导读:本文包含了肺积宁方论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:肺积宁方,增殖,自噬,PI3K,Akt,m,TOR信号通路
肺积宁方论文文献综述
周立江,潘玉真,殷东风[1]（2016）在《肺积宁方影响Lewis肺癌细胞增殖和自噬的作用机制研究》一文中研究指出目的:研究肺积宁方对Lewis肺癌细胞增殖和自噬的影响及相关信号通路的探讨。方法:选用不同浓度的肺积宁方(FJND)提取物作用于体外培养的Lewis肺癌细胞,MTT法检测FJND对Lewis细胞增殖的抑制作用;通过GFP-LC3自噬定位观察细胞自噬情况;蛋白免疫印迹法检测不同浓度FJND作用Lewis细胞后,Beclin-1蛋白、LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ、Atg5蛋白表达;和m TOR,AKT,p-AKT相关蛋白表达情况。结果:FJND在3.12 mg/m L抑制Lewis细胞增殖作用最强,Beclin-1蛋白、Atg5蛋白表达及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明显高于对照组;对m TOR,AKT,p-AKT蛋白抑制作用强于对照组。结论:肺积宁方抑制细胞增殖和诱导自噬,可能通过抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路发挥作用。(本文来源于《中华中医药学刊》期刊2016年07期）
周立江[2]（2016）在《肺积宁方对Lewis肺癌抗肿瘤作用及自噬效应的实验研究》一文中研究指出目的:通过体外实验,研究肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞增殖和凋亡的影响,并检测与凋亡密切相关的自噬基因Beclin1、LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ、Atg5蛋白水平表达及RNA水平的影响,探讨肺积宁方的抗癌作用及其对自噬的关系;并通过体内实验,运用裸鼠lewis移植瘤模型,分析肺积宁方在体内代谢后抗癌效果,观察其对Lewis肺癌细胞形态学影响、对自噬相关基因Beclin1、LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ、Atg5蛋白表达的影响。最终通过体内体外实验,了解肺积宁方对Lewis肺癌细胞抗癌效果及其作用机制。材料与方法:体外实验:制备含药血清,作用于Lewis肺癌细胞。40只大鼠按随机数字表法分为肺积宁方高剂量组、肺积宁方大剂量组、肺积宁方中剂量组、肺积宁方低剂量组和对照组。各组动物分别给予高、大、中、低剂量组肺积宁方及等量生理盐水灌胃,每天1次,连续3天,第3天晚上禁食不禁水12h,次日断头取血;用铡刀断头取血,制备肺积宁方含药血清。MTT法检测肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞的增殖抑制效应,分为肺积宁方含药血清高剂量组、含药血清大剂量组、含药血清中剂量组、含药血清低剂量组和对照血清组。同时设置不加细胞的空白孔。分别加不同浓度肺积宁方含药血清及正常对照组含药血清,分别于培养24 h、48 h、72h收集细胞进行MTT检测,观察肺积宁方含药血清抑制Lewis肺癌细胞增殖的最佳药量和作用时间,筛选出最佳含药血清剂量组,进行后续实验;流式细胞术检测对照组,肺积宁方组,顺铂组,联合组作用48h,细胞凋亡率。GFP-LC3转染定位法检测各组细胞自噬情况:将Lewis细胞以6×105细胞/孔的密度接种于6孔板,分为4组,对照组每孔加入含20%对照组血清DMEM培养液、肺积宁方组为20%肺积宁方含药血清DMEM培养液、顺铂(1μg/ml)组、联合组(20%肺积宁方含药血清+顺铂1μg/ml)。将GFP-LC3转染后的Lewis肺癌细胞正常培养条件下培养24 h,对照组加对照血清、肺积宁方组加肺积宁方含药血清、顺铂组加顺铂、联合组加顺铂和肺积宁方含药血清。