张威1,2
1京东誉美中西医结合肾病医院肾脏病科河北省三河市065201；2解放军总医院肾脏病科北京100853
【摘要】目的:观察肾包膜下注射间充质干细胞对甘油所致急性肾损伤小鼠肾脏的保护作用。方法：健康雄性C57BL/6小鼠(8-12周龄)30只，随机分为3组：Sham+NS（normalsaline）组：肾包膜下生理盐水注射组；RM(rhabdomyolysis)+NS组：甘油肌肉注射加肾包膜下生理盐水注射组；RM+MSCs(mesenchymalstemcells)组：甘油肌肉注射加MSCs肾包膜下注射组。RM+NS和RM+MSCs组给予双后肢肌肉注射50%甘油生理盐水8ml/kg。甘油肌肉注射造模3d后检测血肌酐、尿素氮等，行肾脏病理PAS染色检查。结果：RM+NS组小鼠血肌酐、尿素氮、较Sham组明显升高，出现肾小管损伤；MSCs治疗组小鼠血肌酐、尿素氮较模型组降低(P<0.05)，肾小管损伤明显减轻。结论：肾包膜下注射间充质干细胞对甘油诱导小鼠急性肾损伤具有保护作用。
【关键词】急性肾损伤；间充质干细胞；肾包膜
【中图分类号】R692【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）-2-367-02
前言
急性肾衰竭是由肾小球滤过率急骤下降导致体内血肌酐、尿素氮等代谢物积聚，引起相应临床表现的综合征，是临床常见的危重急症。横纹肌溶解是指横纹肌细胞的完整性受到损害，肌细胞内的成分释放进入细胞外液和血液循环[1]。急性肾损伤（acutekidneyinjury，AKI）是横纹肌溶解的严重并发症[2]。甘油为高渗性物质，在肌肉注射甘油后即可引起局部肌肉坏死以及红细胞溶解，肌红蛋白和血红蛋白分子量小，容易通过肾小球滤过进入肾小管，造成严重的肾小管损伤[3]。通过给小鼠肌肉注射甘油建立AKI动物模型，可用于模拟临床上横纹肌溶解并发的AKI，甘油所致肾损伤模型是一个较为成熟的AKI动物模型。
肾包膜下移植,是上世纪八十年代以来发展起来的一种预测人体肿瘤对化疗药物敏感性的实验方法。肾包膜下有丰富的血管床,注射的细胞能够很快的被周围的血管吸收[4]。骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)为骨髓中一类具有多向分化潜能的多能干细胞,其可向多种造血以外的组织迁移、定居、分化,用于损伤修复[5]。我们利用MSCs可参与损伤肾组织修复的特性，结合肾包膜下细胞注射移植技术，观察MSCs对甘油所致AKI小鼠肾脏的保护作用。
材料与方法
1.实验动物雄性C57BL/6小鼠(8-12周龄)购自军事医学科学院实验动物中心，动物室保持12h昼夜循环，室温控制在19℃～29℃，湿度40%～70%，小鼠自由摄取水和食物。所有动物实验前在动物室适应性培养1周。
2.建立模型和实验分组健康雄性C57BL/6小鼠(8-12周龄)30只，随机分为3组:Sham+NS（normalsaline）组：双侧肾包膜下生理盐水注射组；RM(rhabdomyolysis)+NS组：甘油肌肉注射加双侧肾包膜下生理盐水注射组；RM+MSCs(mesenchymalstemcells)组：甘油肌肉注射加MSCs双侧肾包膜下注射组，每只小鼠肾包膜下注射约5×106MSCs。每组10只，限水不限食24h，Sham组给予双后肢肌肉注射生理盐水8ml/kg，其余3组给予双后肢肌肉注射50%甘油生理盐水8ml/kg（甘油购自美国Amresco公司）。在甘油注射完的72h，处死小鼠，留取血及肾组织标本，以便进一步研究。
3.细胞的培养C57BL/6骨髓来源的MSCs购自赛业生物科技有限公司。MSCs在37°C，5%CO2，90%的湿度条件孵箱中进行培养，用MSC生长专用培养基（赛业公司）进行培养，传代到第6到8代时用于实验。
4.观察血肌酐、尿素氮变化腹主动脉采血，放于促凝管中，颠倒混匀，室温静置40～120min，3000r/min离心10min，分离上层血清，全自动生化分析仪检测血清肌酐、尿素氮。
