导读:本文包含了基因工程细胞株论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:新型制剂,热原检测,细菌内毒素,补充方法
基因工程细胞株论文文献综述
裴宇盛,蔡彤,陈晨,高华[1]（2019）在《基因工程细胞系检测微球和脂质体中细菌内毒素的含量》一文中研究指出目的:针对目前现有热原检查法缺点,建立基因工程细胞系检测微球和脂质体制剂中的内毒素含量的检测方法,为新型制剂中热原物质的质量控制提供补充检测方法。方法:对基因工程细胞系检测细菌内毒素含量进行精密度、准确度、专属性、线性和范围等方法学验证。并对3种微球和3种脂质体进行方法适用性研究。结果:精密度、准确度、专属性、线性和范围符合规定。干扰实验结果显示3种微球的回收率均在50%～200%; 3种脂质体的回收率均不在50%～200%。结论:基因工程细胞系法可以作为微球制剂的质量控制补充方法,脂质体制剂不能使用该方法检测。(本文来源于《中国新药杂志》期刊2019年01期）
蒋文秀,王利利,叶伟,范璟,殷丹丹[2]（2017）在《共刺激基因工程细胞共培养的细胞因子诱导的杀伤细胞对HepG2.2.15细胞中乙肝病毒的抑制作用研究》一文中研究指出目的:研究共刺激基因工程细胞共培养的细胞因子诱导的杀伤细胞(ECCE-CIK)对人肝癌细胞系Hep G2.2.15细胞中乙肝病毒的抑制作用。方法:将共刺激基因工程细胞与人外周血单个核细胞共同培养,使用IFN-γ、CD3单抗、IL-2细胞因子诱导,产生ECCE-CIK细胞;将效应细胞(ECCE-CIK)和靶细胞(Hep G2.2.15)以效∶靶1∶1、5∶1、20∶1的比例共同孵育,使用CFSE/PI染色法检测ECCE-CIK对Hep G2.2.15的杀伤作用;建立体外直接法与间接法共培养系统,收集作用后3、24、48 h的培养上清液,检测HBV DNA与HBsAg水平。结果:随着效靶比的增加和时间的延长,杀伤率逐渐上升,培养上清中HBV DNA、HBsAg水平逐渐下降(P<0.05);直接系统对HBV DNA、HBsAg的抑制曲线略高于间接系统。结论:在体外直接法与间接法共培养系统中,ECCE-CIK都能降低Hep G2.2.15中HBV DNA和HBsAg水平,提示ECCE-CIK能通过细胞毒和非细胞毒方式抑制靶细胞中乙肝病毒的复制,为临床治疗提供了实验依据。(本文来源于《东南大学学报(医学版)》期刊2017年05期）
田磊[3]（2016）在《基因工程细胞hTNFα/CHO的构建及其细胞微囊抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长的实验研究》一文中研究指出恶性肿瘤的发病率和致死率甚高,成为当今世界人类疾病中的头号杀手。常规的叁大疗法(手术、化疗和放疗)对肿瘤的治愈率很低,并存在很大的毒副作用。近年兴起的肿瘤生物疗法及细胞疗法给肿瘤治疗带来了新的希望。已知人肿瘤坏死因子α(hTNFα)具有较强的杀伤或抑制肿瘤组织细胞生长的作用,已用于临床治疗某些肿瘤。但由于该因子的半衰期短,静脉全身用药后到达肿瘤组织的浓度低、持续时间短,难以达到满意的抑瘤效果;并且大剂量的使用会引发严重的寒战、高热及休克等全身不良反应,极大地限制了其在临床的应用。本组前期以人胚肾293细胞为载体,构建了能持续分泌hTNFα的hTNFα/293细胞;以APA微囊包裹该细胞,制备出APA-hTNFα/293细胞微囊;将该细胞微囊植入荷瘤裸鼠肿瘤组织内部及周围;结果初步表明在APA微囊发挥免疫隔离作用的前提下,该细胞微囊可在肿瘤组织局部发挥持续释放hTNFα、抑制肿瘤组织生长的效应。具有提高肿瘤组织局部hTNFα浓度、延长作用时间、降低全身不良反应的优点,可更好地发挥抑制肿瘤组织细胞生长的作用。作为全新的抑瘤方法,是否能在多种载体细胞及抑瘤实验中得到证实,需进一步的扩展性研究。