导读:本文包含了嗜热机制论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:低温淀粉酶,毕赤酵母,同源建模,适冷性
嗜热机制论文文献综述
杨雄振,郭玉杰,涂涛,姚斌,罗会颖[1]（2018）在《嗜热子囊菌Thermoascus crustaceus JCM12803来源的低温α-淀粉酶功能验证及其适冷机制分析》一文中研究指出【目的】挖掘新颖的低温α-淀粉酶基因资源,并对其适冷机制进行分析,可以加深我们对低温酶的认识并为酶分子改良提供科学依据。【方法】根据嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus) JCM12803全基因组序列信息,利用PCR的方法获得一个α-淀粉酶基因Tcamy,将其插入至表达载体pPIC9后,在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115中异源表达,测定其酶学性质。同时采用氨基酸序列分析和同源建模的方法获得其叁维结构,分别从蛋白序列-结构-功能层面上研究其适冷机制。【结果】Tc Amy是一个典型的低温α-淀粉酶,最适温度35°C,在0°C下保持有27%的活性。序列和结构分析表明该酶N-糖基化修饰程度低,Arg和Pro含量低而Gly含量高且二硫键和离子键较少。【结论】本研究获得了一个低温α-淀粉酶,低N-糖基化以及特殊的氨基酸组成和蛋白分子内作用力是其适应低温的根本原因。(本文来源于《微生物学报》期刊2018年12期）
李静[2]（2018）在《磷酸叁（1，3-二氯异丙基）酯对原生动物嗜热四膜虫的毒性效应及作用机制》一文中研究指出磷酸叁(1,3-二氯异丙基)酯(tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate,TDCIPP)是一种典型的有机磷酸酯类阻燃剂,因其优良的阻燃性能,以及全球范围内对溴代阻燃剂(如多溴联苯醚)的逐渐禁用,使得TDCIPP作为良好的替代品近年来被大量生产并广泛使用。由于TDCIPP是以物理添加的形式被应用在产品中的,因此极易释放进入环境中。环境监测表明,TDCIPP在空气、自然水体、土壤和野生生物的组织中具有很高的检出率,对野生生物和人类的生存和繁衍可能构成潜在的威胁。已有的毒理学研究表明,TDCIPP能够引起脊椎动物多种毒性效应,然而对低等生物的影响及多代毒性效应仍是未知,故本研究选取营自由生活的低等水生原生动物嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)为实验生物,通过较高浓度TDCIPP(0.01,0.1和1μmol/L)亚慢性暴露(5 d)和环境相关浓度(300和3000 ng/L)多代暴露60 d(约372代)及恢复实验,以表型观测、转录组测序分析、实时定量PCR检测和透射电子显微镜观察为研究手段,对TDCIPP的毒性效应及分子机制进行了评价和探讨。主要结果如下:(1)采用高浓度(1,10,100,1000和10000μmol/L)急性暴露(8 h),研究了TDCIPP对嗜热四膜虫生物量的剂量-依赖性抑制效应,EC50为615.1μmol/L。0.01,0.1和1μmol/L TDCIPP亚慢性暴露,通过引起细胞密度、细胞大小和纤毛数量剂量-依赖性降低,从而导致生物量显着性降低,表明抑制个体生长和繁殖是TDCIPP的主要毒性效应。RNA-Seq检测及KEGG富集分析,发现差异表达基因显着性富集于核糖体通路,TDCIPP诱导核糖体大、小亚基上的12个核糖体蛋白基因呈现剂量-依赖性的下调表达。此外,伴随着核糖体蛋白基因的下调表达,细胞质和粗面内质网上的核糖体数量减少,细胞质中核糖体增大。本实验结果表明,TDCIPP可能通过靶向作用于核糖体影响嗜热四膜虫的生长和繁殖。(2)多代毒性效应评价实验中,使用环境相关剂量TDCIPP对嗜热四膜虫开展连续约372代(60 d)的暴露实验,随后进行约372代的恢复实验。结果发现,TDCIPP暴露引起嗜热四膜虫种群数量、个体大小和纤毛数量降低;同时,TDCIPP引起纤毛的基体结构发生改变,基体深度和直径显着性降低;此外,TDCIPP诱导了与纤毛组装和维持相关的基因(ift家族的3个基因:ift52,ift81和ift172,tcp-1家族的7个基因:tcp-1-3700.m00089,tcp-1-3706.m00106,tcp-1-3715.m00106,tcp-1-3731.m00045,tcp-1-3698.m00091,tcp-1-2.m02183和tcp-1-16.m00478)表达上调。在60 d的恢复实验中,种群数量恢复至正常水平,然而,TDCIPP对嗜热四膜虫个体大小、纤毛数量、基体结构及相关基因的影响中部分效应有恢复迹象,大多效应依旧显着性存在。因此,本研究首次表明环境相关剂量TDCIPP对嗜热四膜虫多代暴露显示出发育和繁殖毒性,且部分效应在实验时间内不可恢复。(3)为进一步阐明TDCIPP引起多代毒性效应的作用机制,开展环境相关剂量(300和3000 ng/L)TDCIPP对嗜热四膜虫连续约372代的暴露及后续约248代的恢复实验。在此次实验中,TDCIPP对嗜热四膜虫表型的抑制效应与之前的多代暴露结果一致,恢复效应也相同。另外,此次实验还发现,TDCIPP引起细胞粗面内质网池扩张,其上附着的核糖体排列不规则,细胞内这种超微结构变化在恢复实验阶段依旧存在。通过RNA-Seq及KEGG富集分析发现,在暴露和恢复时期,下调表达的差异基因均显着性富集于核糖体通路,TDCIPP诱导核糖体大、小亚基上的核糖体蛋白基因普遍呈现剂量-依赖性下调表达,说明TDCIPP抑制了核糖体功能。此外,在恢复时期,上调表达的差异基因显着性富集于核糖体生物合成通路,推测这可能是嗜热四膜虫对TDCIPP抑制其核糖体功能所表现出的积极的恢复响应。(本文来源于《华中农业大学》期刊2018-06-01）
