导读:本文包含了耐热乳糖酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:耐热乳糖酶,重组表达,分离纯化,条件优化
耐热乳糖酶论文文献综述
吴琼[1]（2012）在《凝结芽孢杆菌耐热乳糖酶基因的原核表达及酶学性质研究》一文中研究指出乳糖酶能分解乳及乳制品中的乳糖,生产低乳糖产品,解决“乳糖不耐症”。但常温乳糖酶在实际生产中存在着诸多不利因素,如杀菌温度低、活性低、生产成本高等。本论文以重组菌E.coli BL21/pET32-gal T242表达的来源于凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans sp.T242的耐热乳糖酶为研究对象,对重组菌的发酵条件及诱导条件进行优化、研究重组酶的分离纯化及酶学特性。为耐热乳糖酶的工业化应用奠定基础。本文选用DNAStar、BLAST、SWISS-MODEL等软件或在线分析平台对耐热乳糖酶的基因序列进行分析比对及空间结构预测,发现实验室分离鉴定的Bacillus coagulans sp.T242耐热乳糖酶基因与GenBank数据库中Bacillus coagulans 36D1基因组DNA的部分序列完全相同,相似性达100%。推测该乳糖酶含665个氨基酸,预测其分子量为76.09kDa,共有两个糖基化位点:NKSW-181,NHTD-623。单因素实验优化重组E.coli的发酵产酶条件及诱导条件:种龄4h,接种量1.5%,装液量30%,摇床转速160r/min;发酵培养5h后加入诱导剂IPTG,终浓度为0.6mmol/L,诱导5h,诱导温度37℃。在此条件下得到的单位OD600酶活为5.242U/mmL。分别用DEAE-52离子交换层析、Sephadex G-75分离纯化Bacillus coagulan 耐热乳糖酶,Ni-NTA亲和层析分离纯化重组E.coli耐热乳糖酶,纯化效率达75%,重组耐热乳糖酶酶活是出发菌的4.3倍。SDS-PAGE电泳检测纯化结果,估算重组耐热乳糖酶分子量约为55.0kDa。研究纯化后的重组耐热乳糖酶以ONPG为底物时的酶学特性,确定反应最适温度为50℃,55社℃以上温度稳定性差;反应最适pH为6.8,在中性偏酸条件下较稳定。酶反应中,离子浓度为1mmol/L时,Mg2+、Ca2+对酶活有明显的激活作用,其中Ca2+的作用尤其明显,达到空白对照的150%。Cu2+、Fe2+对酶活起到抑制作用,但影响不大。在pH 6.8,50℃条件下测得动力学常数 Km=2.21mmol/L,Vmax=0.87mmol/L·min。(本文来源于《大连工业大学》期刊2012-04-01）
夏雨,弓紫丰,成玉梁,赵莹,孙震[2]（2011）在《信号肽编码序列库的构建及耐热乳糖酶的分泌》一文中研究指出为了实现来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,建立一种较简便的方法筛选能够分泌该酶的信号肽,即针对11种信号肽构建信号肽编码序列库,采用随机筛选方法得到合适的信号肽,构建相应的分泌表达载体和重组表达菌株。结果表明,通过信号肽随机筛选方法获得的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶NprE信号肽能够有效引导该酶的细胞外分泌,重组菌株摇瓶培养16h后,上清液中积累的耐热β-半乳糖苷酶活力达到64.02U/mL,占该酶所表达的总酶活力的29.6%。该信号肽筛选方法可以为微生物蛋白质分泌过程中的信号肽快速选择和优化提供参考。(本文来源于《食品与机械》期刊2011年06期）
王双辉[3]（2011）在《耐热乳糖酶的分泌表达研究》一文中研究指出乳糖酶(EC.3.2.1.23),或称β-半乳糖苷酶(Lactase),能水解β-1,4-半乳糖苷键。该酶最重要的用途之一是制备低乳糖奶,可以有效地解决乳糖不耐症的问题,促进乳品工业的迅速发展。耐热乳糖酶具有常温乳糖酶无法比拟的优越性,如生产周期短、卫生性好、设备占用率低和能耗低等。由嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)染色体基因bgaB编码的乳糖酶具有良好的热稳定性,在70℃仍能保持活性稳定。对于像耐热乳糖酶BgaB这种有巨大应用潜力的酶,常采用分泌方式将酶分泌到发酵液上清中,这可以大大简化分离纯化工艺,节约成本。