正常培养24h,荧光显微镜下观察,调整显微镜发射波长395nm,激发滤色镜的波长509nm,拍照,计数。免疫印迹法检测Beclin1蛋白、Atg5和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比例来判断自噬是否被诱导,对照组每孔加入含20%对照组血清DMEM培养液、肺积宁方组为20%肺积宁方含药血清DMEM培养液、顺铂组为顺铂(1μg/ml)组、联合组(20%肺积宁方含药血清+顺铂1μg/ml),培养48h,收集细胞。免疫印迹的定量,用Bio-Rad提供的分析软件进行灰度分析。计算Beclin1、LC3B-I、LC3BII、Ag5和内参照β-actin比值,评价自噬情况。real time PCR检测Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5的m RNA表达。体内实验:建立裸鼠荷瘤模型,Lewis瘤株,液氮保存,于37℃,水浴中复苏,放入37℃、5%C02细胞培养箱中,台盼蓝染色观察记录活细胞数(>95%),调整细胞浓度至1x107/m1的瘤细胞悬液,碘伏消毒,使用1ml注射器,在每只小鼠右腋窝皮下接种瘤细胞0.2ml,共接种50只。一般状态及自主活动次数观察:每日观察精神、饮食、活动、大小便等一般情况,每隔两日称小鼠体重,分别于用药前、d8、d17检测小鼠活动,于每天的同一时刻,小鼠自主活动测试仪测小鼠平行移动和站立次数,计算出每组裸鼠每分钟自主活动次数。实验结束,剥离瘤体,称瘤重及抑瘤率:抑瘤率=(对照组平均瘤重一实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重x100%,肿瘤组织病理形态学观察,各组瘤组织,包埋,完成石蜡组织块制作,用显微镜观察染色结果:细胞核呈现鲜艳的蓝色,细胞质及细胞间质呈粉红至红色。透射电镜观察瘤组织细胞的自噬小体,将取下的瘤组织快速切成1mm3大小,固定,超薄(70nm)切片,铀、铅双重染色,电镜下观察瘤组织细胞中的自噬小体,照相、记录。Western blotting检测瘤组织中Beclin1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、Atg5的蛋白表达。结果:1.肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞增殖的影响肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞的增殖有显着抑制作用,同一时间随着浓度的增加或者同一种浓度随着时间的延长其抑瘤作用增强(P<0.01)。分别在24h,48h,72h检测对lewis细胞的抑制作用,结果发现和对照组相比,肺积宁方含药血清抑制Lewis细胞的增殖,且抑制效果随着浓度、时间的增加而增强。中剂量组抑制率在24h、48h时相抑制率分别为19±1.84%,24±1.93%,与对照组的15±1.08%,20±2.06%比较,均有统计学显着差异(P<0.05),并且其抑制效果有随着浓度增加和时间延长而增强的趋势。大剂量组的抑制率分别为28±2.03%、32±2.04%,与中计量组比较有明显增加(P<0.05)。高剂量组在各个时相的抑制率与大剂量组比较,均无统计学意义。其最佳含药血清剂量组为大剂量组,进行后续实验。2.肺积宁方含药血清与顺铂联合对Lewis肺癌细胞增殖的抑制作用,肺积宁方组在不同作用时间,第24h、48h、72h抑制率分别为28%、32%、33%;顺铂组42%、66%、75%;联合组为58%、86%、91%。3.流式细胞仪检测流式细胞术检测对照组,肺积宁方组,顺铂组,联合组作用48h,细胞凋亡率,对照组、肺积宁方组、顺铂组及联合组对Lewsi肺癌细胞作用48h后的凋亡率分别为3.20%、10.36%、18.31%、30.18%,凋亡率以联合组作用为最高。与对照组比较,肺积宁方组促进凋亡作用明显,P<0.01;与顺铂组比,联合组明显提高了凋亡比例,统计学差异显着,P<0.01。