一、B细胞激活因子水平ELISA检测方法的建立及临床初评（论文文献综述）
刘悦[1]（2021）在《TAZ活化强直性脊柱炎Th17细胞及雷公藤甲素干预机制》文中认为背景:强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）是临床常见的炎症性脊柱关节病,以骶髂关节和脊柱附着点慢性炎症为主要特点,也可累及外周关节,常伴有不同程度的全身多系统损伤。本病常累及脑、体力劳动处于最佳状态的青年男性,晚期出现脊柱强直畸形,严重降低患者的生活质量。炎症是AS病理变化的始动环节,炎症一旦发生,将引起AS患者病理性新骨形成,使病理改变进入不可逆期,最终致残。因此,控制炎症是AS治疗的重点。辅助性T细胞17（T helper cell 17,Th17）由多潜能CD4+T细胞分化而来,能够通过大量分泌细胞因子白细胞介素17（interleukin 17,IL-17）而发挥致炎作用。Th17/IL-17炎症轴在驱动AS炎症发生中发挥着重要作用。抑制致炎性Th17的分化,成为AS的关键治疗靶标。TAZ（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif,TAZ）是Th17细胞的关键转录共激活因子。初始CD4+T细胞经抗原刺激后,活化、扩展并向 Th1、Th2、Th17 及调节性 T 细胞（regulatory T cell,Treg）4 种亚群分化,其分化过程受不同的细胞因子及特征性转录因子的调控。不同于Th1、Th2及Treg亚群,维甲酸相关孤儿核受体（retinoid-acid receptor-related orphan receptor γ t,RORγt）是控制Th17细胞分化的特异性转录因子。而转录因子在基因表达过程中无法独自发挥作用,需要协同转录共激活子形成转录复合物,共同调控基因表达。研究表明,转录共激活因子TAZ能够与RORγt形成转录复合物,增强RORγt转录活性,正向调控致炎性Th17的分化。因此,探索TAZ在强直性脊柱炎患者中的表达及其对AS患者Th17分化的影响,对于寻找缓解和控制AS炎症的新的治疗靶点具有重要意义。AS发病以肾督空虚为本,风、寒、湿、热外邪痹阻经络关节为标。其中,湿热痹阻为AS临床常见证型,治疗当以利湿清热为法。中药雷公藤系卫矛科雷公藤属植物雷公藤的根、叶、花及果实部分,功擅祛风除湿、清热活血、通络止痛。因具有强大的抗炎及免疫抑制作用,雷公藤及其制剂在炎症性疾病及自身免疫病的治疗中得到了广泛运用。网络药理学研究表明,雷公藤有效成分能够通过Th17分化通路发挥治疗AS的作用。雷公藤甲素是雷公藤主要有效活性成分之一。本课题组前期研究表明,雷公藤甲素能够有效干预AS患者外周血中Th17的分化及IL-17的分泌。基于以上研究,本研究将继续着眼于致炎性Th17细胞的分化,探索TAZ在AS患者中的表达及雷公藤甲素干预作用。目的:探索转录共激活因子TAZ在AS患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中的表达及对于Th17细胞分化调控的影响,并使用中药单体雷公藤甲素体外干预活动期AS患者PBMC,探索雷公藤甲素对活动期AS患者ROR γ t及TAZ表达水平的影响。以期为寻找AS新的治疗靶点及新药研发提供新方向。方法:研究一纳入AS患者共50例,其中活动期AS患者（AS-Active）25例,稳定期AS患者（AS-Stable）25例;健康对照组（Normal）20例。取各组受试者肘窝静脉血后,运用Ficoll-hypaque密度梯度离心法分别收集血清及外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）;采用酶联免疫吸附法（enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA）检测各组血清 IL-17 表达水平;采用蛋白免疫印迹法（western blot,WB）检测各组PBMC中RORγ t及TAZ的蛋白表达水平。同时将TAZ表达水平与ROR γ t表达水平、血清IL-17表达水平及炎症指标ESR、CRP和疾病活动指数BASDAI评分做相关性分析。研究二纳入活动期AS患者25例,中药单体雷公藤甲素体外干预活动期AS患者PBMC,观察雷公藤甲素对ROR γ t及TAZ表达的影响。采用SPSS 25.0统计软件进行统计分析。所有检验采用双侧检验,计量数据资料以x±s表示,p值<0.05时认为差异有统计学意义。组间比较,两组数据均符合正态分布且满足方差齐性者,选用两组独立样本t检验;不符合正态分布或方差齐性者,选用Wilcoxon秩和检验。组内比较,两组数据差值符合正态分布且满足方差齐性者,选用配对样本t检验。多个独立样本不符合正态分布或方差齐性者,选用非参数Kruskal-Wallis H检验。两组计量资料符合正态分布者,采用Pearson相关系数进行相关性分析;不满足正态分布者,采用Spearman做相关性分析。结果:1.活动期AS患者较稳定期AS患者血清IL-17表达水平呈显着升高（p<0.05）,较正常对照组亦呈显着升高（p<0.01）;稳定期AS患者血清IL-17表达水平较正常组虽升高,但无统计学意义（p>0.05）。2.活动期AS患者ROR γ t蛋白表达较稳定期及健康对照组均呈显着升高（p<0.01）,稳定期RORγt蛋白表达较健康对照组亦显着升高（p<0.01）。3.与健康对照组相比,活动期AS患者TAZ蛋白表达呈显着升高（p<0.01）;与稳定期相比,活动期AS患者TAZ蛋白表达亦呈显着升高（p<0.01）。稳定期AS患者TAZ蛋白表达较健康对照组亦呈显着升高（p<0.01）。4.Spearman相关性分析结果显示,TAZ表达水平与ROR γ t表达水平呈显着正相关（r=0.730;p<0.01）,与 ESR、CRP 呈显着正相关（TAZ—ESR:r=0.603;p=0.001<0.05;TAZ—CRP:r=0.416;p=0.039<0.05）,与血清 IL-17 水平呈显着正相关（r=0.800;p<0.01）,TAZ表达水平与疾病活动指数BASDAI评分无显着相关性（r=0.353;p=0.084>0.05）。5.经中药单体雷公藤甲素体外干预AS患者PBMC后,活动期AS患者PBMC中RORγt蛋白表达较干预前显着降低（p<0.01）;TAZ蛋白表达较干预前亦呈显着降低（p<0.01）。结论:1.TAZ在AS患者PBMC中的表达明显升高,可能通过与ROR γ t形成转录复合物,正向调控致炎性Th17分化从而参与AS发病。2.雷公藤甲素体外干预活动期AS患者的PBMC能够下调ROR γ t及TAZ的表达,其可能是干预AS患者Th17分化,从而缓解炎症的有效治疗药物。
刘雨婷[2]（2021）在《青蒿素衍生物和BTK抑制剂治疗自身免疫性疾病的作用机理研究》文中研究说明自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病,包括系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）,类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）,银屑病,炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）等。其中,SLE由于多器官受累,临床表现复杂,免疫异常的表型多样,几乎覆盖整个免疫系统,被认为是自身免疫性疾病的原型。B细胞功能及表型异常是SLE疾病发生发展的关键因素。记忆性B细胞在自身免疫反应中快速应答,并维持自身反应性抗体分泌细胞的分化。近年发现的一群具有记忆性表型的年龄相关的B细胞（age-associated B cells,ABCs）亚群随SLE疾病进展快速扩增,其变化趋势与SLE应答指数高度相关。因此,探究调控ABCs分化及功能的通路,明确候选药物对ABCs形成及病理效应的影响,将有助于发现指示疾病预后和预测药物疗效的特征性细胞亚群,据此提高SLE治疗手段的有效性。RA与SLE同为典型的自身免疫介导的风湿性疾病,以滑膜炎症、破骨细胞过度分化所致骨破坏为主要病理特征,患者可出现关节变形及进行性关节功能丧失。自身反应性B细胞分泌大量RA相关的自身抗体,通过Fcγ受体交联信号促进破骨前体细胞分化;同时,浸润在RA患者关节滑膜中的B细胞还可通过产生核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB Ligand,RANKL）,增强关节部位破骨形成作用。因此寻找具有理想活性窗口的B细胞胞内信号通路的小分子抑制剂,可望通过多环节干预,阻断RA的病理过程。水溶性青蒿素衍生物马来酸蒿乙醚胺（SM934）是治疗SLE的候选新药,正在开展Ⅱ期临床研究。本课题研究发现,SM934对狼疮模型小鼠MRL/lpr的治疗作用,与其控制淋巴器官和肾脏中ABCs的扩增、改变异常的细胞能量代谢密切相关。ABCs细胞是与SLE患者的疾病活动度和治疗应答指数高度相关的记忆性B细胞亚群。通过在疾病各进展阶段采用SM934干预,检测狼疮相关自身抗体指标及肾炎相关血生化、尿液指标,综合考察免疫细胞表型和能量代谢模式,结果发现:1)MRL/lpr小鼠脾脏和肾脏中ABCs细胞数量快速增加,与疾病活动指征呈正相关性;2)脾脏中B细胞的糖酵解和线粒体呼吸随疾病进展显着增强,而肾脏中浸润的B细胞的代谢水平低于正常小鼠,两者呈现出相反的能量代谢变化趋势;3)SM934在疾病确立阶段干预治疗,显着减少MRL/lpr小鼠免疫器官和肾脏中的ABCs细胞,该抑制作用与治疗作用呈正相关;4)SM934治疗,逆转了疾病进展期MRL/lpr小鼠免疫器官和肾脏中B细胞的异常能量代谢模式。临床近95%的SLE患者并发关节炎和关节痛,狼疮性关节炎的疾病表征与早期RA类似。姥鲛烷（pristane）诱导的狼疮模型是典型的SLE伴随RA的实验动物模型,被广泛用于研究自身免疫反应和炎症的病理机制。本研究运用pristane诱导的类风湿性关节炎（pristane-induced arthritis,PIA）模型开展SM934对狼疮伴发关节炎的治疗作用及机制研究。实验结果表明,SM934口服给药1)显着降低PIA模型小鼠的关节临床评分和关节炎症;2)降低血清中自身抗体和抗Ⅱ型胶原抗体水平。机制研究发现,SM934通过干预巨噬细胞极化,改变关节腔炎症微环境,改善关节损伤。布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase,BTK）是B细胞受体（B cell receptor,BCR）和Fcγ受体（Fc gamma receptor,FcγR）信号的关键调节分子,参与包括RA在内的自身免疫性疾病的病理过程。靶向BTK能够调节多种RA相关的免疫细胞（B细胞和髓系细胞）功能,具有巨大的治疗潜力。SOMCL-17-016是高度激酶选择性的新结构三环类BTK抑制剂,本课题研究发现其具有优异的体内外免疫抑制活性。运用胶原诱导的小鼠关节炎（collagen-induced arthritis,CIA）模型,证实SOMCL-17-016口服治疗显着改善CIA模型小鼠的关节损伤和炎症,且效价高于第一代BTK抑制剂Ibrutinib及第二代BTK抑制剂Acalabrutinib。进一步机制研究发现,SOMCL-17-016通过抑制BTK,1)降低B细胞产生RA相关自身抗体水平;2)减少滑膜炎症部位浸润的RANKL分泌型B细胞数量,改变关节局部破骨细胞的分化环境;3)通过抑制RANK-BTK-PLCγ2信号通路抑制破骨前体细胞分化。SOMCL-17-016靶向BTK,干预激酶调控的多个信号通路及免疫学事件,快速起效缓解CIA症状,有望成为治疗RA的候选药物。综上所述,本课题研究关键细胞亚群和胞内信号分子在SLE和RA疾病进展和组织损伤中的病理作用及调控机制,确证BTK抑制剂SOMCL-17-016的在自身免疫性疾病中的疗效作用,进一步探究了青蒿素衍生物SM934治疗SLE的作用机制,初步建立其疗效作用与对敏感细胞亚群调控作用的内在关联,将有助于发现和确立新型的自身免疫性疾病候选药物和治疗靶点。