王玥[3]（2018）在《嗜热链球菌缓解细胞氧化应激的作用机制研究》一文中研究指出嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)是重要的工业菌株,广泛应用于酸奶和奶酪的发酵生产,是乳品工业中仅次于乳酸乳球菌的第二大发酵剂菌株,年消费量达到1021菌体细胞。近年来,研究发现S.thermophilus具有诸多的益生功能,例如嗜热链球菌能产生乳糖酶,分解酸奶中的乳糖,缓解乳糖不耐症。2010年欧洲食品安全局颁布了嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌发酵的酸奶具有益生功能的公告。因此,有关S.thermophilus在胃肠道内的存活、肠道屏障功能的提升以及抑制病原菌的黏附和入侵等方面开展大量研究。其中,S.thermophilus抗氧化活性成为研究焦点。研究发现,S.thermophilus细胞内存在多种与抗氧化有关的酶系和活性化合物,研究比较清楚的是超氧化物歧化酶(SOD),它能够将超氧阴离子(O2-)转化为氧分子和过氧化氢,进而保护菌株抵抗氧压力。最近在其基因组上又鉴定出一种新的过氧化物酶基因efeB以及谷胱甘肽合成酶基因gshF,并且发现这两个基因能够提高菌株在过氧化氢下的存活性,预示这两种酶具有清除细胞内活性氧(ROS)以及抗氧胁迫的作用。然而,S.thermophilus进入机体内是否具有抗氧化活性从而发挥益生作用的报道还很有限。本文以S.hermophilus CGMCC 7.179为主要实验材料,以肠道上皮细胞HT-29为模型,体内外分析该菌株及其产生的过氧化物酶EfeB和谷胱甘肽对细胞的抗氧化活性和抗炎作用,并探讨全局调控因子CodY对S.thermophilus ST2017应对氧胁迫的调控机制,取得实验结果如下:1.嗜热链球菌抗氧化特性的体外评价嗜热链球菌应用于酸奶发酵具有悠久历史,是公认的食品安全性菌株。为了评价该菌株的抗氧化活力,选育品质优良的发酵剂菌株,本文对分离自新疆、内蒙等传统发酵乳中的42株嗜热链球菌进行了抗氧化活性体外评价。结果显示,所试菌株均表现出一定的抑制抗坏血酸自氧化活性和DPPH自由基清除能力,以及较强的O2-清除能力和SOD活性,预示嗜热链球菌具有一定的抗氧化活性。此外,通过离散性分析发现,上述每一组抗氧化活性指标均有较大跨度的分布,表明嗜热链球菌的抗氧化能力具有菌株特异性。根据以上测定结果,选取4株高抗氧化活性及3株低抗氧化活性的菌株,测定它们对脂质过氧化的抑制活性,结果发现两株高抗氧化活性菌株SDMCC050231和SDMCC050242同样表现出较强的脂质过氧化抑制活性,并高于测试的其他4株乳酸杆菌(发酵乳杆菌、布氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌以及鼠李糖乳杆菌)。通过以上抗氧化活性指标的检测及分析,证明了嗜热链球菌具有抗氧化能力,并筛选到2株具有较高抗氧化活性的菌株,为后续抗氧化研究奠定基础。2.S.thermophilus CGMCC 7.179对HT-29细胞氧化应激的保护作用嗜热链球菌细胞能够合成多种与抗氧化有关的酶及化合物,例如SOD和谷胱甘肽等。研究发现,S.thermophilus CGMCC 7.179(即S.thermophilusSDMCC050242)合成一种新型染料过氧化物酶EfeB,可协同参与该菌株的抗氧胁迫,并保护细胞在有氧条件下的正常生长。本文研究表明,S.thermophil CGMCC7.179与肠道上皮细胞HT-29共培养后,由过氧化氢诱导的胞内ROS含量降低了 20%,说明S.thermophilus CGMCC 7.179有效缓解了细胞内的氧化压力。同时在过氧化氢诱导下,S.thermophilus CGMCC7.179还能刺激HT-29细胞内叁种主要抗氧化酶(SOD、GSH-px、CAT)活性的提升,分别为efeB缺失株与HT-29细胞共培养时的1.4倍、1.5倍、3倍,说明过氧化物酶EfeB参与了S.thermophilus CGMCC 7.179对HT-29细胞的抗氧化作用。Nrf2是调节细胞抗氧化通路的关键因子,Nrf2-ARE途径是细胞内最主要的抗氧化机制之一。为了研究S.thermophilus CGMCC7.179赋予细胞的抗氧化作用,利用蛋白免疫印迹法,检测了与S.thermophilusCGMCC 7.179共培养后,HT-29细胞内Nrf2蛋白的表达量,结果发现,共培养的HT-29细胞较正常培养细胞内Nrf2蛋白含量提高了 1.4倍。RT-qPCR检测Nrf2相关的抗氧化酶基因HO-1、CGLC、NQO1以及TXNRD1的转录水平发现,与菌株CGMCC7.179共培养后的HT-29细胞内这四种基因的转录水平较正常细胞显着上升,由此证实S.thermophilusCGMCC 7.179通过激活细胞内Nrf2蛋白表达及其下游抗氧化酶基因的转录来应对活性氧的损伤,而efeB缺失株与HT-29细胞共培养后,Nrf2蛋白及其相关抗氧化酶基因的转录表达均未有明显的提升,说明过氧化物酶EfeB在S.thermophilus CGMCC 7.179调控宿主细胞的抗氧化机制中发挥重要作用。以上实验结果表明,S.thermophilus CGMCC7.179能够提高细胞的抗氧化活性并赋予宿主细胞抵御氧化压力的保护作用,并且这种作用机制与过氧化物酶EfeB有关。3.过氧化物酶EfeB对HT-29细胞的抗氧化作用过氧化物酶EfeB是目前乳酸菌中唯一存在利用Tat(双精氨酸转运)系统分泌的一种蛋白质。为了进一步分析S.thermophilus CGMCC 7.179赋予HT-29细胞抗氧化作用是由胞外分泌的EfeB所介导,本文首先将EfeB基因克隆至大肠杆菌进行了异源表达,并将不同浓度EfeB纯蛋白与HT-29细胞共孵育24小时,检测在5mM过氧化氢胁迫下细胞的存活率。结果显示,添加1-1.5 μg/mL浓度的EfeB蛋白即可保护HT-29细胞免受过氧化氢的伤害;当添加1μg/mLEfeB蛋白时,HT-29细胞内SOD活性比正常培养细胞提高了 3倍,并且发现EfeB蛋白能够促进HT-29细胞中Nrf2蛋白表达及HO-1基因转录水平的提高,分别比正常培养细胞提高了 1.2和1.6倍,说明EfeB蛋白对细胞的抗氧化作用与Nrf2-ARE途径的激活有关。为了进一步证明胞外分泌的EfeB蛋白的抗氧化作用,同时添加EfeB蛋白和efeB突变株与HT-29细胞共培养后,胞内SOD活性较正常培养细胞提升2倍,Nrf2蛋白含量和基因转录水平分别上升了 1.6和3.6倍,HO-1基因的转录水平也上升了 5.7倍。