱氨酸断裂蛋白质内含子的构建》一文中研究指出在体内或体外对目标蛋白进行标记或修饰,是研究蛋白质结构和功能的重要手段之一。目前的蛋白质修饰手段存在很多不足之处,尤其会对蛋白质的结构和功能产生影响。为了避免或降低这些影响,借助断裂蛋白质内含子反式剪接技术进行修饰是一个有效可行的方法。可是因为天然存在的断裂蛋白质非常少,使该技术的应用受到了限制。因此通过数据库筛选、定点突变、Western Blot等技术成功获得了2个有活性的体内断裂蛋白质内含子和1个有活性的N端无半胱氨酸的断裂蛋白质内含子。为后续可控的和特异的蛋白N端标记及应用提供了可行的生物学工具。(本文来源于《生物学杂志》期刊2019年04期）
张露[2]（2018）在《新型断裂蛋白质内含子介导的蛋白质内部位点特异性标记》一文中研究指出蛋白质的标记和修饰对于研究蛋白质的功能和结构是不可或缺的。目前,随着蛋白质标记和修饰技术的不断发展和成熟,蛋白质位点特异性的标记在生物领域有着大量的潜在应用。其中在蛋白质的功能研究方面起到了重要作用,例如研究信号通路相关蛋白质时,就需要体外表达目标蛋白且进行标记或修饰;另外利用核磁共振测目标蛋白结构时,也需要对目标蛋白进行标记。为了达到目标蛋白位点特异性的修饰和标记,目前,存在很多基于分子生物学和化学的蛋白质标记或修饰的方法,但是它们都有自身的缺点,且大部分只能做到对目标蛋白质末端位点的标记做不到内部位点的特异性的标记。蛋白质的反式剪接(protein trans-splicing)技术可以说是为蛋白质位点特异性的标记提供了新的方法。首先,蛋白质的反式剪接即由断裂蛋白质内含子介导的。断裂蛋白质内含子的特点是由两部分组成,命名为断裂蛋白质内含子的N端()和断裂蛋白质内含子的C端(),它们分别位于两个开放阅读框中(open reading frame,ORF)。当N端和C端的蛋白质内含子分别翻译成熟后,和能够重新识别,并且形成具有催化功能的活性中心,从而进行蛋白质的反式剪接。最终断裂蛋白质内含子被剪切下来,蛋白质内含子两侧的外显子通过肽键连接起来。目前利用断裂蛋白质内含子已经实现了蛋白质末端的标记与修饰,但是仍然没有做到蛋白质内部位点特异性的标记与修饰。而本文实现了对蛋白质内部位点的特异性标记。这也是首次利用断裂蛋白质内含子实现蛋白质的内部标记。本课题最终选取了TE3S11和RBS1两种新型的断裂蛋白质内含子。其中S1型断裂蛋白质内含子的N端仅包含有11个氨基酸,S11型断裂蛋白质内含子的C端仅包含有6个氨基酸。可用于目标蛋白位点特异性的荧光基团的标记。将麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)和TE3S11N(S11型断裂蛋白质内含子的N端)融合,形成N端前体蛋白;TE3S11C(S11型断裂蛋白质内含子的C端)、标有荧光基团FITC的赖氨酸和RBS1N(S1型断裂蛋白质内含子的N端)融合形成中间前体蛋白;RBS1C(S1型断裂蛋白质内含子的C端)与硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)融合形成C端前体蛋白。化学法合成中间前体蛋白。利用Amylose Resin纯化可得到N端前体蛋白,利用Ni~(2+)-NTA纯化可得到C端前体蛋白。叁种前体蛋白需要按照摩尔比1:1:1在室温下进行蛋白质的反式剪接,最后通过SDS-PAGE、Western Blot、荧光扫描以及质谱鉴定终产物,判断是否可以实现蛋白质内部位点特异性的标记。最终结果表明,本文实现了对目标蛋白内部位点特异性的标记。相比较已有的技术,本文中涉及到的技术更为简便、通用和真正实现了蛋白质内部位点的特异性标记。为蛋白质的标记开辟了新的方法。在蛋白质工程中具有很大的潜在应用。(本文来源于《东华大学》期刊2018-01-18）
林森珠,陈格飞,孟清[3]（2016）在《DNA展示系统介导的断裂蛋白质内含子体外定向进化方法的研究》一文中研究指出蛋白质内含子对于外显子的选择性限制了它的应用范围。目前,已经建立的卡那霉素定向进化系统适用于微小蛋白质内含子,但不适用于断裂蛋白质内含子。为了研究适用于断裂蛋白质内含子的定向进化的方法,我们引入了DNA展示系统。在该系统中,生物素化基因在人工细胞中与其表达的融合蛋白(内含子C端-外显子-生物素结合蛋白)形成DNA-蛋白质连接体。只有能与后续加入的N端蛋白质内含子前体(Flag-内含子N端)发生剪接反应的DNA-蛋白质连接体,才能被加上旗帜标签(Flag),从而被抗旗帜标签抗体纯化柱(Anti Flag antibody M2 agarose)筛选富集。