韩超[3]（2021）在《Th17细胞中SOX-5介导RORγt基因新的增强子RORCE2与启动子相互作用的机制研究》文中认为Th17细胞是一种CD4+辅助性T细胞（CD4+Th）的亚群,表达细胞因子IL-17A,以及IL-17F、IL-26、IL-22、IL-21和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等,这些细胞因子尤其是IL-17A是Th17细胞发挥各种生物学功能的基础。Th17细胞在多种炎症相关的疾病中发挥着非常重要的作用,例如多发性硬化（multiple sclerosis,MS）、实验性自身免疫性脑炎（Experimental autoimmune encephalitis,EAE）、类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）、肝炎（Hepatitis）、以及结肠炎（colitis）等等。因此,深入研究Th17细胞的内在分子机制对于多种炎症相关疾病的发病原理和相关防治措施的建立都具有非常重大的意义。维甲酸受体相关孤儿受体（Retinoic acid receptor-related orphan receptor-γ,RORγ,又称为RORC）基因可以编码两种不同的异构体,RORγ1和RORγ2（也称为RORγt）。目前众多的研究表明,在CD4+Th免疫细胞亚群中,RORγt仅表达于Th17细胞中,是Th17细胞特异性的关键转录因子（transcription factor,TF）。在体外实验中证实,敲除RORγt基因的CD4+T细胞中的IL-17A的表达量会迅速下降;而通过基因转染的方式过表达RORγt可恢复表达IL-17A。缺失RORγt基因小鼠的Th17细胞会发生缺陷,在构建的EAE疾病模型中,RORγt基因缺失小鼠更难发病,发病时间会延迟,疾病程度会减轻。由此可见,RORγt是Th17细胞分化、发育和发挥功能的关键转录因子。RORγt可以控制许多调控Th17细胞分化的关键基因,因此,对于RORγt基因自身转录调控机制的研究就显得尤为重要。近年来的研究已经明确RORγt基因的启动子是位于转录起始位点（transcriptional start site,TSS）-400～+151 bp的区域,但是关于RORγt基因增强子却报道不多。本课题围绕RORγt基因增强子的发现和鉴定,以及其具体的作用机制进行了深入的研究,并得到了以下三方面的结论:1.增强子RORCE2通过增强RORγt的表达促进Th17细胞的分化。我们首先利用表观遗传学方法通过对增强子相关的组蛋白修饰H3K4me2的Ch IP-seq数据进行分析,发现在小鼠RORC基因上游存在一段Th17细胞特异的1.5kb左右的候选增强子序列RORCE2;并在人的Th17细胞中RORC基因相同的位点发现了还高度表达与增强子活化相关的H3K4me1和H3K27ac表观修饰标志;体外双荧光素酶实验证实了RORCE2对RORγt启动子活性有显着地增强作用;在小鼠体内分选的Th17细胞中,利用染色质免疫共沉淀（Chromatin Immnoprecipitation,Ch IP）-q PCR进一步证实该序列还发生了与增强子活化密切相关的其他组蛋白修饰,例如H3K4me1、H3K27ac和H3ac;基于CRISPR/Cas9技术制备RORCE2敲除的小鼠,利用RT-q PCR和流式细胞技术（Flow cytometry,FCM）证实RORCE2的缺失严重影响RORγt和IL-17A的表达;在体外诱导分化模型中,通过FCM进一步发现RORCE2的缺失影响Th17细胞的分化;利用RORCE-/-和WT小鼠建立EAE疾病模型发现RORCE2的缺失显着降低了EAE疾病的严重程度。这些结果都提示了Th17细胞中RORCE2是RORγt基因的潜在增强子·,可以通过增强RORγt的表达促进Th17细胞的分化。2.SOX-5介导增强子RORCE2与RORγt基因启动子相互作用对Th17细胞的分化至关重要。增强子对于目的基因的调节依赖于染色质环（loop）的形成,其具体机制是:首先是谱系特异性转录因子与增强子结合并开放该染色质区域,然后招募其他的转录因子协同活化该增强子区域,使其发生特定的组蛋白修饰并最终被彻底激活,进而与同源基因的启动子相互作用发挥增强子的功能。为了进一步探究Th17细胞中增强子RORCE2是如何发挥作用的?我们做了如下实验:（1）首先我们发现在RORCE序列中存在8个限制性内切酶Nla III的酶切位点（TS1-8）;（2）通过染色体构象捕获技术结合定量PCR的方法（Chromatin conformation capture-q PCR,3C-q PCR）证实,无论是表达RORγt的小鼠淋巴细胞株EL4,还是FACS分选的Th17细胞,或者是体外诱导分化的Th17中,3号检测位点（TS3）相比于其他位点而言,可以与RORγt启动子存在很强的相互作用;（3）通过对增强子上转录因子结合位点的生物信息学分析以及文献提示,我们推测转录因子SOX-5可能是与增强子RORCE2相互结合进而参与loop形成调节RORγt基因表达的关键转录因子,其结合位点（SOX-5-Binding site,SOX-5-BS）位于TS3上游约50 bp;（4）通过Ch IP-q PCR证实SOX-5确实结合在SOX-5-BS与以及RORγt启动子区域;（5）通过3C-q PCR结合Ch IP的实验方法（Ch IP-loop）证实,无论是EL4还是体外分化的Th17细胞中,SOX-5都介导了TS3和RORγt启动子之间的相互作用;（6）为了进一步了解其中的机制,基于CRISPR/Cas9技术构建了RORCE上转录因子SOX-5结合位点缺失的小鼠(SOX-5-BS-deficient,SOX-5-BS-/-),结果发现SOX-5-BS的缺失导致SOX-5在SOX-5-BS上的结合显着降低,并严重破坏了TS3和RORγt启动子之间的相互作用;（7）小鼠体内实验也表明:SOX-5结合位点的缺失显着影响了RORγt和IL-17的表达,并通过影响Th17细胞的分化显着降低了EAE疾病的严重程度。这些结果都提示了Th17细胞中转录因子SOX-5介导增强子RORCE2与RORγt基因启动子相互作用对Th17细胞的分化至关重要。3.Th17细胞中SOX-5与STAT3协同诱导RORCE2的染色质开放。SOX家族转录因子通过与DNA结合可以引起染色质开放从而进行基因的转录调控,但是有研究表明,SOX家族的转录因子结合DNA后,并不能独自的招募染色质重塑复合物导致染色质结构的改变,必须依赖于结合在邻近位置上的伙伴转录因子（Partner TF）协同合作才能招募重塑复合物引起染色质的开放。基于此,我们首先利用WT和SOX-5-BS-/-小鼠,通过Ch IP-q PCR和染色质可接近性检测实验发现,SOX-5-BS缺失后,增强子RORCE2区域染色质开放程度严重下降;通过生物信息学分析发现在SOX-5-BS下游存在转录因子STAT3（signal transducer and activator of transcription 3）的结合位点（STAT3 binding site,STAT3-BS）,多篇研究证实STAT3在Th17细胞的分化中至关重要,这就提示Th17细胞中我们STAT3是潜在的SOX-5的Partner TF;进一步的实验结果显示STAT3可以结合在RORCE2上,而且当SOX-5与RORCE2结合缺失后,STAT3与RORCE2的结合也几乎消失;双荧光素酶报告实验结果表明STAT3-BS的缺失严重影响了RORCE2对RORγt启动子活性的增强作用;Co-IP的结果也证实STAT3与SOX-5之间存在蛋白-蛋白之间的相互作用;此外,我们在Th17细胞中敲低（Knock down,KD）STAT3表达后发现,增强子RORCE2区域的染色质开放程度明显降低。这些结果提示我们Th17细胞中SOX-5与STAT3协同诱导RORγt基因增强子RORCE2染色质开放。综上所述,我们证实了在Th17细胞中RORCE2是RORγt基因新的增强子,它可以在转录水平上增强RORγt基因的表达从而促进Th17的分化,转录因子SOX-5与STAT3协同诱导了增强子RORCE2染色质的开放,并介导了其与RORγt基因启动子的相互作用。这项开创性的研究证实了顺式作用元件在疾病发病机制中的重要意义,该研究不仅进一步丰富了Th17细胞分化的机制,同时也为Th17细胞相关疾病的干预治疗提供潜在线索。
李兆东[4]（2021）在《万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析》文中提出类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性自身免疫性疾病,具有致残率高,治疗周期长,预后差和易复发等特点,常给患者家属和社会带来沉重负担。成纤维样滑膜细胞（rheumatoid arthritis-fibroblast-like synoviocytes,RAFLSs）是关节滑膜组织的重要组成细胞,其过度增殖可促进免疫细胞释放大量促炎因子,从而引发炎症反应,加剧RA病理进程。此外,关节腔内募集的促炎因子也会进一步激活RA-FLSs细胞。因此,抑制RA-FLSs细胞增殖或降低关节内促炎因子水平是治疗RA的一种有效手段。当前,药物治疗仍是RA的主要治疗方式,但由于化学合成药物的治疗不仅费用昂贵,且常伴有副作用,因此人们正积极寻找安全、有效和廉价的药物来治疗RA。近年来,中药以其具有的显着疗效和较少的副作用,在治疗RA方面已受到越来越多的关注。此外,中药可通过多成分、多途径、多靶点的方式参与RA的治疗过程。万通筋骨片是由25味中药组成的复方药,具有“祛风散寒、通络止痛”的功效,主要用于风湿和类风湿性关节炎等骨性疾病。由于其作用机理不明确,从而限制了它在国内外的推广和使用。因此,系统研究万通筋骨片在治疗RA中的作用和机制十分必要。首先,基于胶原诱导性关节炎（collagen-induced rheumatoid arthritis,CIA）大鼠模型,我们研究万通筋骨片对RA的抗炎作用;其次,基于RA-FLSs细胞的生物学活性,我们研究万通筋骨片对RA的抗炎机制;随后,在万通筋骨片抗炎作用的基础上,我们利用高通量测序技术继续挖掘万通筋骨片的抗炎基因靶点;最后,我们利用16S rDNA高通量测序和代谢组学分析研究万通筋骨片对肠道菌群和血清代谢物谱的影响,拟挖掘参与万通筋骨片抗炎作用的靶点微生物群和靶点代谢物。因此,本研究不仅为万通筋骨片在临床上治疗RA提供了实验依据,促进了其推广和应用,而且也为中药治疗RA的机制研究建立了新的思路。第一部分万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎作用首先,为了确定万通筋骨片的安全给药浓度,我们进行了急性毒性实验,血常规检测和肝脾肾功能分析。其次,为了评估CIA大鼠模型的构建效果,我们检测了大鼠的足趾肿胀度,关节内TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子水平,关节的病理结构变化,以及滑膜组织中FLSs特异性标志蛋白（Vimentin）的表达水平。最后,为了研究万通筋骨片对RA的抗炎作用,我们连续灌胃给药14天和28天后,检测了CIA大鼠足趾肿胀度,炎性关节病理结构变化,以及关节腔和关节组织中TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子水平。结果显示:万通筋骨片给药的安全有效浓度可设为150、300和600 mg/kg;CIA大鼠成模率>99.00%。当连续治疗14天时,各组CIA大鼠足趾肿胀度没有明显变化;当连续治疗28天时,300和600 mg/kg组的CIA大鼠足趾肿胀度明显降低。组织病理切片显示,连续给药14天和28天时,各组CIA大鼠的关节病理结构发生不同程度的改善,尤以600 mg/kg连续给药28天的治疗组CIA大鼠,病理结构改善效果最佳。关节腔内促炎因子的水平变化结果显示,在连续给药14天和28天时,各给药浓度均表现出不同程度的抗炎作用,尤以600 mg/kg连续给药28天的抗炎效果最佳。关节组织中促炎因子的水平变化结果显示,连续给药14天时,TNF-α和IL-1β促炎因子水平显着降低;连续给药28天时,TNF-α,IL-1β和IL-6促炎因子水平明显下调。这些结果说明,万通筋骨片对RA具有抗炎作用,且呈现一定的时间依赖性和浓度依赖性。第二部分万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎机制基于万通筋骨片的抗炎作用,本研究在细胞水平和动物水平继续研究万通筋骨片的抗炎机制。首先,为了确定万通筋骨片对RA-FLSs细胞增殖的影响,我们观察了RA-FLSs细胞形态变化,并应用乳酸脱氢酶活性测定,Ed U核酸标记以及免疫组化等实验技术检测RA-FLSs细胞数目变化和滑膜组织中Vimentin蛋白表达情况。其次,我们利用蛋白免疫印迹,免疫荧光和免疫组化等技术检测了MEK、p MEK、ERK1/2和p ERK1/2蛋白在RA-FLSs细胞及CIA大鼠滑膜组织中的表达水平。同时,我们还利用ERK1/2质粒转染等相关实验,进一步验证MEK/ERK信号通路在万通筋骨片抗炎过程的作用。最后,为了研究万通筋骨片是否通过诱导滑膜细胞凋亡的方式参与抗炎作用,我们检测了RA-FLSs细胞中caspase-3/9蛋白酶活性,cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的蛋白表达水平,以及CIA大鼠滑膜组织中Bax,Bcl-2,caspase-3和cleaved-caspase-3蛋白表达水平。结果显示:药物处理24 h和48 h后,各组RA-FLSs细胞形态均发生改变,尤以3 mg/ml和4 mg/ml药物浓度处理48 h,细胞形态变化较为明显。药物处理24 h后,各组RA-FLSs细胞数目无明显变化;药物处理48 h后,2 mg/ml、3mg/ml、4 mg/ml给药浓度可以显着抑制RA-FLSs细胞增殖。经药物处理24 h和48 h后,MEK,p MEK,ERK1/2和p ERK1/2蛋白在RA-FLSs细胞中均呈现不同程度的降低趋势,尤以3 mg/ml和4 mg/ml药物浓度处理48 h,各蛋白表达差异最为明显。同时,过表达ERK1/2显着提升RA-FLSs细胞的增殖能力,而过表达ERK1/2的RA-FLSs细胞经3 mg/ml药物浓度处理后,细胞增值能力显着下降。同时,万通筋骨片可以下调MEK,p MEK,ERK1/2和p ERK1/2蛋白在滑膜组织中的表达。此外,药物处理24 h后,4 mg/ml药物浓度显着提高RA-FLSs细胞中caspase-3/9蛋白酶活性;药物处理48 h后,3 mg/ml和4 mg/ml明显上调caspase-3/9蛋白酶活性。