外源回补了 EfeB蛋白的efeB突变株对细胞的抗氧化作用恢复或超过了野生菌株的效果,由此证明了胞外分泌的EfeB赋予S.hermophilus CGMCC 7.179对细胞的抗氧化作用。以上结果证明了S.thermophilus CGMCC 7.179的过氧化物酶EfeB具有胞外抗氧化活性,在一定浓度下能够激活Nrf2-ARE途径并保护细胞抵御氧化压力,同时赋予嗜热链球菌有效的抗氧化活性。4.谷胱甘肽生物合成对S.thermophilus CGMCC 7.179抗炎作用的研究谷胱甘肽是一种广泛存在于生物体内的重要生物活性化合物,具有抗氧化、抗炎以及解毒等功效。嗜热链球菌细胞中编码一种双功能谷胱甘肽合成酶(GshF),催化谷胱甘肽的一步合成,本文对嗜热链球菌合成的谷胱甘肽的抗氧化活性进行了分析。首先通过同源臂单交换的方法插入失活S.thermophilus.CGMCC 7.179基因组中的gshF基因,构建得到的gshF突变株对氧压力敏感,并且测定该突变株中的谷胱甘肽合成量显着低于野生株CGMCC7.179。随后将gshF突变株、菌株CGMCC7.179分别与HT-29细胞共培养,并测定细胞在过氧化氢刺激下的存活率,结果发现,相比菌株CGMCC7.179,与gshF突变株共培养后细胞的存活率显着降低,表明HT-29细胞对氧化压力的耐受性与GshF催化的谷胱甘肽生物合成有关。此外,gshF突变株调节HT-29细胞内抗氧化酶活性以及Nrf2相关基因转录水平的降低,证明了 GshF催化的谷胱甘肽生物合成对嗜热链球菌具有重要的生理作用。为了检测谷胱甘肽赋予菌株的抗炎症效果,分别将菌株CGMCC7.179、gshF突变株与沙门氏菌共同孵育HT-29细胞,酶联免疫法分析表明,S.thermophilus CGMCC7.179能够减弱沙门氏菌感染引发的细胞因子IL-8升高;同时,抑制炎症因子CXCL1和CCL20的转录水平,证明S.thermophilus CGMCC 7.179具有显着的抗炎活性。相比菌株CGMCC 7.179,gsh 突变株显着上调了 IL-8的分泌以及CXCL1和CCL20的转录水平,证明谷胱甘肽对嗜热链球菌抗炎活性的重要作用。以上实验结果表明,GshF催化的谷胱甘肽生物合成能够促进S.thermophilus CGMCC 7.179对人体肠道上皮细胞的抗炎作用,是嗜热链球菌益生特性的重要体现。5.全局调控因子CodY对S.thermophilusST2017氧压力响应的调控机制CodY是一个调控嗜热链球菌细胞代谢网络的全局转录调控因子,参与细胞内多种生理代谢活动。转录组分析,CodY缺失条件下,环境响应因子CovR转录水平提高,菌株存活性降低,预示着CodY参与了S.thermophilus ST2017抗氧胁迫作用。本文研究了 CodY对S.thermophilusST2017氧压力响应的调控机制。通过转录组和RT-qPCR分析,在codY缺失突变株中,谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的转录下调了 3倍;在mCDM培养基中,谷胱甘肽合成量较野生株下降20%,而在过氧化氢处理后细胞的存活率也下降了 50%,说明CodY通过调控谷胱甘肽的生物合成来响应环境中的氧压力。体外凝胶阻滞实验显示,CodY纯蛋白能够与gshF上游的启动子区结合,证明了 CodY对gshF的直接调控作用。以上实验结果证明,在S.thermophilus ST2017中CodY能够通过直接调控gshF的转录来响应环境中的氧压力。此外,通过转录组发现CodY对二组分系统CovRS也有调控作用,RT-qPCR也证实了该结论。实验结果显示,covR缺失突变株对环境中的氧气敏感,表明CovR的调控也具有抗氧胁迫作用。然而,covR突变株在过氧化氢刺激下的存活率在30分钟时升高,而在1小时后直接降低至0,说明CovR对S.thermophilus ST2017氧压力响应的调控不只是单纯的促进作用。通过对covR缺失株的转录组分析,发现CovR能够启动S.thermophilus ST2017中谷氧还蛋白亚基的转录表达,因此推测CovR通过调控谷氧还蛋白的合成来维持菌株的氧化还原平衡。以上结果表明,CodY对嗜热链球菌氧压力响应的调控通过两种方式:一是通过直接调控GshF催化的谷胱甘肽合成途径;二是通过CovR间接调控谷氧还蛋白及其他调控因子的转录表达。(本文来源于《山东大学》期刊2018-05-21）
朱牧孜[4]（2017）在《嗜热厌氧杆菌碳代谢物阻遏机制初探及高浓度碳底物细胞动态响应研究》一文中研究指出嗜热厌氧菌(Thermoanaerobes)因具有广泛的底物谱、代谢产物类型简单和较高的底物转化率等特点,在上世纪80年代能源危机后引起生物燃料研究者的关注。本课题组前期研究中筛选并改造了一株嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium aotearoense LA1002,以下简称LA1002),能有效利用葡萄糖、木糖、纤维二糖、葡聚糖等单一糖分发酵生产乳酸,而且乳酸的转化率接近理论转化率,展现出很好的工业应用价值。本论文就该菌株的碳源代谢利用机制及其效率提高展开系统研究。碳代谢物阻遏(Carbon catabolite repression,CCR)是微生物普遍存在的一种适应性调节机制。不同微生物碳代谢物阻遏机制不尽相同,即使同一类微生物,调节途径也是多样的。混合碳源利用研究表明,该嗜热厌氧杆菌对纤维二糖、半乳糖、乳糖等的利用受到2-脱氧葡萄糖和葡萄糖的严重抑制,显示其对该类碳源的利用存在明确的碳代谢物阻遏效应。鉴于此,本论文克隆鉴定了CCR机制关键蛋白编码基因pts H和hprK。体外磷酸化实验证实HPr(histidine-containing phosphocarrier protein)的位点特异性磷酸化由HPrK(HPr kinase/phosphorylase)催化完成,且该过程无需1,6-二磷酸果糖和6-磷酸葡萄糖的刺激即可实现。