本研究采用常用的CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)作为载体细胞,应用脂质体转染技术,构建hTNFα/CHO基因工程细胞;采用APA微囊包裹该基因工程细胞,制备APA-hTNFα/CHO细胞微囊;植入荷瘤鼠肿瘤组织内部及周围,以期利用APA微囊克服异基因细胞的免疫排斥反应,通过hTNFα/CHO细胞提供持续分泌和释放hTNFα的微型生物泵作用,达到维持肿瘤组织局部高浓度hTNFα、全身其他组织低浓度hTNFα的效应,以更好地发挥hTNFα的抑瘤作用,并降低全身不良反应,旨在为恶性肿瘤的治疗提供全新的生物治疗方法。一、实验目的:构建hTNFα/CHO基因工程细胞;制备APA-hTNFα/CHO细胞微囊;在体内、外实验中了解该细胞微囊对肿瘤组织细胞生长的抑制效应及对宿主的毒副作用。二、实验内容:应用脂质体转染技术,构建hTNFα/CHO基因工程细胞;在体外实验中证明该细胞可持续释表达hTNFα基因并分泌放人肿瘤坏死因子α;用ELISA法检测该细胞培养液中hTNFα蛋白的含量。用APA微囊包裹所构建的细胞系,制备出APA-hTNFα/CHO细胞微囊。将APA-hTNFα/CHO细胞微囊与9种不同的人肿瘤细胞共培养,观察该细胞微囊对不同人肿瘤细胞的生长是否具有抑制作用。选取2肿肿瘤细胞制备APA细胞微囊,将该细胞微囊植入荷瘤裸鼠的肿瘤组织内部和周围,了解其对荷瘤裸鼠肿瘤组织的生长是否具有抑制作用,及其对宿主体重和生存的影响。叁、实验方法:1、构建htnfα/cho基因工程细胞系:采用pcr技术对htnfα目的基因进行合成并扩增。通过质粒酶切与重组技术,将合成的目的基因整合入质粒gv141中,并检测目的基因整合水平。使用脂质体(lipofectamine2000)将整合htnfα目的基因的重组质粒gv141转染入cho细胞中,通过g418抗性筛选,构建出基因工程细胞htnfα/cho细胞系。提取筛选后扩增的该细胞的总rna,采用pt-pcr方法检测htnfα/cho细胞的外源性htnfα基因的表达;采用elisa法测定不同传代数的htnfα/cho细胞的培养上清液中htnfα蛋白的含量。在倒置光学显微镜下,观察培养中的htnfα/cho细胞、cho细胞的生长状态,并用mtt法测定该2种细胞的生长曲线,对比转染前、后htnfα/cho细胞与cho细胞生长增殖的变化。2、观察apa-htnfα/cho细胞微囊对共培养的肿瘤细胞生长的影响:分别用apa微囊包裹htnfα/cho细胞、0/cho细胞(转染空载体的cho细胞),用倒置光学显微镜观察体外培养的apa-htnfα/cho细胞微囊、apa-0/cho细胞微囊的形态变化及囊内细胞的生长状态。将定量的apa-htnfα/cho细胞微囊分别与9种不同的人肿瘤细胞(肝癌细胞hepg2、结肠癌细胞lovo、宫颈癌细胞hela、肺癌细胞h460、乳腺癌细胞mcf-7、膀胱癌细胞t24、乳腺癌细胞t47d、肺腺癌细胞a549、肾癌细胞achn)共培养。按照培养肿瘤细胞的加入物的不同分组:不加任何处理因素、仅培养的肿瘤细胞为空白对照组;加入htnfα溶液为阳性对照组;加入apa-0/cho细胞微囊为阴性对照组;加入不同剂量(低剂量50个、中剂量100个、高剂量200个细胞微囊)apa-htnfα/cho细胞微囊为实验组。采用mtt法检测各组肿瘤细胞叁天的增殖值,计算并绘制增殖曲线,了解apa-htnfα/cho细胞微囊分别对9种不同的人肿瘤细胞生长的影响。应用spss19.0软件对实验数据进行重复测量资料的方差分析,按照α=0.05水平,p<0.05表示有明显统计学差异,p<0.01表示有显着统计学差异。3、观察apa-htnfα/cho细胞微囊植入对荷瘤裸鼠肿瘤组织细胞生长的影响:参考上述体外实验结果,选取2种人肿瘤细胞,分别制备出移植瘤模型荷瘤裸鼠。分别将apa-htnfα/cho细胞微囊注射植入成模的荷瘤裸鼠肿瘤组织的内部及周围。按照给荷瘤裸鼠肿瘤组织中注射物的不同分组:注射生理盐水的为空白对照组;注射htnfα溶液的为阳性对照组;注射apa-0/cho细胞微囊的为阴性对照组;注射不同剂量的apa-htnfα/cho细胞微囊为实验组,并依剂量分为高、中、低剂量组。植入后每隔3天观察荷瘤裸鼠的生存状态,称重荷瘤裸鼠的体重,测量其肿瘤组织的长短径。于植入细胞微囊后第21天时测量结束后,用脊髓脱臼法处死荷瘤裸鼠,分离出荷瘤裸鼠的肿瘤组织,称重其瘤组织重量,测量其肿瘤组织的长短径。对数据进行整理计算。