处于G0/G1期,肺积宁方组处于此周期细胞较多比例为38.69%,顺铂组为56.12%,联合组最高,68.35%。4.自噬GFP-LC3转染及计数结果显示,对照组细胞中GFP-LC3融合蛋白弥散在包浆中,但代表自噬体的荧光斑点很少观察到;肺积宁方组有较为明显的绿色荧光聚集,可以观察到自噬体形成,荧光的强度比对照组明显高亮。经肺积宁方含药血清处理的,大多数细胞发生自噬(37.5%),而对照组自噬率较低(17.6%),具有显着差异,P<0.05。与顺铂组的自噬率(56.4%)相比,联合组的荧光斑点也明显增多,自噬发生率77.9%,并进行统计分析,两组差异明显,P<0.05。5.Western blotting检测Beclin1、LC3B-Ⅱ/LC3B-I、Atg5的变化免疫印迹法检测结果显示:肺积宁组较对照组Beclin1、Atg5蛋白表达显着增强,灰度值分别为Beclin1(0.38 VS 0.24),Atg5(0.31 VS 0.18)。LC3B-Ⅱ/LC3B-I灰度值比值(0.52 VS 0.2),差异显着,P<0.05。联合组与顺铂组比较,Beclin1(0.62 VS0.44)、Atg5(0.63 VS 0.41)也表达增强,LC3B-Ⅱ/LC3B-I灰度值比值上升(0.98 VS0.81),均有显着差异(P<0.05)。6.real time PCR检测Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5的m RNA表达引物验证,各引物扩增曲线均正常,溶解曲线无杂峰,均单峰,平均溶解温度一致,具有特异性。real time PCR结果提示,肺积宁方组细胞中的Beclin1、LC3B-Ⅱ、Ag5的m RNA表达增强,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);联合组细胞的Beclin1、LC3B-Ⅱ、Ag5的m RNA表达也明显高于顺铂组,差异显着(<0.05)。7.裸鼠成瘤情况、一般状态;各组药物对肿瘤生长的影响各组裸鼠瘤体大小较为相似、均衡。在平均肿瘤体积长到100mm3时,给药。B组(肺积宁方低剂量组)和C组(高剂量组)体重增长较为稳定,高低剂量组相差不大,精神及活动保持较好;A组(对照组)早期体重变化不明显,d10开始略有下降;D组(顺铂组)在给药3天后体重下降明显,精神萎靡,活动差;E组体重下降,与D组相比较下降较缓,但比B组和C组明显,后期下降不明现,精神和活动状态较D组表现好。B组和C组(单用肺积宁方组)自主活动次数较A组活跃,B组和C组比较,差异不显着;E组与D组比较,自主活动次数明显有优势。8.肺积宁方对裸鼠Lewis移植肿瘤生长的影响:B组、C组、D组和E组的肿瘤重量均低于对照组,与对照组比较有显着差异(p=0.000﹤0.01),B组瘤重较C组要轻,但差异不显着;其中E组的瘤重最轻,明显低于单独用药组(p﹤0.01),D组的瘤重组低于B组和C组,有统计学差异(p=0.031﹤0.05)。B组、C组、D和E组的抑瘤率分别为33.7%、40.6%、56.6%、66.9%,说明肺积宁方对Lewis移植肿瘤的生长有抑制作用,并与顺铂有协同作用。9.各组裸鼠移植瘤HE染色结果:肉眼瘤组织,较为规整,剥离较容易。部分瘤体的外区域可见坏死。HE染色光镜下可见,A组肿瘤细胞大,排列较为杂乱,紧密,核大深染,核浆比例失衡,处于分裂象细胞较多;B组及C组,肿瘤细胞大小较稍规整,可见坏死细胞明显较多,异型性较少见;D组可见大量坏死,可见少量纤维组织;E组坏死细胞大量出现,肿瘤细胞较小,分裂象比较少见,且周围有大量的淋巴细胞,白细胞浸润。10.各组裸鼠移植瘤电镜透视观察自噬小体各组均可见双层膜包裹的自噬体,可见典型的凋亡小体,其由膜包绕,小体内可见核的残片及细胞器。其中B组和C组可见较多散在的自噬体,D组也可见胞质内大量空泡,E组最为多见。依次增多:A组、B组、C组、D组、E组。