我们还发现,药物处理24 h和48 h后,3 mg/ml和4mg/ml药物浓度显着上调cleaved-caspase-3蛋白表达,2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml药物浓度显着上调cleaved-PARP蛋白表达。同时,万通筋骨片可以上调滑膜组织中Bax和cleaved-caspase-3蛋白表达以及下调Bcl-2和caspase-3蛋白表达。这些结果表明,万通筋骨片通过抑制RA-FLSs细胞增殖及诱导RA-FLSs细胞凋亡参与抗炎过程。第三部分基于RNA高通量测序挖掘万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎靶点基于万通筋骨片对RA-FLSs细胞的影响,本研究针对药物处理后的RA-FLSs细胞进行RNA高通量测序分析。为了更加全面、准确的获得抗炎靶点,我们采用两种不同的分析方法进行筛选,即DESeq2差异分析以及STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析。DESeq2差异分析:通过DESeq2差异分析,拟筛选不同组别间的差异基因;针对这些差异基因,我们随后进行功能富集过滤和蛋白互作（protein-protein interaction,PPI）网络分析,并根据PPI网络中节点连接度筛选备用核心基因。STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析:基于药物处理组和未处理组之间的差异基因,我们拟筛选与时间序列具有相同表达趋势的基因。针对这些基因,我们进一步筛选具有相同表达模式的差异基因。随后通过功能富集过滤,权重共表达网络分析,PPI网络分析,以及节点连接度来筛选备用核心基因。最后,我们利用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹验证备用核心基因的表达模式,以便获得理想的抗炎靶点。结果显示:通过DESeq2差异分析,在不同比较组间,我们共获得184个差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,且这些基因与细胞周期和同源重组等代谢通路密切相关。同时,基于PPI蛋白网络,我们共筛选出4个备选核心基因,即BRCA1,ATR,SMC3和BUB1。通过STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析,我们共获得111个具有相同表达趋势和表达模式的DEGs,且这些基因显着富集于细胞周期和RNA转运等代谢通路。同时,基于WGCNA和PPI网络,我们共筛选出6个备选核心基因,即PNN,SMC3,EIF3A,BUB1,ATR和ORC4。此外,TTK,STAG2和THOC1也与细胞周期密切相关,因此TTK,STAG2和THOC1也作为备选核心基因。至此,共获得10个备选核心基因,即:BRCA1、ORC4、TTK、BUB1、SMC3、ATR、PNN、EIF3A、STAG2和THOC1。基因和蛋白验证结果显示,只有SMC3和BUB1的表达模式与测序结果一致。这些结果表明,SMC3和BUB1可能是万通筋骨片在RA中的抗炎靶点。第四部分基于16S高通量测序和代谢组学联合分析挖掘万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎靶点基于万通筋骨片对CIA大鼠的抗炎作用,本研究针对CIA大鼠粪便样本和血清样本,分别进行16S高通量测序分析和代谢组学分析,拟挖掘万通筋骨片抗炎作用的肠道菌群靶点和代谢物靶点。16S高通量测序分析:基于操作单元聚类和物种多样性分析,我们拟研究万通筋骨片对肠道菌群结构的影响;基于肠道菌群差异分析,我们拟筛选相对丰度较高的差异菌群。代谢组学分析:基于样本相关性和多元统计分析,我们拟研究万通筋骨片对血清代谢物谱的影响;基于差异代谢物筛选,功能富集过滤和差异代谢物表达分析,我们拟筛选理想的差异代谢物。16S高通量测序与代谢组学联合分析:基于top10差异肠道菌属和top20差异代谢物,我们进行联合分析,拟研究肠道微生物群与血清代谢物的关系,并验证或筛选肠道菌群靶点和代谢物靶点。结果显示:通过16S高通量测序分析,我们发现万通筋骨片可以明显改变CIA大鼠的肠道菌群结构。在门水平上,拟杆菌、软壁菌和脱铁杆菌的菌群相对丰度得到显着改善。此外,拟杆菌与厚壁菌的菌群相对丰度比值（Bacteroidetes/Firmicutes）也恢复到正常水平。在属水平上,弧菌、巨型球菌和漫游球菌的菌群相对丰度下调至正常水平。通过代谢组学分析,我们发现万通筋骨片可以明显改变CIA大鼠的血清代谢物谱。其中,血清素、二硫化谷胱甘肽、N-乙酰神经氨酸、萘和血栓素B2等5种代谢物均有标准化的趋势,但不具有统计学差异。通过16S高通量测序与代谢组学联合分析,我们发现,弧菌、巨型球菌和漫游球菌都存在于top10差异肠道菌群范围内,且与这3种微生物群存在显着联系的代谢物包括5种。此外,考虑到代谢物鉴定过程中的假阳性,我们认为:在这5种代谢物中,只有微管素B是内源性代谢物。这些结果表明,万通筋骨片可能通过调节肠道菌群结构和血清代谢物谱发挥抗炎作用,且弧菌、巨型球菌和漫游球菌可能是万通筋骨片的抗炎靶点菌群;微管素B可能是万通筋骨片的抗炎靶点代谢物。
张洪亮[5]（2021）在《伪狂犬病病毒的基因工程疫苗构建及其感染PK-15细胞的转录组和蛋白质组学分析》文中研究指明伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）,是一种可感染猪、牛、羊等家畜,犬猫等宠物,家兔、狐、貉、水貂等毛皮动物和野生动物,以引起发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎等主要临床症状的疱疹病毒。该病毒可感染各年龄段的猪群,主要造成种猪繁殖障碍、仔猪发生神经系统和呼吸道症状。自2011年PRV变异株出现以来,导致Bartha-K61等传统疫苗的保护力有所降低,我国多个地区已免疫PRV疫苗的猪场发生伪狂犬病疫情,严重威胁了我国生猪养殖业的健康可持续发展。因此,本研究开展了PRV变异株的病原学、快速鉴别诊断技术、新型基因工程疫苗、转录组和蛋白质组学的研究,为该病有效防控奠定技术和理论基础。取得的主要研究成果有:1.本研究对山东某Bartha-K61疫苗免疫猪场感染的PRV野毒株进行了分离鉴定,成功分离鉴定到PRV SD-2017株,并完成了生物学特性分析。基于g E、TK和g B等毒力基因的遗传进化分析,确定该毒株为我国当前流行的PRV变异毒株。透射电镜观察病毒粒子直径大约在140～180 nm,有厚囊膜,囊膜表面有放射状纤突,粒子核心致密,呈现出疱疹病毒典型的病毒粒子形态结构。该毒株在PK-15细胞上的病毒滴度可达到109.0TCID50/m L,对家兔的半数致死量(LD50)为3.2×102.0TCID50/m L。2.针对PRV疫苗株与野毒株的鉴别诊断,筛选到特异性引物和探针,成功建立了PRV g B和g E基因的酶促重组等温扩增（ERA）荧光检测方法。g B和g E基因的ERA检测方法的敏感性分别为10copies/μL、103copies/μL,与荧光定量PCR方法比对,g B和g E基因检测结果符合率分别为100%和92.31%。该方法在38℃恒温反应25 min,能够实现对PRV g B和g E基因的特异性鉴别检测,将反应体系进行预冻干后,可组装成检测试剂盒进行现场应用,可有效应用于PRV野毒和疫苗毒的临床快速诊断。3.以PRV变异毒株SD-2017株作为亲本毒株,利用同源重组技术对g E/g I/TK毒力基因进行了缺失,分别构建了PRV SD-2017Δg E/g I株和SD-2017Δg E/g I/TK-EGFP株,并分析了其一步生长曲线、致病性等生物学特性,基因缺失株的病毒含量在PK-15细胞上仍能达到108.0TCID50/m L,SD-2017Δg E/g I/TK-EGFP株对家兔的LD50>1.0×106.0TCID50/m L,为针对PRV变异株开发基因缺失灭活疫苗和减毒活疫苗提供了理想的候选疫苗种毒。4.将树突状细胞靶向诱导肽DCpep作为分子内佐剂,脑膜炎奈瑟氏球菌Por B蛋白作为疫苗佐剂,分别构建了含有蛋白分泌信号肽gp67的重组杆状病毒Ac-g B-DCpep和Ac-Por B,利用昆虫细胞真核表达系统进行了PRV g B-DCpep蛋白融合表达和Por B蛋白真核表达,基于前期研究构建的PRV毒力基因缺失株,分别制备了PRV SD2017株Δg E/g I/TK三基因缺失活疫苗和Δg E/g I双基因缺失灭活疫苗,与g B-DCpep基因工程亚单位疫苗、Bartha K61活疫苗一同在家兔上进行了对PRV变异株感染的免疫保护效果评价。构建的SD2017Δg E/g I/TK减毒活疫苗、PRV-g B+Por B亚单位疫苗和SD2017Δg E/g I+Por B灭活疫苗,在家兔上显示了对变异株SD-2017良好的免疫保护作用。结果说明DCpep可作为潜在的分子佐剂,Por B蛋白可以作为新型疫苗佐剂,对体液免疫和细胞免疫均具有显着的诱导刺激作用,后续可应用于新型基因工程疫苗的制备,为PRV新型疫苗开发提供了新的策略。5.基于Illumina转录组测序技术对PRV SD-2017株、SD-2017Δg E/g I/TK株、Bartha K61株感染PK-15细胞的转录组差异进行了全面分析,发现差异上调的基因多集中在细胞周期、m TOR信号通路、自噬-动物、PI3K-Akt信号通路、细胞衰老、癌症的途径、胞吞作用、HTLV-I感染、ap1信号通路、MAPK等信号通路。差异下调的基因多集中在有氧化磷酸化、RNA转运、碳代谢、HTLV-I感染、人乳头瘤病毒感染和MAPK等信号通路。差异表达下调的基因富集最多的通路是核糖体、氧化磷酸化RNA转运、m RNA监测途径、卵母细胞减数分裂、内质网中的蛋白质加工、丙酸酯代谢、基因复制、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、生热等信号通路。相关基因的其生物学意义需要进一步研究揭示。6.利用TMT标记定量蛋白质组学技术对PRV SD-2017株、SD-2017Δg E/g I/TK株、Bartha K61株感染PK-15细胞的蛋白质组学差异进行了全面分析,解析了差异蛋白参与不同毒力PRV感染细胞中的生物学过程、分子功能及细胞定位。差异蛋白涉及的主要信号通路有抗原处理和展示、初级胆汁酸合成、醚脂质代谢、矿物质吸收、过氧化物酶体、HTLV-I感染、催产素信号通路、单纯疱疹感染、卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒感染、细胞衰老、趋化因子信号通路、Notch信号通路等。PRV病毒-宿主细胞相互作用的机制值得进一步研究,尤其是蛋白质组差异中涉及的关键基因如何调节PRV感染方面,将有助于更好地了解PRV的特定感染机制。另外,本研究通过PRV感染PK15细胞的转录组和蛋白质组GO功能富集关联性分析发现,两者在细胞部分、细胞、细胞器部分大分子复合物、催化活性、结合、细胞过程、代谢过程等方面的显着差异相关联,为后续深入研究不同PRV毒株的致病机理提供了有利条件。
宋国静[6]（2021）在《基于ROS响应负载地塞米松的纳米颗粒靶向治疗类风湿关节炎的作用及机制研究》文中指出研究背景:类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种免疫介导的炎症性疾病,其以滑膜炎症为主要病理特征,可导致软骨破坏甚至关节功能丧失。研究表明巨噬细胞（Macrophages）和成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like synoviocytes,FLS）是滑膜炎症及软骨破坏的主要细胞,尤其是活化的巨噬细胞通过分泌肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor alpha,TNF-α）、白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）和B细胞激活因子（B-cell activation factor,BAFF）等细胞因子促进炎症进程和组织损伤。而巨噬细胞中非活性菱形蛋白2（inactive rhomboid protein 2,i Rhom2）可促进TNF-α的分泌,同时TNF-α可诱导BAFF的表达。TNF-α和BAFF抑制剂能改善RA的炎症程度,延缓疾病的进展,因此,抑制i Rhom2及其介导TNF-α和BAFF的产生有望缓解RA的炎症进程。地塞米松（Dexamethasone,Dex）具有较强的抗炎、抗风湿和免疫抑制作用,可快速缓解RA患者关节肿胀和疼痛,减少骨侵蚀并降低TNF-α的水平而用于RA的治疗,且Dex可抑制RA巨噬细胞中TNF-α和BAFF的表达。但长期高剂量的Dex治疗会导致全身的毒副作用,如股骨头缺血性坏死、骨质疏松及骨折等。因此,若能将Dex有效地靶向递送至RA巨噬细胞内并减少给药次数和剂量,无疑能有效降低其副作用,从而提高其在RA中的应用。近年研究表明纳米颗粒（Nanoparticles,NPs）能够有效地将药物传递至病变部位,是一种可靠、有效,可应用于临床的策略。