导读:本文包含了抗耐药作用论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:肝癌,索拉非尼,耐药,iTRAQ
抗耐药作用论文文献综述
蒋国平[1]（2016）在《肝癌索拉非尼耐药标志物筛选及PPARγ拮抗剂抗耐药作用研究》一文中研究指出背景:肝癌为我国高发恶性肿瘤之一,每年约有38.3万人死于肝癌,约占全球肝癌死亡总数的51%。目前肝癌治疗手段有限,疗效不理想,病死率极高,是困扰我国群众健康的重大问题。肝癌的常见治疗手段包括外科手术、肝动脉栓塞化疗术和消融术等,对于无法手术患者,化疗也是重要手段之一。近年来新型分子靶向治疗技术的发展为肝癌治疗带来了全新视野。靶向药物索拉非尼可以通过抑制酪氨酸激酶阻止肿瘤新生血管的生成,还能经Raf/MEK/ERK信号传导通路直接抑制肿瘤生长。临床试验表明索拉非尼在肝癌晚期患者中展现了良好的疗效和耐受性,但存在耐药现象,其耐药机制尚不明确,一般认为与肿瘤细胞、肿瘤基质和个体遗传耐药性有关。相关研究表明肝癌耐药相关分子的表达变化能指示患者疗效敏感性,因此通过探索潜在生物标志物,建立索拉非尼治疗疗效的分子生物标志物谱,将有利于针对性给药,实现精准医疗;此外对于关键分子的机制研究,将解决耐药发生,并推动新药研发。方法:1、外科(肝切除/肝移植)术后复发患者接受索拉非尼治疗,根据影像学表现结合血清学指标(AFP)将入组患者分为耐药型和敏感型。取各组肝癌及癌旁组织,同时以其他肝硬化患者及健康供肝组织作为基准对照进行iTRAQ实验,比较耐药组与敏感组之间组织蛋白表达差异,进而开展GO、KEGG等生物信息学分析,发现特征标志物谱和所涉及的生物学通路。2、建立肝癌细胞体外索拉非尼耐药模型,在模型中采用Western blot技术对特征标志物的表达差异进一步验证。3、利用耐药模型,结合PPARy拮抗剂及激动剂,采用CCK8法检测PPARγ信号通路外在干预下肝癌细胞增殖情况的变化,细胞流式技术研究细胞周期阻滞和凋亡对肝癌细胞增殖抑制的作用,探索PPARγ拮抗剂潜在的抗索拉非尼耐药价值。结果:1、利用iTRAQ技术,发现索拉非尼敏感组和耐药组表达差异达到1.5倍以上的蛋白有222个,而表达差异达到2倍以上的蛋白57个,其中表达上调蛋白有26个,表达下调蛋白有31个;2、GO分析表明差异蛋白多涉及小分子代谢过程、分解代谢过程、羧酸代谢过程及含氧酸的代谢过程,而KEGG的信号通路分析同样表明,差异蛋白富集在糖代谢、脂肪酸代谢和糖酵解通路;3、利用体外耐药模型对2倍以上差异蛋白的验证发现包括ITGA6、FN1、ICAM1、ITPA、BAX、TXNDC17和MSH2等蛋白差异与体内结果一致,可作为机制研究的候选蛋白;4、基于生物信息学分析结果,发现PPARs特别是PPARγ在耐药模型中表达发生显著变化;5、发现PPARγ的拮抗剂T0070907能够增强肝癌细胞对索拉非尼的敏感性,另一个拮抗剂GW9662未能达到同样效果;6、,.拮抗剂T0070907及GW9662的联用未能进一步增强细胞对索拉非尼的敏感性;7、肝癌细胞对索拉非尼敏感性的增强是细胞周期阻滞所致。结论:1、通过比较索拉非尼耐药和敏感患者组织蛋白表达谱,发现多个差异蛋白,涉及脂肪酸代谢等生物学过程及信号通路;2、PPARγ可能是肝癌索拉非尼耐药发生的关键因子,其拮抗剂T0070907可增强肝癌细胞的敏感性,具有潜在的临床应用价值。(本文来源于《浙江大学》期刊2016-10-01）