应用spss19.0软件对实验数据进行重复测量资料的方差分析,按照α=0.05水平,p<0.05表示有统计学差异,p<0.01表示有显着统计学差异。四、实验结果:1、htnfα/cho基因工程细胞的构建及其htnfα蛋白分泌功能的检定:pcr检测结果表明重组质粒中包含有htnfα基因;阳性克隆基因与htnfα基因测序比对结果表明整合的htnfα基因完整一致。rt-pcr检测结果显示:阳性对照基因gapdh电泳条带显示正常,表明整个rt-pcr检测体系正常;从5个转化株中筛选出4株含有htnfα基因,其中1号和2号的htnfα基因电泳条带呈强阳性,选用1号htnfα/cho细胞进行后续实验。光镜下观察和细胞生长曲线表明cho细胞转染前后生长未出现明显变化。2、apa-htnfα/cho细胞微囊对体外共培养的肿瘤细胞生长的抑制效应:⑴倒置光学显微镜下见apa-htnfα/cho细胞微囊呈圆球状,htnfα/cho细胞在囊内均一分布,培养3天后可见囊内细胞聚集成团。⑵与空白对照组比较,apa-0/cho细胞微囊组对9种肿瘤细胞的生长无明显抑制作用(p>0.05);阳性药物htnfα组对除t47d和hela外的7种肿瘤细胞的生长具有显着的抑制作用(p<0.01);对t47d和hela细胞无抑制作用(p>0.05)。⑶与空白对照组比较,各剂量apa-htnfα/cho细胞微囊对除t47d和hela外的7种肿瘤细胞的生长具有显着的抑制作用(p<0.01);中剂量该细胞微囊组对t47d细胞的生长具有抑制作用(p<0.05),高剂量该细胞微囊组对t47d和hela细胞的生长具有显着的抑制作用(p<0.01);大部分剂量的该细胞微囊抑制效果强于阳性药物htnfα组(p<0.05);部分存在剂量依赖关系。3、apa-htnfα/cho细胞微囊植入对裸鼠移植瘤生长的抑制效应⑴对荷lovo细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用植入apa-htnfα/cho细胞微囊对荷人结肠癌细胞lovo裸鼠的体重没有影响(p>0.05),21天后裸鼠均存活。21天时,与空白对照组比较,阳性药物htnfα组和高剂量apa-htnfα/cho细胞微囊组对瘤重量有明显的抑制作用(p<0.05)。高中低叁个剂量apa-htnfα/cho细胞微囊组对人结肠癌lovo裸鼠移植瘤的瘤体积抑制率分别为31.9%、29.1%和14.7%;瘤重抑制率分别为54.8%、46.2%和29.9%。并可见阳性药物htnfα组的瘤体积抑制率为48.9%,瘤重抑制率为63.5%。而apa-0/cho细胞微囊组的瘤体积抑制率为-21.8%,瘤重抑制率为3.1%,无抑制肿瘤生长的作用。⑵对荷hepg2细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用植入APA-hTNFα/CHO细胞微囊对荷人肝癌细胞HEPG2裸鼠的体重没有影响(P>0.05),21天后裸鼠均存活。21天时,与空白对照组比较,各剂量APA-hTNFα/CHO细胞微囊组对瘤组织无明显的抑制作用(P>0.05);高、中、低叁个剂量组对人肝癌细胞HEPG2裸鼠移植瘤的瘤体积抑制率分别为14.6%、7.9%和-7.6%;瘤重抑制率分别为7.5%、3.2%和-12.7%。并可见阳性药物hTNFα组的瘤体积抑制率为45.3%,瘤重抑制率为45.4%。而APA-0/CHO细胞微囊组的瘤体积抑制率为-35.6%,瘤重抑制率为-32.2%,无抑制肿瘤生长的作用。五、结论1、成功的构建了hTNFα/CHO细胞系,该细胞能够较为稳定地遗传外源性hTNFα基因,并且能够通过增殖代谢将其翻译表达并释放出细胞外。选用1号筛选株的第五代细胞进行下一步实验。2、APA-hTNFα/CHO细胞微囊对共培养的9种肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用,部分实验中抑制效应存在明确的剂量依赖关系。APA微囊中的hTNFα/CHO细胞可通过分泌释放hTNFα至培养液中,产生抑制这些肿瘤细胞生长的作用。选用的HEPG2和LOVO细胞进行下一步实验。