5.肾脏组织学检查将肾组织固定于10%福尔马林液中，常规脱水、石蜡包埋，行PAS染色。组织学检查采用盲法。急性肾小管坏死的严重程度进行评估，200倍光镜下随机选取10个视野，记录每个视野细胞坏死、刷状缘脱落、管型形成、管腔扩张的小管站该视野小管数的百分比，进行评估对比观察。
6.统计学方法数据以(x±SEM)表示，采用SPSS20.0软件对数据进行单因素方差分析，方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Games－Howell检验，P＜0.05被认为差异具有统计学意义。
结果
1.一般情况Sham组反应灵敏，精神良好，进食进水正常，尿液颜色正常；RM+NS组，小鼠反应迟钝，精神萎靡，1～4h可见肉眼血尿，进食进水量减少；MSCs干预后，小鼠反应迟钝、精神萎靡状况有所缓解。
2.血肌酐、尿素氮小鼠双侧肌肉注射甘油后，肾功能急剧恶化，血肌酐、尿素氮明显升高。RM+MSCs组血肌酐、尿素氮较RM+NS组有所改善(P＜0.05)，差异有统计学意义。（表1）
3.小鼠肾脏组织病理学变化小鼠双侧肌肉注射甘油3d后，RM+NS肉眼可见肾脏肿大，肾脏病理PAS染色显示，肾小管上皮细胞肿胀、变性、刷状缘消失和部分上皮细胞坏死，伴有肌红蛋白管型形成。MSCs治疗后，肾脏损伤较RM+NS组明显减轻，肾小管内管型减少，上皮细胞坏死减轻，可见不连续的刷状缘。（图1）
表1各组血肌酐、尿素氮变化情况(`x±SEM)
讨论
本研究尝试肾包膜下注射MSCs对小鼠AKI模型进行治疗，观察其对AKI的防治作用，初步结果表明肾包膜下注射MSCs具有预防和治疗甘油诱导的小鼠AKI的作用，可以降低血肌酐、尿素氮水平，减轻肾脏病理损伤。
本研究选用甘油诱导的AKI模型，观察时机选择在造模后3d，因为本研究前期模型曲线探索中发现大鼠注射甘油后出现血肌酐、尿素氮逐渐上升，3d时达到峰值，之后逐渐下降[6]。为了排除疾病修复带来的干扰，我们选择造模后3d作为实验终点。
干细胞治疗肾脏疾病首先面临的是干细胞导入方式的选择问题。目前很多细胞移植是经静脉输注,静脉血流通过全身,可能归巢到肺、脑、脾等器官,也可能会刺激未知肿瘤的生长,因此这种移植方式效率并不确定。我们采用肾包膜下移植这种直接的方式将肾脏干细胞靶向植入体内来观察治疗效果。这样就能使MSCs与损伤部位充分的接触，解决了归巢率低的问题，来观察MSCs对AKI疗效。
在实验设计上，为了验证MSC是否能起到对AKI的修复治疗作用，我们设计了以下的实验分组：Sham+NS组排除手术操作对实验的影响；RM+NS组观察甘油模型是否成功；RM+MSCs组明确MSCs对肾损伤是否起到治疗作用。实验结果显示：RM+NS组，血肌酐、尿素氮明显上升，P<0.05表明甘油肌肉注射会引起AKI。RM+MSCs组与RM+NS组相比较，血肌酐、尿素氮下降趋势明显，P<0.05有统计学意义，表明肾包膜下MSCs注射能起到对肾损伤的治疗作用，并且从肾脏病理切片PAS染色结果也可以看出以上结论。我们在这里提供了肾包膜下注射MSCs治疗肾损伤的一种方式方法，我们希望我们这种的方式方法能提供一种新颖的观念，同时我们也将不断的改进技术、提高疗效，使其得到推广应用，从而为提供更多的可供选择的方案。
参考文献：
[1]李家瑞.重症监护病房的急性肾损伤[J].中国中西医结合急救杂志,2014(3):238-240.
[2]郑晓勇,刘云海.横纹肌溶解症致急性肾损伤的诊断和治疗[J].中国中西医结合肾病杂志,2010,11(6):518-519.
[3]谢院生,刘晓峦,陈香美.横纹肌溶解致急性肾损伤的诊治[J].中国血液净化,2009,8(03):120-123.
[4]臧东钰,李晓明,郭敏.大鼠和小鼠胚胎后肾移植的形态学研究[J].解剖科学进展,2006(04):333-334.
[5]卫静,袁发焕,黄云剑.骨髓间充质干细胞移植与肾脏病[J].现代生物医学进展,2011,11(10):1987-1990.
[6]陶琦,姚源璋.急性肾衰竭动物模型研究进展[J].中国中西医结合肾病杂志,2013(7):654-655.