魏宁[2]（2011）在《新型汉防己甲素衍生物H1抗耐药作用研究及无毒浓度H1对P-gp表达与功能的影响》一文中研究指出目前,肿瘤多药耐药(multi-drug resistance, MDR)已成为肿瘤治疗中面临的一大难题,所谓肿瘤MDR是指肿瘤接触了某些抗癌药物后产生对其他多种未接触过的、结构无关和作用机制完全不同的抗癌药物也具有交叉耐药性。肿瘤MDR产生的机制十分复杂,主要包括：细胞凋亡敏感性降低、细胞存活信号通路的异常活化、药物外排泵ABC转运蛋白(P-glycoprotein, P-gp等)过表达、药物作用靶点的改变、DNA损伤修复活性增强、药物解毒与消除酶活性增强或过表达等。肿瘤MDR逆转剂是通过抑制转运蛋白的功能或表达,恢复耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。与此不同,抗耐药药物则是通过直接杀伤或抑制耐药肿瘤克服肿瘤MDR。近年来,抗耐药研究越来越受到人们的重视。我国天然产物资源丰富,从天然产物及其衍生物中寻找新型抗耐药化合物或肿瘤MDR逆转剂具有广阔的前景。在此,我们发现汉防己甲素新型衍生物H1在体内、外均显示出良好的抗耐药作用,而且在无毒浓度时能显着逆转P-gp所介导的肿瘤MDR,并对其分子机制进行了初步探讨。本论文主要分为两部分：第一部分,H1抗耐药药效学评价及其分子机制研究；第二部分,无毒浓度H1逆转P-gp介导的肿瘤MDR作用及对P-gp表达与功能的影响。第一部分H1抗耐药药效学评价及其分子机制研究本部分实验主要研究了汉防己甲素新型衍生物H1体内、外抗耐药作用及其对敏感株、耐药株细胞凋亡通路与存活信号通路的影响。采用MTT比色法测定H1对8株不同组织来源肿瘤细胞的细胞毒活性,再以KB、KBv200; MCF-7、MCF-7/adr;A549、A549/tax亲本与其相应的耐药细胞为研究对象,以叁种常用的抗肿瘤药物阿霉素(ADR)、紫杉醇(TAX)、长春新碱(VCR)为对照,系统评价了H1体外抗耐药作用。建立敏感性KB、耐药性KBv200裸鼠移植瘤模型,以VCR为阳性对照药,结合KB裸鼠移植瘤模型考察KBv200裸鼠移植瘤模型的体内耐药性,进而采用KB、KBv200裸鼠移植瘤模型评价H1低、中、高(10、15、20mg/kg)叁个剂量的抗肿瘤效果,评价H1体内抗耐药作用。PI单染法流式细胞仪检测H1对敏感株细胞KB、耐药株细胞KBv200细胞周期的影响。采用DAPI染色法观察细胞形态学变化；琼脂糖凝胶电泳分析细胞DNA片段化状态；PI-AnnexinV双染法定量检测H1诱导KB、KBv200细胞凋亡作用。JC-1染色法检测H1对KB、KBv200细胞线粒体膜电位的影响。H1处理KB、KBv200细胞24h后,Western blot方法检测内源性凋亡通路相关蛋白：Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3的表达及线粒体膜间隙蛋白细胞色素-C、AIF的释放；外源性凋亡通路相关蛋白：Fas、FasL、Caspase-8的表达；以及细胞存活性信号通路PI3K-AKT、MEK-ERK中关键分子p-ERK、ERK、p-AKT、AKT的表达。与此同时,以Bel7042/5-Fu细胞为研究对象,以5-Fu为对照,评价了Bel7042/5-Fu细胞的耐药特性及H1对Bel7402/5-Fu与Be17402细胞的生长抑制作用。采用Trizol法提取了Bel7402、Bel7402/5-Fu细胞及H1(4μM)处理细胞24h后的mRNA,以琼脂糖凝胶电泳进行RNA质量检测。采用Affimatrix基因表达芯片平台分析敏感株细胞Be17402,耐药株细胞Bel7402/5-Fu,以及H1处理后Bel7402、Bel7402/5-Fu细胞全基因组表达水平变化。研究结果显示：H1对8株不同组织来源的肿瘤细胞都具有不同程度的生长抑制作用,IC50在1-4μM之间,对KB、Bel7402的生长抑制作用较为显着,1C50分别为1.068±0.017、0.671±0.026(μM)。