3、APA-hTNFα/CHO细胞微囊对荷人结肠癌细胞LOVO具有明显的抑制瘤组织生长的作用;对荷HEPG2细胞裸鼠的瘤组织生长具有一定的抑制趋势;对荷瘤裸鼠的生存没有明显的影响。提示APA-hTNFα/CHO细胞微囊中的hTNFα/CHO细胞可通过分泌释放hTNFα至肿瘤组织中,发挥抑制肿瘤组织细胞生长的作用,特别是对荷LOVO细胞裸鼠。本研究构建了hTNFα/CHO细胞系,在APA微囊的包裹下,通过体内、外实验证明其具有抑制多种肿瘤组织细胞生长的作用。进一步表明APA-hTNFα/X细胞微囊有望成为治疗恶性肿瘤的全新的细胞治疗产品,他可克服异基因载体细胞的免疫排斥反应问题,可解决hTNFα临床应用的难题,以基因工程活细胞产生持续分泌hTNFα的微型生物泵作用,达到维持肿瘤组织局部高浓度hTNFα、全身其他组织低浓度hTNFα的效应,可更好地发挥hTNFα的抑瘤作用,并降低全身不良反应。可望为难治的恶性肿瘤提供全新有效的辅助治疗手段。(本文来源于《中国人民解放军军事医学科学院》期刊2016-06-08）
田磊,潘静坤,施明,薛毅珑[4]（2016）在《hTNFα/CHO基因工程细胞的构建及其分泌蛋白功能的检定》一文中研究指出目的构建能够持续分泌人肿瘤坏死因子(h TNFα)的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)基因工程细胞h TNFα/CHO细胞系,并且观察其分泌功能的变化。方法应用载体GV141构建携带h TNF基因表达的质粒;采用脂质体转染法,经G418筛选稳定转染细胞株;通过Real-Time PCR鉴定其基因表达,采用ELIAS法鉴定其蛋白分泌情况。结果经序列比对,证明GV141-h TNFα表达载体构建成功,Real-Time PCR证明转染细胞系包含h TNFα目的基因,ELIAS鉴定结果证明该细胞系可以在一定代数稳定持续内分泌h TNFα。结论构建的h TNFα/CHO细胞系可以在一定代数内稳定持续地分泌人肿瘤坏死因子。(本文来源于《局解手术学杂志》期刊2016年04期）
贺菊芳,余资江[5]（2015）在《基因工程细胞移植治疗坐骨神经损伤的研究进展》一文中研究指出坐骨神经是人体最粗大的神经,主要支配股二头肌长头、半腱肌、半膜肌和大收肌、小腿及足的全部肌肉以及除隐神经支配区以外的小腿与足的皮肤感觉。在损伤严重的情况下,远段发生的轴突坏死、髓鞘分解消失和神经鞘膜增生等,即"瓦勒变性"过程,引起股后部肌肉及小腿和足部所有肌肉全部瘫痪,导致膝关节不能屈、踝关节与足趾运动功能完全丧失,呈足下垂,且小腿后外侧和足部感觉丧失,足部出现神经营养性改变,可严重影响伤者的日常生活。坐骨神经损伤为临床常见且术后修复(本文来源于《局解手术学杂志》期刊2015年06期）
屈传强,陈裴,郭洪志,王翠兰,杜怡峰[6]（2013）在《构建OECs-VEGF165基因工程细胞的实验研究》一文中研究指出目的:构建携带human-VEGF165基因的慢病毒载体,转染嗅鞘细胞(OECs),探索将human-VEGF165基因导入OECs的方法,分析构建OECs-VEGF基因工程细胞的可行性。方法:差速贴壁法纯化OECs,采用免疫荧光鉴定OECs原代细胞纯度。使用慢病毒包装试剂盒,通过叁种质粒的共同转染293T细胞,合成携带目的基因的慢病毒载体。荧光实时定量PCR法测定病毒滴度,采用免疫荧光检测和ELISA检测OECs-VEGF165基因工程细胞。结果:差速贴壁法所取出的原代细胞约在所有细胞中占98%,第二代约占78%,第叁代降至58%,活性也明显下降,细胞形态变得多种多样,增殖变缓。从质粒转染成功的293T细胞提取的蛋白中检测到22KD附近处有条带,其大小和目的基因合成的蛋白分子量相吻合。合成病毒的滴度为2×10~8个/ml。转染组GFP阳性细胞数占总细胞数的比例大于80%,转染后MOI为5亚组细胞死亡较少,细胞功能恢复快。转染成功的OECs观察到外源VEGFA的表达。结论:差速贴壁法纯化是简便、经济的体外研究OECs的方法,要选择合适的传代次数。通过携带有human-VEGF165基因的慢病毒载体感染OECs,构建出的human-NEGF-OECs基因工程细胞可稳定、高效表达VEGF165基因,合成的目的蛋白分泌到细胞外。(本文来源于《山东省2013年神经内科学学术会议暨中国神经免疫大会2013论文汇编》期刊2013-09-07）