11.Westen blot检测瘤组织中自噬相关蛋白Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5表达水平。采用Western blot蛋白免疫印迹法,检测各组裸鼠抑制瘤组织中自噬相关基因Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5的蛋白表达水平。Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5蛋白相对灰度值,B组分别为0.63、0.46、0.82,和C组的0.65、0.48、1.0比较无差异,P>0.05;B、C两组与A组0.42、0.38、0.43比较,显着增高,P<0.05;Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5蛋白相对灰度值在E组的统计值0.80、0.78、1.3,显着高于D组0.78、0.62、1.0,P<0.05。结论:1.肺积宁方含药血清能抑制Lewis肺癌细胞增殖,并能促进其凋亡。2.肺积宁方含药血清诱导Lewis肺癌细胞自噬,增强Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5蛋白和m RNA水平的表达,提高LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比例。3.肺积宁方能改善荷瘤裸鼠的一般状态、增加自主活动次数,抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长。4.肺积宁方上调荷瘤裸鼠瘤组织中Beclin1、LC3BB-Ⅱ、Atg5蛋白的表达,提高LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比例。5.肺积宁方具有抑制肿瘤作用,可能与诱导自噬有关。(本文来源于《辽宁中医药大学》期刊2016-03-01）
周立江,殷东风,潘玉真,唐广义[3]（2009）在《肺积宁方对C_(57)小鼠肺癌VEGF蛋白表达和生存质量的影响》一文中研究指出目的:观察肺积宁方对C57BL/6J小鼠肿瘤血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达和生存质量的影响,并探讨其作用机理。方法:小鼠造模后随机分为4组:模型组、顺铂组、肺积宁组、综合组,检测各组小鼠的体重变化和抑瘤率;测试小鼠自主活动情况;取脾、胸腺称重,计算脾、胸腺指数;检测瘤组织VEGF蛋白的表达。结果:肺积宁组和综合组体重增加、自主活动次数、脾和胸腺指数均高于顺铂组(P<0.05);抑瘤率综合组高于顺铂组(P<0.05);VEGF蛋白表达综合组低于顺铂组(P<0.05)。结论:肺积宁方具有一定的抑瘤作用,能提高脾和胸腺指数,改善生存质量。(本文来源于《现代肿瘤医学》期刊2009年06期）
周立江[4]（2009）在《肺积宁方对C_（57）小鼠Lewis肺癌VEGF蛋白和机体状况作用的实验研究》一文中研究指出目的:观察肺积宁方对C_(57)BL/6J小鼠肿瘤血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达和机体状况的影响,并探讨其作用机理。材料与方法:近交系C_(57)BL/6J小鼠50只,瘤细胞悬液接种于小鼠腋下,接种后第5天,选取荷瘤成功的小鼠40只,随机分为模型组(MG)、顺铂组(DG)、肺积宁组(FG),综合组(CG),每组10只。检测各组小鼠的体重变化和抑瘤率;测试小鼠自主活动情况;第12天,处死小鼠取脾、胸腺称重,计算脾、胸腺指数;剥离肿瘤,称重计算抑瘤率。肿瘤组织HE染色切片,光镜观察病理形态学变化;Western Blotting检测瘤组织中VEGF蛋白的表达。结果:1.肺积宁组与综合组比较,体重增加、自主活动次数增多;综合组与化疗组比较,体重增加、自主活动次数增多,相比均有差异性显着(p＜0.05)。2.肺积宁组和综合组脾和胸腺指数均高于顺铂组,相比差异性显着(p＜0.05)。3.肿瘤组织中VEGF蛋白表达综合组低于顺铂组,相比差异性显着(p＜0.05)。4.抑瘤率综合组高于顺铂组,相比差异性显着(p＜0.05)。结论:1.肺积宁方能改善Lewis肺癌小鼠机体状况。2.肺积宁方能提高Lewis肺癌小鼠脾和胸腺指数。3.肺积宁方能抑制Lewis肺癌肿瘤生长,与化疗药顺铂联用抗肿瘤有协同作用。4.抑制肿瘤组织中VEGF蛋白的表达。(本文来源于《辽宁中医药大学》期刊2009-05-01）