然而本实验室先后尝试了青霉素酰化酶、淀粉酶和中性蛋白酶等信号肽,都未在B.subtilis中对BgaB实现有效分泌。可能的原因是由于BgaB中存在特殊结构阻止了成功分泌,因此本课题将研究BgaB结构对蛋白分泌的影响,通过改变BgaB的一级结构来提高该酶的分泌效率。由于蛋白质的表达是分泌的前提,因此本课题尝试了LipB、WprA和NprE等多种信号肽来表达BgaB。得到了重组菌株WB600(pMALipB-bgaB)、WB600(pMAWprA-bgaB)和WB600(pMANprE-bgaB)。实验结果显示,各重组菌耐热乳糖酶BgaB表达差异非常显着,其中WB600(pMANprE-bgaB)有较高的表达,酶活可达2.091U/mL,WB600(pMAWprA-bgaB)表达较低,最高酶活仅0.328U/mL,而WB600(pMALipB-bgaB)无法检测到乳糖酶活性。这表明信号肽对BgaB的表达存在较大的影响,有些情况会致使表达失败。为了研究疏水性对BgaB分泌的影响,本论文通过PCR的方法获得了删除部分强疏水区的bgaB-X(X=1、2、3、4、5)基因,构建了一系列载体pMANprE-bgaB-X,并将其转入枯草芽孢杆菌WB600中,得到了重组菌株WB600(pMANprE-bgaB-X),在此基础上研究了BgaB中强疏水区对其分泌的影响。结果表明,BgaB的N-端疏水区的切除能少量提高BgaB的分泌量,而其他强疏水区的切除不仅对其分泌没有贡献,反而降低了BgaB的分泌效率。此外,本课题还研究了BgaB的长度对其分泌的影响,构建了含不同长度的bgaB基因的一系列载体pMANprE-bgaB-Y(Y=A、B、C、D),并将其转入WB600中,得到一系列重组菌WB600(pMANprE-bgaB-Y)。研究结果显示,当BgaB长度较小时,随着BgaB长度的减少,BgaB的分泌效率有所提高。(本文来源于《江南大学》期刊2011-03-01）
董艺凝,王霁昀,陈海琴,张灏,陈卫[4]（2011）在《耐热β-半乳糖酶在乳酸克鲁维酵母及毕赤酵母中的表达研究》一文中研究指出将嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖酶基因bgaB分别插入穿梭质粒pKLAC1、pPIC9k的α-因子信号肽下游,构建bgaB基因的乳酸克鲁维酵母真核表达载体pKLAC1-bgaB及毕赤酵母真核表达载体pPIC9k-bgaB。载体经酶切线性化后采用电击方法分别转化到乳酸克鲁维酵母K.lactis GG799及毕赤酵母GS115中,并通过同源区各自整合到宿主基因组中。重组酶进行镍柱纯化、Western Blot杂交鉴定及酶学性质分析。结果表明,耐热β-半乳糖苷酶在酵母表达系统中可以实现外源表达且热稳定性保持良好,但不能被酵母系统有效分泌。(本文来源于《食品工业科技》期刊2011年05期）
白利[5]（2010）在《耐热乳糖酶基因克隆、表达及酶学性质研究》一文中研究指出我国大部分人群(约75%-95%)因体内缺乏乳糖酶而患有乳糖消化不良和乳糖不耐受症状,而乳糖酶能将乳制品中的乳糖水解为半乳糖和葡萄糖,利于人体对其消化吸收,故利用乳糖酶来生产这种乳糖水解产品为减轻乳糖不耐受症状提供了一种可行的方法,具有重要的实践价值和理论意义。本论文从一筛选菌株凝结芽孢杆菌Bacillus coagulansT242中克隆获得耐热乳糖酶基因,进行原核表达,分析其酶学性质。以凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans36D1基因组DNA及乳糖酶基因作为参考序列,分别设计同源性验证引物：F1/R1、F2/1R2,含乳糖酶基因DNA片段引物：F3/R3、F4/R4及乳糖酶基因扩增引物F/R,以Bacillus coagulans T242基因组DNA为模板,利用PCR获得碱基序列全长2005个碱基的乳糖酶基因gal。将gal基因插入到表达载体pET32-a(+)构建重组表达质粒(pET32-gal),亚克隆到E.coli HSTO8宿主细胞中,通过菌落PCR初步检测,再提取质粒测序,筛选出阳性克隆子。将表达质粒pET32-gal转化到E.coli BL21宿主细胞中,挑取阳性克隆子37℃培养至OD600约为0.6时,用IPTG(终浓度1mmol/L)分别在37℃、25℃诱导培养4h后,细胞破碎离心沉淀经SDS-PAGE分析检测到大量目的蛋白,说明表达产物为包涵体。