体外抗耐药作用研究显示H1不仅对敏感株细胞具有较好的杀伤作用,而且对耐药株细胞也同样具有显着的抑制作用,平均耐药因子(resistant factor, RF)仅为1.6,而叁种抗肿瘤药物’TAX、ADR、VCR的平均耐药因子分别为：22.6、71.7、52.3。可见,在体外H1具有良好的抗耐药作用。KB、KBv200裸鼠移植瘤实验表明：在敏感性KB裸鼠模型,VCR给药组的相对肿瘤体积抑制百分率、瘤重抑制百分率分别为：84.4%、82.1%,显示出良好的抗肿瘤效果。但在耐药肿瘤模型(KBv200裸鼠移植瘤模型)VCR给药组的相对肿瘤体积抑制百分率、瘤重抑制百分率则分别为：12.6、27.7%,KBv200细胞在体内仍然对VCR展现良好的耐药作用,证明建立的体内耐药移植瘤模型是成功的。H1无论在敏感性KB裸鼠移植瘤还是在耐药性KBv200裸鼠移植瘤模型都具有显着的抗肿瘤效果,并且显示良好的剂量依赖关系。尤其是H1高剂量组(即20mg/kg)对敏感株KB裸鼠移植瘤的相对肿瘤体积与重量抑制百分率分别为79.7%、79.0%；对耐药株KBv200裸鼠移植瘤的相对肿瘤体积与重量抑制百分率分别为61.5%、74.9%。可见,H1在我们建立的体内移植瘤耐药模型中仍具有良好的抗耐药作用。作用机制显示：H1对KB、KBv200细胞周期分布无显着影响,但我们观察到随着H1浓度的增加出现凋亡峰(Sub-G1)。DPAI染色显示细胞核皱缩、碎裂、染色加深,且凋亡细胞的百分率随着H1浓度的升高而增加。琼脂糖凝胶电泳检测到典型的DNA片段化(DNALadder)现象。PI-AnnexinV染色后发现H1诱导KB细胞的凋亡作用略强于耐药株细胞KBv200,8μM Hl处理组诱导KB细胞晚期凋亡百分率为85.4%,而诱导耐药细胞KBv200细胞晚期凋亡的百分率为42.4%,这一结果与细胞增殖抑制活性结果相一致。无论在敏感细胞KB还是在耐药细胞KBv200,H1均能升高Bax/Bcl-2比例、降低线粒体膜电位、使细胞色素-C、AIF从线粒体释放到胞浆,进而活化Caspase-3,启动内源性凋亡通路；但H1对Fas、FasL、Caspase-8的表达无影响,提示H1诱导KB、KBv200细胞凋亡不依赖于外源性凋亡通路。KB细胞对Hl的凋亡敏感性略强于耐药细胞KBv200。同时,H1能显着抑制ERK、AKT的磷酸化水平,下调PI3K-AKT、MEK-ERK信号通路,这可能与Hl的抗耐药作用相关。另一方面,Bel7402/5-Fu细胞对5-Fu具有明显的耐药性,耐药因子为161.1,而H1的耐药因子仅为6.0,H1在Bel7402/5-Fu细胞显示出一定的抗耐药作用。基因表达芯片结果显示Bel7402/5-Fu细胞与亲本细胞Be17402相比,发生主要变化的基因为有非受体酪氨酸激酶FYN(上调),p38MAPK(上调),凋亡效应激酶Caspase-3基因(下调)。JAK-STAT通路相关基因表达上调,AKT基因上调,抗凋亡作用增强。H1处理后Bel7402/5-Fu细胞与亲本细胞Be17402相比,发生主要变化的有Fas/FasL介导的外源性凋亡相关基因(下调)。非受体酪氨酸激酶FYN(上调),PI3K-AKT通路相关基因(上调)。上述结果表明：无论在体外还是体内,H1均显示出良好的抗耐药作用。其分子机制可能与启动内源性凋亡通路、下调细胞存活通路PI3k-AKT、MEK-ERK等有大。第二部分无毒浓度H1逆转P-gp介导的肿瘤MDR作用及对P-gp表达与功能的影响本部分实验主要研究了无毒浓度H1对P-gp介导肿瘤MDR的逆转作用并检测其对P-gp表达与功能的影响。采用MTT比色法测定H1对KB、MCF-7与其相应的P-gp过表达耐药株KBv200、MCF-7/adr细胞的生长曲线,以维拉帕米(VRP)为阳性对照药,选择无毒浓度H1(0.125、0.25、0.5μM)与3种抗肿瘤药物VCR、ADR、TAX合用评价其逆转肿瘤MDR作用,并计算逆转倍数(reversal fold, RF)。