体外亲和实验和等离子体表面共振研究表明,位点Ser46磷酸化的HPr(HPr-Ser46-P)与分解代谢物控制蛋白A(Catabolite control protein A,CcpA)可特异性结合,其结合常数(K_D)为2.22±0.36 nM。上述研究表明,该嗜热厌氧杆菌的碳代谢物阻遏依循厚壁菌门微生物(Firmicutes)的CCR机制,为后续该菌株的CCR的解除和多种碳源等效利用奠定了理论基础。底物抑制会导致微生物发酵过程菌体生长减缓、发酵速度下降、生产能力降低等问题。针对产乳酸突变株T.aotearoense LA1002的高浓度底物抑制现象(>50 g/L糖底物),本论文采用梯度适应性驯化方法获得了可稳定、快速利用高糖底物的突变株T.aotearoense LA1002-G40。以100 g/L糖为碳源(90 g/L葡萄糖+10 g/L果糖)的摇瓶发酵研究表明,接种后突变株LA1002-G40几乎没有迟滞期存在,培养至24 h时OD_(600)可达到1.3左右,而原始菌株LA1002在同样发酵条件下未见明显生长。进一步以厨余废弃物水解液为原料(75 g/L葡萄糖和16 g/L果糖),可在48 h内完成发酵,乳酸产量和转化率分别达68.03±0.77 g/L和0.79±0.03 g/g,且批次间稳定(SD<5%)。转录组测序结果表明共有239个基因呈现显着性差异表达,有6条代谢通路至少含有5个差异基因富集。胞内溶质响应研究显示,相比于出发菌株,高浓度底物条件下LA1002-G40的葡糖基供体UDP-Glucose上调了1.88倍;作为渗透压保护剂的谷氨酸和甘氨酸等相容性溶质,其胞内含量也分别提高了2.90和1.42倍,与转录组数据相吻合。同时,应对环境压力的DNA修复相关基因的表达也被上调。本研究结果为同类菌株的工业化应用提供了范例,且对高浓度底物抑制解除的菌株理性改造具有指导性意义。(本文来源于《华南理工大学》期刊2017-11-20）
刘原子[5]（2017）在《腾冲嗜热厌氧杆菌EndoTT作用的分子机制研究》一文中研究指出【目的】腾冲嗜热厌氧杆菌(T.tengcongensis)是从我国云南腾冲温泉中分离出的一株嗜热厌氧革兰氏阴性杆菌,也是第一个由我国自主完成基因组测序和基因注释的原核微生物。SSB1、SSB2、SSB3是腾冲嗜热厌氧杆菌中被注释的3个单链DNA结合蛋白,其中SSB1是由tte0829基因编码。体外研究发现,SSB1蛋白具有复杂的受多环境因子调控的体外生化功能,它能结合ssDNA、dsDNA和损伤的ds DNA,也可以对ssDNA上特异位点进行切割。由于SSB1同时具有单链DNA结合活性和单链DNA切割活性的双功能作用而被称为EndoTT。然而腾冲嗜热厌氧杆菌EndoTT在体内有何生理功能及在热适应过程中发挥什么样的作用仍不清楚,本试验为揭示EndoTT在不同温度下的功能及其互作蛋白对其影响可提供一定的实验依据和奠定理论基础。【方法】(1)应用同源重组分别构建EndoTT双功能回补质粒ΔendoTT::endoTT、单链DNA结合回补质粒ΔendoTT::endo TTB和单链DAN切割回补质粒Δendo TT::endo TTS,分别将3个回补质粒转入WT和ΔendoTT菌液中,在60℃培养,然后转入腾冲嗜热厌氧杆菌固体培养基中,挑选转化子,提取基因组进行PCR验证。(2)通过表型观察野生株WT、ΔendoTT::endoTT、ΔendoTT::endoTTB、ΔendoTT::endoTTS菌株在75℃和80℃的生长趋势。(3)通过RNA测序对腾冲嗜热厌氧杆菌WT和ΔendoTT在50℃、60℃、75℃和80℃生长条件下的转录组进行分析,定义ΔendoTT在不同温度下的差异表达基因,挑选其特定温度下转录丰度高的基因。(4)通过Real-time PCR分析ΔendoTT中特定温度下转录丰度高的基因的mRNA表达量。【结果】(1)在ΔendoTT基础上成功构建了EndoTT双功能回补株ΔendoTT::endoTT、单链DNA结合活性回补株ΔendoTT::endoTTB和单链DAN切割活性回补株ΔendoTT::endoTTS。(2)生长曲线结果显示在75℃和80℃条件下ΔendoTT::endoTTB生长速度慢于ΔendoTT::endo TTS。(3)腾冲嗜热厌氧杆菌WT和ΔendoTT生长在50℃、60℃、75℃和80℃条件下的转录组RNA测序分析,显示501个差异表达基因(包括296个基因在特定温度下显着表达)可能与EndoTT有着联系甚至与热适应有关;利用GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)对差异表达基因进行分析,认为信号转导、脂肪酸合成和ABC转运系统在腾冲嗜热厌氧杆菌的热适应过程中起到重要作用。(4)Real time-PCR分析ΔendoTT转录组中在特定温度下转录丰都高的tte0270、celA、argH、argC、oppF3、purR3基因,发现tte0270、argH在50℃和60℃显着表达,celA、argC只在60℃显着表达,purR3在75℃和80℃显着表达,opp F3只在80℃显着表达。【结论】成功构建了EndoTT不同功能的回补株,具有单链DNA切割活性的ΔendoTT::endoTTS在高温条件下生长快,推测EndoTT在高温下主要发挥单链切割作用。4个温度下的ΔendoTT转录组分析,定义了501个差异表达基因,涉及到糖代谢、氨基酸代谢、ABC转运系统等途径,且发现tte0270、celA、argH、argC、oppF3、purR3基因在不同温度下差异显着表达,提示这些基因编码的蛋白可能与EndoTT存在相互作用而影响其功能的发挥。(本文来源于《甘肃农业大学》期刊2017-06-01）