而RA巨噬细胞中叶酸受体（Folate receptor,FR）的高表达和活性氧水平（Reactive oxygen species,ROS）的显着升高为NPs的靶向输送提供了有益条件。基于以上分析,本课题制备了叶酸（Folate acid,FA）修饰的ROS响应性材料（Oxi-αCD）,并通过纳米沉淀自组装将Dex包裹并组装成纳米颗粒,探讨其是否能靶向关节炎症部位活化的巨噬细胞以及其在RA治疗中的作用及机制。研究目的:探讨ROS响应负载Dex的NPs对RA的治疗作用及分子机制。研究方法:1.通过化学反应合成ROS响应性材料Oxi-αCD和Cy5标记的Oxi-αCD,并对材料进行核磁共振氢谱表征。2.通过纳米沉淀法制备ROS响应的NPs,并对所制备的NPs进行透射电镜、纳米粒径、纳米颗粒分散性指数、Zeta电位表征以及冻干法检测载药率。3.通过半透膜透析实验检测Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs的体外药物释放和水解机制。4.使用过氧化氢检测试剂盒测定NPs处理活化小鼠巨噬细胞Raw264.7内H2O2的含量。5.通过激光共聚焦检测小鼠巨噬细胞Raw264.7和人成纤维滑膜细胞MH7A对Cy5标记的NPs的摄取情况。6.采用q PCR实验检测MH7A细胞中三种FRs的m RNAs水平,WB实验检测Raw264.7和MH7A细胞中三种FRs的蛋白水平。7.Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs处理活化的Raw264.7细胞后,采用q PCR检测i Rhom2的m RNA表达水平,WB检测i Rhom2、TNF-α和BAFF的蛋白的表达水平。8.采用CCK-8实验检测Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs对Raw264.7细胞的细胞活性。9.通过观察给药治疗后CIA小鼠体重、血常规检测和主要内脏器官的H&E染色,评价Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs的体内生物安全性。10.采用活体成像系统检测Cy5标记的Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs在CIA小鼠体内的关节炎症靶向性和生物学分布。11.通过观察CIA小鼠给药治疗后的足掌厚度、AI指数和直接拍照观察,评价Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs在CIA小鼠的体内抗炎效果。12.通过Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs给药治疗后小鼠足掌关节的micro-CT、H&E和番红O染色,观察给药治疗后CIA小鼠的关节滑膜损伤和软骨侵蚀情况。13.通过ELISA检测CIA小鼠给药治疗后血清中细胞因子TNF-α和BAFF的表达。14.通过WB检测CIA小鼠给药治疗后关节组织蛋白中促炎基因i Rhom2、TNF-α和BAFF的蛋白的表达水平。研究结果:1.成功制备了形态规则、大小均一、200 nm左右的球形纳米颗粒,包括不载药的ROS响应性纳米颗粒（Blank/Oxi-αCD NPs）、负载Dex的ROS响应性纳米颗粒（Dex/Oxi-αCD NPs）、FA修饰的负载Dex的ROS响应性纳米颗粒（Dex/FA-Oxi-αCD NPs）以及Cy5标记的Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs。2.半透膜透析实验表明Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs在H2O2溶液中加速降解,且其可显着降低活化Raw264.7细胞内H2O2的含量。3.FRβ在Raw264.7细胞中的表达明显高于MH7A细胞,激光共聚焦检测证实Raw264.7细胞以时间依赖的方式有效摄取Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs,且摄取Dex/FA-Oxi-αCD NPs能力更强,而MH7A细胞对NPs的摄取能力明显弱于Raw264.7细胞。4.Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs以剂量依赖的方式显着抑制活化Raw264.7细胞中i Rhom2 RNA的表达以及i Rhom2、TNF-α和BAFF蛋白的表达,但不同浓度的Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs对Raw264.7细胞活性无明显影响。5.Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs在CIA小鼠中具有良好的生物安全性,Dex/FA-Oxi-αCD NPs积聚在CIA小鼠关节炎症部位能力最强且持续时间更久。6.Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs治疗后明显减轻CIA小鼠关节的滑膜炎症和软骨侵蚀,且Dex/FA-Oxi-αCD NPs治疗效果更佳。7.Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs治疗CIA小鼠后显着降低血清TNF-α和BAFF水平,且抑制CIA小鼠关节中i Rhom2、TNF-α和BAFF蛋白的表达,Dex/FA-Oxi-αCD NPs的抑制效果更显着。结论:1.成功制备了负载Dex的ROS响应纳米颗粒（Dex/Oxi-αCD NPs）、FA修饰的负载Dex的ROS响应纳米颗粒（Dex/FA-Oxi-αCD NPs）以及Cy5标记的Dex/Oxi-αCD NPs和Dex/FA-Oxi-αCD NPs。2.Dex/FA-Oxi-αCD NPs能主动靶向活化Raw264.7细胞中的FRs而被摄取,并能够有效地清除活化Raw264.7细胞内升高的H2O2,使NPs的球形结构崩塌释放Dex,释放的Dex通过抑制i Rhom2、TNF-α和BAFF的表达而抗炎。3.CIA小鼠体内实验证明Dex/FA-Oxi-αCD NPs具有良好的体内安全性和主动靶向性,可通过主动靶向到达炎症关节部位,并通过抑制i Rhom2/TNF-α/BAFF信号通路缓解CIA小鼠关节的滑膜损伤和软骨侵蚀,发挥抗炎作用。表明Dex/FA-Oxi-αCD NPs可作为RA治疗的新型候选策略。
冯科[7]（2021）在《D-Nap-GFFY水凝胶增强LXR配体抗肿瘤作用的研究》文中进行了进一步梳理背景和目标:肺癌是在全球范围内发病率和死亡率最高的癌症,肺腺癌是肺癌最常见的类型。尽管近年在研究和治疗中取得了巨大进步,但是治疗效果仍有待提高。研究表明,肝X受体（liver X receptor,LXR）被其配体T0901317（T317）激活后,能促进干扰素γ（interferonγ,IFNγ）表达,发挥抗肿瘤作用。然而,LXR同时激活脂质合成基因表达,导致肝脏脂质过度合成和积累,造成脂肪肝及高甘油三酯血症,这些严重副作用限制了LXR激动剂的临床应用。D-Nap-GFFY水凝胶是萘乙酸修饰的D构型氨基酸组成的多肽,能被树突细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞（antigen presenting cell,APC）特异性吞噬,增强免疫反应,具有作为药物载体的优势和潜力。在此项研究中,我们采用D-Nap-GFFY包裹法构建T317的载药系统（D-Nap-GFFY-T317）,通过小鼠皮下注射方式给药,探究D-Nap-GFFY-T317抑制肺腺癌的作用和机制,以及该载药系统能否避免肝脏脂质积累等副作用。方法:用PBS配制D-Nap-GFFY形成水凝胶后,探究D-Nap-GFFY的物理性质,评估D-Nap-GFFY-T317在体内和体外条件下降解和T317释放水平;选用C57BL/6J背景的野生型和IFNγ敲除小鼠,分别以皮下注射小鼠肺腺癌肿瘤细胞LLC1的方式构建移植瘤模型,或者腹腔注射乌拉坦的诱导方式构建原位肺癌模型;分别给予各模型小鼠口服给药T317、皮下注射D-Nap-GFFY-T317的治疗,探究皮下注射D-Nap-GFFY-T317的治疗方式对肿瘤生长以及肝脏脂质合成的影响。结果:D-Nap-GFFY-T317能形成稳定胶体,T317均匀地分散在胶体中。T317的释放依赖于细胞内蛋白酶对D-Nap-GFFY的降解。皮下注射D-Nap-GFFY-T317后,小鼠血液中T317维持较低水平。在肺癌模型小鼠中,与口服T317相比,皮下注射D-Nap-GFFY-T317具有更好的抗癌效果。机制上,D-Nap-GFFY-T317能够激活APC、表达IFNγ,并且以IFNγ依赖的方式增加肿瘤中M1型巨噬细胞数量,减少M2型巨噬细胞数量。此外,D-Nap-GFFY-T317促进树突细胞的成熟和浸润;增加肿瘤中CD3+CD8+T细胞的数量;以依赖IFNγ的方式抑制肿瘤中血管的生成。与口服T317相比,皮下注射D-Nap-GFFY-T317抑制肝脏中脂质合成基因的过度表达,从而消除了T317引起的脂肪肝、高甘油三酯血症等副作用。机制上确认D-Nap-GFFY-T317可被巨噬细胞通过SR-A受体特异性吞噬,从而避免激活肝细胞内LXR。结论:皮下注射D-Nap-GFFY-T317能够特异性地被DC和巨噬细胞吞噬,激活IFNγ表达,抑制肺腺癌发生发展,同时对肝脏没有副作用。这表明水凝胶D-Nap-GFFY包裹T317的新型载药系统有望成为治疗肿瘤的新策略。
李倩琴[8]（2021）在《IL-37通过Notch1和NF-κB途径抑制M1巨噬细胞极化而延缓主动脉瓣钙化》文中认为第一部分IL-37通过抑制Notch1和核因子κ B途径抑制M1巨噬细胞极化研究背景巨噬细胞Ml和M2极化失衡在主动脉瓣钙化中起重要作用,M1极化在主动脉瓣钙化（Calcific aortic valve desease,CAVD）过程中起重要作用。研究表明重组白细胞介素37（Interleukin 37,IL-37）可能参与调节免疫细胞分化和减轻炎症的功能,本研究旨在明确IL-37对M1极化的特异性调节作用,并探讨其可能的机制。方法常规方法培养人急性单核白血病细胞（THP-1细胞）,把干预药物加入细胞培养液,收集细胞培养上清液,用ELISA试剂盒（R&D系统）检测IL-6、IL-10和MCP-1的表达。正常主动脉瓣叶取自6例接受心脏移植的男性患者,狭窄瓣膜取自6例接受主动脉瓣置换术的男性患者,标本切成5μm厚的切片染色后进行组织学分析。免疫印迹法检测iNOS,CD11c,CD206,IL-6,MCP-1,NICD1,磷酸化和总NF-κ B表达。结果与正常瓣膜相比,钙化主动脉瓣中M1巨噬细胞积聚较多,而IL-37表达较少,提示IL-37与M1极化呈负相关。我们证明了较低的IL-37水平能引起更多的M1巨噬细胞浸润到钙化的主动脉瓣中。佛波酯可诱导THP-1细胞分化为静息巨噬细胞经,脂多糖和干扰素γ处理后THP-1细胞可分化为M1巨噬细胞。重组人IL-37可降低M1中iNOS、CD11c、IL-6和MCP-1的表达,增强M2巨噬细胞中CD206和IL-10的表达。IL-37抑制M1巨噬细胞极化与抑制核因子κB（NF-κB）和Notch1信号通路有关。这些结果表明,IL-37通过抑制Notch1和核因子κB途径,抑制巨噬细胞极化为M1型。结论IL-37可以通过调节M1巨噬细胞极化及其协调的炎症,成为治疗进行性CAVD的潜在候选药物。第二部分 心脏手术患者术后白介素37水平与围术期各因素相关性分析研究背景血浆中IL-37在心脏外科术后患者中的水平尚未有相关的研究。本研究的目的是监测心脏外科术后患者血浆IL-37水平,并评价其与临床相关因素和生化实验室指标的相互关系。方法收集心脏的术后IL-37水平以及术前、围术期各个临床指标及生化检验结果,分析心脏术后IL-37水平与各个因素的相关性。结果纳入患者193例,与IL-37有相关性的连续性变量包括患者体表面积（p=0.000,r值=0.980）,术后血小板计数（p=0.034,r值=0.152）,术前血肌酐（p=0.000,r值=0.294）,术后第一天、第二天、第三天血肌酐,分别为（p=0.000,r 值=0.390）、（p=0.000,r 值=0.327）、（p=0.000,r 值=0.305）,BMI（p=0.002,r值=-0.225）,心胸比（p=0.003,r 值=0.215）,术后 EF（p=0.008,r 值=-0.191）,术后 WBC（p=0.015,r 值=0.175）,术前 CysC（p=0.000,r 值 0.257）,术后前三天 CysC（p=0.000,r值=0.503）、CysC（p=0.000,r值=0.478）、CysC（p=0.000,r值=0.221）。对于离散资料等级数据,有显着性差异的结果与IL-37相关性包括患者的BMI（F=3.11,p=0.028）,BMI与IL-37水平呈负相关。术前合并慢性肾功能不全的患者IL-37水平升高（F=16.36,p=0.000）;术后使用新活素的患者IL-37水平升高（p=0.008）;术后的EF值与IL-37水平呈负相关（p=0.040）;术中或术后的输注红细胞的患者IL-37水平升高（p=0.008）;术后第一天WBC与IL-37水平呈正相关（F=3.494,p=0.032）;机械通气时间与IL-37水平呈正相关（p=0.015）,住院天数与IL-37水平呈正相关（p=0.014）;术后肌酐清除率与IL-37水平呈负相关（F=33.56,p=0.028）。结论IL-37的水平与心脏患者心功能情况、心脏术后机械通气时间及住院天数的、心脏患者术后肾功能不全的具有相关性。