赵钢勇,崔蕾,高娟,代瑞廷,张平[7]（2013）在《BDNF基因工程细胞对帕金森大鼠纹状体多巴胺及其代谢物影响的研究》一文中研究指出目的:观察经侧脑室移植pIRESneo-EGFP-BDNF修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)对帕金森病(PD)大鼠纹状体多巴胺(DA)及代谢产物的影响。方法:采用电穿孔法将pIRESneo-EGFP-BDNF转染至骨髓MSCs;制备PD大鼠模型,随机分为Sham组,PD组,MSCs组,脑源性神经生长因子(BDNF)组,经侧脑室移植MSCs或pIRESneo-EGFP-BDNF修饰骨髓MSCs,术后2周,4周,8周,腹腔注射阿朴吗啡(APO)诱导PD大鼠旋转行为;应用高效液相色谱测定各组大鼠纹状体内多巴胺(DA)、高香草酸(HVA)及二羟苯乙酸(DOPAC)。结果:移植术后2周,4周,8周BDNF组、MSCs组大鼠与PD组比较旋转次数明显减少(P<0.05),以BDNF组改善更为明显。移植细胞干预PD模型8周后BDNF组、MSCs组大鼠纹状体DA、HVA、DOPAC较PD组明显提高(P<0.01),以BDNF组更为显着。结论:经侧脑室移植pIRESneo-EGFP-BDNF修饰的骨髓MSCs干预PD大鼠模型,显着降低PD大鼠纹状体内DA代谢率,提高DA水平,改善PD大鼠的行为能力。(本文来源于《中国应用生理学杂志》期刊2013年01期）
屈传强[8]（2012）在《构建OECs-VEGF165基因工程细胞的实验研究》一文中研究指出研究背景(?)脑白质疏松症的高发生率与治疗滞后随着人口老龄化的日益加剧、人们保健意识的增强以及影像学技术的发展,脑白质疏松症(Leukoaraiosis, LA)也备受关注,它是老年人认知障碍最常见的原因之一,正常老年人的发病率为1.7-8.6%,高血压患者为78%-93%, Alzheimer氏病为30%-31%,脑卒中病人为36%-100%。LADIS (Leukoaraiosis and Disability in the Elderly)研究发现：在没有残疾的老年人中,机体能力的水平和脑白质损害的程度相关,LA白质损害的程度和痴呆残疾评估分数密切相关。目前多数学者认为LA是由于年龄、高血压及其他血管病危险因素造成脑内小动脉发生结构变化,最终导致的脑部缺血性损伤。高血压、老龄的LA的最主要危险因素。LA作为一种慢性血管性缺血性病症,脑缺血后的神经发生和血管发生是由缺血引发的脑内两个主要病理生理过程,两者在促进缺血性损伤后的神经功能恢复方面都有重要作用。只有从改善局部的血管供血,才能从根本上解决LA发生发展的病因,阻止其向更严重(痴呆、脑梗塞)的病情发展。(?)血管内皮生长因子的研究进展和分析治疗性血管再生(therapeutic angiogenesis)是近年提出的一个新概念,率先在心肌缺血方面被重点研究,指刺激心肌缺血区的小血管生长和促进侧枝循环形成,即心肌缺血区的“自我搭桥”。目前认为,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是最有效的刺激血管生长的细胞因子之一,VEGF的生物学功能和可使新生血管形成的特性己引起越来越多人的关注,国外有人把VEGF基因治疗称为“分子搭桥术”,有望部分取代外科搭桥术和血管成形术。有研究发现,脑缺血后VEGF及其受体的表达上调,脑内注射VEGF导致脑部新生血管的形成和VEGFR-1在星形细胞的表达,VEGF还可直接发挥神经保护作用而不依赖血管形成,有助于皮质神经元免受低氧和低糖的损害,刺激轴突的生长。有关LA病变内VEGF变化及对LA的治疗国内外未见报道。VEGF在心脑血管方面的成功实验,为我们对LA的研究打下坚实的基础。如何应用外源性VEGF蛋白及VEGF基因治疗脑血管病,改善受损脑组织的血液供应,减轻其缺血程度,尚需进一步探索。LA的病理改变主要表现为缺血性脱髓鞘、髓鞘含量下降,如果能使局部的髓鞘再生,或将控制LA的进展,改善临床症状。