张巍[5]（2008）在《肺积宁方诱导人肺腺癌A549细胞凋亡及下调VEGF表达的实验研究》一文中研究指出目的:探讨肺积宁方对人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡及血管内皮生长因子(VEGF)基因蛋白表达的影响。方法:体外培养A549细胞,选择不同浓度肺积宁含药培养基与人肺癌细胞共同孵育72h后,应用倒置相差显微镜、荧光显微镜观察细胞生长状况和凋亡细胞形态变化,采用MTT法检测细胞生长抑制率、PI/ AnnexinV -FITC双染法检测细胞凋亡率、ELISA法检测细胞上清液中VEGF含量变化。结果:经MTT实验测定,肺积宁方各浓度对人肺腺癌A549细胞的增殖均有显着的抑制作用,呈良好的量效关系。肺积宁方对A549细胞IC50是200mg/ml,我们选用了30mg/ml,100mg/ml, 200mg/ml, 1100mg/ml四个浓度作为本实验的四个剂量组,作用时间为72h。在倒置显微镜下观察细胞生长状态,对照组细胞贴壁生长状态良好,但随着作用浓度的增加,细胞由贴壁生长而逐渐脱落,外形变圆,体积缩小,细胞间距增大,折光性增强。PI/ AnnexinV -FITC双染,流式细胞仪下检测细胞凋亡率,可测得本方可以诱导A549细胞凋亡,并随着药物浓度的增大,凋亡细胞的数量逐渐增加。经X2检验,四个浓度剂量组的细胞凋亡率均高于正常对照组,差异性显着(P<0.05);高浓度剂量组(1100mg/ml)处理后细胞凋亡率(44.8%)明显高于对照组(4.3%),p<0.01。经PI/ AnnexinV -FITC双染,在荧光显微镜下,可见部分细胞的细胞核呈大小不等、形态不规则的碎片状或梅花状,为典型的细胞凋亡形态,并随着浓度增加,每视野下的凋亡细胞增加。各剂量组均可使VEGF基因蛋白表达下调,呈明显的量效关系,当浓度为200mg/ml和1100mg/ml时,与对照组相比,差异性显着(p<0.01)。结论:肺积宁方能抑制人肺腺癌A549细胞增殖,其抑制作用可能是通过诱导细胞凋亡和下调VEGF基因蛋白表达来实现的。(本文来源于《辽宁中医药大学》期刊2008-05-01）
张巍,殷东风[6]（2007）在《肺积宁方诱导人肺腺癌A549细胞凋亡及下调VEGF表达的实验研究》一文中研究指出目的探讨肺积宁方对人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法体外培养A549细胞,采用MTT法检测细胞生长抑制率、PI/Annexin V-FITC双染法检测细胞凋亡率、荧光染色法观察凋亡细胞形态变化、ELISA法检测细胞上清液中VEGF含量变化。结果随着药物浓度的增大,对细胞生长的抑制率逐渐增加;本方可以诱导A549细胞凋亡,当浓度达到1100mg/ml时,凋亡率明显高于对照组(44.8%:3.4%,P<0.01);各剂量组均可使VEGF表达下调,且中、高剂量组作用更明显(P<0.01)。结论肺积宁方能抑制人肺腺癌A549细胞增殖,其抑制作用可能是通过诱导细胞凋亡和下调VEGF表达来实现的。(本文来源于《实用肿瘤学杂志》期刊2007年04期）