杨爽[9]（2021）在《YAP1通过PRD和TAD片段来抑制炎症反应》文中研究指明背景:类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）是一种慢性,全身性的自身免疫疾病,主要累及各个关节。它由对抗自身抗体的适应性免疫反应造成,导致炎性因子和自身抗体的过度产生,主要由自体反应的CD4+T cells和病理性B细胞介导。在RA的病程发展过程中,TNFα起着至关重要的作用,它可以激活下游的NFKB,从而介导产生大量的炎性因子,加重炎症反应。因此目前的治疗方法都集中在如何中和TNFα的活性,并且疗效显着,但是仍有部分患者对于TNFα抑制剂并不敏感,且TNFα抑制剂的价格昂贵。Hippo信号通路被激活后,MST1/2使其下游的LATS1/2以及MOB1发生磷酸化改变并被活化。LATS1/2会在多个位点上使YAP1/TAZ发生磷酸化,磷酸化后的YAP1/TAZ将无法进入细胞核,最终留在细胞质中或被蛋白酶体系统降解。否则,未磷酸化的YAP1/TAZ将进入到细胞核中,与TEA域DNA结合转录因子（TEAD）结合,实现促进细胞增殖和分化的作用。根据本实验室前期的实验结果,证明了细胞骨架张力通过YAP1抑制TNFα介导的炎症反应。YAP1和Hippo信号通路因其在细胞增殖和机械传感中的作用而广为人知。在这里,我们发现YAP1是一种普遍的负性调节因子,它可以抑制TNFα、IL-1β和LPS诱导的炎症反应。YAP1利用富含脯氨酸结构域（PRD）和反式激活结构域（TAD）的两个小区段直接抑制这些刺激的信号通路。合成后的这两个小区段可以穿透细胞,抑制刺激信号的传递,有望成为脓毒症、自身免疫等多种疾病的潜在治疗药物。目的:探究YAP1中抑制炎症反应的区段方法:1.分别敲低HCT-8细胞的YAP1,TAZ,TEAD,LATS1和LATS2,并给予2ng/ml TNFα刺激过夜,收集细胞上清通过ELISA比较IL8的分泌水平,从而证实Hippo信号通路调控TNFα的炎症反应。并且在人体单核细胞THP-1中给予LPS/IL-1β刺激,探究YAP1对其炎症反应的影响。同时,也对人外周血单个核细胞（PBMCs）给予同样的刺激与检测,以探究YAP1在不同细胞系中的作用。2.为了进一步了解YAP1如何抑制TNFα诱导的炎症反应,我们利用Crispr/Cas9靶向PRD从而敲除YAP1。对HCT-8中的YAP1进行敲除,并给予TNFα/IL-1β刺激,检测IL8分泌情况。接下来我们利用Western-Blot探究敲低/敲除YAP1对TNFα信号通路的影响并利用免疫荧光比较YAP1在敲除组和野生型中产物的胞内定位。随后,我们对YAP1 m RNA的不同克隆型测序并与野生型比较,解释了为何YAP1 KO细胞中会有YAP1的存在。3.我们过表达了重组基因HA-YAP2,它是YAP的9种亚型中的亚型2,随后通过QPCR测定YAP1 KD/KO和YAP2 OE细胞在TNFα刺激下的基因表达水平。接着我们用免疫荧光对比HA-YAP2和内源性YAP1的胞内定位。我们通过WB研究HA-YAP2 OE对TNFα信号通路的影响。此外,我们还研究了YAP2的N-term区域对TNFα诱导的下游信号的影响和它的胞内定位。4.我们在对YAP1不同亚型测序后构建YAP9的过表达基因型,通过q PCR检测TNFα诱导下的基因表达水平。随后合成PRD和TAD肽段,在不使用转染试剂的情况下,让肽段直接渗入细胞,用TNFα刺激,检测IL8的分泌水平,并且在人外周血单个核细胞中进行同样的实验。此外,我们通过流式检测了单个肽段和两种肽段结合,对细胞炎症应答的影响。结果:1.（1）HCT-8细胞系中,TAZ/TEAD KD细胞上清中的IL8浓度升高,对TNFα应答增强,而LATS1/LATS2 KD减弱细胞对TNFα应答（2）在THP-1和PBMCs中,YAP1 KD组细胞上清中IL8浓度均升高,表示对TNFα,LPS和IL-1β的应答增强2.（1）HCT-8细胞被TNFα/IL-1β刺激后,YAP1 KO组细胞上清中IL8浓度比WT组显着升高,表示YAP1 KO细胞对TNFα/IL-1β应答增强（2）WesternBlot结果显示YAP1 KO组依然有YAP1蛋白的出现,表示敲除PRD并未完全阻止YAP1的合成（3）YAP1在KO和WT细胞中的定位没有差别（4）除M5以外,对于其他YAP1 m RNA克隆型,敲除PRD域并不能彻底阻止YAP1生成3.（1）YAP1 KD,KO,和YAP2 OE组均可提高细胞对TNFα的应答,且HA-YAP2的细胞内定位与内源性YAP1相似（2）根据WB结果显示,YAP2 OE增强了TNFα的下游信号（3）YAP2的N-term域也提高了对TNFα的应答,且YAP2 N-term域仅存在于胞质4.测序结果显示,YAP2拥有PRD片段但是缺少TAD片段拥有PRD和TAD的YAP9过表达后抑制了TNFα的应答合成后的PRD和TAD肽段均可以抑制TNFα的应答在不使用转染试剂的情况下,PRD和TAD均可抑制HCT-8和PBMCs对TNFα的应答,且抑制作用呈剂量依赖性同时使用PRD和TAD时,抑制作用更加强烈结论:Hippo信号通路的重要效应分子YAP1是促炎刺激的抑制因子,可以减弱HCT-8和PBMCs细胞对TNFα,LPS和IL-1β的应答,且YAP1对TNFα的抑制作用并不是依赖于其转录活性或核内定位。YAP1中的PRD和TAD片段可以有效抑制TNFα应答,而且它们的抑制作用都具有剂量依赖性。当PRD和TAD肽段联合使用时,对TNFα信号的抑制作用更加强烈。
徐一平[10]（2021）在《B细胞活化因子在胆道闭锁中（BA）的作用及其中和抗体对BA小鼠的治疗作用》文中提出背景及目的:免疫功能紊乱是导致胆道闭锁（BA）肝脏损伤的重要发病机制,其具体机制未完全阐述。本研究初步探讨B细胞活化因子（BAFF）在胆道闭锁患儿中的表达及意义,并在RRV诱导胆道闭锁模型的小鼠中验证BAFF中和性抗体的作用。方法:1.收集2018年3月至2020年6月在我院肝胆外科通过胆道造影诊断为胆道闭锁的52例病例,作为BA组;诊断为胆总管囊肿的25例病例,作为CC组;并回顾性研究其临床资料。采用CBA（cytometric bead array）法测定BAFF在肝脏以及血浆中表达,以及血浆中的IFN-γ,IL-4,IL-17,IFN-β的表达。免疫荧光检测患儿肝脏组织标本中BAFF的表达以及BAFF与CD14,CD68共定位情况。用BAFF刺激分选的BA外周血CD19+B细胞并检测其培养上清Ig G4表达;分选CD19+B细胞与单核细胞共培养,检测共培养上清Ig G4表达水平;分选CD4+T和CD8+T细胞,用重组BAFF蛋白和BR3-FC刺激T细胞,检测IFN-γ的表达水平。2.新出生小鼠通过恒河猴轮状病毒（RRV）诱导建立胆道闭锁模型,将新出生的BALB/C小鼠随机分为三组:Control组:出生12-24h内腹腔肝下缘注射PBS;RRV组:出生12-24h内腹腔肝下缘注射RRV;RRV+anti-BAFF组:出生12-24h内腹腔肝下缘注射RRV,在第1天,第5天,第9天腹腔注射BAFF中和抗体（2mg/kg）。在12天取材分析表型,利用肝脏组织HE染色,评估肝脏汇管区的炎性细胞浸润情况。Masson评估不同组间小鼠的肝脏纤维化水平。实时定量PCR（RT-q PCR）检测不同组之间RRV病毒复制情况（NSP3,VP6）,通过13-plex检测评估肝脏组织,血清炎性细胞因子表达水平变化。利用流式细胞术检测各组小鼠肝脏组织以及脾脏组织中T细胞,B细胞,髓系细胞的各个亚群比例变化。同时分析T细胞IFN-γ,FOXP3,IL-17的表达,B细胞IL-6,IL-10等表达情况。利用ELISA检测小鼠血清中BAFF水平。结果:BA患儿血浆和肝脏组织中BAFF水平较胆总管囊肿（CC）对照组显着增多,（P<0.001,差异具有统计学意义）;并且肝脏组织中BAFF蛋白浓度与淋巴细胞浸润程度（根据淋巴细胞浸润程度分级）成正相关。在BA患者纤维化早期阶段,肝脏组织中BAFF蛋白浓度与纤维化程度成正相关。肝脏组织中BAFF蛋白浓度与淋巴细胞浸润程度评分+纤维化程度评分成正相关。BAFF能促进天然B细胞分泌Ig G4;CD19+B细胞与单核细胞体外共培养实验表明:阻断BAFF能显着降低B细胞Ig G4的表达,免疫荧光染色结果显示,免疫荧光发现BA患儿的肝脏中CD20+,Ig G4+表达较对照组CC显着增多。CD20+B细胞分泌的Ig G4主要沉积在门脉汇管区,提示Ig G4可能参与胆道闭锁疾病的进展。血清BAFF浓度与肝功能γ-GGT显着正相关（P<0.001,差异具有统计学意义）。BA患儿血清BAFF与血清IFN-γ显着正相关,而与IL-4,IL17无显着相关性。另外体外刺激实验表明,BAFF可直接刺激CD4+T细胞以及CD8+T细胞分泌IFN-γ。胆道闭锁模型小鼠中,1)Control组小鼠毛发旺盛,无发育迟缓,无黄疸,胆汁淤积等症状。RRV组小鼠均出现黄疸,毛发稀疏,体重减低等胆道闭锁症状,RRV+anti-BAFF治疗组中胆道闭锁发生率降低,表现为体重增长率增加,黄疸出现时间推迟,黄疸减轻。2)RRV组的肝脏外观黄染,表面颗粒状,伴坏死灶,胆囊显示不清,HE染色显示肝脏汇管区有大量的淋巴细胞浸润,大面积坏死灶,肝内胆管闭锁。Masson染色提示汇管区大量纤维化形成,RRV+anti-BAFF组肝脏外观无明显黄染及坏死灶,HE染色显示门脉汇管区的淋巴细胞浸润以及纤维化程度有所减少。3)RRV+anti-BAFF组血浆BAFF表达较RRV组和对照组显着降低。RRV+anti-BAFF组中脾脏B细胞（B220+）较RRV组显着降低,且B1-a（CD43+CD5+）,成熟B细胞(Ig DhiIg M+/-),滤泡B细胞(CD23hiCD21-),边缘区B细胞(CD23+/-CD21hi)显着降低。有趣的是,RRV组中IL-6+B效应细胞（占CD19细胞比例）较对照组明显增多,但RRV小鼠腹腔注射中和BAFF抗体后IL-6+B效应细胞的比例显着下调。同时RRV+anti-BAFF较RRV组相比较,IL-10表达明显上调,提示Breg（调节性B细胞）增多。4)RRV+anti-BAFF组小鼠的肝脏组织和脾脏组织中的CD4+T细胞和CD8+T细胞分泌的IFN-γ较RRV组显着减少。RRV组中Treg（CD4+CD25+Foxp3+）细胞与对照组相比较显着降低,然而RRV+anti-BAFF组中的Treg细胞比例显着上调。5)阻断BAFF后肝脏组织中Kuppfer（F4/80+CD11b+）细胞比例以及吞噬E-coil（大肠杆菌）病原体能力与RRV小鼠相比显着改善。6)注射中和性BAFF抗体后炎症相关因子水平（TNF-α,MCP-1,IL-6,IL-12p70,IFN-β）较RRV组显着下调。结论:1.BA患儿中血清和肝脏BAFF表达较对照组显着上调,且肝脏的BAFF表达水平与肝脏炎症程度分级正相关性,在纤维化早期随着BAFF水平升高其纤维化程度增加,BAFF对BA疾病的诊断以及预后有重要参考价值。2.BAFF可能通过促进B细胞分泌大量Ig G4沉积在门脉汇管区介导BA。3.BAFF与IFN-γ水平呈正比,且体外实验证明BAFF能促进T细胞分泌IFN-γ,提示BAFF通过调节T细胞功能对肝脏造成损伤。4.在胆道闭锁小鼠模型中阻断BAFF抑制分泌IL-6的效应B细胞,促进分泌IL-10的调节B细胞,还可以显着降低T细胞分泌细胞毒性细胞因子IFN-γ,上调Treg细胞比例。此外,anti-BAFF改善肝脏Kuffer细胞比例以及病原体的吞噬功能。5.阻断BAFF在胆道闭锁模型中能显着改善黄疸,以及肝脏炎症纤维化水平。为胆道闭锁形成的机制以及潜在的治疗靶点提供了免疫学的实验基础。
二、B细胞激活因子水平ELISA检测方法的建立及临床初评（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、B细胞激活因子水平ELISA检测方法的建立及临床初评（论文提纲范文）
（1）TAZ活化强直性脊柱炎Th17细胞及雷公藤甲素干预机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 强直性脊柱炎免疫学发病机制研究进展 |
| 1. 固有免疫在强直性脊柱炎发病中的作用 |
| 2. 适应性免疫在强直性脊柱炎发病中的作用 |
| 3. 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 Th17细胞分化调控机制及其在脊柱关节病中的研究进展 |
| 1. Th17生物学特征 |
| 2. Th17细胞功能的二分性 |
| 3. 调控Th17致病性的因素 |
| 4. Th17细胞与脊柱关节病 |
| 5. 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 网络药理学研究 基于网络药理学探讨雷公藤治疗强直性脊柱炎分子机制 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 前言 |
| 研究一 AS患者Th17分化状况及TAZ表达情况的研究 |