嗅鞘细胞的生物学特性嗅鞘细胞(Olfactory ensheathing cells, OECs)作为一种具有星形胶质细胞和雪旺细胞双重特性的细胞,保留了许多发育阶段的特性和可塑性,OECs的存在使嗅系统成为迄今发现唯一可以再生的中枢,它的生物学功能极其广泛。对神经元的生长、发育、存活以及对突起生长有明显的促进作用。Ramon-Cueto等研究表明啮齿类动物的OECs能够使脊髓损伤大鼠轴突再生并使再生的神经纤维和脱髓鞘的神经纤维复髓鞘,因而,OECs为细胞移植治疗CNS疾病开辟了一条希望之路。基于OECs的生物学作用,目前的许多研究都集中在应用OECs移植来治疗神经组织的脱髓鞘损伤。通过对OECs与凋亡关系的研究,可以加强对OECs治疗作用和机制的理解,扩展其治疗范围和改进其治疗方法。》建立OECs-VEGF基因工程细胞的构想和意义随着基因工程技术研究的不断深入,基因治疗成为脑血管疾病防治新的切入点,基因转染技术使利用两者治疗LA成为可能,建立基因工程细胞的构想随之产生。基于以上分析,设想：利用嗅球OECs进行培养,诱导血管内皮再生的VEGF目的基因转入受体细胞,构建高度表达VEGF的大鼠OECs-VEGF基因工程细胞株,将移植细胞注入脑内,使其不但可以充分发挥两者的协同作用,并为解决VEGF表达量较少、持续性欠佳这一瓶颈问题提供了有效的解决途径。从而为LA的细胞移植治疗和基因治疗探索出一种新的切实可行的具有突破性的方法。预期OECs在LA模型的脑内大量传代扩增,向神经系细胞分化,具有促进轴突再生和修复髓鞘的作用；同时,经过转染的OECs生物活性更强,持续分泌更多的促进血管内皮再生的VEGF,从而改善LA神经组织的微循环,促进血管再生,减轻神经组织的缺血性损伤。本研究旨在嗅球OECs的分离、培养、纯化,携带human-VEGF165基因慢病毒的构建、合成以及病毒对OECs的转染,完成OECs-VEGF基因工程细胞的构建。研究目的：1.探索将human-VEGF165基因导入OECs的方法,分析构建OECs-VEGF基因工程细胞的可行性。2.研究从大鼠嗅球分离培养纯化OECs的方法与技巧。3.构建携带human-VEGF165基因的慢病毒载体。4. human-VEGF165-LV转染OECs,构建OECs-VEGF165基因工程细胞。研究方法：1.嗅球OECs的取材、分离、培养、纯化与鉴定。将雄性SD大鼠断头处死后,取嗅球嗅神经层和嗅球颗粒层剪碎,放在胰酶中,置培养箱内消化。用含FBS的DF12终止消化,吹打,静置,吸取上层悬液待接种,重复3次。OECs的纯化方法主要为差速贴壁法。将细胞悬液接种,加入双抗,培养。调整细胞,种植,贴壁。每3天换液一次。取原代细胞,制成细胞悬液。在24孔板中接种,测细胞总数,求平均值,持续计数9天,做出生长曲线。采用免疫荧光鉴定OECs原代细胞纯度：吸去培养液,反复漂洗、固定、孵育细胞两次,滴加Hoechst33342复染核,滴加碱性甘油于载玻片上,p75染色,封固后荧光显微镜下观察。计算高倍镜下视野中核的数目以及阳性细胞数,并计算阳性细胞数与核数的比例,即为OECs的纯度。2.构建携带human-VEGF165基因的慢病毒载体。使用慢病毒包装试剂盒,通过叁种质粒的共同转染293T细胞,合成携带目的基因的慢病毒载体。1)克隆构建：①过表达目的基因的载体制备：利用PCR方法钓取目的基因,将目的载体进行酶切,交换,其产物转化细菌感受态细胞。②明确目的基因及载体信息。③DNA琼脂糖凝胶电泳。④用CaC12制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞。⑤转化：将已转化的感受态细胞转移到琼脂培养基上。长出的克隆进行后续PCR鉴定。2)质粒表达检测：①准备目的细胞。②目的细胞质粒转染：制成细胞悬液,接种于培养板中,根据Lipofectamine2000转染试剂使用说明书进行转染操作。转染后观察质粒上荧光标记基因的表达情况以判断感染效率。③蛋白印迹法检测目的基因表达,将收集的细胞提取蛋白进行蛋白印迹检测,同时提取7860细胞,和空质粒转染的293T细胞分别作为空白对照和阴性对照。3)病毒包装和收集浓缩：细胞状态对于病毒包装至关重要,因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。