流式细胞仪测定H1处理后KBv200细胞P-gp对其底物阿霉素、罗丹明123的蓄积与外排功能的影响。Pgp-GloTM试剂盒检测H1对VRP刺激的重组P-gpATPase活性的影响。计算机辅助设计Discovery.Studio分子模拟软件对H1的空间结构与P-gp叁维构象进行了分子对接模拟,考察H1分子与P-gp结合能力。Western blot方法检测无毒浓度H1处理KBv200细胞48h后P-gp表达水平,RT-PCR检测MDR1转录水平的变化。引入放线菌酮(CHX)考察0.5μM H1处理后对P-gp半衰期的影响。免疫沉淀法(Immunoprecipitation,IP)检测H1对P-gp泛素化水平的影响。同时考察H1对KBv200细胞MAPK信号通路的影响以及RNAi沉默ERK1与ERK2基因或ERK特异性抑制剂U0126、PD98059对P-gp表达水平的影响。研究结果显示：H1能够有效逆转P-gp介导肿瘤MDR并具有良好的剂量依赖关系。0.5μM H1能够完全逆转KBv200细胞对VCR、ADR、TAX的耐药作用,逆转倍数分别为54.0、28.4、50.1。同时H1对P-gp介导MCF-7/adr的MDR也具有良好的逆转作用,0.5μM H1完全逆转MCF-7/adr细胞对ADR的耐药作用,部分逆转MCF-7/adr细胞对VCR、TAX的耐药作用,逆转倍数分别为126.8、24.8、10.1。无毒浓度H1可以显着干扰P-gp的转运功能,蓄积与外排功能实验表明H1可以浓度依赖性增加ADR、罗丹明123的蓄积,并能剂量依赖性的抑制P-gp介导的罗丹明123外排功能。同时,H1能明显抑制维拉帕米(VRP)刺激的重组P-gp的ATPase活性。H1的空间结构与P-gp叁维构象分子对接模拟结果显示H1与P-gp的ATP口袋之间存在氢键、疏水性相互作用,结合能力较强,计算机评分达到141分。0.5μM H1处理KBv200细胞48h后可以显着降低P-gp表达,并呈剂量依赖关系,但RT-PCR结果显示H1并不影响P-gp的(?)nRNA水平。进一步研究显示0.5μM H1与CHX (100mg/mL)合用后与单独CHX组相比,H1能够使P-gp的半衰期由18.3h减少至13.5h,0.5μM H1处理KBv200细胞48h后可显着增加P-gp的泛素化水平,促进P-gp的降解。无毒浓度H1对JNK、p38MAPK的活化无显着影响,但能明显下调MEK-ERK信号通路,并具有良好的剂量依赖关系。RNAi沉默ERK1与ERK2基因或采用U0126、PD98059处理KBv200细胞后,均检测到P-gp表达下调,表明MEK-ERK信号通路参与了P-gp的表达调控。上述结果提示：无毒浓度H1具有良好的逆转肿瘤MDR作用,不仅能干扰P-gp的转运功能,而且影响P-gp的稳定性,下调P-gp蛋白表达。综上所述,新型汉防己甲素衍生物H1在体内、外均具有良好的抗耐药作用,其分子机制可能与启动内源性凋亡通路、抑制细胞存活通路PI3K-AKT、MEK-ERK有关。此外,无毒浓度H1能逆转P-gp介导的肿瘤MDR,不仅能干扰P-gp的转运功能,而且影响P-gp的稳定性,下调P-gp蛋白表达。提示H1对临床MDR肿瘤的治疗可能有一定潜能。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2011-04-01）