为了验证该系统的可行性,实验构建了2个基因,即含有具剪接活性的蛋白质内含子的阳性基因IRC和含有不具剪接活性的蛋白质内含子的阴性基因IRCM。实验首先通过Western印迹和琼脂糖凝胶电泳证明,人工细胞中的体外转录翻译系统不仅可高表达500个氨基酸的蛋白质,而且表达的蛋白中内含子仍保持原有的剪接能力。生物素结合蛋白能结合95%的DNA,并且形成的DNA-蛋白质连接体可以被筛选富集,最终证明了该系统用于断裂蛋白质内含子定向进化筛选的可行性。随后,为了检测系统的富集效率,制备了人为的基因"突变库",即将基因IRC和IRCM以摩尔比1:10的比例混合,经过2轮筛选后,阳性基因IRC可以被10倍富集,进一步证明了体外筛选方法的可行性。该方法为后续针对不同宿主进化出不同的断裂蛋白质内含子提供筛选方法支持,也为断裂蛋白质内含子的在生物技术和研究领域的应用奠定了基础。(本文来源于《中国生物化学与分子生物学报》期刊2016年10期）
张晓玲[4]（2015）在《断裂蛋白质内含子介导的蛋白质两端标记》一文中研究指出蛋白质标记是蛋白质的结构、功能及其相互作用研究中必不可少的工具。现今，随着蛋白标记技术的不断发展和成熟，多位点特异性标记蛋白质方法在生命科学多个领域有着广泛应用，尤其是在研究蛋白质动态构像以及动力学分析中起到了重要作用，例如单分子荧光共振能量转移（smFRET）。为实现蛋白质多位点特异性标记，目前已经发展了多种基于化学和/或分子生物学的蛋白质标记方法，但是各自都存在自身的缺陷，不能很好地实现蛋白质多位点特异性标记。蛋白质反式剪接技术（protein trans-splicing）的发展为蛋白质的标记开辟了新途径。蛋白质反式剪接反应是由断裂蛋白质内含子（split-intein）介导，断裂蛋白质内含子在蛋白质内含子内部区域特定位点发生断裂，形成N-端蛋白（IN）和C-端蛋白（IC），分别由基因组上相距较远的两个开放阅读框（open reading frame，ORF）编码。在蛋白质翻译后成熟过程中，IN和IC相互识别，重建催化活性中心，催化反式剪接反应发生。蛋白质外显子（exteins）通过肽键相连接，形成成熟的蛋白质，IN和IC在蛋白质成熟过程中自我剪切下来。现今利用断裂蛋白质内含子介导的蛋白质反式剪接已经实现蛋白质的N和C端的单一特异性蛋白质标记，Yang等人2009年实现了蛋白质两端的特异性标记。本论文利用两种不同的断裂蛋白质内含子同样实现蛋白质两端的特异性标记，相比已有的标记方法有许多优越性，并且实现蛋白质两端特异性同时标记，方法优于yang实验室的蛋白质两端特异性标记方法。本课题选取SG-S1、SX-S1、TX-S1和TE3-S11断裂蛋白质内含子，其中S1型断裂蛋白质内含子的N端仅含有12个氨基酸，S11型断裂蛋白质内含子的C端仅含有6个氨基酸，用于重组蛋白质N末端或C末端荧光染料标记。将S1型断裂内含子C端和S11型断裂内含子N端分别与靶蛋白diUb的N端和C端融合，形成M端前体蛋白；荧光染料FITC标记S1型断裂内含子N端，形成N端前体蛋白；荧光染料Alexa594标记S11型断裂内含子C端，形成C端前体蛋白。化学方法合成荧光标记的N端前体蛋白，利用Ni2+-NTA纯化得到M端前体蛋白和C端前体蛋白，筛选合适的M端前体蛋白。N端前体蛋白、M端前体蛋白和C端前体蛋白按摩尔比1：1：1进行反式剪接反应，通过优化反应条件和C端前体蛋白优化反式剪接反应，通过荧光扫描、SDS-PAGE和质谱检测技术，检测是否产生两端特异性标记蛋白产物。研究结果表明，本文实现了蛋白质两端特异性同时标记。相比已有的标记方法，具有特异性，通用性、操作简捷等优点。开辟了新的蛋白质多位点特异性标记方法，使蛋白质标记不再局限于传统的氨基酸特异性标记。在蛋白质工程和蛋白质构象动态学研究中有着潜在的应用价值。(本文来源于《东华大学》期刊2015-01-15）
戴旭东,李佳,刘相钦,孟清[5]（2014）在《应用突变的断裂蛋白质内含子标记蛋白质N端》一文中研究指出蛋白质的特异位点修饰可以帮助了解蛋白质的结构与功能.但是,现有的蛋白质特异位点标记方法种类有限,而且存在局限性,所以有必要开发新的蛋白质特异位点标记方法.以谷胱甘肽-S-转移酶(GST)为研究对象,借助蛋白质反式剪接技术,建立了利用新型断裂蛋白质内含子对蛋白质进行N端标记的新方法.在这个方法中,通过简单的重组表达、标记和纯化得到带有荧光基团的小肽,经过蛋白质反式剪接,荧光基团被标记到蛋白质的N端.初步研究结果显示,标记效率可达到12%.(本文来源于《中国生物化学与分子生物学报》期刊2014年05期）