收集浓缩后,进行病毒生物学滴度测定。4)病毒滴度检测：使用荧光实时定量PCR法测定病毒滴度,通过比较control组和实验组的Ct值差异判断滴度值。3. human-VEGF165-LV转染OECs、构建OECs-VEGF165基因工程细胞。1)预实验：分四组进行,每组四个不同梯度的MOI (Multiply of Infection),共16孔,其中每种实验条件做叁个复孔。每组均有不同梯度的MOI值。2)免疫荧光检测：将未转染的OECs与转染后OECs传代接种,弃培养液,漂洗细胞两次,室温固定,PBS洗涤,加入正常山羊血清后进行孵育,洗涤,再在爬片上滴加Hoechst33342复染核,碱性甘油封固后荧光显微镜下观察。同时在染色过程中制作有阴性对照玻片,未加一抗。3)Real time-PCR:①总RNA提取：取6孔板细胞,用吹打管吹至液体澄清,无细胞团块转至EP管中。用力摇晃试管、离心。用移液枪转上层水相于另EP管中,加等体积异丙醇,沉淀RNA,离心,用紫外光度检测RNA浓度。②RT-PCR:进行转染后OECs与未转染OECs细胞总RNA的逆转录。RT试剂盒中试剂解冻后,摇晃试管使其均匀,再稍离心,放于冰盒上操作。③Real-time PCR,融解曲线分析。4)ELISA检测：在标准品孔及待测样本孔中分别加入酶联亲和物,包被微孔板覆膜、孵育后扣干孔内剩余残液,每孔依照次序分别加入底物,避光反应后每孔分别加入终止液,终止反应。使用酶标仪读取OD值。Logit-Log直线回归计算、绘制出标准曲线图。研究结果：1.嗅球OECs的取材、分离、培养、纯化与鉴定。1)差速贴壁法所取出的原代细胞约在所有细胞中占98%,但是随着代数的增加,OECs的纯度很快下降,在第二代约占78%,到第叁代纯度降至58%。2)细胞形态和生长特性：纯化后OECs形态较为一致,主要呈梭性,约占细胞总数的90%以上；OECs也有其它形态,比较常见的有多突起型和不规则型。传代后OECs的形态发生改变,增殖形成的紧密连接消失,细胞也从梭性变成多突起形状。在培养液营养物质充分且完全的情况下,活性差的细胞渐渐凋亡,脱离瓶底,但对于大多数的细胞则可从多突起形态转化为增殖能力较强的梭形形态,继续增殖。3)原代OECs的增殖能力强,但随着传代次数的增加,OECs纯度下降,活性也明显下降,并且细胞的形态变得多种多样,增殖变缓。2.构建携带human-VEGF165基因的慢病毒。1)质粒克隆载体的构建：从载有humanVEGF165基因的质粒上扩增出目的基因片段,并重新链接与用于慢病毒包装载体的质粒上,通过对连接上的阳性转化子测序,并与NCBI上的目的基因序列进行比对,得出包装质粒上连接的目的基因序列正确。2)质粒表达目的基因检测：携带有EGFP蛋白基因做标记的质粒通过脂质体转染入293T细胞内,24小时后细胞内即可观察到明显的荧光,表明目的基因与EGFP表达正常。目的基因蛋白预测大小为22KD。通过Western Blot检测,从质粒转染成功的293T细胞提取的蛋白中可以检测到22KD附近处有条带,其大小和目的基因合成的蛋白分子量相吻合。这表明连接于克隆载体质粒上的目的基因在进入细胞后过表达成功。3)合成病毒的滴度：通过Real-time PCR来检测病毒的滴度,得出在相当于病毒原液万分之一组(即梯度稀释中的10-4ul组)和Con组样品的Ct值出现2个循环左右差异,认为在10-4ul组样品中存在病毒颗粒,得出病毒滴度为2×108个／ml。3. human-VEGF165-LV转染OECs、构建OECs-VEGF165基因工程细胞1)通过对不同浓度的病毒,以及不同转染条件的比较,得出对OECs慢病毒基因载体的最佳感染条件如下：对于合成的慢病毒,在MOI为10时即得到大于80%的感染效率；相对于普通培养基,Eni.s培养基并不能明显提高感染效率；Polybrene同样对病毒的感染效率改变不大。2)转染后,OECs的生长活性受到影响。12小时内进入“休止期”,24小时后,细胞培养上清内死细胞增多,荧光不可见,48小时后,转染组的细胞死亡的更多,72小时后,少量细胞可见微弱荧光表达,96小时后,大部分细胞内出现EGFP的表达。