| 1. 资料与方法 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 研究二 雷公藤甲素对活动期AS患者TAZ表达及RORγt的干预作用 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 论文总结 |
| 1. 研究小结 |
| 2. 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）青蒿素衍生物和BTK抑制剂治疗自身免疫性疾病的作用机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 自身免疫性疾病概述 |
| 1.2 系统性红斑狼疮 |
| 1.2.1 系统性红斑狼疮概述 |
| 1.2.2 B细胞异常在系统性红斑狼疮中的致病机制 |
| 1.2.3 系统性红斑狼疮治疗策略 |
| 1.3 类风湿性关节炎 |
| 1.3.1 类风湿性关节炎概述 |
| 1.3.2 类风湿性关节炎致病机理 |
| 1.3.3 类风湿性关节炎疾病动物模型 |
| 1.3.4 类风湿性关节炎治疗策略 |
| 1.4 科学问题与研究意义 |
| 第二章 青蒿素衍生物SM934 调控ABCs细胞分化及代谢状态治疗SLE的作用机制探究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 药物及试剂 |
| 2.2.2 仪器及耗材 |
| 2.2.3 试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验动物 |
| 2.3.2 小鼠分组及给药 |
| 2.3.3 小鼠脾脏淋巴细胞制备 |
| 2.3.4 血生化指标检测 |
| 2.3.5 肾脏浸润单核细胞(kidney mononuclear cells,KMNCs)制备 |
| 2.3.6 细胞分选 |
| 2.3.7 Seahorse XF96 线粒体压力细胞代谢测试实验 |
| 2.3.8 流式细胞术 |
| 2.3.9 血清抗自身抗体测定 |
| 2.3.10 蛋白尿检测 |
| 2.3.11 荧光实时定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR) |
| 2.3.12 组织免疫荧光 |
| 2.3.13 TLR激动剂诱导B细胞反应 |
| 2.3.14 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 MRL/lpr小鼠脾脏中ABCs增加并与疾病活动性相关 |
| 2.4.2 SM934 治疗抑制脾脏中ABCs的同时改善MRL/lpr小鼠疾病指征 |
| 2.4.3 SM934 治疗改善MRL/lpr小鼠脾脏中B细胞分化异常 |
| 2.4.4 SM934 治疗改善MRL/lpr小鼠脾脏B细胞代谢异常 |
| 2.4.5 MRL/lpr小鼠肾脏中ABCs浸润随周龄增大而增多 |
| 2.4.6 SM934 治疗抑制MRL/lpr小鼠肾脏中ABCs细胞浸润 |
| 2.4.7 SM934 抑制TLR受体激活影响的B细胞代谢 |
| 2.5 总结与讨论 |
| 第三章 青蒿素衍生物SM934对Pristane诱导的类风湿性关节炎治疗作用及机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 药物及试剂 |
| 3.2.2 仪器及耗材 |
| 3.2.3 试剂配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 实验动物 |
| 3.3.2 PIA模型建立及小鼠分组给药 |
| 3.3.3 小鼠关节临床评分 |
| 3.3.4 血清抗体检测 |
| 3.3.5 微计算机断层扫描(micro computed tomography,Micro-CT) |
| 3.3.6 组织病理学分析 |
| 3.3.7 甲苯胺蓝染色 |
| 3.3.8 液相悬浮系统检测血清及结关节组织匀浆中细胞因子水平 |
| 3.3.9 细胞培养 |
| 3.3.10 BMDM提取及分化 |
| 3.3.11 SM934 对巨噬细胞向M1 型极化的影响 |
| 3.3.12 SM934 对巨噬细胞向M2 型极化的影响 |
| 3.3.13 细胞免疫荧光 |
| 3.3.14 荧光实时定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR) |
| 3.3.15 蛋白免疫印迹(Western Blot) |
| 3.3.16 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 SM934 治疗改善PIA发病严重程度及关节病变 |
| 3.4.2 SM934 治疗降低PIA小鼠血清自身抗体水平 |
| 3.4.3 SM934 治疗降低PIA小鼠脾脏炎性细胞浸润 |
| 3.4.4 SM934 治疗体内调控巨噬细胞极化 |
| 3.4.5 SM934 治疗体外调控巨噬细胞极化 |
| 3.4.6 SM934 影响Stat1和Stat6 的磷酸化调节巨噬细胞极化 |
| 3.5 总结与讨论 |
| 第四章 新型三环类BTK抑制剂SOMCL-17-016 抗类风湿性关节炎药效学及机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 药物及试剂 |
| 4.2.2 仪器及耗材 |
| 4.2.3 试剂配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 实验动物 |
| 4.3.2 小鼠脾脏淋巴细胞制备 |
| 4.3.3 小鼠脾脏淋巴细胞和RAW264.7 细胞毒性实验 |
| 4.3.4 丝裂原(Con A和 LPS)诱导的小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应 |
| 4.3.5 OVA诱导的抗原特异性免疫反应 |
| 4.3.6 小鼠CIA模型建立 |
| 4.3.7 CIA小鼠分组及给药 |
| 4.3.8 OVA小鼠血清抗OVA特异性抗体检测 |
| 4.3.9 CIA小鼠临床评分标准 |
| 4.3.10 组织病理学分析 |
| 4.3.11 Micro-CT |
| 4.3.12 免疫组织化学检测 |
| 4.3.13 CIA小鼠血清抗CⅡ特异性抗体检测 |
| 4.3.14 液相悬浮系统检测血清及结关节组织匀浆中细胞因子水平 |
| 4.3.15 荧光实时定量反转录聚合酶链式反应(q RT-PCR) |
| 4.3.16 细胞培养 |
| 4.3.17 组织免疫荧光 |
| 4.3.18 人血细胞沉渣PBMC分离 |
| 4.3.19 PBMC体外刺激体系 |
| 4.3.20 破骨细胞分化 |
| 4.3.21 TRAP染色 |
| 4.3.22 蛋白免疫印迹(Western Blot) |
| 4.3.23 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 SOMCL-17-016 体外免疫抑制活性 |
| 4.4.2 SOMCL-17-016 抑制卵清蛋白(OVA)特异性的免疫细胞反应 |
| 4.4.3 SOMCL-17-016 改善CIA小鼠临床评分及骨侵蚀程度 |
| 4.4.4 SOMCL-17-016 抑制自身反应性B细胞效应及病理因子产生 |
| 4.4.5 SOMCL-17-016 抑制滑膜B细胞产生RANKL及破骨前体细胞分化 |
| 4.5 总结与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（3）Th17细胞中SOX-5介导RORγt基因新的增强子RORCE2与启动子相互作用的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 增强子RORCE2 通过增强RORγt的表达促进Th17 细胞的分化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 SOX-5 介导增强子RORCE2与RORγt启动子的相互作用影响Th17 细胞的分化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 Th17 细胞中SOX-5与STAT3 协同诱导增强子RORCE2 的染色质开放 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Th17 细胞中RORγt转录调控及转录后调控的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（4）万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 类风湿关节炎概述 |
| 1.2 类风湿关节炎发病机制 |
| 1.2.1 触发阶段 |
| 1.2.2 成熟阶段 |
| 1.2.3 靶向阶段 |
| 1.2.4 爆发性阶段 |
| 1.3 类风湿性关节炎现代药物疗法 |
| 1.3.1 传统DMARDs |
| 1.3.2 生物DMARDs |
| 1.3.3 小分子DMARDs |
| 1.4 肠道微生物群与类风湿关节炎 |
| 1.4.1 肠道菌群与免疫调节细胞 |
| 1.4.2 肠道菌群介导炎症性关节炎 |
| 1.4.3 肠道菌群介导类风湿关节炎治疗 |
| 1.4.4 益生菌 |
| 1.5 中草药对RA-FLSs细胞凋亡的影响及机制 |
| 1.5.1 RA-FLSs细胞凋亡 |
| 1.5.2 死亡受体介导的凋亡途径 |
| 1.5.3 线粒体依赖性凋亡途径 |
| 1.5.4 .NF-κB介导的凋亡途径 |
| 1.5.5 MAPK介导的凋亡途径 |
| 1.5.6 .其他凋亡途径 |
| 1.6 万通筋骨片研究进展 |
| 1.7 技术路线 |
| 第2章 万通筋骨片在类风湿性关节炎中的抗炎作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂与耗材 |
| 2.2.3 实验细胞与实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大鼠急毒实验 |
| 2.3.2 CIA大鼠模型建立 |
| 2.3.3 动物分组与给药 |
| 2.3.4 酶联免疫吸附试验 |
| 2.3.5 HE染色 |
| 2.3.6 免疫组化分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 万通筋骨片安全给药浓度 |
| 2.4.2 CIA大鼠模型 |
| 2.4.3 万通筋骨片对RA具有抗炎作用 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 万通筋骨片在类风湿性关节炎中的抗炎机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂与耗材 |
| 3.2.3 实验细胞与实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 万通筋骨片溶液配制 |
| 3.3.2 RA-FLSs细胞培养 |
| 3.3.3 细胞形态观察 |
| 3.3.4 RA-FLSs细胞增殖检测 |
| 3.3.5 蛋白免疫印迹分析 |
| 3.3.6 实时荧光定量PCR分析 |
| 3.3.7 细胞免疫荧光 |
| 3.3.8 质粒转染 |
| 3.3.9 Caspase-3/9蛋白酶活性检测 |
| 3.3.10 免疫组化分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 万通筋骨片乙醇提取物对RA-FLSs细胞的影响 |
| 3.4.2 MEK/ERK信号通路介导万通筋骨片的抗炎作用 |
| 3.4.3 万通筋骨片乙醇提取物促进RA-FLSs细胞凋亡 |
| 3.4.4 线粒体依赖性凋亡途径介导万通筋骨片的抗炎作用 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 基于RNA高通量测序挖掘万通筋骨片对RA的抗炎靶点 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验试剂与耗材 |
| 4.2.3 实验分析软件 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 RA-FLSs细胞培养与分组 |
| 4.3.2 样品收集和准备 |
| 4.3.3 数据分析 |
| 4.3.4 实时荧光定量PCR |
| 4.3.5 蛋白免疫印迹 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 DESeq2差异分析 |
| 4.4.2 差异基因功能注释分析 |
| 4.4.3 KEGG富集通路提取及蛋白互作网络分析 |
| 4.4.4 STEM时间聚类分析 |
| 4.4.5 权重共表达网络分析及功能富集分析 |
| 4.4.6 基因共表达网络分析及蛋白互作网络分析 |