宋慧玲[6]（2014）在《新型断裂蛋白质内含子介导的蛋白质反式剪接系统的建立及应用》一文中研究指出蛋白质内含子(intein)是前体蛋白质中的一段插入序列,被认为是基因内含子(intron)在蛋白质水平上的等效物质,它通过催化蛋白质剪接反应将自身从前体蛋白质中剪切出来,并将两侧的蛋白质外显子序列(N-端蛋白质外显子和C-端蛋白质外显子)以天然肽键连接。断裂型蛋白质内含子(split-intein)是蛋白质内含子的断裂形式,表达前体蛋白质的开放阅读框被分裂成了两个基因,断裂位点是在蛋白质内含子的序列内,断裂蛋白质内含子因此得名。N-端蛋白质外显子(EN)与断裂型蛋白质内含子的N端(IN)形成的融合蛋白,称为N-端前体蛋白质。断裂型蛋白质内含子的C端(Ic)与C-端蛋白质外显子(Ec)形成的融合蛋白,称为C-端前体蛋白质。分离的IN与Ic能够通过结构互补相识别以非共价键结合,形成有功能的蛋白质内含子,从而催化蛋白质反式剪接反应,将两个分离的蛋白质外显子(EN、EC)以肽键连接。蛋白质反式剪接正逐渐成为蛋白质工程中的重要工具,已经在多肽连接、基因治疗等方面得到应用。传统的S0型断裂蛋白质内含子是在靠近蛋白质内含子中部的位置断裂,含有较大的N-端和C-端,难于化学合成。近来,人们构建了新型的S1型断裂蛋白质内含子,断裂位点是在靠近蛋白质内含子N-末端的位置,其N-端较小,仅有11个氨基酸残基。如果N-端蛋白质外显子也是较小的多肽,人们可以比较容易地化学合成由N-端蛋白质外显子与S1型断裂蛋白质内含子N-端形成的N-端蛋白质前体,而N-端蛋白质外显子可在人工合成过程中添加某种修饰基团或探针标记,在蛋白质反式剪接后,N-端蛋白质外显子被连接到目标蛋白质的剩余部分即C-端蛋白质外显子上,因此修饰基团或探针标记被随之添加到了整个目标蛋白质分子上。Ssp DnaB S1型断裂蛋白质内含子已经被成功应用于体外重组蛋白质的N-末端荧光标记和动物细胞表面蛋白质的标记。此外,人们构建了新型的S11型断裂蛋白质内含子,断裂位点是在靠近蛋白质内含子C-末端的位置,其C-端较小,仅有6个氨基酸残基。同理,如果C-端蛋白质外显子是较小的多肽,可通过S11型断裂蛋白质内含子的反式剪接将修饰或标记过的C-端蛋白质外显子连接到目标蛋白质的C-末端。SspGyrB S11型断裂蛋白质内含子已经被用于在重组蛋白质的C-末端添加荧光基团。S1型断裂蛋白质内含子、S11型断裂蛋白质内含子介导的蛋白质反式剪接又被称为多肽-蛋白质剪接、蛋白质-多肽剪接。为蛋白质添加荧光基团或同位素等探针标记在细胞定位研究、蛋白质示踪方面具有很重要的作用,而化学修饰(例如非天然的氨基酸)可以有助于研究蛋白质结构-功能之间的关系。常规的添加探针标记的化学方法通常以特定的氨基酸侧链(硫醇基、羧基、氨基等)为靶标,蛋白质中的不同位置可能存在多个靶标,因此会产生多种混合的修饰性蛋白质。用于特异性标记蛋白质的其它方法也都具有局限性。基于S1型和S11型断裂蛋白质内含子的蛋白质反式剪接是一种新型的具有潜在优势的蛋白质修饰方法。蛋白质反式剪接发生在目标蛋白质的特定位点,因而保证了标记或修饰位点的特异性：此外,这种方法不会在被修饰的蛋白质上残留大的蛋白质标签,而且由于可以在化学合成的多肽外显子上添加仟何化学模体,其应用更加具有多样性。不同的蛋白质内含子对于不同蛋白质外显子的剪接效率可能不同,为了更好地实现上述或其它潜在的利用多肽-蛋白质剪接或蛋白质-多肽剪接的应用,人们需要更进一步地探索蛋白质内含子的结构与其功能的奥秘,并且.需要获得更多种不同的新型断裂蛋白质内含子以供选择。根据最新的研究报道,蛋白质内含子Ssp DnaX的较大C-端片段(IC)能够发生自发性的C-端断裂反应,而蛋白质内含子Ssp DnaB的C-端大片段(I(,)不具有这一现象。这种C-端断裂反应是人们意料之外的,关于此蛋白质内含子的结构与功能的关系以及蛋白质反式剪接的活性有待进一步研究。在本论文中,我们的研究结果表明,蛋白质内含子Ssp DnaX的N-端片段(IN)存在时,其IC片段可以与IN发生蛋白质反式剪接反应,而且蛋白质反式剪接反应的活性抑制了C-端断裂反应的活性。此外,本研究发现此IC也能够与来源于另外两种蛋白质内含子的IN发生蛋白质反式剪接反应,表明断裂蛋白质内含子Ssp DnaX与其它蛋白质内含子存在交叉反应活性。另外,本研究发现即使蛋白质内含子Ssp DnaX的IN被包裹在一个接近完整的蛋白质内含子结构内部,Ic仍然能够与之发生蛋白质反式剪接反应,揭示此蛋白质内含子的IN部分可以游离出结构中心的催化口袋,并与Ic相互识别。