于海侠[3]（2006）在《抗耐药作用的Bcr-Abl选择性抑制剂的设计、合成与筛选》一文中研究指出慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia，CML)是一种髓细胞增殖紊乱性疾病，起源于造血多能干细胞的恶性增生。CML病程进展缓慢，未加治疗者的中数生存期可达3年。90％以上的CML患者的白血病细胞中都存有由费城(Ph)染色体易位而形成的Bcr—Abl融合基因，该融合基因是CML发病的重要癌基因。 2001年上市的Gleevec(STI-571)是Bcr-Abl激酶非活性构象的特异选择性抑制剂，也是美国食品与药品管理局第一个批准的Bcr—Abl酪氨酸激酶选择性抑制剂，该药的问世代表了最近几年来CML治疗领域的重大进展。虽然它在临床上成功证实了以Bcr—Abl酪氨酸激酶为靶点治疗慢性粒细胞白血病的重要性，但治疗过程中产生的耐药性问题，也是当前迫切需要解决的首要问题。 本文以Bcr—Abl酪氨酸激酶为靶点，进行抗耐药作用的选择性抑制剂的研究。结合Gleevec(STI-571)与BMS-354825的结构设计了一系列以2—亚氨基—5—羰基—1，3—硒唑为母核的硒唑甲酰胺类化合物。并通过AUTODOCK程序进行了化合物结合受体合理性的评价。 本研究共合成16个未见文献报道的目标化合物，结构均经~1H-NMR、MS确证。生物活性测定结果表明，Y7和Y10对K562／R抑制活性与阳性化合物相当，Y11抑制作用最强，并表现出对K562／R具有良好的选择性。 使用AUTODOCK对接方法分析Gleevec(STI-571)、BMS-354825、(本文来源于《广西大学》期刊2006-05-01）
金涌,李俊,李元海,吕雄文,葛金芳[4]（2005）在《5-氟尿嘧啶半乳糖神经酰胺脂质体的抗耐药作用及部分机制研究》一文中研究指出目的研究5氟尿嘧啶半乳糖神经酰胺脂质体(5FuGCL)体外对耐5FuHepG2细胞株的抑制作用并对其抗耐药机制进行探讨。方法在建立耐5Fu的HepG2细胞株模型的基础上,采用MTT法检测5FuGCL对其的抑制作用。另外,通过高效液相法(HPLC)检测细胞内液的药物含量、免疫组化法检测胸苷酸合酶(TS)的表达、化学法检测NO含量等研究其抗耐药作用机制。结果5FuGCL(75,150,300,600,1200μmol·L-1)对耐5Fu的HepG2细胞株有明显的抑制作用,IC50为158.6μmol·L-1,远小于游离5Fu(400.9μmol·L-1);5FuGCL(300μmol·L-1)对耐5Fu的HepG2细胞的抑制作用随时间的延长而增强,其中(24～48h)的抑制作用明显强于相同浓度的游离5Fu。5FuGCL(300μmol·L-1)与相同浓度的游离5Fu比较,能明显增加药物进入HepG2细胞内液的程度;5FuGCL(75,300,1200μmol·L-1)既可明显降低TS的表达,又可显着增加NO的含量,且5FuGCL(300,1200μmol·L-1)与相同浓度的游离5Fu相比,其作用明显增强。结论5FuGCL有明显的抗5Fu耐药作用,这可能是通过增加细胞内液5Fu的含量,抑制TS的表达和增加NO含量实现的。(本文来源于《中国药理学通报》期刊2005年08期）
金京春,朴龙,朴松旭,崔桂顺,太善姬[5]（2003）在《G-CSF和IFN-α对K562/A02耐药细胞株的抗耐药作用》一文中研究指出[目的 ]观察G CSF ,IFN α分别或联合应用于K 562 /A0 2耐药细胞株时对柔红霉素敏感性的影响 .[方法 ]通过MTT法测定各组的K 562 /A0 2细胞的抑制率 .[结果 ]G CSF组及IFN α组K 562 /A0 2细胞抑制率明显升高 ,分别为 55 0 8%± 2 18%及 56 72 %± 1 77% ,与柔红霉素组比较具有显着性差异 ;联合用药组K 562 /A0 2细胞的抑制率明显升高 ,与柔红霉素组、G CSF组及IFN α组比较均具有非常显著性差异 . [结论 ]G CSF及IFN α逆转K562 /A0 2的多种药物耐药性 ,且具有协同作用(本文来源于《延边大学医学学报》期刊2003年04期）