为实现耐热乳糖酶基因gal的可溶性表达,将表达质粒pET32-gal与分子伴侣质粒pGro7同时转化E.coli BL21,经SDS-PAGE分析,在细胞破碎上清液中含有目的蛋白。进一步优化pET32-gal/pGro7/BL21诱导培养条件：在IPTG浓度为0.6mmol/L时37℃诱导培养4h,乳糖酶的表达量最高,酶活为6.791U/mL发酵液,是出发菌株乳糖酶活力的5倍。同时对表达后耐热乳糖酶进行酶学性质研究。pH6.8乳糖酶活力最高,属中性酶；pH6.0-9.0范围内,37℃保温1h,其相对酶活可达80%以上；其最适反应温度50℃,40-50℃保温20min,其相对酶活达80%以上,但60℃保温20min,则残余酶活仅为原酶的3.16%,热稳定性降低。Mg2+、Ca2+、SDS对乳糖酶有激活作用,其中Ca2+激活作用最大,K+、EDTA影响不大；Cu2+、Pb2+、Zn2+、Mn2+对酶有抑制作用,其中Fe2+离子抑制作用最大,抑制率为68%。在50℃, pH6.8条件下,其Km=7.60mmol/L, max=128.21nmol/min。综上,乳糖酶最适pH为中性,且Ca2+对该酶激活作用明显,可用于水解牛乳中的乳糖。(本文来源于《大连工业大学》期刊2010-03-01）
刘涛[6]（2009）在《耐热性乳糖酶的研究》一文中研究指出利用乳糖酶生产低乳糖制品,可有效解决“乳糖不耐症”。嗜热菌所产耐热乳糖酶稳定性好,具有转化率高、污染小等优点,具有重要研究意义。本论文研究目的在于筛选产耐热乳糖酶的嗜热菌株,并进一步对其进行菌体分类鉴定,研究其发酵产酶条件、酶分离及酶学性质等。为后续耐热乳糖酶基因克隆与高效表达奠定基础。经研究发现：从22个样品中分离得到产耐热乳糖酶的嗜热菌株T242。经菌体表观特征、菌落形态、生理生化鉴定等传统细菌分类鉴定,以及16S rRNA基因序列相似性比对和系统发育分析等现代分子生物学鉴定,菌株T242与凝结芽孢杆菌有99%的同源性。最终确定菌株T242是芽孢杆菌属凝结芽孢杆菌种(Bacillus coagulans)。嗜热菌株Bacillus coagulans T242分泌胞内耐热乳糖酶,水解乳糖产葡萄糖和半乳糖。研究发现,溶菌酶结合高浓度NaCl法对菌株T242破壁效果最好,短时冻融法则最差,前者酶活是后者8倍。通过单因素分析对嗜热菌株Bacillus coagulans T242产酶营养条件和发酵条件进行优化。其产酶最佳营养条件为：乳糖1.5%,酵母膏1%,蛋白胨1.5%, MgSO40.7%.菌株T242最佳产酶发酵条件为：培养温度60℃,初始pH8.0,接种量2%,装液量30mL/250mL,培养时间36h,种龄36h。在优化条件下耐热乳糖酶活力为1.21U/mL。对Bacillus coagulans T242所产的耐热乳糖酶进行初步分离纯化。粗酶液经DEAE-52离子交换层析(2×10cm,梯度洗脱:0-0.4mol/L NaCl,流速：0.5mL/min,3mL/管)得到4个蛋白峰,其中2个峰有酶活(峰Ⅰ4.161U/mL、峰II1.886U/mL),综合酶活力和蛋白回收率选择峰Ⅰ浓缩透析；并进一步Sephadex G-75层析分离(1.64×70cm,50mmol/L pH6.8磷酸盐缓冲液,洗脱流速：0.083mL/min,1mL/管),得2个蛋白峰,其中1个峰有酶活；对有酶活峰的样品,透析除盐浓缩后进行SDS-PAGE电泳,得单一带,测定耐热乳糖酶分子量55.0kDa。最后对分离纯化的耐热乳糖酶酶学性质和反应动力学进行研究,结果表明：乳糖酶最适反应温度60℃,其中40～60℃热稳定性较好；最适pH6.8,其中pH6.4～7.5较稳定；离子浓度1mmol/L时Fe2+, Zn2+能显着抑制作用酶活,而Mn2+、Ca2+、Mg2+、K+、Na+对酶活力无明显抑制或激活作用；当离子浓度10mmol/L时,Mn2+、Mg2+、Na+对酶活有明显激活作用,其中Mn2+作用最强,可提高酶活3倍,高浓度Ca2+、Zn2+、K+对酶活力有明显抑制作用,其中K+抑制作用最强；耐热乳糖酶水解乳糖的Vmax为0.146mmol/L·min,Km为20.060mmol/L。(本文来源于《大连工业大学》期刊2009-04-01）