总之,本研究发现了一种非常有价值的可用于多肽-蛋白质反式剪接的新型断裂蛋白质内含子,并且进一步证实了蛋白质内含子结构的灵活性以及此蛋白质内含子在活性位点的交叉反应活性。蛋白质内含子Ssp GyrB非常具有研究价值,因为这个蛋白质内含子可以被改造成非传统型的新型断裂形式即S11型。本研究发现,蛋白质内含子SspGyrB也可以改造成为有活性的S1断裂型,且没有检测到Ssp GyrB S1型断裂蛋白质内含子发生C-端断裂的副产物,这与其它一些发生不同程度副反应的蛋白质内含子相比,具有很大的优势。此外,在Ssp GyrB蛋白质内含子内部添加6×组氨酸标签,不会阻断蛋白质剪接活性,因此,便于含有该蛋白质内含子的融合蛋白通过镍(Ni)亲和层析得到纯化。另外,本研究发现重迭型的Ssp GyrB蛋白质内含子也有蛋白质反式剪接活性,可能适用于重组蛋白质的可溶性表达与剪接。由于S0型断裂蛋白质内含子的断裂位点在靠近蛋白质内含子结构的中间位置,可能容易对蛋白质内含子的结构造成破坏,经常导致这种断裂蛋白质内含子的其中一个或两个片段与蛋白质外显子形成的融合蛋白错误折迭或可溶性较差。本研究发现的Ssp GyrB重迭型断裂蛋白质内含子是由S11型断裂蛋白质内含子的N-端和S1型断裂蛋白质内含子的C-端组成,即两个片段均是接近完整的蛋白质内含子片段,对蛋白质内含子整体结构的破坏较小,发生错误折迭的可能性相对较低。本论文对另外两种S1型断裂蛋白质内含子Rma DnaB、Ssp GyrB的较大C-端片段分别与不同S1型断裂蛋白质内含子的N-端片段在大肠杆菌内的交叉反应活性进行了分析检测。目的是探讨S1型断裂蛋白质内含子的结构杂交特征是否具有普遍性。结果发现,S1型蛋白质内含子Rma DnaB的C-端片段能够与S1型蛋白质内含子Ssp GyrB的N-端片段交叉反应,不能与S1型断裂蛋白质内含子Ssp DnaX的N-端片段交叉反应;与此相似,S1型蛋白质内含子Ssp GyrB的C-端蛋片段能够与DnaB的N-端片段交叉反应,不能与却DnaX的N-端蛋片段交叉反应。这表明S1型断裂蛋白质内含子C-端大片段的交叉反应活性具有一定的普遍性,并非Ssp DnaX的C-端大片段独有的特征此外,某些交叉反应表现出温度依赖性。我们检测了多种杂合断裂蛋白质内含子的交叉剪接反应活性,对S1型、S11型断裂蛋白质内含子的体外交叉反应进行了研究。我们获得了一个包含有多种无交叉反应的S1型断裂蛋白质内含子和S11型断裂蛋白质内含子的数据库,包括多个S1型、多个S11型和多个S1与S11型的混合组合,形成了一个新的同时利用多个断裂型蛋白质内含子的蛋白质反式剪接系统,我们对此系统进行了模拟应用。此系统中多个新型断裂蛋白质内含子在同一体系中的共剪接能够在蛋白质研究及蛋白质工程领域广泛应用。例如在某“体系中,当人们需要同时研究多个蛋白质时,利用多个新型断裂蛋白质内含子共剪接可以实现对多个目标蛋白质的修饰或标记。选择此蛋白质反式剪接系统中的断裂蛋白质内含子我们成功模拟了两种S11型断裂蛋白质内含子的共剪接、两种S1型断裂蛋白质内含子的共剪接和S11型与S1型断裂蛋白质内含子的共剪接,没有发生非特异性的交叉剪接,证实了此系统至少在本实验环境中的可行性。利用无交叉反应的S11型和S1型断裂蛋白质内含子,还可以进行内部小肽剪接反应,从而将小肽剪接到蛋白质的内部。我们选择了9组上述系统中的S11型和S1型断裂蛋白质内含子的组合进行了内部小肽剪接实验。除了其中一个组.合外其余8种组合均成功将小肽剪接到了蛋白质外显子内部。由于中间前体肽较小,容易人工化学合成,在合成过程中可以进行小肽的修饰或标记,通过S11型和S1型断裂蛋白质内含子的剪接反应,小肽被剪接到目标蛋白质的内部。因此,断裂蛋白质内含子在内部小肽剪接方面的应用可以实现在蛋白质内部特异位点的修饰或标记。上述蛋白质反式剪接系统还可以有很多其它方面的应用。例如,此系统可以对蛋白质内部进行同位素探针标记,用于核磁共振(NMR)究。可以在蛋白质分子两端进行荧光标记或化学修饰(糖基化、磷酸化等)；有些毒性蛋白无法在细胞内完整表达,也有些蛋白质因分子量太大而无法在细胞内表达完整,均可以利用此系统中无交叉反应的断裂蛋白质内含子,将目标蛋白质分多个小段单独表达后通过蛋白质反式剪接有序连接形成完整的蛋白质。荧光能量共振转移(FRET)在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。但是这种技术需要为蛋白质添加两个或更多的荧光探针。利用多个S1型或S11型的断裂蛋白质内含子则可以实现对多个蛋白质分子的特异性标记或单个蛋白质分子的多位点特异性标记。本论文主要涉及新型断裂蛋白质内含子的构建,蛋白质内含子结构与功能关系的研究,断裂型蛋白质内含子的杂交反应研究,新的蛋白质反式剪接系统的建立及其应用研究。论文的研究成果使人们对蛋白质内含子有了更多的认识,并且提供了更丰富的蛋白质研究及蛋白质工程的工具和方法,有利于促进生物技术、生物医药和蛋白质化学等领域的发展。(本文来源于《东华大学》期刊2014-01-01）