| 4.4.7 核心基因筛选与验证 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 基于16S高通量测序和代谢组学联合分析挖掘万通筋骨片对RA的抗炎靶点 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验分析软件 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 16S rDNA扩增子测序 |
| 5.3.2 16S rDNA扩增子信息分析 |
| 5.3.3 代谢物提取 |
| 5.3.4 色谱条件 |
| 5.3.5 质谱条件 |
| 5.3.6 代谢物鉴定 |
| 5.3.7 肠道菌群与代谢物联合分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 万通筋骨片改变CIA大鼠肠道菌群结构 |
| 5.4.2 万通筋骨片作用特定肠道菌群 |
| 5.4.3 万通筋骨片改变CIA大鼠血清代谢物谱 |
| 5.4.4 差异代谢物筛选 |
| 5.4.5 靶点代谢物筛选 |
| 5.4.6 16S rDNA高通量测序与代谢物组学联合分析 |
| 5.5 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 附表 |
（5）伪狂犬病病毒的基因工程疫苗构建及其感染PK-15细胞的转录组和蛋白质组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 伪狂犬病病毒概述 |
| 1.2 病原学研究 |
| 1.2.1 分子结构 |
| 1.2.2 基因组特征 |
| 1.2.3 主要蛋白功能 |
| 1.2.4 遗传变异分析 |
| 1.3 诊断技术研究 |
| 1.3.1 病原学诊断 |
| 1.3.2 血清学诊断 |
| 1.4 新型疫苗研究 |
| 1.4.1 基因缺失疫苗 |
| 1.4.2 重组载体疫苗 |
| 1.4.3 亚单位疫苗 |
| 1.4.4 核酸疫苗 |
| 1.5 生物信息学研究 |
| 1.6 本研究的目的意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 猪源PRV SD-2017 株的分离鉴定及其遗传变异分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验仪器 |
| 2.1.3 试验方法 |
| 2.1.3.1 细胞培养 |
| 2.1.3.2 引物设计与合成 |
| 2.1.3.3 基因组DNA提取及目的基因扩增 |
| 2.1.3.4 病毒分离培养 |
| 2.1.3.5 病毒传代纯化 |
| 2.1.3.6 病毒形态观察 |
| 2.1.3.7 病毒滴度测定 |
| 2.1.3.8 动物感染试验(LD50 测定) |
| 2.1.3.9 主要毒力基因遗传变异分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 目的基因的扩增和克隆 |
| 2.2.2 病毒的分离培养及纯化 |
| 2.2.3 病毒的形态观察 |
| 2.2.4 PRV SD-2017 株病毒滴度的测定 |
| 2.2.5 PRV SD-2017 株家兔感染试验 |
| 2.2.6 PRV SD-2017 株遗传变异分析 |
| 2.2.6.1 gE基因的序列分析 |
| 2.2.6.2 gB基因的序列分析 |
| 2.2.6.3 gC基因的序列分析 |
| 2.2.6.4 gD基因的序列分析 |
| 2.2.6.5 TK基因的序列分析 |
| 2.2.6.6 gI基因的序列分析 |
| 2.2.6.7 gM基因的序列分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 PRV gB和 gE基因酶促重组等温扩增(ERA)检测方法的建立及应用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验仪器 |
| 3.1.3 试验方法 |
| 3.1.3.1 核酸提取 |
| 3.1.3.2 引物和探针设计 |
| 3.1.3.3 PRV gB和 gE基因标准质粒的构建及其鉴定 |
| 3.1.3.4 ERA反应体系的优化 |
| 3.1.3.5 特异性试验 |
| 3.1.3.6 敏感性试验 |
| 3.1.3.7 重复性试验 |
| 3.1.3.8 临床样本检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 PRV gB和 gE基因重组质粒的构建 |
| 3.2.2 ERA反应体系的建立 |
| 3.2.3 特异性试验 |
| 3.2.4 敏感性试验 |
| 3.2.5 重复性试验 |
| 3.2.6 临床样品的检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 PRV SD-2017 基因缺失株的构建及其生物学特性分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验仪器 |
| 4.1.3 试验方法 |
| 4.1.3.1 引物和质粒 |
| 4.1.3.2 gE/gI和 TK转移载体的构建 |
| 4.1.3.3 PRV2017 基因缺失株的构建和纯化 |
| 4.1.3.4 PRV一步生长曲线和噬斑大小测定 |
| 4.1.3.5 动物接种试验(LD50 测定) |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 rPRV SD-2017ΔgE/gI-EGFP的构建与纯化 |
| 4.2.2 rPRV SD-2017ΔgE/gI-EGFP报告基因的敲除 |
| 4.2.3 rPRV SD-2017ΔgE/gI/TK-EGFP的构建和纯化 |
| 4.2.4 rPRV一步生长曲线和噬斑大小测定 |
| 4.2.5 动物接种试验(LD50 测定) |
| 4.2.6 病理组织学观察 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 基于PRV SD-2017 株三种基因工程新型疫苗的构建及其免疫原性研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验仪器 |
| 5.1.3 试验方法 |
| 5.1.3.1 重组蛋白序列的优化与合成 |
| 5.1.3.2 重组杆状病毒穿梭质粒的构建与鉴定 |
| 5.1.3.3 重组杆状病毒的转染和蛋白表达纯化 |
| 5.1.3.4 家兔的疫苗接种和攻毒保护试验 |
| 5.1.3.5 血清PRV特异性抗体测定 |
| 5.1.3.6 血清PRV中和抗体测定 |
| 5.1.3.7 外周血淋巴细胞增殖测定 |
| 5.1.3.8 外周血细胞因子检测 |
| 5.1.3.9 剖检和病理病变观察 |
| 5.1.3.10 统计分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 重组杆状病毒穿梭质粒的构建与鉴定 |
| 5.2.2 重组蛋白PRV gB-DCpep和 PorB的表达和纯化 |
| 5.2.3 PRV疫苗体液免疫反应的测定 |
| 5.2.4 PRV疫苗细胞免疫反应的测定 |
| 5.2.5 PRV疫苗血清中和抗体滴度的测定 |
| 5.2.6 PRV疫苗的攻毒保护试验 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 PRV变异株基因缺失疫苗的构建 |
| 5.3.2 PRV变异株基因工程亚单位疫苗的构建 |
| 5.4 小结 |
| 6 PRV感染引起PK-15 细胞的转录组变化及差异表达基因分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 细胞及毒株 |
| 6.1.2 试剂与耗材 |
| 6.1.3 仪器设备 |
| 6.1.4 主要数据库、网站和软件 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 PRV感染PK-15 细胞 |
| 6.2.2 细胞总RNA的提取 |
| 6.2.3 RNA样本测序 |
| 6.2.3.1 样本检测 |
| 6.2.3.2 文库构建与质检 |
| 6.2.3.3 上机测序 |
| 6.2.4 RNA-Seq数据处理及分析 |
| 6.2.4.1 数据输出与质控 |
| 6.2.4.2 序列比对到参考基因组 |
| 6.2.4.3 新转录本预测 |
| 6.2.4.4 基因表达水平定量 |
| 6.2.4.5 基因表达差异分析 |
| 6.2.4.6 差异基因的GO功能富集及KEGG信号通路分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 PRV毒株感染PK-15 细胞的时间与剂量效应 |
| 6.3.2 RNA-seq测序样本检测结果 |
| 6.3.3 RNA-seq测序数据评估及质控 |
| 6.3.4 PRV感染PK-15 细胞差异表达基因分析 |
| 6.3.4.1 差异基因统计 |
| 6.3.4.2 差异表达基因可视化分析 |
| 6.3.4.3 差异表达基因叠加关系分析 |
| 6.3.4.4 差异表达基因聚类分析 |
| 6.3.5 PRV毒株感染PK-15 细胞差异表达基因富集分析 |
| 6.3.5.1 GO功能富集分析 |
| 6.3.5.2 KEGG通路富集分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 7 伪狂犬病病毒感染引起PK-15 细胞的蛋白质组学变化分析 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试剂与耗材 |
| 7.1.2 仪器设备 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 PRV感染PK-15 细胞 |
| 7.2.2 蛋白质组学分析的细胞样品制备 |
| 7.2.3 细胞总蛋白的提取 |
| 7.2.4 蛋白质检 |
| 7.2.5 TMT标记 |
| 7.2.6 馏分分离 |
| 7.2.7 液质检测 |
| 7.2.8 生物信息学分析 |
| 7.2.9 蛋白质组与转录组的关联性分析 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 提取蛋白质检结果 |
| 7.3.2 数据质控与蛋白鉴定结果 |
| 7.3.2.1 鉴定到的蛋白总体情况 |
| 7.3.2.2 肽段长度分布 |
| 7.3.2.3 母离子质量容差分布 |
| 7.3.2.4 Unique肽段数分布 |
| 7.3.2.5 蛋白覆盖度分布 |
| 7.3.2.6 蛋白分子量分布 |
| 7.3.2.7 蛋白重复性分析 |
| 7.3.3 蛋白差异分析结果 |
| 7.3.3.1 差异蛋白统计 |
| 7.3.3.2 差异蛋白可视化分析 |
| 7.3.4 差异蛋白GO功能注释分析 |
| 7.3.5 差异蛋白KEGG分析 |
| 7.3.6 差异蛋白亚细胞定位分析 |
| 7.3.7 转录组和蛋白组表达调控关联分析 |
| 7.3.8 转录组和蛋白质组表达量关联分析 |
| 7.3.9 转录组和蛋白质组GO功能富集关联分析 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 8 结论 |
| 9 创新点 |
| 10 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）基于ROS响应负载地塞米松的纳米颗粒靶向治疗类风湿关节炎的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 基于活性氧响应的NPs的制备与表征 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 本章小结 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 Dex/Oxi-αCD NPs和 Dex/FA-Oxi-αCD NPs性能及体外生物学作用研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 本章小结 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 Dex/Oxi-αCD NPs和 Dex/FA-Oxi-αCD NPs在 RA动物模型中的抗炎作用及机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 本章小结 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 类风湿关节炎中滑膜巨噬细胞发生发展的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（7）D-Nap-GFFY水凝胶增强LXR配体抗肿瘤作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 第一节 肺腺癌的研究进展 |
| 1.1.1 肺癌的分类 |