李婉[6]（2017）在《嗜热链球菌CRISPR-Cas系统的分析及抗噬菌体机制的研究》一文中研究指出随着社会经济的不断发展,发酵乳制品在国内市场的需求量逐年增加。然而,在发酵过程中乳酸菌有时会遭受噬菌体的侵染,导致发酵失败。乳酸菌自身的噬菌体防御机制能够抵抗噬菌体的侵染,其中CRISPR-Cas系统广泛存在于细菌和古细菌中,能够为乳酸菌抵抗溶源性噬菌体提供获得性免疫。实验室自主知识产权的乳酸菌其抗噬菌体能力仍有待研究,本课题对乳酸菌标准菌株的CRISPR-Cas系统的结构和类型进行了预测,并检测实验室自主知识产权的嗜热链球菌的CRISPR-Cas系统。筛选出3株嗜热链球菌抗噬菌体突变菌株,分析了其抗噬菌体机制。基于生物信息学方法对NCBI中已测序嗜热链球菌的CRISPR-Cas系统进行预测,比较分析了瑞士乳杆菌及德氏乳杆菌保加利亚亚种的CRISPR-Cas系统以探究CRISPR-Cas系统在乳酸菌种间的同源性关系。结果表明尽管菌种不同,相同类型的CRISPR-Cas系统其重复序列高度保守,cas基因序列同源性较高,且重复序列与Cas蛋白在一定程度上体现了共进化的特点,这在一定程度上为CRISPR-Cas基因座能够发生水平基因转移事件提供了佐证。根据嗜热链球菌标准菌株cas基因序列的保守性设计内部引物,扩增并测序具有自主知识产权的6株嗜热链球菌的标记cas基因,以分析其所含CRISPR-Cas系统的类型。结果表明,6株嗜热链球菌中,S4仅含1个Ⅱ-A型CRISPR-Cas系统,其它5株均含有2个Ⅱ-A型CRISPR-Cas系统和1个Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统,此外,79和KLDS3.0207均含有1个Ⅰ-E型CRISPR-Cas系统。扩增3株实验室自主知识产权的嗜热链球菌的CRISPR序列,预测嗜热链球菌CRISPR基因座的活性,构建重复序列的系统发育树,并对间隔序列进行同源性分析。预测实验室3株嗜热链球菌的原间隔序列,为探究其抗噬菌体机制奠定基础。结果显示嗜热链球菌S0含有3个CRISPR基因座,嗜热链球菌S4仅含1个CRISPR基因座,嗜热链球菌79含有4个CRISPR基因座,CRISPR1基因座活性最高,CRISPR2基因座最不活跃。相同类型的CRISPR-Cas系统其重复序列高度保守,不同类型的CRISPR-Cas系统其重复序列存在较大差异。不同CRISPR的间隔序列在内容及数目上高度可变,其原间隔序列绝大部分来源于噬菌体,少数来源于质粒或染色体序列。扩增并测序宿主嗜热链球菌St-Ⅰ的CRISPR序列,采用自然选育法筛选抗噬菌体Φ7p的突变菌株,并对突变菌株进行CRISPR序列扩增、测序。结果表明,3株突变菌株中仅BIM1的CRISPR3获得了1个新的间隔序列,其余两株突变菌株均无新间隔序列插入,说明BIM1是通过CRISPR-Cas系统防御噬菌体的,而其它两株突变菌株则是通过其它防御机制对抗噬菌体入侵。测定在高噬菌体环境下突变菌株与敏感菌株的发酵性能,结果表明敏感菌株在高噬菌体环境下的产酸、产黏及增殖能力均显着下降,凝乳时间明显延长,而抗性菌株的发酵性能基本无变化。由此得出抗性菌株具有遗传稳定性和发酵稳定性。本研究的结论为相同类型的CRISPR-Cas系统其重复序列和Cas蛋白均具有种间保守性。基于嗜热链球菌79与标准菌株嗜热链球菌MN-BM-A02及嗜热链球菌ASCC1275具有较高的同源性,推测供试嗜热链球菌79是快速产酸和高产多糖的潜力菌株。抗噬菌体突变菌株BIM1通过整合新的间隔序列获得噬菌体抗性。(本文来源于《东北农业大学》期刊2017-06-01）
孟歆昕[7]（2017）在《嗜热嗜铁蓝藻JSC-1铁特性相关基因、蛋白及机制的研究》一文中研究指出本研究课题主要针对2003年新发现的一株热泉新藻Leptolyngbya sp.JSC-1的铁特性产生的机理、基因和相关蛋白结构进行了研究。首先获得纯藻种,并进行藻种的保藏。JSC-1在45℃、2000 lux光强、40 μM铁浓度下生长最佳。JSC-1可以耐受400 μM的铁浓度。研究JSC-1的铁矿化机制与其结构相关的。随着铁浓度升高,其细胞外部EPS层首先出现铁矿化物的成核,这是由于外部EPS层上含有带负电的羧基,容易螯合带正电的铁离子,形成铁氧矿化物,作为抗氧化的第一道防线。当铁浓度继续升高时,在其内部多磷酸体的位置形成铁矿化颗粒,其有解毒作用,螯合金属离子,作为抗氧化的第二道防线。研究还表明,400 μM铁培养时,JSC-1细胞内部总铁含量明显升高,这与其内部形成矿化颗粒相关。同时,JSC-1内的Fe2+也显着升高,说明高铁对其造成氧化胁迫,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)在400 μM铁培养时,酶活显着升高。过氧化物酶(POD)在200 μ铁培养时,酶活最高,但是在400 μM铁培养时,酶活有所下降,其对铁的耐受性不如SOD和CAT强。研究了 JSC-1与铁代谢和抗氧化相关基因在低铁(4 μM)、对照(40μM)、高铁(400 μM)下的表达情况。通过内参基因的优化,最终选取rps1B和livD基因。研究发现,bfr、sod-4、cat基因,在高铁培养中,显着上调,是JSC-1与耐受高铁培养的相关性基因。也是其高铁氧化胁迫下的第叁道防线以pUC18和pUC19载体成功构建了bfr、sod-4、cat基因的基因敲除载体。首次尝试以自然转化和电击转化的方式进行基因敲除并进行优化,但目前尚未敲除成功。以bfr、sod-4、cat基因表达产物的蛋白序列进行比对,发现铁蛋白同源度低且在本应该高度保守的铁氧化中心位点出现明显差别,其谷氨酸变为丝氨酸,这可能对铁蛋白的结构和性质产生影响,因此研究其蛋白结构。构建 pGEX6p-1-BFR、pET28a-BFR、pET22b-BFR 叁个表达载体,并进行纯化及纯化方法的优化。进行JSC-1中的BFR和Apo-BFR晶体的初筛和优化,获得JSC-1的5套Apo-BFR晶体衍射数据,JSC-1的Apo-BFR结构完成初构。得到4套泡Fe2+ 2.5 min的衍射数据,2套泡Fe2+ 65 min的衍射数据,3套泡Zn2+和Fe2+的数据,结构正在解析中。(本文来源于《北京化工大学》期刊2017-05-31）
