导读:本文包含了中性白细胞抑制因子论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:中性白细胞抑制因子,大肠杆菌,表达,纯化
中性白细胞抑制因子论文文献综述
甘雨耕,蔡绍皙,王红兵,王建,陈海蓉[1]（2003）在《中性白细胞抑制因子在大肠杆菌中的表达与纯化》一文中研究指出利用PCR技术扩增编码钩虫中性白细胞抑制因子(NIF)成熟肽的cDNA,克隆于表达载体pET-21a(+),序列分析表明与文献报道一致。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)plys中实现高效可溶性表达。SDS-PAGE分析结果表明,外源蛋白(相对分子质量28900)约占全菌蛋白的20%。菌体用溶菌酶处理,上清经Q-SepharoseFF阴离子交换、羟基磷灰石层析、SephacrylS-100凝胶过滤,得到纯度约95%的重组NIF。活性测定结果表明,大肠杆菌表达的重组NIF能有效地抑制中性白细胞粘附。这些结果为利用大肠杆菌制备重组NIF奠定了基础。(本文来源于《生物技术通讯》期刊2003年04期）
甘雨耕[2]（2003）在《中性白细胞抑制因子在大肠杆菌中的表达与纯化》一文中研究指出中性白细胞抑制因子（Neutrophil inhibitory factor,NIF）是一种犬的钩虫（Ancylostoma caninum）分泌的糖蛋白，理论分子量为41 kDa，其cDNA编码的蛋白质由274 个氨基酸残基组成，N端有17个氨基酸残基的信号肽，成熟蛋白有257个氨基酸残基。NIF是一种新型抗炎因子，它能专一地结合人中性白细胞膜上的整合素CD11b/CD18，从而抑制活化的中性白细胞释放H2O2以及粘附血管内皮细胞，以此减轻中性白细胞介导的组织损伤。目的：美国辉瑞公司将rNIF用于治疗与局部出血性中风相关的再灌注损伤，现已进入Ⅱ期临床。仅美国每年就大约有750 000人患上局部出血性中风，如果rNIF顺利通过临床实验，无疑具有极大的商业价值。在基因工程中，rNIF的表达一般采用真核表达系统，美国Corvas公司的Moyle等人就利用巴斯德毕赤酵母成功表达出rNIF，但尚未见利用原核表达系统表达rNIF的报道，本研究初步探讨了如何利用大肠杆菌表达rNIF并进行纯化。方法：根据有关文献报道的编码NIF成熟肽的cDNA序列并参照引物设计的基本原则，设计出一对引物，以含目的cDNA的质粒PUC57为模板，利用PCR技术扩增目的cDNA。用限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ双酶切扩增产物和表达质粒pET-21a(+)，连接目的cDNA和表达质粒的大片段，将连接产物用CaCl2 法转化大肠杆菌DH5α。抽提重组质粒pET-21a(+)/NIF，用NdeⅠ和BamHⅠ小量双酶切，确定目的cDNA与表达质粒的大片段是否正确连接，然后由上海生工用Sanger双脱氧链终止法-PUC体系对目的cDNA测序，确定目的cDNA的基因序列是否正确。大量抽提重组质粒，转化宿主菌BL21（DE3）plysS，经IPTG诱导，确定rNIF在宿主菌BL21（DE3）plysS中以可溶形式或包涵体形式高效表达，通过发酵大量制备rNIF。离心分离表达菌体和培养基，收获的菌体用Tris-HCl 缓冲液（pH8.0）+超声破菌处理，再离心收集包涵体沉淀，经过洗涤、溶解和复性，rNIF复性溶液经Q-Sepharose层析、羟基磷灰石（HTP）层析、Sephacryl S-100凝胶过滤层析，得到纯化的rNIF。在纯化过程中，用Bradford法测定rNIF浓度。凝胶扫描15％SDS-PAGE胶条，测定rNIF在全菌蛋白中的百分含量。HPLC分析rNIF纯品的纯度。通过中性白细胞与96孔细胞培养板的粘附性实验，测定rNIF抑制中性白细胞粘附的活性。结果：本研究成功利用PCR技术扩增出目的cDNA并克隆于表达质粒pET-21a(+)。对目的cDNA的序列分析结果表明，扩增的目的cDNA序列与文献报道一致。经IPTG诱导3 h，rNIF在宿主菌BL21（DE3）plysS中以包涵体形式实现高效表达。凝胶扫描的分析结果表明，目的蛋白（28.9 kDa）约占全菌蛋白的20％。HPLC的分析结果表明，rNIF纯品的纯度在98％以上。活性测定结果表明，rNIF能有效抑制中性白细胞的粘附。结论：本研究在大肠杆菌中高效表达出具有生物活性的rNIF,而且摸索出一套相应的纯化工艺，该工艺成本低、工艺衔接合理、分离效率高，可以方便的放大至中试和生产规模,这些结果为利用大肠杆菌制备rNIF奠定了基础。(本文来源于《重庆大学》期刊2003-05-18）