| 1.1.2 肺腺癌的发生因素 |
| 1.1.2.1 基因突变、融合导致的肺腺癌 |
| 1.1.2.2 病毒感染导致的肺腺癌 |
| 1.1.3 肺腺癌的检测方式 |
| 1.1.3.1 影像学检测 |
| 1.1.3.2 分子生物学检测 |
| 1.1.4 肺癌的治疗 |
| 1.1.5 小鼠肺癌模型 |
| 1.1.5.1 基因工程鼠肺癌模型 |
| 1.1.5.2 化学成分诱导模型 |
| 1.1.5.3 肺癌细胞系诱导模型 |
| 1.1.5.4 体外模型 |
| 第二节 LXR研究进展 |
| 1.2.1 LXR与脂质代谢 |
| 1.2.1.1 LXR与胆固醇代谢 |
| 1.2.1.2 LXR与脂肪酸代谢 |
| 1.2.2 LXR与免疫系统 |
| 1.2.2.1 LXR与巨噬细胞 |
| 1.2.2.2 LXR与淋巴细胞 |
| 1.2.2.3 LXR与树突细胞 |
| 1.2.3 LXR与肿瘤 |
| 1.2.3.1 LXR与肺癌治疗的研究进展 |
| 1.2.3.2 LXR与其他癌症治疗的研究进展 |
| 第三节 IFNγ研究进展 |
| 1.3.1 IFNs简介 |
| 1.3.2 IFNγ的功能 |
| 1.3.2.1 抗原处理和递呈 |
| 1.3.2.2 抗病毒 |
| 1.3.2.3 激活杀菌效应 |
| 1.3.2.4 抗肿瘤与免疫逃逸 |
| 第四节 免疫细胞与肿瘤的研究进展 |
| 1.4.1 巨噬细胞与肿瘤 |
| 1.4.1.1 巨噬细胞的极化 |
| 1.4.1.2 肿瘤相关巨噬细胞 |
| 1.4.1.3 靶向巨噬细胞的抗肿瘤治疗 |
| 1.4.2 树突细胞 |
| 1.4.2.1 树突细胞参与的抗肿瘤作用 |
| 1.4.2.2 树突细胞抗肿瘤的阻力 |
| 1.4.2.3 通过树突细胞抗肿瘤治疗的方式 |
| 第五节 水凝胶抗肿瘤研究进展 |
| 1.5.1 宏观水凝胶 |
| 1.5.1.1 在局部肿瘤化疗中的应用 |
| 1.5.1.2 在肿瘤免疫治疗中的应用 |
| 1.5.1.3 微针贴片 |
| 1.5.2 微凝胶 |
| 1.5.2.1 口服给药 |
| 1.5.2.2 肺部输送 |
| 1.5.2.3 经动脉栓塞化疗 |
| 1.5.3 纳米凝胶 |
| 第六节 选题依据 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 第一节 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.1.1 细胞株 |
| 2.1.1.2 实验动物 |
| 2.1.1.3 实验耗材 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.2.1 细胞培养相关 |
| 2.1.2.2 药物 |
| 2.1.2.3 抗体 |
| 2.1.2.4 试剂盒 |
| 2.1.2.5 其他试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.3.1 细胞培养相关 |
| 2.1.3.2 免疫印迹和基因克隆相关 |
| 2.1.3.3 其他仪器 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 细胞实验相关 |
| 2.2.1.1 细胞传代 |
| 2.2.1.2 细胞冻存 |
| 2.2.1.3 细胞复苏 |
| 2.2.2 动物实验相关 |
| 2.2.2.1 小鼠喂养 |
| 2.2.2.2 小鼠造模 |
| 2.2.2.3 小鼠组织收集和处理 |
| 2.2.3 小鼠骨髓来源树突细胞的提取和诱导 |
| 2.2.4 夹心ELISA |
| 2.2.5 肝脏脂质提取 |
| 2.2.6 切片制备 |
| 2.2.6.1 石蜡切片 |
| 2.2.6.2 冰冻切片 |
| 2.2.7 免疫组织化学染色(immunohistochemical staining,IHC) |
| 2.2.8 免疫荧光染色(immunofluorescent staining,IF) |
| 2.2.8.1 冰冻切片免疫荧光 |
| 2.2.8.2 石蜡切片免疫荧光 |
| 2.2.9 苏木素伊红染色(hematoxylin and eosin staining,HE) |
| 2.2.10 油红O染色(Oil red O staining,ORO) |
| 2.2.11 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.11.1 蛋白提取 |
| 2.2.11.2 BCA法蛋白浓度定量 |
| 2.2.11.3 凝胶电泳 |
| 2.2.11.4 转膜 |
| 2.2.11.5 杂交 |
| 2.2.11.6 显色曝光 |
| 2.2.11.7 Strip |
| 2.2.12 实时定量荧光PCR |
| 2.2.12.1 细胞总RNA提取 |
| 2.2.12.2 cDNA文库构建 |
| 2.2.12.3 Real-time qPCR |
| 2.2.13 实验相关材料 |
| 2.2.13.1 水凝胶的制备 |
| 2.2.13.2 流变力学检测 |
| 2.2.13.3 核磁 |
| 2.2.13.4 透射电镜 |
| 2.2.13.5 水凝胶的体内外降解 |
| 2.2.13.6 T317 的体内外释放 |
| 2.2.14 流式 |
| 2.2.15 细胞毒性实验 |
| 2.2.16 siRNA |
| 2.2.17 数据统计和分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 第一节 D-Nap-GFFY和 D-Nap-GFFY-T317 的特征分析 |
| 3.1.1 D-Nap-GFFY的核磁分析 |
| 3.1.2 D-Nap-GFFY和 D-Nap-GFFY-T317 制备 |
| 3.1.3 D-Nap-GFFY和 D-Nap-GFFY-T317 的流变力学检测 |
| 3.1.4 D-Nap-GFFY的降解检测 |
| 3.1.5 从D-Nap-GFFY-T317 中释放的T317 检测 |
| 第二节 D-Nap-GFFY-T317对Lewis肺癌移植瘤生长的抑制作用 |
| 3.2.1 D-Nap-GFFY-T317 降低LLC1 细胞的活力 |
| 3.2.2 D-Nap-GFFY-T317 提高荷瘤小鼠生存率 |
| 3.2.3 皮下注射D-Nap-GFFY-T317 能抑制肿瘤生长 |
| 3.2.4 D-Nap-GFFY-T317 能够激活IFNγ的表达和免疫细胞的浸润 |
| 第三节 D-Nap-GFFY-T317 抑制LLC1 肿瘤生长的机制探究 |
| 3.3.1 D-Nap-GFFY-T317 激活抗原呈递细胞中IFNγ表达 |
| 3.3.2 D-Nap-GFFY-T317 调控巨噬细胞极化 |
| 3.3.3 D-Nap-GFFY-T317 调控树突细胞的成熟和浸润 |
| 3.3.4 D-Nap-GFFY-T317 促进T细胞的浸润 |
| 3.3.5 D-Nap-GFFY-T317 抑制肿瘤中血管的生成 |
| 第四节 D-Nap-GFFY-T317 避免诱导荷瘤小鼠的肝脏脂质积累 |
| 3.4.1 D-Nap-GFFY-T317 处理不影响小鼠肝脏功能 |
| 3.4.2 D-Nap-GFFY-T317 处理不影响小鼠肝脏中脂质合成基因的表达 |
| 第五节 D-Nap-GFFY-T317 对乌拉坦诱发肺癌的抑制作用 |
| 3.5.1 D-Nap-GFFY-T317 抑制乌拉坦诱导的肺腺癌的发生发展 |
| 3.5.2 D-Nap-GFFY-T317 抑制乌拉坦诱导的肺腺癌中的炎症 |
| 3.5.3 D-Nap-GFFY-T317 通过促进IFNγ表达抑制乌拉坦诱导的肺腺癌 |
| 第六节 长期施用D-Nap-GFFY-T317 不影响乌拉坦诱导小鼠的肝脏脂肪生成和血脂水平 |
| 第七节 巨噬细胞以清道夫受体SR-A依赖的方式吞噬D-Nap-GFFY-T317 |
| 第四章 讨论 |
| 第一节 避免LXR副作用的研究现状 |
| 4.1.1 使用组织特异性LXR激动剂 |
| 4.1.2 使用LXRβ特异性激动剂 |
| 4.1.3 使用纳米颗粒特异性输送LXR激动剂 |
| 第二节 IFNγ抗肿瘤的研究现状 |
| 第三节 给药方式的探究 |
| 第四节 水凝胶包裹T317 抗肿瘤的机制 |
| 第五章 结论 |
| 第一节 课题结果总结 |
| 第二节 论文创新 |
| 第三节 进一步需要做的工作 |
| 附录 复方丹参滴丸抑制阿霉素诱导的心脏毒性 |
| 研究背景 |
| 研究结果 |
| 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表论文及所获奖励 |
（8）IL-37通过Notch1和NF-κB途径抑制M1巨噬细胞极化而延缓主动脉瓣钙化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 白细胞介素37通过Notch1和核因子κB途径抑制M1巨噬细胞极化 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二部分 心脏手术患者术后白介素37水平及围术期各因素相关性分析 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 资料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（9）YAP1通过PRD和TAD片段来抑制炎症反应（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 YAP1 对类风湿性关节炎的影响及研究意义 |
| 参考文献 |
| 在攻读硕士学位期间论文投稿及发表情况 |
| 致谢 |
（10）B细胞活化因子在胆道闭锁中（BA）的作用及其中和抗体对BA小鼠的治疗作用（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 1.病例队列 |
| 2.实验材料与实验方法 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 3.1.BA队列临床一般资料 |
| 3.2.BA患儿肝脏和血浆中BAFF水平增加 |
| 3.3.BAFF 与肝脏淋巴细胞浸润程度和纤维化程度呈正相关 |
| 3.4.BAFF 促进 B 细胞分泌 IgG4 在汇管区沉积介导肝损伤 |
| 3.5. BAFF促进T细胞分泌IFN-γ |
| 3.6.阻断BAFF显着改善BA小鼠胆道闭锁症状 |
| 3.7.阻断 BAFF 调节 B 细胞的发育和功能 |
| 3.8.阻断 BAFF 调节 T 细胞功能 |
| 3.9.阻断 BAFF 改善巨噬细胞的吞噬能力 |
| 3.10.阻断 BAFF 降低炎性因子的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| BAFF作用机制图 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 胆道闭锁病因:基于免疫学角度探讨研究现状与展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
四、B细胞激活因子水平ELISA检测方法的建立及临床初评（论文参考文献）
- [1]TAZ活化强直性脊柱炎Th17细胞及雷公藤甲素干预机制[D]. 刘悦. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]青蒿素衍生物和BTK抑制剂治疗自身免疫性疾病的作用机理研究[D]. 刘雨婷. 中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所), 2021(08)
- [3]Th17细胞中SOX-5介导RORγt基因新的增强子RORCE2与启动子相互作用的机制研究[D]. 韩超. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [4]万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析[D]. 李兆东. 吉林大学, 2021(01)
- [5]伪狂犬病病毒的基因工程疫苗构建及其感染PK-15细胞的转录组和蛋白质组学分析[D]. 张洪亮. 内蒙古农业大学, 2021
- [6]基于ROS响应负载地塞米松的纳米颗粒靶向治疗类风湿关节炎的作用及机制研究[D]. 宋国静. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [7]D-Nap-GFFY水凝胶增强LXR配体抗肿瘤作用的研究[D]. 冯科. 南开大学, 2021(02)
- [8]IL-37通过Notch1和NF-κB途径抑制M1巨噬细胞极化而延缓主动脉瓣钙化[D]. 李倩琴. 南方医科大学, 2021(02)
- [9]YAP1通过PRD和TAD片段来抑制炎症反应[D]. 杨爽. 广州医科大学, 2021(02)
- [10]B细胞活化因子在胆道闭锁中（BA）的作用及其中和抗体对BA小鼠的治疗作用[D]. 徐一平. 广州医科大学, 2021(02)