黄晓燕[8]（2016）在《基于RNA-Seq及全基因组测序的嗜热厌氧杆菌乙醇耐受性机制的研究》一文中研究指出随着能源及环境问题日益突出,开发可再生能源已经成为人类的共识。其中以生物质为原料制取的工业乙醇,作为一种清洁可再生能源,是替代石油等化石燃料的必然趋势。以纤维素和半纤维素为主要成分的植物生物质是地球上含量最丰富的可再生资源,因此,利用微生物对其进行转化生产乙醇具有重要的意义。嗜热厌氧菌具有木质纤维素降解能力,能够代谢生物质中大部分的糖产乙醇,但是其乙醇耐受性一般较低,限制了工业化的应用,同时,其全局性的乙醇耐受性机理研究较少。本文主要通过全基因组测序、转录组测序分析、代谢工程改造嗜热厌氧杆菌Thermoanaerobacterium aotearoense△ldh,从基因遗传、乙醇胁迫的瞬时响应及长时间适应过程叁个方面研究嗜热厌氧杆菌的乙醇耐受性机制。经过410次的外源高浓度乙醇胁迫驯化嗜热厌氧杆菌T.aotearoense△ldh,获得了能够耐受6%(v/v)乙醇浓度的突变株T.aotearoense ET7,相比起始菌株乙醇耐受性提高了100%。对突变株ET7进行基因组重测序,通过与参考序列T.aotearoense SCUT27进行比对,样品ET7基因组共发现113个单核苷酸多态性(SNP)突变,20个插入或缺失(InDel)突变。其中蛋白质编码区(CDS区)共发现111个突变位点,分布在100个基因上,总的突变率为3.73%,有氨基酸突变的基因总共有83个,含多个突变位点的基因5个。以T.aotearoense△ldh为出发菌株,在其生长到对数期前期(OD_(600)=1),分别加入0%、2%、3%浓度的乙醇,分别在乙醇胁迫后的10min、45 min、120 min取样,提取RNA进行转录组测序。发现△ldh随着乙醇胁迫时间的延长,差异表达基因(DEGs)数目逐渐减少,差异倍数逐渐增大;与2%乙醇浓度下的样品相比,在3%的乙醇胁迫下DEGs数目更多,差异倍数更大。通过叁种乙醇浓度下△ldh的DEGs两两比对,发现叁个取样时间点分别有1214,1021,669个DEGs。再对这叁个取样时间点综合分析共发现1516个乙醇耐受相关的DEGs,进一步聚类分析得到50个基因,对乙醇的胁迫做出了较大的响应。其中包括13个显着下调的基因,15个显着上调的基因,5个高表达量的生长必须基因,17个表达量较低,但与乙醇浓度呈正相关的基因。综合△ldh的叁种乙醇浓度及叁个取样时间点,共发现76个DEGs对低浓度或高浓度乙醇的瞬时刺激或长时间胁迫做出了较大的响应,再结合聚类分析得到的50个基因,获得22个最为关键的基因。进一步结合基因的功能及文献报道重点研究了8个乙醇耐受的关键基因。通过对转录组分析得到的8个关键基因进行代谢工程改造T.aotearoense△ldh,成功获得了5个工程菌株。以20 g/L的葡萄糖为碳源,工程菌△ldh/adhE乙醇产量及得率分别为7.27 g/L和0.45 g/g,相比原始菌分别提高了18.8%和12.5%。工程菌△ldh/△pflA的最大细胞密度、乙酸产量及得率显着下降,乙醇产量及得率显着提高,分别为6.49 g/L和0.50 g/g,相比原始菌分别提高了6.1%和25%,其得率接近理论得率0.51 g/g。工程菌△ldh/△APS的细胞密度提高了24%,乙酸产量显着提高,达到2.73g/L。以20 g/L的葡萄糖作为碳源,在OD_(600)达到1时分别加入3.5%,4.0%,4.5%的乙醇,发现工程菌耐受乙醇的能力为△ldh/SH>△ldh/△APS>△ldh/adhE>△ldh。其中工程菌△ldh/SH在高浓度乙醇下的最大OD值及维持高细胞密度的时长显着高于其它菌。通过和接种前加入乙醇的耐受性情况相比,推测可能的原因是SH、adhE基因发挥乙醇耐受性效果需要发酵后期其它基因的协同作用。(本文来源于《华南理工大学》期刊2016-12-26）
贾宪波[9]（2016）在《福州温泉嗜热菌多样性及嗜热菌Geobacillus thermoglucosidasius低温适应的机制》一文中研究指出温泉是地球上一类重要的热环境,其高温和贫营养环境中生存着大量的嗜热微生物。嗜热菌是一类重要的微生物,在生存机制和应用方面都吸引着越来越多关注。地球上不同地区温泉嗜热菌组成差异很大,对不同地区温泉中嗜热菌多样性研究有利于加深对该类生态系统的认识。地芽孢杆菌属(Geobacillus)是温泉可培养嗜热菌中的优势菌,也是堆肥等热环境中的常见菌种,但是随着近年来在常温和寒冷环境中不断分离到Geobacillus属菌株,这类嗜热菌适应低温生存的机制引起人们关注。本论文通过调查福州叁处温泉的嗜热菌多样性,发现Geobacillus属细菌在温泉热环境中广泛分布,在此基础上进一步研究了Geobacillus属细菌的低温适应机制。本文应用Illumina MiSeq平台检测福州大汤(DaTang)、汤埕(TangCheng)和双龙(ShuangLong)叁处温泉水体中的细菌16S rDNA多样性,显示叁处温泉中嗜热菌多样性丰富,其中丰度较大的嗜热菌有变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、产水菌门(Aquificae),硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、装甲菌门(Armatimonadetes),栖热菌门(Thermi), GAL15菌门,酸杆菌门(Acidobacteria),绿菌门(Chlorobi),放线菌门(Actinobacteria),绿弯菌纲(Chloroflexi), OP1菌门,OD1菌门,拟杆菌门(Bacteroidetes)和EM3菌门。不同温泉之间细菌多样性差异较大,Pearson相关性分析和RDA分析显示叁处温泉微生物多样性的差异与温泉温度、Na+、NO2和Mg2+等水体理化性质有关。对福州地区叁个典型温泉：大汤温泉、汤埕温泉和双龙温泉温泉底泥中的可培养嗜热菌进行了研究,结果显示大汤温泉嗜热菌的种类多于汤埕,双龙温泉嗜热菌最少。进一步分析发现叁个温泉嗜热菌多样性与pH,碱解氮和有效磷有关,pH越低,碱解氮和有效磷含量越高温泉中嗜热菌越丰富。所分离的32株嗜热菌隶属于6个不同的属,其中Geobacillus属和Anoxybacillus属菌株为福州温泉中的优势嗜热菌菌种。可培养方式和非可培养方式研究对比发现温泉中可培养菌只占非常小一部分,坚壁菌门中产芽孢细菌较易培养；栖热菌,变形菌等嗜热菌没有从现有的培养方式中得到纯培养物。改善可培养方式或者应用宏基因组学手段有利于进一步挖掘温泉嗜热菌基因资源。对分离的一株嗜热菌Geobacillus sp. CHB1进行了鉴定和基因组测序。该菌生长温度范围为47℃～74℃之间,最适生长温度为60℃。