邱沛然[7]（2012）在《微小蛋白质内含子和新型断裂蛋白质内含子的定向进化》一文中研究指出蛋白质内含子(intein)可视为RNA内含子的蛋白质等价物,是一段位于宿主蛋白质前体中的插入序列,连接在其两端的蛋白质序列称为蛋白质外显子(extein)。根据蛋白质内含子的结构特征可将其分为叁类：标准型蛋白质内含子、微小型蛋白质内含子和断裂型蛋白质内含子。在宿主蛋白质的成熟过程中,蛋白质内含子可以催化自身从蛋白质前体中剪切下来,同时将两侧的外显子以肽键连接,这种蛋白质翻译后的成熟过程称为蛋白质剪接(protein splicing)。蛋白质剪接技术为在蛋白质水平上直接对蛋白质进行修饰和加工提供了一种全新的解决方案,因而在蛋白质工程及相关领域具有非常广阔的应用前景。现阶段,大部分天然的蛋白质内含子在异源蛋白质中剪接活性非常低，极大限制了蛋白质内含子的开发和应用。虽然已经获得Ssp DnaB、Ssp DnaE及Mxe GyrA等蛋白质内含子的晶体结构,但是对其结构和剪接功能之间的关系仍所知甚少,这就使得通过理性设计的方法来提高异源蛋白质中蛋白质内含子的剪接活性变得十分困难。在本研究中,将蛋白质内含子编码基因插入到卡那霉素抗性蛋白基因中,使蛋白质内含子剪接活性与卡那霉素抗性相结合,构建基于卡那霉素抗性的筛选系统。分别选择Ter ThyX(TX)和Ter DnaE-3(TE3)两个蛋白质内含子的微小型、S1型和S11型插入到卡那霉素抗性蛋白基因的多个位点,在成功的验证该系统可行性的同时,也为定向进化筛选合适的进化位点。结果表明TX微小型蛋白质内含子在卡那霉素抗性蛋白的多个位点均具有较高的剪接活性,而S1和S11型对应的剪接活性则明显较低,其中S1型蛋白质内含子只在卡那霉素抗性蛋白中的一个位点有较弱的剪接活性,S11型蛋白质内含子在所有位点均无剪接活性。对于TE3蛋白质内含子而言,除了微小型蛋白质内含子在其中个位点有微弱的剪接活性之外,S1和S11型内含子在所有位点均没有剪接活性。在下一步试验中,利用易错PCR作为进化手段,构建了菌落数超过106的突变库,经过两轮筛选在抗性平板上获得了9个提高了剪接活性的突变株。western blot结果显示：经过进化后的TE3微小内含子在该系统中的剪接活性从20%提高到了超过60%。结合蛋白质内含子的结构信息分析各处突变,其中E71D(Glu突变为Asp)这个突变可能位于蛋白质内含子与N端外显子接触区,而D的侧链比E要短,由此分析可能是因为D为N端外显子提供了更大的空间使得蛋白质内含子的剪接活性提高。对于TX内含子,本研究尝试对其S1和S11型内含子进行定向进化,可能是由于其本身溶解性的原因,未能取得阳性克隆。本研究通过定向进化技术成功提高了蛋白质内含子的剪接活性,为蛋白质内含子的应用提供了丰富的资源。分析高剪接活性突变体的结构信息,为研究蛋白质内含子结构和功能之间的关系带来更多的信息和新的启示。随着在结构和功能方面的进一步研究,蛋白质内含子将得到更广泛的应用,为蛋白质工程研究开辟新的途径。(本文来源于《东华大学》期刊2012-06-01）
王瑾,林瑛,郑言成,孟清[8]（2012）在《新型T+1断裂蛋白质内含子的构建》一文中研究指出首次从天然C端外显子为苏氨酸(Thr)的标准蛋白质内含子(TerSnf2)构建出两类T+1型断裂蛋白质内含子:Snf-S0和Snf-S1,通过蛋白印迹法测定Snf-S0和Snf-S1介导的蛋白质反式剪接效率分别达到53.5%和33.3%;当这两类断裂蛋白质内含子C端外显子分别为半胱氨酸(Cys)和丝氨酸(Ser)时均具有剪接活性.所获的两类具有剪接活性的T+1型断裂蛋白质内含子具备一定的插入位点通用性,这一特点为蛋白质反式剪接技术在蛋白质工程领域广泛应用提供了新的契机.(本文来源于《东华大学学报(自然科学版)》期刊2012年01期）