肺积宁方论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:通过体外实验,研究肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞增殖和凋亡的影响,并检测与凋亡密切相关的自噬基因Beclin1、LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ、Atg5蛋白水平表达及RNA水平的影响,探讨肺积宁方的抗癌作用及其对自噬的关系;并通过体内实验,运用裸鼠lewis移植瘤模型,分析肺积宁方在体内代谢后抗癌效果,观察其对Lewis肺癌细胞形态学影响、对自噬相关基因Beclin1、LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ、Atg5蛋白表达的影响。最终通过体内体外实验,了解肺积宁方对Lewis肺癌细胞抗癌效果及其作用机制。材料与方法:体外实验:制备含药血清,作用于Lewis肺癌细胞。40只大鼠按随机数字表法分为肺积宁方高剂量组、肺积宁方大剂量组、肺积宁方中剂量组、肺积宁方低剂量组和对照组。各组动物分别给予高、大、中、低剂量组肺积宁方及等量生理盐水灌胃,每天1次,连续3天,第3天晚上禁食不禁水12h,次日断头取血;用铡刀断头取血,制备肺积宁方含药血清。MTT法检测肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞的增殖抑制效应,分为肺积宁方含药血清高剂量组、含药血清大剂量组、含药血清中剂量组、含药血清低剂量组和对照血清组。同时设置不加细胞的空白孔。分别加不同浓度肺积宁方含药血清及正常对照组含药血清,分别于培养24 h、48 h、72h收集细胞进行MTT检测,观察肺积宁方含药血清抑制Lewis肺癌细胞增殖的最佳药量和作用时间,筛选出最佳含药血清剂量组,进行后续实验;流式细胞术检测对照组,肺积宁方组,顺铂组,联合组作用48h,细胞凋亡率。GFP-LC3转染定位法检测各组细胞自噬情况:将Lewis细胞以6×105细胞/孔的密度接种于6孔板,分为4组,对照组每孔加入含20%对照组血清DMEM培养液、肺积宁方组为20%肺积宁方含药血清DMEM培养液、顺铂(1μg/ml)组、联合组(20%肺积宁方含药血清+顺铂1μg/ml)。将GFP-LC3转染后的Lewis肺癌细胞正常培养条件下培养24 h,对照组加对照血清、肺积宁方组加肺积宁方含药血清、顺铂组加顺铂、联合组加顺铂和肺积宁方含药血清。正常培养24h,荧光显微镜下观察,调整显微镜发射波长395nm,激发滤色镜的波长509nm,拍照,计数。免疫印迹法检测Beclin1蛋白、Atg5和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比例来判断自噬是否被诱导,对照组每孔加入含20%对照组血清DMEM培养液、肺积宁方组为20%肺积宁方含药血清DMEM培养液、顺铂组为顺铂(1μg/ml)组、联合组(20%肺积宁方含药血清+顺铂1μg/ml),培养48h,收集细胞。免疫印迹的定量,用Bio-Rad提供的分析软件进行灰度分析。计算Beclin1、LC3B-I、LC3BII、Ag5和内参照β-actin比值,评价自噬情况。real time PCR检测Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5的m RNA表达。体内实验:建立裸鼠荷瘤模型,Lewis瘤株,液氮保存,于37℃,水浴中复苏,放入37℃、5%C02细胞培养箱中,台盼蓝染色观察记录活细胞数(>95%),调整细胞浓度至1x107/m1的瘤细胞悬液,碘伏消毒,使用1ml注射器,在每只小鼠右腋窝皮下接种瘤细胞0.2ml,共接种50只。一般状态及自主活动次数观察:每日观察精神、饮食、活动、大小便等一般情况,每隔两日称小鼠体重,分别于用药前、d8、d17检测小鼠活动,于每天的同一时刻,小鼠自主活动测试仪测小鼠平行移动和站立次数,计算出每组裸鼠每分钟自主活动次数。实验结束,剥离瘤体,称瘤重及抑瘤率:抑瘤率=(对照组平均瘤重一实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重x100%,肿瘤组织病理形态学观察,各组瘤组织,包埋,完成石蜡组织块制作,用显微镜观察染色结果:细胞核呈现鲜艳的蓝色,细胞质及细胞间质呈粉红至红色。