16S rDNA测序发现该菌与标准菌株Geobacillus thermoglucosidasius DSM2542T同源性最近为99.26%。该菌的G+C含量为49%,与Geobacillus thermoglucosidasius DSM25421基因组杂交率为75%。但是其与标准菌株Geobacillus thermoglucosidasius DSM25421在生理生化特征和细胞膜磷脂脂肪酸组成方面又有所不同,判断该菌株为Geobacillus thermoglucosidasius种的一个亚种。对Geobacillus sp. CHB1基因组进行测序,该菌株基因组长度为3.22M,编码4122个开放阅读框。为了研究Geobacillus sp. CHB1适应低温生长的机制。以Geobacillus sp. CHB1为目标菌株,应用适应性进化技术(Experimental evolution)向低于其最低生长温度的方向进化,经过6个月的实验得到了可以在430C温度下起始生长的进化菌株。进化菌株生长速度明显高于初始菌株。进化菌株Ec细胞膜磷脂脂肪酸在低温下表现出剧烈调整的倾向,iso 15：00在45℃低温生长时相对含量显着上升,这也从另一个方面证明了进化后的菌株对低温的适应能力更好。比较蛋白组学发现进化菌株与核苷酸相关的蛋白表达量上调,而与脂肪酸代谢相关的蛋白表现下调。蛋白组学结果与进化菌株表现出较高的生长速度和较强的脂肪酸调节能力是相一致的。在前期6个月进化的基础上,以Ec为出发菌株又继续向更低生长温度进行了12个月的进化实验。温度生长实验证明,液体培养条件下叁个进化群体(F1、F2和F3)都可以在38-39℃之间稳定生长传代,固体平板实验证明进化群体中挑取的菌株F3可以在39℃温度条件下生长并形成菌落。这些证明,在Ec的基础上,经过12个月的进化实验,该菌的最低生长温度又下降了至少4℃。对进化群体Ec,F2和F3进行重测序分析,发现两个群体有15个共有的突变基因,其中7个基因在两个群体中突变位置不同,说明这些基因很可能在这个阶段适应低温的过程中起到重要的作用。比较基因组学发现MFS、DNA聚合酶p亚基、AB水解酶和肽酶等是独立适应低温进化的群体共有的突变基因,认为这些基因是与低温适应有关的潜在基因突变。从F3群体中挑取两个单菌落重测序,发现个体基因组中杂合子明显少于其对应的群体F3,说明在适应低温进化过程中群体内菌株间积累了大量的不同的突变,这些突变有些还没有在群体中固定下来。在这个阶段Ec适应更低温度的进化过程中还出现了一些突变体,F3群体中出现了细胞分裂被抑制的长线形菌体,通过比较基因组结果发现该群体中FtsK基因发生了倒位突变。这些结果加深了对嗜热菌适应低温的机制的理解。过氧化氢酶在独立进化的群体EA、EB和EC均表现出比初始菌株A高出20倍以上的过氧化氢酶活性。质谱鉴定证明起作用的过氧化氢酶是一种携带血红素的单功能过氧化氢酶,针对该基因的qPCR进一步证明其在进化菌株中高表达。进化菌株的发酵液和重组过氧化氢酶都显示出该过氧化氢酶在0℃～40℃温度范围内至少有40%以上的活性,表明该酶在Geobacillus低温生长时是以活性形式存在的。有研究表明过氧化氢酶可以促进一些常温菌在低温下的生存能力。我们认为适应性进化过程中群体中过氧化氢酶高表达个体的出现是一个重要事件,该过氧化氢酶高表达个体更能适应该个体出现时的低温环境,随着该适应低温个体在群体中占据统治地位出现了整个群体对低温适应性增强的现象。总之,适应低温进化后的Geobacillus sp. CHB1群体在多个水平表现出低温适应能力的增强：如起始生长温度的明显降低了约9℃,生长速度的明显提高,细胞膜脂肪酸调节能力的改变,过氧化氢酶表达量的提高及蛋白组水平上与核酸代谢和脂肪酸代谢相关蛋白的表达变化。可能原因是进化菌株在低温条件下的生长速度高于死亡速度。通过比较基因组学找到与物质转运相关的基因MFS、与DNA复制相关的基因、DNA聚合酶p亚基以及功能未知的AB水解酶和肽酶等基因的突变。这些基因是适应低温过程的关键基因,它们的突变如何影响生长参数、脂肪酸组成和蛋白质表达需要进一步研究。(本文来源于《福建农林大学》期刊2016-06-01）
李曦[10]（2016）在《深海热液区嗜热发酵型异化铁还原细菌铁还原和生物成矿机制的研究》一文中研究指出异化铁还原是指微生物利用细胞外Fe(Ⅲ)作为末端电子受体,以有机物作为电子供体,Fe(Ⅲ)获取电子还原为Fe(Ⅱ),能以此类代谢形式进行生命活动的微生物即为异化铁还原菌(DIRBs)。它们广泛分布于厌氧环境中,在含铁矿物中铁的还原和矿物的迁移转化以及铁元素的地球化学循环具有重要意义。Anoxybacter fermentans DY22613~T和Caloranaerobacter ferrireducens DY22619T两株嗜热异化铁还原菌(最适生长温度60℃)分离自东太平洋洋中脊热液区的两个硫化物样品,均能利用蛋白胨或酵母膏发酵获取能量,同时利用可溶性的柠檬酸铁和不可溶的铁氧化物作为胞外电子受体,将Fe(III)还原成Fe(II)。A.fermentans DY22613~T利用蛋白胨作为电子供体,可溶性的柠檬酸铁和不可溶的FeOOH作为电子受体,其主要发酵代谢产物是乙酸、丁酸、H2、CO2,以可溶性的柠檬酸铁和不可溶的FeOOH作为电子受体时,其发酵产物乙酸、丁酸、CO2,细胞生长均高于单纯以蛋白胨发酵,说明铁的异化还原对该菌的发酵代谢及细胞生长有一定的促进作用。但是,氢气的产生量却低于缺少胞外铁电子受体的对照,异化铁还原过程抑制了氢气的产生,本应传递给H+的电子被传递给胞外Fe(III),通过对电子流的计算发现该菌只将极少电子传递到胞外进行异化铁还原。当菌株DY22613~T以FeOOH作为电子受体时,Fe(III)被还原并矿化形成结晶度良好的颗粒状磁铁矿;而以柠檬酸铁作为电子受体时,胞外形成的黑色固体为无定形的铁硫复合物,推测该菌异化Fe(III)还原伴随着硫酸盐还原。为确定菌株DY22613~T的相关电子传递途径,我们分析了该菌基因组,从中找到了电子传递链相关蛋白,如NADH脱氢酶、FAD脱氢酶的基因簇。然而,未找到编码在呼吸型异化铁还原地杆菌(Geobacter spp.)、希瓦氏(Shewanella spp.)等其他菌中常见的多血红素细胞色素C的基因簇。