抗耐药作用论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目前,肿瘤多药耐药(multi-drug resistance, MDR)已成为肿瘤治疗中面临的一大难题,所谓肿瘤MDR是指肿瘤接触了某些抗癌药物后产生对其他多种未接触过的、结构无关和作用机制完全不同的抗癌药物也具有交叉耐药性。肿瘤MDR产生的机制十分复杂,主要包括：细胞凋亡敏感性降低、细胞存活信号通路的异常活化、药物外排泵ABC转运蛋白(P-glycoprotein, P-gp等)过表达、药物作用靶点的改变、DNA损伤修复活性增强、药物解毒与消除酶活性增强或过表达等。肿瘤MDR逆转剂是通过抑制转运蛋白的功能或表达,恢复耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。与此不同,抗耐药药物则是通过直接杀伤或抑制耐药肿瘤克服肿瘤MDR。近年来,抗耐药研究越来越受到人们的重视。我国天然产物资源丰富,从天然产物及其衍生物中寻找新型抗耐药化合物或肿瘤MDR逆转剂具有广阔的前景。在此,我们发现汉防己甲素新型衍生物H1在体内、外均显示出良好的抗耐药作用,而且在无毒浓度时能显着逆转P-gp所介导的肿瘤MDR,并对其分子机制进行了初步探讨。本论文主要分为两部分：第一部分,H1抗耐药药效学评价及其分子机制研究；第二部分,无毒浓度H1逆转P-gp介导的肿瘤MDR作用及对P-gp表达与功能的影响。第一部分H1抗耐药药效学评价及其分子机制研究本部分实验主要研究了汉防己甲素新型衍生物H1体内、外抗耐药作用及其对敏感株、耐药株细胞凋亡通路与存活信号通路的影响。采用MTT比色法测定H1对8株不同组织来源肿瘤细胞的细胞毒活性,再以KB、KBv200; MCF-7、MCF-7/adr;A549、A549/tax亲本与其相应的耐药细胞为研究对象,以叁种常用的抗肿瘤药物阿霉素(ADR)、紫杉醇(TAX)、长春新碱(VCR)为对照,系统评价了H1体外抗耐药作用。建立敏感性KB、耐药性KBv200裸鼠移植瘤模型,以VCR为阳性对照药,结合KB裸鼠移植瘤模型考察KBv200裸鼠移植瘤模型的体内耐药性,进而采用KB、KBv200裸鼠移植瘤模型评价H1低、中、高(10、15、20mg/kg)叁个剂量的抗肿瘤效果,评价H1体内抗耐药作用。PI单染法流式细胞仪检测H1对敏感株细胞KB、耐药株细胞KBv200细胞周期的影响。采用DAPI染色法观察细胞形态学变化；琼脂糖凝胶电泳分析细胞DNA片段化状态；PI-AnnexinV双染法定量检测H1诱导KB、KBv200细胞凋亡作用。JC-1染色法检测H1对KB、KBv200细胞线粒体膜电位的影响。H1处理KB、KBv200细胞24h后,Western blot方法检测内源性凋亡通路相关蛋白：Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3的表达及线粒体膜间隙蛋白细胞色素-C、AIF的释放；外源性凋亡通路相关蛋白：Fas、FasL、Caspase-8的表达；以及细胞存活性信号通路PI3K-AKT、MEK-ERK中关键分子p-ERK、ERK、p-AKT、AKT的表达。与此同时,以Bel7042/5-Fu细胞为研究对象,以5-Fu为对照,评价了Bel7042/5-Fu细胞的耐药特性及H1对Bel7402/5-Fu与Be17402细胞的生长抑制作用。采用Trizol法提取了Bel7402、Bel7402/5-Fu细胞及H1(4μM)处理细胞24h后的mRNA,以琼脂糖凝胶电泳进行RNA质量检测。采用Affimatrix基因表达芯片平台分析敏感株细胞Be17402,耐药株细胞Bel7402/5-Fu,以及H1处理后Bel7402、Bel7402/5-Fu细胞全基因组表达水平变化。