中性白细胞抑制因子论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
中性白细胞抑制因子（Neutrophil inhibitory factor,NIF）是一种犬的钩虫（Ancylostoma caninum）分泌的糖蛋白，理论分子量为41 kDa，其cDNA编码的蛋白质由274 个氨基酸残基组成，N端有17个氨基酸残基的信号肽，成熟蛋白有257个氨基酸残基。NIF是一种新型抗炎因子，它能专一地结合人中性白细胞膜上的整合素CD11b/CD18，从而抑制活化的中性白细胞释放H2O2以及粘附血管内皮细胞，以此减轻中性白细胞介导的组织损伤。目的：美国辉瑞公司将rNIF用于治疗与局部出血性中风相关的再灌注损伤，现已进入Ⅱ期临床。仅美国每年就大约有750 000人患上局部出血性中风，如果rNIF顺利通过临床实验，无疑具有极大的商业价值。在基因工程中，rNIF的表达一般采用真核表达系统，美国Corvas公司的Moyle等人就利用巴斯德毕赤酵母成功表达出rNIF，但尚未见利用原核表达系统表达rNIF的报道，本研究初步探讨了如何利用大肠杆菌表达rNIF并进行纯化。方法：根据有关文献报道的编码NIF成熟肽的cDNA序列并参照引物设计的基本原则，设计出一对引物，以含目的cDNA的质粒PUC57为模板，利用PCR技术扩增目的cDNA。用限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ双酶切扩增产物和表达质粒pET-21a(+)，连接目的cDNA和表达质粒的大片段，将连接产物用CaCl2 法转化大肠杆菌DH5α。抽提重组质粒pET-21a(+)/NIF，用NdeⅠ和BamHⅠ小量双酶切，确定目的cDNA与表达质粒的大片段是否正确连接，然后由上海生工用Sanger双脱氧链终止法-PUC体系对目的cDNA测序，确定目的cDNA的基因序列是否正确。大量抽提重组质粒，转化宿主菌BL21（DE3）plysS，经IPTG诱导，确定rNIF在宿主菌BL21（DE3）plysS中以可溶形式或包涵体形式高效表达，通过发酵大量制备rNIF。离心分离表达菌体和培养基，收获的菌体用Tris-HCl 缓冲液（pH8.0）+超声破菌处理，再离心收集包涵体沉淀，经过洗涤、溶解和复性，rNIF复性溶液经Q-Sepharose层析、羟基磷灰石（HTP）层析、Sephacryl S-100凝胶过滤层析，得到纯化的rNIF。在纯化过程中，用Bradford法测定rNIF浓度。凝胶扫描15％SDS-PAGE胶条，测定rNIF在全菌蛋白中的百分含量。HPLC分析rNIF纯品的纯度。通过中性白细胞与96孔细胞培养板的粘附性实验，测定rNIF抑制中性白细胞粘附的活性。结果：本研究成功利用PCR技术扩增出目的cDNA并克隆于表达质粒pET-21a(+)。对目的cDNA的序列分析结果表明，扩增的目的cDNA序列与文献报道一致。经IPTG诱导3 h，rNIF在宿主菌BL21（DE3）plysS中以包涵体形式实现高效表达。凝胶扫描的分析结果表明，目的蛋白（28.9 kDa）约占全菌蛋白的20％。HPLC的分析结果表明，rNIF纯品的纯度在98％以上。活性测定结果表明，rNIF能有效抑制中性白细胞的粘附。结论：本研究在大肠杆菌中高效表达出具有生物活性的rNIF,而且摸索出一套相应的纯化工艺，该工艺成本低、工艺衔接合理、分离效率高，可以方便的放大至中试和生产规模,这些结果为利用大肠杆菌制备rNIF奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
中性白细胞抑制因子论文参考文献
[1].甘雨耕,蔡绍皙,王红兵,王建,陈海蓉.中性白细胞抑制因子在大肠杆菌中的表达与纯化[J].生物技术通讯.2003
[2].甘雨耕.中性白细胞抑制因子在大肠杆菌中的表达与纯化[D].重庆大学.2003