3)转染组MOI叁个不同亚组,GFP阳性细胞数占总细胞数的比例大于80%。但是在转染后,10与20亚组细胞死亡较多,MOI为5亚组细胞死亡较少,细胞功能恢复快。对转染成功的OECs进行VEGFA免疫荧光染色,可观察外源VEGFA的表达。通过对转染效率,转染对OECs生长的影响,初步确定大量转染OECs时,MOI值为5是合适的选择。结论1.通过差速贴壁法纯化从嗅球提取出的OECs有高纯度和较好的活性,是体外研究OECs时提取和纯化原代细胞简便、经济的方法,适合进行相关的进一步研究。2.随着原代细胞传代次数的增加,OECs的纯度和活性都明显下降,因而在OECs研究时,要选择合适传代次数下的OECs进行研究,使结果具有代表性。3.携带有human-VEGF基因的慢病毒载体可以成功将目的基因转入OECs,并且由于慢病毒对原代细胞感染的高效性,在尽量小的影响OECs活性的情况下,达到较高的转染效率。4.通过携带有human-VEGF基因的慢病毒载体感染OECs,构建出的human-VEGF-OECs基因工程细胞可稳定、高效表达VEGF165基因,合成的目的蛋白分泌到细胞外,符合VEGF165蛋白的生理特点,完成其在正常机体中的生物学作用。(本文来源于《山东大学》期刊2012-11-14）
高宇红,薛毅珑[9]（2012）在《分泌肿瘤坏死因子的基因工程细胞对人肝癌细胞的抑制作用》一文中研究指出【目的】自行建立分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞;将其与肝癌细胞共培养,观察体外培养中,分泌肿瘤坏死因子hTNF/93基因细胞表达的情况及对人肝癌细胞的抑制作用。【方法】(1)建立可稳定分泌人肿瘤坏死因子α/293细胞;采用RT-PCR、Western blot、ELISA和流式细胞仪等技术,检测人肿瘤坏死因子表达和分泌;(2)观察体外培养中,分泌肿瘤坏死因子hTNF/293基因细胞对人肝癌细胞的抑制作用,于不同的时间点,用MTT法检测490nm下的光密度值。(本文来源于《2012中国器官移植大会论文汇编》期刊2012-10-25）
孙天骏,柴家科,韩焱福,刘玲英,张培培[10]（2012）在《微囊化基因工程细胞的体外构建》一文中研究指出目的:体外构建微囊化VEGF基因修饰的人脐带间充质干细胞。方法:应用VEGF重组腺病毒感染人脐带间充质干细胞,获得VEGF基因修饰人脐带间充质干细胞。采用海藻酸钠和氯化钡为材料,采用气体吹喷法制备微囊化VEGF基因修饰人脐带间充质干细胞,并进行(本文来源于《中华医学会烧伤外科学分会2012年学术年会论文汇编》期刊2012-10-19）
基因工程细胞株论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:研究共刺激基因工程细胞共培养的细胞因子诱导的杀伤细胞(ECCE-CIK)对人肝癌细胞系Hep G2.2.15细胞中乙肝病毒的抑制作用。方法:将共刺激基因工程细胞与人外周血单个核细胞共同培养,使用IFN-γ、CD3单抗、IL-2细胞因子诱导,产生ECCE-CIK细胞;将效应细胞(ECCE-CIK)和靶细胞(Hep G2.2.15)以效∶靶1∶1、5∶1、20∶1的比例共同孵育,使用CFSE/PI染色法检测ECCE-CIK对Hep G2.2.15的杀伤作用;建立体外直接法与间接法共培养系统,收集作用后3、24、48 h的培养上清液,检测HBV DNA与HBsAg水平。结果:随着效靶比的增加和时间的延长,杀伤率逐渐上升,培养上清中HBV DNA、HBsAg水平逐渐下降(P<0.05);直接系统对HBV DNA、HBsAg的抑制曲线略高于间接系统。结论:在体外直接法与间接法共培养系统中,ECCE-CIK都能降低Hep G2.2.15中HBV DNA和HBsAg水平,提示ECCE-CIK能通过细胞毒和非细胞毒方式抑制靶细胞中乙肝病毒的复制,为临床治疗提供了实验依据。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
基因工程细胞株论文参考文献
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