李佳[9]（2012）在《N端无半胱氨酸断裂蛋白质内含子的构建及蛋白质N端标记的应用》一文中研究指出蛋白质是细胞功能的主要执行者。在许多情况下,一个细胞功能的实现是多个蛋白质分子相互作用的结果。近年来,随着蛋白质标记技术的不断发展与成熟,对蛋白质的研究进入了一个高速发展的阶段。对它们的研究主要包括“体内”和“体外”两个方向。体外研究的重点是纯化后的蛋白质,将它们置于可控制的环境中,以期获得它们的功能信息；而体内研究实验着重于蛋白质在细胞或者整个组织中的活性作用,从而可以了解蛋白质发挥功能的场所和相应的调节机制。在体内或者体外的蛋白质工程和蛋白质修饰有利于帮助探究蛋白质的生物功能和结构功能。目前对蛋白质进行标记的方法主要有各种化学方法和利用蛋白质内含子的反式剪接进行的标记。前者大多数相对简单易行,可是存在许多不足之处,如特异性不强,化学标签容易干扰被标记蛋白的活性,蛋白浓度要求较高等；后者是一项新兴的蛋白质标记技术,它虽然克服了化学标记的不足可是目前仍有融合蛋白不稳定、溶解性较差、活性低和通用性差等急需解决的问题。本文在蛋白质反式剪接的基础上另辟蹊径,寻找内部半胱氨酸较少的内含子,对活性较高的内含子我们利用定点突变、搭桥PCR等方法,构建断裂蛋白质内含子,获得活性较高的N末端(整个intein内部)无半胱氨酸的内含子,并通过SDS-PAGE, Western Blot等方法检测蛋白质内含子的剪接活性,然后利用实验室的TM系统检测蛋白质内含子作为标记手段的应用潜质。最后选择合适的蛋白进行N端特异性标记。本课题选取蛋白质内含子TerNdse-2、TX-S1、HaVol Pol、Msm DnaB-1、Arsp FB24和PP-PhiEL ORF40进行蛋白质N端标记的研究。其中Msm DnaB和Arsp FB24为3型蛋白质内含子,其余均为常见的1型蛋白质内含子。TerNdse、TX-S1 (C1/S)、HaVol Po1、Msm DnaB-1和Arsp FB24的一位氨基酸分别为丝氨酸、丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸,这些intein内部半胱氨酸也非常少,有利于定点突变和后续标记的应用。首先对这些蛋白质内含子的原始剪接活性进行检测,在体内pMTerNdse-2有微弱接活性,pMTX-S1 (C1/S)有较高的剪接活性(本实验室已研究,体内和体外均由较高的剪接活性),pMHP的剪接活性为100%,pMMD(C1突变成S后)有微弱的剪接活性,pMAF没有任何剪接活性。接着对pMTerNdse-2、pMTX-S1 (C1/S)和pMHP进行氨基酸定点突变,将其内部的所有半胱氨酸通过搭桥PCR突变成丝氨酸,同时将pMMD内部的C1恢复。通过Western Blot检测它们的剪接活性。pMTerNdse-2、pMTX-S1 (C1/S)和pMHP在半胱氨酸完全突变后没有任何剪接活性,pMMD有非常高的剪接活性。对pMHP,将其内部的四个半胱氨酸分别突变成丝氨酸,我们发现第二个半胱氨酸可以决定其剪接活性,利用定点突变的方法选择其侧链基团相似的氨基酸进行替换,首先选择苏氨酸和甘氨酸进行替换,幸运的获得了两个内部有剪接活性的无半胱氨酸的HP突变体、pMHPG和pMHPT,为荻得一种通用性的标记intein奠定了基础。通过和实验室的蛋白质内含子进行比对等确定S1、S0和S11叁个断裂位点,构建pMTerNdse-2、pMMD、pMHP、pMHPG和pMHPT对应的S1、S0和S11体内断裂蛋白质内含子。通过Western Blot检测其剪接活性,pMTerNdse-2、pMHP和pMHPG叁个断裂intein没有剪接活性,pMHPT-S1有较高的剪接活性；pMMD-SO有100%的剪接活性。通过SWISS MODLE建模,Protean比对等,从新选择了其它断裂位点,pMHP、pMHPG和pMHPT选择了10个新的断裂位点F1-F10,pMMD重新选择了5个断裂位点F1-F5。通过Western Blot检测其体内剪接活性,结果显示,pMHP-F2和F8有较高的剪接活性；pMHPT只有F2有剪接活性；pMMD只有F4有非常高的剪接活性。选择pMHP-F2、pMHP-F8、pMHPT-S1、pMHPT-F2、pMMD-S0、pMMD-F4和pMTX-S1 (C1/S)几个蛋白质内含子,构建含有N端前体蛋白或C端前体蛋白相应序列的表达质粒,麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein, MBP)与IN组成的融合蛋白为N端前体蛋白：IC与硫氧还蛋白(thioredoxin, T)组成的融合蛋白为C端前体蛋白。