进一步实验证明,该菌内膜上参与电子传递的主要是FAD脱氢酶,而周质空间和外膜可能利用其它具有电子传递功能的蛋白而非多血红素细胞色素C进行电子传递。这些结果表明,该菌可作为发酵型异化铁还原菌的代表菌种,其可能有完全不同于呼吸型异化铁还原菌地杆菌属Geobacter spp.和希瓦氏菌属Shewanella spp.的细胞色素C的具有氧化还原功能的电子传递蛋白参与膜上电子传递。本文还对菌株C.ferrireducens DY22619T的铁还原特性进行分析,比较了该菌对无定形羟基氧化铁、无定形铁氧化物和针铁矿叁种不同铁氧化物的铁还原速率;并利用透射电镜对矿化产物进行矿物形貌、组成元素和晶型的分析。研究发现该菌生长在指数期至稳定期(48 h)时,铁还原速率最快,其中对无定形羟基氧化铁和无定形铁氧化物的还原速率较高,可达2.82μmol/h和2.15μmol/h;透射电镜结果表明,该菌可将叁种不同胞外铁氧化物均还原矿化形成颗粒状磁铁矿,由针铁矿矿化形成的磁铁矿少,但粒径最大,而由无定形铁氧化物形成的磁铁矿晶面不同于另外两种铁氧化物。结果表明,该菌有很强的铁还原和矿化能力,能厌氧呼吸还原叁价铁氧化物,但是铁氧化物的性质对该菌胞外铁还原能力和矿化形成的磁铁矿的性质有重要影响。A.fermentans DY22613~T和C.ferrireducens DY22619T均为深海热液区嗜热型的发酵异化铁还原菌,同属于厚壁菌门梭菌纲,拓展了我们对梭菌纲中的细菌在全球铁循环过程中所扮演角色的认识,它可能与其他铁还原菌共同参与深海热液环境中铁元素的地球化学循环以及含铁矿物的迁移和转化。(本文来源于《国家海洋局第叁海洋研究所》期刊2016-06-01）
嗜热机制论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
磷酸叁(1,3-二氯异丙基)酯(tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate,TDCIPP)是一种典型的有机磷酸酯类阻燃剂,因其优良的阻燃性能,以及全球范围内对溴代阻燃剂(如多溴联苯醚)的逐渐禁用,使得TDCIPP作为良好的替代品近年来被大量生产并广泛使用。由于TDCIPP是以物理添加的形式被应用在产品中的,因此极易释放进入环境中。环境监测表明,TDCIPP在空气、自然水体、土壤和野生生物的组织中具有很高的检出率,对野生生物和人类的生存和繁衍可能构成潜在的威胁。已有的毒理学研究表明,TDCIPP能够引起脊椎动物多种毒性效应,然而对低等生物的影响及多代毒性效应仍是未知,故本研究选取营自由生活的低等水生原生动物嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)为实验生物,通过较高浓度TDCIPP(0.01,0.1和1μmol/L)亚慢性暴露(5 d)和环境相关浓度(300和3000 ng/L)多代暴露60 d(约372代)及恢复实验,以表型观测、转录组测序分析、实时定量PCR检测和透射电子显微镜观察为研究手段,对TDCIPP的毒性效应及分子机制进行了评价和探讨。主要结果如下:(1)采用高浓度(1,10,100,1000和10000μmol/L)急性暴露(8 h),研究了TDCIPP对嗜热四膜虫生物量的剂量-依赖性抑制效应,EC50为615.1μmol/L。0.01,0.1和1μmol/L TDCIPP亚慢性暴露,通过引起细胞密度、细胞大小和纤毛数量剂量-依赖性降低,从而导致生物量显着性降低,表明抑制个体生长和繁殖是TDCIPP的主要毒性效应。RNA-Seq检测及KEGG富集分析,发现差异表达基因显着性富集于核糖体通路,TDCIPP诱导核糖体大、小亚基上的12个核糖体蛋白基因呈现剂量-依赖性的下调表达。此外,伴随着核糖体蛋白基因的下调表达,细胞质和粗面内质网上的核糖体数量减少,细胞质中核糖体增大。本实验结果表明,TDCIPP可能通过靶向作用于核糖体影响嗜热四膜虫的生长和繁殖。(2)多代毒性效应评价实验中,使用环境相关剂量TDCIPP对嗜热四膜虫开展连续约372代(60 d)的暴露实验,随后进行约372代的恢复实验。结果发现,TDCIPP暴露引起嗜热四膜虫种群数量、个体大小和纤毛数量降低;同时,TDCIPP引起纤毛的基体结构发生改变,基体深度和直径显着性降低;此外,TDCIPP诱导了与纤毛组装和维持相关的基因(ift家族的3个基因:ift52,ift81和ift172,tcp-1家族的7个基因:tcp-1-3700.m00089,tcp-1-3706.m00106,tcp-1-3715.m00106,tcp-1-3731.m00045,tcp-1-3698.m00091,tcp-1-2.m02183和tcp-1-16.m00478)表达上调。在60 d的恢复实验中,种群数量恢复至正常水平,然而,TDCIPP对嗜热四膜虫个体大小、纤毛数量、基体结构及相关基因的影响中部分效应有恢复迹象,大多效应依旧显着性存在。因此,本研究首次表明环境相关剂量TDCIPP对嗜热四膜虫多代暴露显示出发育和繁殖毒性,且部分效应在实验时间内不可恢复。(3)为进一步阐明TDCIPP引起多代毒性效应的作用机制,开展环境相关剂量(300和3000 ng/L)TDCIPP对嗜热四膜虫连续约372代的暴露及后续约248代的恢复实验。在此次实验中,TDCIPP对嗜热四膜虫表型的抑制效应与之前的多代暴露结果一致,恢复效应也相同。另外,此次实验还发现,TDCIPP引起细胞粗面内质网池扩张,其上附着的核糖体排列不规则,细胞内这种超微结构变化在恢复实验阶段依旧存在。通过RNA-Seq及KEGG富集分析发现,在暴露和恢复时期,下调表达的差异基因均显着性富集于核糖体通路,TDCIPP诱导核糖体大、小亚基上的核糖体蛋白基因普遍呈现剂量-依赖性下调表达,说明TDCIPP抑制了核糖体功能。此外,在恢复时期,上调表达的差异基因显着性富集于核糖体生物合成通路,推测这可能是嗜热四膜虫对TDCIPP抑制其核糖体功能所表现出的积极的恢复响应。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
嗜热机制论文参考文献
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