研究结果显示：H1对8株不同组织来源的肿瘤细胞都具有不同程度的生长抑制作用,IC50在1-4μM之间,对KB、Bel7402的生长抑制作用较为显着,1C50分别为1.068±0.017、0.671±0.026(μM)。体外抗耐药作用研究显示H1不仅对敏感株细胞具有较好的杀伤作用,而且对耐药株细胞也同样具有显着的抑制作用,平均耐药因子(resistant factor, RF)仅为1.6,而叁种抗肿瘤药物’TAX、ADR、VCR的平均耐药因子分别为：22.6、71.7、52.3。可见,在体外H1具有良好的抗耐药作用。KB、KBv200裸鼠移植瘤实验表明：在敏感性KB裸鼠模型,VCR给药组的相对肿瘤体积抑制百分率、瘤重抑制百分率分别为：84.4%、82.1%,显示出良好的抗肿瘤效果。但在耐药肿瘤模型(KBv200裸鼠移植瘤模型)VCR给药组的相对肿瘤体积抑制百分率、瘤重抑制百分率则分别为：12.6、27.7%,KBv200细胞在体内仍然对VCR展现良好的耐药作用,证明建立的体内耐药移植瘤模型是成功的。H1无论在敏感性KB裸鼠移植瘤还是在耐药性KBv200裸鼠移植瘤模型都具有显着的抗肿瘤效果,并且显示良好的剂量依赖关系。尤其是H1高剂量组(即20mg/kg)对敏感株KB裸鼠移植瘤的相对肿瘤体积与重量抑制百分率分别为79.7%、79.0%；对耐药株KBv200裸鼠移植瘤的相对肿瘤体积与重量抑制百分率分别为61.5%、74.9%。可见,H1在我们建立的体内移植瘤耐药模型中仍具有良好的抗耐药作用。作用机制显示：H1对KB、KBv200细胞周期分布无显着影响,但我们观察到随着H1浓度的增加出现凋亡峰(Sub-G1)。DPAI染色显示细胞核皱缩、碎裂、染色加深,且凋亡细胞的百分率随着H1浓度的升高而增加。琼脂糖凝胶电泳检测到典型的DNA片段化(DNALadder)现象。PI-AnnexinV染色后发现H1诱导KB细胞的凋亡作用略强于耐药株细胞KBv200,8μM Hl处理组诱导KB细胞晚期凋亡百分率为85.4%,而诱导耐药细胞KBv200细胞晚期凋亡的百分率为42.4%,这一结果与细胞增殖抑制活性结果相一致。无论在敏感细胞KB还是在耐药细胞KBv200,H1均能升高Bax/Bcl-2比例、降低线粒体膜电位、使细胞色素-C、AIF从线粒体释放到胞浆,进而活化Caspase-3,启动内源性凋亡通路；但H1对Fas、FasL、Caspase-8的表达无影响,提示H1诱导KB、KBv200细胞凋亡不依赖于外源性凋亡通路。KB细胞对Hl的凋亡敏感性略强于耐药细胞KBv200。同时,H1能显着抑制ERK、AKT的磷酸化水平,下调PI3K-AKT、MEK-ERK信号通路,这可能与Hl的抗耐药作用相关。另一方面,Bel7402/5-Fu细胞对5-Fu具有明显的耐药性,耐药因子为161.1,而H1的耐药因子仅为6.0,H1在Bel7402/5-Fu细胞显示出一定的抗耐药作用。基因表达芯片结果显示Bel7402/5-Fu细胞与亲本细胞Be17402相比,发生主要变化的基因为有非受体酪氨酸激酶FYN(上调),p38MAPK(上调),凋亡效应激酶Caspase-3基因(下调)。JAK-STAT通路相关基因表达上调,AKT基因上调,抗凋亡作用增强。H1处理后Bel7402/5-Fu细胞与亲本细胞Be17402相比,发生主要变化的有Fas/FasL介导的外源性凋亡相关基因(下调)。非受体酪氨酸激酶FYN(上调),PI3K-AKT通路相关基因(上调)。上述结果表明：无论在体外还是体内,H1均显示出良好的抗耐药作用。其分子机制可能与启动内源性凋亡通路、下调细胞存活通路PI3k-AKT、MEK-ERK等有大。第二部分无毒浓度H1逆转P-gp介导的肿瘤MDR作用及对P-gp表达与功能的影响本部分实验主要研究了无毒浓度H1对P-gp介导肿瘤MDR的逆转作用并检测其对P-gp表达与功能的影响。