利用N端前体蛋白带有的MBP标签可以与Amylose resin特异性结合,C端前体蛋白带有的6×组氨酸标签可以与Ni-NTA resin特异性结合,纯化得到用于后续体外反应所需的N端前体蛋白和C端前体蛋白。将纯化的N端前体蛋白与C端前体蛋白在摩尔比为1：1的条件下进行反应,通过Western印迹检测剪接反应的活性,结果表明,断裂蛋白质内含子pMTX-S1(C1/S)和pMMD-SO有部分剪接活性,其余蛋白质内含子的体外剪接活性还需要进一步实验验证。对有剪接活性的体外断裂蛋白质内含子,我们选择TXS1在TM系统检测其蛋白质N端标记的应用。将TX-S1N构建到含有SUMO的PEDHC表达载体中,体外纯化TX-S1N和TX-S1C蛋白,TX-S1N与巯基染料以1：5的比例反应4小时,通过透析袋透析掉未反应的染料,接着SUM0酶与L-X-S1N反应1小时,切除SUMO蛋白,将L-TX-S1和TX-S1 C在体外剪接Buffer内反应3小时,SDS-PAGE检测,利用波长346-442纳米的紫外观察拍照。本课题不仅是对前人研究的补充,同时还克服了化学合成和蛋白质标记的不足之处,实现了蛋白质的N-端特异性位点标记。为实现可控的、特异的、对目标蛋白影响小的对目标蛋白的标记及实际应用奠定了基础。同时,我们发现了一种非常有意思的现象：pMHP和pMMD内部一个非保守区的半胱氨酸竟然可以决定蛋白质内含子的活性,目前没有相关文献的报道,其化学和分子生物学机理值得继续研究,相信是蛋白质内含子剪接理论知识的很好补充。另外,获得了两个活性非常高的内部无半胱氨酸的蛋白质内含子突变体,虽然现在没有获得有活性的体外断裂蛋白质内含子,但是我们会继续研究,希望获得活性较高的多个断裂蛋白质内含子,这样不仅为N端标记提供了选择的蛋白质内含子,同时也为蛋白质的C端标记或两端标记都提供了通用的蛋白质内含子和一种新的蛋白质标记途径。(本文来源于《东华大学》期刊2012-01-01）
荀启静[10]（2011）在《构建及筛选S1型断裂蛋白质内含子用于蛋白质定点标记》一文中研究指出蛋白质内含子是位于宿主蛋白质中的插入序列,在蛋白成熟过程中自我去除,并以肽键连接两侧的宿主蛋白质序列(称为蛋白外显子),蛋白质这一成熟过程被称为蛋白质剪接。断裂蛋白质内含子是指蛋白质内含子被分裂成两部分即N端区域(IN)和C端区域(IC),分别由不同的开放阅读框表达。断裂蛋白质内含子的独特性是能够分段表达或合成,并且能够特异性识别,为蛋白质合成和修饰提供了新的途径,因而在蛋白质工程及其它领域具有广泛的应用前景。在蛋白质标记领域,应用新型断裂蛋白质内含子对目的蛋白特异位点进行修饰或标记,有助于更深入地研究目的蛋白的结构和功能。目前在蛋白质标记领域中所采用的是人工构建的断裂蛋白质内含子,该方法用于定点标记的局限性在于：(1)异源宿主中蛋白质剪接效率可能大大降低甚至不能发生剪接反应,并且其剪接需要的蛋白质外显子的氨基酸也是特定的,限制了蛋白质内含子的应用范围；(2)大片段的断裂蛋白质内含子与目的蛋白进行融合表达,这样可能造成目的蛋白可溶性的改变或其它不可知的影响；(3)人工合成小肽增加了实验成本等。为克服上述局限性,本课题构建6个新型的S1型断裂蛋白内含子,将其C端半胱氨酸突变为丝氨酸,并且将两侧的天然外显子替换为一段通用性高的连接小肽(GG-SAG),对新型断裂蛋白质内含子体内和体外的剪接活性进行检测,筛选出合适的断裂蛋白质内含子进行应用。本文利用实验室已有的微小蛋白质内含子进行改造,成功构建了6个C端无半胱氨酸的S1型断裂蛋白质内含子(称为CF-intein),通过对体内剪接活性的分析,筛选出3个具有相对较高剪接活性的断裂蛋白质内含子(CFRBS1, CFTXS1和CFSXS1)进行体外剪接活性检测。结果分析表明：CFRBS1 intein具有较稳定的剪接活性,较高的剪接活性以及较快的剪接速率；同时模式蛋白的标记检测结果也显示,CFRBS1 intein可进行蛋白质定点标记应用。本课题中期望改造后的S1型断裂蛋白质内含子在进行应用时,特异性较高,不仅可以带上荧光基团、标签等,对于富含半胱氨酸的蛋白也能进行定点标记,并且不需要对目的蛋白进行突变或其它改造。由于C端不含有半胱氨酸,能够避免蛋白质内含子与目的蛋白的巯基形成二硫键。同时所构建的蛋白质内含子的两边已经不是其天然蛋白质外显子,替换成一段连接小肽,这样可以提高其通用性,利于蛋白质工程的实际应用。本课题不仅仅是对前人的研究作为一个补充,更为提高蛋白质内含子在异源蛋白中的适应能力,为拓宽其应用范围打下坚实的基础。(本文来源于《东华大学》期刊2011-12-01）