透射电镜观察瘤组织细胞的自噬小体,将取下的瘤组织快速切成1mm3大小,固定,超薄(70nm)切片,铀、铅双重染色,电镜下观察瘤组织细胞中的自噬小体,照相、记录。Western blotting检测瘤组织中Beclin1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、Atg5的蛋白表达。结果:1.肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞增殖的影响肺积宁方含药血清对Lewis肺癌细胞的增殖有显着抑制作用,同一时间随着浓度的增加或者同一种浓度随着时间的延长其抑瘤作用增强(P<0.01)。分别在24h,48h,72h检测对lewis细胞的抑制作用,结果发现和对照组相比,肺积宁方含药血清抑制Lewis细胞的增殖,且抑制效果随着浓度、时间的增加而增强。中剂量组抑制率在24h、48h时相抑制率分别为19±1.84%,24±1.93%,与对照组的15±1.08%,20±2.06%比较,均有统计学显着差异(P<0.05),并且其抑制效果有随着浓度增加和时间延长而增强的趋势。大剂量组的抑制率分别为28±2.03%、32±2.04%,与中计量组比较有明显增加(P<0.05)。高剂量组在各个时相的抑制率与大剂量组比较,均无统计学意义。其最佳含药血清剂量组为大剂量组,进行后续实验。2.肺积宁方含药血清与顺铂联合对Lewis肺癌细胞增殖的抑制作用,肺积宁方组在不同作用时间,第24h、48h、72h抑制率分别为28%、32%、33%;顺铂组42%、66%、75%;联合组为58%、86%、91%。3.流式细胞仪检测流式细胞术检测对照组,肺积宁方组,顺铂组,联合组作用48h,细胞凋亡率,对照组、肺积宁方组、顺铂组及联合组对Lewsi肺癌细胞作用48h后的凋亡率分别为3.20%、10.36%、18.31%、30.18%,凋亡率以联合组作用为最高。与对照组比较,肺积宁方组促进凋亡作用明显,P<0.01;与顺铂组比,联合组明显提高了凋亡比例,统计学差异显着,P<0.01。处于G0/G1期,肺积宁方组处于此周期细胞较多比例为38.69%,顺铂组为56.12%,联合组最高,68.35%。4.自噬GFP-LC3转染及计数结果显示,对照组细胞中GFP-LC3融合蛋白弥散在包浆中,但代表自噬体的荧光斑点很少观察到;肺积宁方组有较为明显的绿色荧光聚集,可以观察到自噬体形成,荧光的强度比对照组明显高亮。经肺积宁方含药血清处理的,大多数细胞发生自噬(37.5%),而对照组自噬率较低(17.6%),具有显着差异,P<0.05。与顺铂组的自噬率(56.4%)相比,联合组的荧光斑点也明显增多,自噬发生率77.9%,并进行统计分析,两组差异明显,P<0.05。5.Western blotting检测Beclin1、LC3B-Ⅱ/LC3B-I、Atg5的变化免疫印迹法检测结果显示:肺积宁组较对照组Beclin1、Atg5蛋白表达显着增强,灰度值分别为Beclin1(0.38 VS 0.24),Atg5(0.31 VS 0.18)。LC3B-Ⅱ/LC3B-I灰度值比值(0.52 VS 0.2),差异显着,P<0.05。联合组与顺铂组比较,Beclin1(0.62 VS0.44)、Atg5(0.63 VS 0.41)也表达增强,LC3B-Ⅱ/LC3B-I灰度值比值上升(0.98 VS0.81),均有显着差异(P<0.05)。6.real time PCR检测Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5的m RNA表达引物验证,各引物扩增曲线均正常,溶解曲线无杂峰,均单峰,平均溶解温度一致,具有特异性。real time PCR结果提示,肺积宁方组细胞中的Beclin1、LC3B-Ⅱ、Ag5的m RNA表达增强,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);联合组细胞的Beclin1、LC3B-Ⅱ、Ag5的m RNA表达也明显高于顺铂组,差异显着(<0.05)。7.