采用MTT比色法测定H1对KB、MCF-7与其相应的P-gp过表达耐药株KBv200、MCF-7/adr细胞的生长曲线,以维拉帕米(VRP)为阳性对照药,选择无毒浓度H1(0.125、0.25、0.5μM)与3种抗肿瘤药物VCR、ADR、TAX合用评价其逆转肿瘤MDR作用,并计算逆转倍数(reversal fold, RF)。流式细胞仪测定H1处理后KBv200细胞P-gp对其底物阿霉素、罗丹明123的蓄积与外排功能的影响。Pgp-GloTM试剂盒检测H1对VRP刺激的重组P-gpATPase活性的影响。计算机辅助设计Discovery.Studio分子模拟软件对H1的空间结构与P-gp叁维构象进行了分子对接模拟,考察H1分子与P-gp结合能力。Western blot方法检测无毒浓度H1处理KBv200细胞48h后P-gp表达水平,RT-PCR检测MDR1转录水平的变化。引入放线菌酮(CHX)考察0.5μM H1处理后对P-gp半衰期的影响。免疫沉淀法(Immunoprecipitation,IP)检测H1对P-gp泛素化水平的影响。同时考察H1对KBv200细胞MAPK信号通路的影响以及RNAi沉默ERK1与ERK2基因或ERK特异性抑制剂U0126、PD98059对P-gp表达水平的影响。研究结果显示：H1能够有效逆转P-gp介导肿瘤MDR并具有良好的剂量依赖关系。0.5μM H1能够完全逆转KBv200细胞对VCR、ADR、TAX的耐药作用,逆转倍数分别为54.0、28.4、50.1。同时H1对P-gp介导MCF-7/adr的MDR也具有良好的逆转作用,0.5μM H1完全逆转MCF-7/adr细胞对ADR的耐药作用,部分逆转MCF-7/adr细胞对VCR、TAX的耐药作用,逆转倍数分别为126.8、24.8、10.1。无毒浓度H1可以显着干扰P-gp的转运功能,蓄积与外排功能实验表明H1可以浓度依赖性增加ADR、罗丹明123的蓄积,并能剂量依赖性的抑制P-gp介导的罗丹明123外排功能。同时,H1能明显抑制维拉帕米(VRP)刺激的重组P-gp的ATPase活性。H1的空间结构与P-gp叁维构象分子对接模拟结果显示H1与P-gp的ATP口袋之间存在氢键、疏水性相互作用,结合能力较强,计算机评分达到141分。0.5μM H1处理KBv200细胞48h后可以显着降低P-gp表达,并呈剂量依赖关系,但RT-PCR结果显示H1并不影响P-gp的(?)nRNA水平。进一步研究显示0.5μM H1与CHX (100mg/mL)合用后与单独CHX组相比,H1能够使P-gp的半衰期由18.3h减少至13.5h,0.5μM H1处理KBv200细胞48h后可显着增加P-gp的泛素化水平,促进P-gp的降解。无毒浓度H1对JNK、p38MAPK的活化无显着影响,但能明显下调MEK-ERK信号通路,并具有良好的剂量依赖关系。RNAi沉默ERK1与ERK2基因或采用U0126、PD98059处理KBv200细胞后,均检测到P-gp表达下调,表明MEK-ERK信号通路参与了P-gp的表达调控。上述结果提示：无毒浓度H1具有良好的逆转肿瘤MDR作用,不仅能干扰P-gp的转运功能,而且影响P-gp的稳定性,下调P-gp蛋白表达。综上所述,新型汉防己甲素衍生物H1在体内、外均具有良好的抗耐药作用,其分子机制可能与启动内源性凋亡通路、抑制细胞存活通路PI3K-AKT、MEK-ERK有关。此外,无毒浓度H1能逆转P-gp介导的肿瘤MDR,不仅能干扰P-gp的转运功能,而且影响P-gp的稳定性,下调P-gp蛋白表达。提示H1对临床MDR肿瘤的治疗可能有一定潜能。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
抗耐药作用论文参考文献
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