断裂蛋白质内含子论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
蛋白质的标记和修饰对于研究蛋白质的功能和结构是不可或缺的。目前,随着蛋白质标记和修饰技术的不断发展和成熟,蛋白质位点特异性的标记在生物领域有着大量的潜在应用。其中在蛋白质的功能研究方面起到了重要作用,例如研究信号通路相关蛋白质时,就需要体外表达目标蛋白且进行标记或修饰;另外利用核磁共振测目标蛋白结构时,也需要对目标蛋白进行标记。为了达到目标蛋白位点特异性的修饰和标记,目前,存在很多基于分子生物学和化学的蛋白质标记或修饰的方法,但是它们都有自身的缺点,且大部分只能做到对目标蛋白质末端位点的标记做不到内部位点的特异性的标记。蛋白质的反式剪接(protein trans-splicing)技术可以说是为蛋白质位点特异性的标记提供了新的方法。首先,蛋白质的反式剪接即由断裂蛋白质内含子介导的。断裂蛋白质内含子的特点是由两部分组成,命名为断裂蛋白质内含子的N端()和断裂蛋白质内含子的C端(),它们分别位于两个开放阅读框中(open reading frame,ORF)。当N端和C端的蛋白质内含子分别翻译成熟后,和能够重新识别,并且形成具有催化功能的活性中心,从而进行蛋白质的反式剪接。最终断裂蛋白质内含子被剪切下来,蛋白质内含子两侧的外显子通过肽键连接起来。目前利用断裂蛋白质内含子已经实现了蛋白质末端的标记与修饰,但是仍然没有做到蛋白质内部位点特异性的标记与修饰。而本文实现了对蛋白质内部位点的特异性标记。这也是首次利用断裂蛋白质内含子实现蛋白质的内部标记。本课题最终选取了TE3S11和RBS1两种新型的断裂蛋白质内含子。其中S1型断裂蛋白质内含子的N端仅包含有11个氨基酸,S11型断裂蛋白质内含子的C端仅包含有6个氨基酸。可用于目标蛋白位点特异性的荧光基团的标记。将麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)和TE3S11N(S11型断裂蛋白质内含子的N端)融合,形成N端前体蛋白;TE3S11C(S11型断裂蛋白质内含子的C端)、标有荧光基团FITC的赖氨酸和RBS1N(S1型断裂蛋白质内含子的N端)融合形成中间前体蛋白;RBS1C(S1型断裂蛋白质内含子的C端)与硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)融合形成C端前体蛋白。化学法合成中间前体蛋白。利用Amylose Resin纯化可得到N端前体蛋白,利用Ni~(2+)-NTA纯化可得到C端前体蛋白。叁种前体蛋白需要按照摩尔比1:1:1在室温下进行蛋白质的反式剪接,最后通过SDS-PAGE、Western Blot、荧光扫描以及质谱鉴定终产物,判断是否可以实现蛋白质内部位点特异性的标记。最终结果表明,本文实现了对目标蛋白内部位点特异性的标记。相比较已有的技术,本文中涉及到的技术更为简便、通用和真正实现了蛋白质内部位点的特异性标记。为蛋白质的标记开辟了新的方法。在蛋白质工程中具有很大的潜在应用。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
断裂蛋白质内含子论文参考文献
[1].李佳,孟清.N端无半胱氨酸断裂蛋白质内含子的构建[J].生物学杂志.2019
[2].张露.新型断裂蛋白质内含子介导的蛋白质内部位点特异性标记[D].东华大学.2018
[3].林森珠,陈格飞,孟清.DNA展示系统介导的断裂蛋白质内含子体外定向进化方法的研究[J].中国生物化学与分子生物学报.2016
[4].张晓玲.断裂蛋白质内含子介导的蛋白质两端标记[D].东华大学.2015
[5].戴旭东,李佳,刘相钦,孟清.应用突变的断裂蛋白质内含子标记蛋白质N端[J].中国生物化学与分子生物学报.2014
[6].宋慧玲.新型断裂蛋白质内含子介导的蛋白质反式剪接系统的建立及应用[D].东华大学.2014
[7].邱沛然.微小蛋白质内含子和新型断裂蛋白质内含子的定向进化[D].东华大学.2012
[8].王瑾,林瑛,郑言成,孟清.新型T+1断裂蛋白质内含子的构建[J].东华大学学报(自然科学版).2012
[9].李佳.N端无半胱氨酸断裂蛋白质内含子的构建及蛋白质N端标记的应用[D].东华大学.2012
[10].荀启静.构建及筛选S1型断裂蛋白质内含子用于蛋白质定点标记[D].东华大学.2011
标签：N端无半胱氨酸断裂蛋白质内含子; 蛋白质N端标记; 蛋白质剪接;