裸鼠成瘤情况、一般状态;各组药物对肿瘤生长的影响各组裸鼠瘤体大小较为相似、均衡。在平均肿瘤体积长到100mm3时,给药。B组(肺积宁方低剂量组)和C组(高剂量组)体重增长较为稳定,高低剂量组相差不大,精神及活动保持较好;A组(对照组)早期体重变化不明显,d10开始略有下降;D组(顺铂组)在给药3天后体重下降明显,精神萎靡,活动差;E组体重下降,与D组相比较下降较缓,但比B组和C组明显,后期下降不明现,精神和活动状态较D组表现好。B组和C组(单用肺积宁方组)自主活动次数较A组活跃,B组和C组比较,差异不显着;E组与D组比较,自主活动次数明显有优势。8.肺积宁方对裸鼠Lewis移植肿瘤生长的影响:B组、C组、D组和E组的肿瘤重量均低于对照组,与对照组比较有显着差异(p=0.000﹤0.01),B组瘤重较C组要轻,但差异不显着;其中E组的瘤重最轻,明显低于单独用药组(p﹤0.01),D组的瘤重组低于B组和C组,有统计学差异(p=0.031﹤0.05)。B组、C组、D和E组的抑瘤率分别为33.7%、40.6%、56.6%、66.9%,说明肺积宁方对Lewis移植肿瘤的生长有抑制作用,并与顺铂有协同作用。9.各组裸鼠移植瘤HE染色结果:肉眼瘤组织,较为规整,剥离较容易。部分瘤体的外区域可见坏死。HE染色光镜下可见,A组肿瘤细胞大,排列较为杂乱,紧密,核大深染,核浆比例失衡,处于分裂象细胞较多;B组及C组,肿瘤细胞大小较稍规整,可见坏死细胞明显较多,异型性较少见;D组可见大量坏死,可见少量纤维组织;E组坏死细胞大量出现,肿瘤细胞较小,分裂象比较少见,且周围有大量的淋巴细胞,白细胞浸润。10.各组裸鼠移植瘤电镜透视观察自噬小体各组均可见双层膜包裹的自噬体,可见典型的凋亡小体,其由膜包绕,小体内可见核的残片及细胞器。其中B组和C组可见较多散在的自噬体,D组也可见胞质内大量空泡,E组最为多见。依次增多:A组、B组、C组、D组、E组。11.Westen blot检测瘤组织中自噬相关蛋白Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5表达水平。采用Western blot蛋白免疫印迹法,检测各组裸鼠抑制瘤组织中自噬相关基因Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5的蛋白表达水平。Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5蛋白相对灰度值,B组分别为0.63、0.46、0.82,和C组的0.65、0.48、1.0比较无差异,P>0.05;B、C两组与A组0.42、0.38、0.43比较,显着增高,P<0.05;Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5蛋白相对灰度值在E组的统计值0.80、0.78、1.3,显着高于D组0.78、0.62、1.0,P<0.05。结论:1.肺积宁方含药血清能抑制Lewis肺癌细胞增殖,并能促进其凋亡。2.肺积宁方含药血清诱导Lewis肺癌细胞自噬,增强Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5蛋白和m RNA水平的表达,提高LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比例。3.肺积宁方能改善荷瘤裸鼠的一般状态、增加自主活动次数,抑制荷瘤裸鼠的肿瘤生长。4.肺积宁方上调荷瘤裸鼠瘤组织中Beclin1、LC3BB-Ⅱ、Atg5蛋白的表达,提高LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比例。5.肺积宁方具有抑制肿瘤作用,可能与诱导自噬有关。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
肺积宁方论文参考文献
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