蒋燕灵,朱俭,俞一萍[7]（2005）在《耐热乳糖酶的纯化及理化性质研究》一文中研究指出目的:对从栖热菌(Thermussp.A3)中分离得到的耐热乳糖酶进行纯化及部分理化性质的研究。方法:采用聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离耐热乳糖酶,用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(x-gal)进行酶染显色,切下单一电泳带进行回收;分别用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)及非变性孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定其分子质量,用聚丙烯酰胺管状等电聚焦电泳法测其等电点。结果表明:用SDS-PAGE法及梯度电泳法测定该耐热乳糖酶的分子质量分别为51.1kD和65.6kD;用等电聚焦电泳法测得其等电点约为7.2。结论:从栖热菌中提取的耐热乳糖酶的理化性质不同于其它来源的乳糖酶。(本文来源于《中国食品学报》期刊2005年01期）
蒋燕灵,丁倩,邵靖宇[8]（2001）在《耐热乳糖酶产生菌株的筛选及产酶条件试验》一文中研究指出目的 :探讨耐热乳糖酶产生菌的筛选方法及其产酶条件。方法 :利用含有 X-gal平板培养基 ,于 6 0℃划线培养 ,筛选出耐热乳糖酶产生菌 ,并观测了培养温度、培养时间、培养基初始 p H及乳糖浓度对菌株生长及产酶条件的影响。结果 :筛选出含耐热乳糖酶菌株 ,该菌株的最适产酶条件分别为培养温度 (6 0± 1 )℃ ,培养时间 1 8～ 2 1 h,培养基起始 p H7.0～ 8.0 ,培养基乳糖浓度 41 .7mmol/ L。结论 :在含有 X-gal培养基进行划线培养是筛选产乳糖酶菌株的有效方法 ,同时该菌株具有嗜热性。(本文来源于《浙江大学学报(医学版)》期刊2001年03期）
蒋燕灵,邵靖宇,吕礼[9]（1999）在《耐热乳糖酶的酶动力学研究》一文中研究指出对从栖热菌中分离纯化的耐热乳糖酶进行酶动力学研究。方法：采用单因素试验方法，分别研究了温度、ｐＨ值、底物浓度对酶活性的影响。结果：该酶的最适温度为６０℃，最适ｐＨ为７．０，ｋｍ值为６３．９ ｍｍｏｌ／Ｌ。结论：该酶在工业生产低乳糖乳制品中具有一定意义。(本文来源于《中国生化药物杂志》期刊1999年04期）
耐热乳糖酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
为了实现来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,建立一种较简便的方法筛选能够分泌该酶的信号肽,即针对11种信号肽构建信号肽编码序列库,采用随机筛选方法得到合适的信号肽,构建相应的分泌表达载体和重组表达菌株。结果表明,通过信号肽随机筛选方法获得的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶NprE信号肽能够有效引导该酶的细胞外分泌,重组菌株摇瓶培养16h后,上清液中积累的耐热β-半乳糖苷酶活力达到64.02U/mL,占该酶所表达的总酶活力的29.6%。该信号肽筛选方法可以为微生物蛋白质分泌过程中的信号肽快速选择和优化提供参考。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
耐热乳糖酶论文参考文献
[1].吴琼.凝结芽孢杆菌耐热乳糖酶基因的原核表达及酶学性质研究[D].大连工业大学.2012
[2].夏雨,弓紫丰,成玉梁,赵莹,孙震.信号肽编码序列库的构建及耐热乳糖酶的分泌[J].食品与机械.2011
[3].王双辉.耐热乳糖酶的分泌表达研究[D].江南大学.2011
[4].董艺凝,王霁昀,陈海琴,张灏,陈卫.耐热β-半乳糖酶在乳酸克鲁维酵母及毕赤酵母中的表达研究[J].食品工业科技.2011
[5].白利.耐热乳糖酶基因克隆、表达及酶学性质研究[D].大连工业大学.2010
[6].刘涛.耐热性乳糖酶的研究[D].大连工业大学.2009
[7].蒋燕灵,朱俭,俞一萍.耐热乳糖酶的纯化及理化性质研究[J].中国食品学报.2005
[8].蒋燕灵,丁倩,邵靖宇.耐热乳糖酶产生菌株的筛选及产酶条件试验[J].浙江大学学报(医学版).2001
[9].蒋燕灵,邵靖宇,吕礼.耐热乳糖酶的酶动力学研究[J].中国生化药物杂志.1999